JPH02226066A - オープンカラム用逆相型充填剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） 本発明は、オープンカラム用逆相型充填剤に係り、特に
シリカゲルの細孔内部が疎水性とされる一方、その外表
面が部分的に親水性とされて、極性溶媒に対する親和性
が向上せしめられた、オープンカラムクロマトグラフィ
ーに好適に用いられる逆相型充填剤に関するものである
。

（背景技術） 従来から、オープンカラムクロマトグラフィー法は、ク
ロマト管に充填剤を入れ、そして展開液を自然流下する
だけで分離カラムの調整が出来、その後直ちに分取が可
能となることから、使用が容易で、また薄層クロマトグ
ラフィーでの結果を直ちにオープンカラムクロマトグラ
フィーの分取条件に移行出来ること、更にクロマト管の
他には、送液ポンプ等のような特別な装置を必要としな
いこと等から、試料の簡易な精製方法として広く用いら
れてきている。

このオープンカラムクロマトグラフィーに適用され得る
クロマトグラフィー的手法としては、大別すると、一般
に、ヘキサン、ベンゼン、クロロホルム、酢酸エチル等
の極性の低い展開溶媒を使用して、極性の高い、シリカ
ゲル、アルミナ、セルロース粉末等の充填剤を用いる順
相クロマトグラフィーと、メタノール、アセトニトリル
、水。

緩衝液等或いは水溶性有機溶媒と水の混合液のような極
性の高い展開液と、極性が低く、疎水性の高い充填剤と
を用いる逆相クロマトグラフィーがあるが、実際にオー
ブン力ラムクロマトグラフィ−に使用される充填剤の大
部分は、順相型充填剤である。これは、順相クロマトグ
ラフィーに使用する充填剤が安価であること、分離にお
いて高い立体選択性が得られること、展開液の組成を変
更することで保持時間が容易に調節出来ること、展開液
が揮発性である場合が多く、分取後の試料処理が容易な
こと等を理由としている。

ところで、オープンカラムクロマトグラフィーに逆相型
充填剤を使用して逆相クロマトグラフィーを実施する場
合には、順相クロマトグラフィーでは問題とはならない
、展開液との親和性が重要となり、使用される展開液に
制限を受けることが考えられる。

即ち、逆相クロマトグラフィーに適用され得る展開液の
種類は極めて広いが、汎用的に使用される展開液は、通
常、その組成がｌＯ〜８０％程度において有機溶媒を含
む水溶液であって、この有機溶媒濃度を変更することに
より分離や保持時間を調節しているのであるが、逆相型
オープンカラムクロマトグラフィーに極性の高い展開液
を使用した場合には、充填剤が展開液に浮かぶ現象が起
こるという極めて重大な問題が惹起され、それ故逆相型
充填剤を使用したオープンカラムクロマトグラフィーで
は、展開液中の有機溶媒の濃度に制限を受けることとな
り、保持時間と分離を自由に調節出来ず、そのために逆
相型充填剤が敬遠されることとなるのである。

なお、上記の如く、逆相型充填剤が展開液に浮かぶ原因
としては、極性の低い油が極性の高い水に浮かぶのと同
様の理由で、逆相カラムクロマトグラフィー用充填剤は
、その全表面に疎水性基が導入されて構成されているた
めに、極性が低く、且つ高い疎水性を有していることに
よって、展開液の含水量が増加した場合に、該逆相型充
填剤と展開液との親和性が低下して、充填剤が展開液に
馴染まずに、浮上するようになるからであり、これによ
って、正常なりロマトグラフィーが困難になるという問
題が惹起されるのである。このために、極性の高い充填
剤を使用する方法が考えられているが、充填剤の極性を
高めることは逆相分離用充填剤として疎水性を低下する
こととなり、試料を分離する充填剤としては不適当とな
るのである。

しかしながら、逆相型充填剤は、クロマトグラフィーを
行なうに際して、空気中の水分の影響を順相型よりも受
は難いものであるため、分離の再現性が良く、また試料
の疎水性の違いで分離するものであるところから、分離
が通用出来る試料の範囲が広いという特性を有している
。そして、高速液体クロマトグラフィーのように、充填
剤を密閉したカラムに詰めて使用する場合には、むしろ
逆相クロマトグラフィーが順相クロマトグラフィーより
も広く使用されているのである。

このようなことから、より広範囲な試料を分離すること
が出来る逆相クロマトグラフィー分離に適用出来、且つ
展開液の制限がないオープンカラム用充填剤の開発が望
まれているのである。

（解決課題） ここにおいて、本発明は、かかる事情を背景にして為さ
れたものであって、その解決課題とするところは、前述
の如き逆相型充填剤を広範囲な展開液が適用され得る充
填剤と為すべく、該充填剤の表面にある疎水性基を部分
的に加水分解して、極性の高い溶媒に対する充填剤の親
和性、即ち親水性化を図り、オープンカラムクロマトグ
ラフィーに良好に適用し得るようにすることにある。

（解決手段） そして、本発明は、上述の如き課題解決のために、細孔
を有する多孔性シリカゲルの内外面に結合せしめられた
疎水性有機基が酸性媒体中での処理によって５〜３５％
の除去率にて除去されて、かかる多孔性シリカゲルの外
表面に詰合せる疎水性有機基の一部が残存せしめられて
いることを特徴とするオープンカラム用逆相型充填剤を
、その要旨とするものである。

（具体的構成） ところで、本発明に係る逆相型充填剤を得るには、先ず
、通常の細孔を有する多孔性のシリカゲルに対して、そ
の内外面に、所定のシリル化剤との反応によって疎水性
有機基が結合せしめられるのであるが、このシリカゲル
に結合、導入される疎水性有機基としては、オープンカ
ラム用の充填剤として用いる場合に、プロピル基、オク
チル基、オクタデシル基等のアルキル基、シアノプロピ
ル基等のシアノアルキル基、或いはアミノプロピル基等
のアミノアルキル基等が挙げられる。また、そのような
疎水性有機基を与えるシリル化剤としては、公知の各種
のものが採用され得、その反応条件も、選択されるシリ
ル化剤に応じて適宜に決定される。

次いで、この内外面に疎水性有機基が結合せしめられた
シリカゲルに対して、酸性媒体中、一般には酸水溶液中
における処理操作が施され、かかるシリカゲルの外表面
に結合する疎水性有機基が部分的に加水分解されて、５
〜３５％の除去率（全表面に結合せる疎水性有機基を基
準にして）にて除去せしめられることにより、目的とす
る、外表面に結合する疎水性有機基が一部残存せしめら
れた逆相型充填剤が得られるのである。また、この加水
分解によって、シリカゲルの外表面には、親水性基（シ
ラノール基）が形成されることとなる。

なお、この酸性媒体処理に用いられる酸としては、例え
ば、塩酸、硝酸、硫酸、燐酸の如き鉱酸（無機酸）等が
挙げられ、また必要に応じて、そのような酸性媒体には
、シリカゲルとの親和性を高めるために、水と共に、メ
タノール等の溶媒が混入される。また、かかる加水分解
処理における操作手法としては、公知の各種の手法が適
宜に採用され、例えば激しい撹拌の下での濃い酸水溶液
を用いた還流操作等が採用されることとなる。

そして、このような加水分解処理の後、更に必要に応じ
て、シリカゲルの外表面の親水性基（シラノール基）に
、ジオール基等を有する親水性基が導入されることによ
って、充填剤の外表面における部分的な親水性が高めら
れるのである。

ところで、本発明に係る充填剤は、上記の如く、加水分
解により充填剤の外表面に結合せる疎水性有機基が部分
的に除去されたものであるが、その除去率が５〜１０％
程度においても極性溶媒に対する親和性の向上が著しく
、１０％メタノール或いはアセトニトリル等の有機溶媒
を含む展開液であれば、充分に親和性を示し、沈降性質
が見られる一方、極性の著しく高い展開液である水単独
での使用或いは緩衝液の如き塩類を含む展開液に対して
は、除去率５〜ｌＯ％の充填剤では展開液に浮遊する粒
子が認められる場合があるため、高極性の展開溶媒を使
用する場合には、更に外表面の剥離程度を増加し、好ま
しくは２５〜３０％程度除去することが望ましい。

また、本発明の如き、部分親水性の逆相型充填剤では、
シリカゲルの外表面に存在する疎水性の固定相（疎水性
有機基）を３５％を越えて除去すると、充填剤（シリカ
ゲル）の疎水性が減少し、またシリカゲルの溶解性が促
進するという問題が生じることから、その除去率として
は、５〜３５％の範囲が採用されることとなるのである
。

要するに、逆相クロマトグラフィーにおいて、充填剤た
るシリカゲルに導入されている固定相の割合は、充填剤
の疎水性を決定し、試料の保持時間や分離能に影響を及
ばすものであり、固定相として導入された疎水性基が少
ない場合には、逆相クロマトグラフィーの分離機構であ
る疎水性相互作用が減少し、試料の保持時間は短くなる
ことから、充分な分離が得られなくなる場合がある。こ
のことから、短いカラムで、即ちより少量の充填剤の使
用で、効率的な分離を達成するには、出来る限り多くの
固定相を導入することが望ましいのである。従って、本
発明に係る部分親水性の充填剤においても、必要以上の
固定相の剥離は充填剤の疎水性の低下をもたらし、疎水
性に基づく分離能の低下に繋がることから、外表面部に
存在する疎水性基は、極性溶媒に対する親和性を損なわ
ない程度に残存させる方が望ましいのである。

また、本発明の如く、シリカゲルを担体とするクロマト
グラフ用充填剤を使用する場合には、常に担体の安定性
を考慮する必要がある。即ち、シリカゲルは、使用する
溶媒がアルカリ性でない限り、比較的難溶性の担体であ
るが、クロマトグラフィーのように溶媒を通液する場合
には僅かな溶解性が問題となるのである。これは、順相
用のシリカゲルカラムに水を含む移動相を送液した場合
に、シリカゲルが徐々に溶解して理論段数の低下やピー
クの分裂等の原因となることからも理解出来る。これに
対して、Ｃｒｙ型充填剤の如き逆相型充填剤では、含水
溶媒の使用においても安定に使用することが出来るとこ
ろから、これらを考慮すると、部分親水性型充填剤につ
いても充填剤の溶解に対する安定性からも、疎水性基を
除去する割合は少ない方が好ましく、固定相の剥離によ
って生じるシリカゲルの露呈部分の減少は、充填剤の安
定性に寄与すると考えられるのである。

（実施例） 以下に、本発明の幾つかの実施例を示し、本発明を更に
具体的に明らかにすることとするが、本発明が、そのよ
うな実施例の記載によって、何等の制約をも受けるもの
でないことは、言うまでもないところである。

また、本発明には、以下の実施例の他にも、更には上記
の具体的記述以外にも、本発明の趣旨を逸脱しない限り
において、当業者の知識に基づいて種々なる変更、修正
、改良等を加え得るものであることが、理解されるべき
である。

なお、以下に示される部及び百分率は、特に断わりのな
い限り、重量を基準とするものである。

実施例　１ 予め、粒径が２３０〜４００メツシユの多孔性シリカゲ
ルを、２００ｍｍＨＨの減圧下において、１５０″Ｃで
３時間の間、加熱減圧乾燥を施した。

次いで、この得られたシリカゲルの１０部に対して、シ
リル化剤としてのオクタデシルジメチルクロロシランの
１０部を用い、ピリジン：３部を触媒として、トルエン
中で、６時間還流することにより、反応せしめ、該シリ
カゲルの内外面（細孔内面及び外表面）の全面にオクタ
デシル基が導入された、ＯＤＳ　（オクタデシルジメチ
ルシリル化）シリカ（Ｃｉａ型充填剤）を合成した。

そして、この得られたＯＤＳシリカ：１０部を、１１Ｎ
の塩酸：２００部中に投入し、加熱温度：１００°Ｃの
下で激しく撹拌（約１０１０００ｒｐしながら、加水分
解反応を行なった。

この加水分解操作における疎水性有機基（ＯＤＳ）の除
去状況を調べるために、各時間ごとにシリカゲルをサン
プルアウトして、内径：４．６ａａｘ長さ＝１５０−の
ステンレス・スチール製のカラムに湿式充填法にて充填
した後、メタノール；水＝６０１０（容量比）なる組成
の溶媒を移動相として使用して、トルエンのキャパシテ
ィー比二に′の変化を測定し、その結果を、第１図に示
した。

なお、充填剤の評価条件は、逆相条件下で測定している
ことから、充填剤の疎水性を発現するオクタデシル基が
除去されるに従って、トルエンのに′値は小さくなる傾
向を示し、このキャパシティー比の変化から、シリル化
剤の除去率が推定出来るのである。

即ち、かかる第１図から明らかなように、ｋ′値は５時
間までに速やかに低下し、その後、非常に僅かずつ低下
しているところから、充填剤の外表面の加水分解反応は
、約若しくは概略５時間以内に大部分完了しているもの
と考えられる。従って、本発明においてシリカゲルの外
表面にオクタデシル基を残存させるには、前記加水分解
条件下では５時間以内の条件を採用する必要のあること
が判る。

実施例　２ 実施例１において得られた、オクタデシル基が内外面の
全表面に導入されたシリカゲル及び外表面部のオクタデ
シル基が部分的に加水分解除去されたシリカゲルについ
て、それぞれの炭素の含有率を測定したところ、下記の
第１表の如き結果が得られた。

第１表 この結果、表面を加水分解によって部分的に剥離した充
填剤の炭素含有率は、オクタデシル基を全面に導入した
充填剤上比較して、５％の低下に止まり、比較的多くの
オクタデシル基が残存していることがｉ認出来た。

実施例　３ 実施例２における、表面のシリル化剤（ｃｏｇ）を塩酸
触媒によって部分的に加水分解して得られた部分親水性
型逆相充填剤（以下、Ｐｌ（Ｓと略称する）を用いて、
かかる充填剤の溶媒に対する親和性に関する評価を行な
い、その結果を、下記第２表に示した。また、比較とし
て、−船釣な逆相型充填剤（Ｃｒ　ｓ型、Ｃ，型、Ｃ＋
型充填剤）を用い、同様に評価した。なお、かかるＣ　
ＩＩ型充填剤は加水分解の施されていない前記オクタデ
シル基が全面に導入されたシリカゲルであり、またＣ１
ｌ型、Ｃ１型充填剤は、それぞれ、シリル化剤としてオ
クチルジメチルクロロシラン、トリメチルクロロシラン
を用いて合成されたものである。

そして、それら充填剤の評価方法としては、メタノール
：水の割合を変化させて調製した含水メタノールに、前
記各種の充填剤をそれぞれ加え、振盪して均一に充填剤
を分散せしめた後、静置して、それぞれの充填剤の沈降
状態を観察して行なった。

第２表 この結果から明らかなように、Ｃ１ｌ型、Ｃ１型。

ＣＩ型の各充填剤においては、メタノール含有率が６０
％より低下すると、即ち水の含有率が４０％よりも増加
すると、充填剤が溶媒に対して浮いてしまい、カラムク
ロマトグラフィー用充填剤としては使用出来ないことが
判明した。

これに対して、部分親水性型逆相充填剤（ＰＨ８）にあ
っては、メタノールを全く含まない水に対しても、完全
に親和性を示していることから、極性の非常に高い溶媒
を使用した逆相カラムクロマトグラフィー用の充填剤と
して良好に使用し得ることが確認出来た。

実施例　４ 実施例３にて用いられた部分親水性型逆相充填剤を使用
して、テオブロミンとテオフィリンのカラムクロマトグ
ラフィーについて、検討を行なった。なお、その評価方
法としては、かかるテオブロミンとテオフィリンを充填
カラムに同時に注入することで、分析、評価し、その結
果を第２図に示した。また、展開液としては、２０％メ
タノールを使用した。

一般に、上記テオブロミンとテオフィリンは、比較的親
水性の高い薬剤であり、その分子構造は極めて類似し、
両試料にはメチル基１個の存無に違いがあるだけである
。このように疎水性基であるメチル基の差について、カ
ラムクロマトグラフィー分離を通用する場合、順相クロ
マトグラフィーでは認識が困難であり、反面従来の疎水
性の認識能が高い逆相クロマトグラフィーでは、試料の
親水性が高いために、充填剤が浮上しない有機溶媒濃度
の展開液では充填剤に保持されず、カラムクロマトグラ
フィーにおいては分離し難い試料である。

しかしながら、第２図の結果から明らかなように、本発
明に係る部分親水性の逆相型充填剤を用いて分析したと
ころ、テオブロミンとテオフィリンを分離することが出
来た。

（発明の効果） 以上の説明から明らかなように、本発明に係る充填剤に
あっては、多孔性シリカゲルの内外面に結合せしめられ
た疎水性有機基が酸性媒体中での加水分解により５〜３
５％の割合で除去されて、シリカゲルの外表面が部分的
に親水性化されたものであるところから、オープンカラ
ムクロマトグラフィーで有機溶媒を全く含まない展開液
を使用した場合においても、充填剤の浮遊は何等惹起さ
れ得す、逆相高速液体クロマトグラフィーで使用可能な
移動相は全て適用可能となったのである。

また、シリカゲルの内表面には、疎水性基が残存してい
るため、充填剤は、充分な疎水性も有し、これによって
逆相クロマトグラフィーの通用を可能としているのであ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、塩酸を触媒としてオクタデシル基を加水分解
して除去した時の進行状態を表す、トルエンのキャパシ
ティー比＝に′の時間による変化を示すグラフであり、
第２図は、本発明に係る部分親水性の逆相型充填剤を用
いた時のテオプロミンとテオフィリンのクロマトグラム
である。 出願人　　ナカライテスク株式会社 第１ 加水分解時間 （ｈｒ） 第２０

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 細孔を有する多孔性シリカゲルの内外面に結合せしめら
   れた疎水性有機基が酸性媒体中での処理によって５〜３
   ５％の除去率にて除去されて、かかる多孔性シリカゲル
   の外表面に結合せる疎水性有機基の一部が残存せしめら
   れていることを特徴とするオープンカラム用逆相型充填
   剤。