JPH02226069A - 改良されたクラミジアアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は被分析物についてのアッセイに関し、更に詳細
にはクラミジア（ＣｈｌＪＢｄｉｘ）Ｊ二ついての改良
された固体相アッセイに関する。

（従来の技術） タラミジアッシ−（Ｃｂｌａｍｙｄｉｘｃｅａｅ）属に
はクラミジア・トラコーマチス（Ｃｂｌｉ＋５ｙｄｉｓ
　ｔｒ＆ｅｂｏｍａｉｉｓ）及びクラミジア・プシタッ
チ（ＣｈｌａＩＩｙｄｉａ　ｐｓｉｉｔａｃｉ）の２種
がある。クラミジア・トラコーマチスの１５種類の種々
の株の多くは、トラコーマ、封入体結膜炎、性ｇｉｔ性
リンパ肉芽腫、゛非特異性“もしくは非淋菌性尿道炎及
び直腸炎を含む数多くのヒトの眼の及び生殖器の病気の
病原菌である。クラミジア・トラコーマチス惑染は一般
公衆に広がっている。例えば、クラミジア・トラコーマ
チスは１年間当たり数百万件の非淋菌尿道炎の原因とな
りていると推定されている。

クラミジア・トラコーマチスに媒介される疾病が蔓延し
ているので、適切な処置を行うためにその生物の存在に
ついて信頼性のある、簡単で安価な試験法が強く望まれ
ており且つ非常に重要である。現在使用されている唯一
の血清学的試験法はマイクロイムノフロルエセンス試験
法である。しかしながら、この試験法はクラミジア・ト
ラコーマチスのある株を血清学的試験法の抗原として用
いることを必要とする。更に、この試験法を行うための
設備が利用できるのは全世界の限られた数の実験室のみ
である。この試験法は大変労力を要し、時間がかかり、
そして実施が雌しい。

クラミジアについての幾つかのイムノアッセイ法が開示
されている。ＰＣＴ公開された出願番号ＷＯ３６１０２
７３３号は眼の感染を引き起こすクラミジアを含む種々
の抗原についてのアッセイを開示している。このアッセ
イは抗原を固体支持体上に吸収されたモノクロナール抗
体に結合させることによって固体支持体上に固定するこ
と、又は抗原を固体支持体に直接吸収させることを含ん
でいる。

ヨーロッパ特許出願番号第０１８３３８３号は、非特異
的結合を減らすために抗原を約１００℃にまで加熱する
単離方法を含んでいるクラミジア抗原についてのアッセ
イを開示している。

ローズ（ン■ｓｅ）は米国特許第４．６６３，２９１号
においてクラミジア菌を含んでいると推定される試料を
界面活性剤及び金属イオンで旭理してクラミジア抗原を
放出させ、そして既知の方法によって前記抗原をアッセ
イすることを開示している。

この方法によれば、界面活性剤による抗原の抗−クラミ
ジア抗体への結合の既知の阻害は起こらない アームストロング（Ａ、ｒｌｉｓｔｒｏａｇ）らは米国
持許第４．４９７，８９９号においてクラミジア抗原の
イムノアッセイを開示しており、そのイムノアッセイに
おいてはクラミジア菌を含んでいると推定されるサンプ
ルを溶解して抗原を放出させ、そして抗原を直接的に固
体支持体上に吸収させる。

（発明が解決しようとする課題） 上記の開示にも拘わらず、クラミジアのアッセイを更に
改良することについて明確な要求がまだ残っている。本
発明はこれらの要求を満たすことを目的としている。

（課題を解決するための手段） 体液中のクラミジア薗を測定するための方法は、クラミ
ジア抗原をアミジン基を誘導された固体支神体に付着さ
せること、付着した抗原を標識に結合した抗体を含んで
いるトレーサーに結合させること、結合した抗原を有し
ている支持体を液体から分離すること、及び結合したト
レーサーを標識に関連した信号によって検出することを
含んでいる。好ましくは、その菌を洗浄剤による旭理に
よって変化させて、前記抗原が支持体により多く暴露さ
れるようにする。本開示において、−測定−という用語
は体液サンプル中のクラミジア菌の存在を定性的に又は
そのような菌の数を定量的に検出する二七を意味してい
る。

好ましい固体支持体はアミジン誘導粒子のポリスチレン
ラテックスであり、好ましい標識は抗体に結合した酵素
である。分離するための好ましい方法は適当な膜を通し
てその粒子を濾過することである。そして、濾過された
粒子を好ましくは膜上でそれらを酵素と反応して色を生
成する基質と接触させることによって検出する。好まし
い酵素と基質の組み合わせはアルカリホスファターゼ−
インドキシルホスフェートであり、それによって膜上に
響きが出現し、そして体液サンプル中のクラミジア菌の
存在が示される。好ましくは、その色を例えばテトラゾ
リウム塩の存在下で酵素と基質を反応させることによっ
て増感するこができる。

本アッセイを実施するための物質のキットも本発明の範
囲に含まれる。

アミジンで修飾されたラテックスはアミジン修飾されて
いない粒子を含むラテックスを用いる実質的に同一のア
ッセイよりも大幅に改善されたアッセイを提供する。抗
原はアミジン基に容易に結合するので、捕獲抗体を必要
としない。アミジン基への抗原の増強された付着による
と考えられる高い感度に加えて、本アッセイは容易に実
施され、僅か２〜３の工程のみを含み、そして３０分も
しくはそれ以下の時間で完了できる。

本発明は多くの異なった形での実施態様で実現されるが
、本開示は本発明の原理の例示であると考えるべきであ
り、本発明を述べらた実施態様に限定する意図はないと
いう理解の下に、本発明の詳細な好ましい実施態様につ
いてここに述べる。

本発明の範囲は特許請求の範囲及びその均等物によって
判断されるべきである。

本発明によれば、クラミジア菌の存在は特定の固体支持
体を用いた抗原についてのアッセイによって検出される
。クラミジア抗原をアミジン基で修飾された重合体支持
体とインキュベーションすると、従来の支持体に比較し
て抗原の支持体への付着がかなり多い結果として高い感
度のアッセイを行うことができることを発見した。

アミジン側鎖を有しているどのような重合体支持体でも
本発明のアッセイに使用することができる。従って、例
えば、支持体にはスチレン−ブタジェン共重合体、ポリ
アクリレート、又は、好ましくはアミジン修飾ポリスチ
レンがある。アミジン修飾重合体はカルボキシ置換オレ
フィンモノマーを重合させそしてカルボン酸もしくはエ
ステル基をアミジン基に変換することによって、又は好
ましくは酸もしくはエステル置換オレフィンモノマーを
対応するアミジン置換上ツマ−に変更してから重合させ
ることによって調製される。カルボン酸モしくはエステ
ルのアミジンへの変換はこの分野の当業者には良く知ら
れた有機化学の日常的方法である。

固体支持体は慣用的などのような形態もしくは形状であ
っても良く、例えばシート状、板状、ウェル、ビーズ、
デイラグスティック及びチューブ等がある。好ましい固
体支持体はビーズであり、最も好ましくはラテックス粒
子である。具体的な好ましい固体支持体はアミジン修飾
ポリスチレンラテックス（インターフアシアル・ダイナ
ミックス（Ｉｎｌｅｒｆｉｃｉｉｌ　Ｄｙａｍｍｉｃｓ
）、オレゴン州ポートランド）である。好ましいラテッ
クスの粒子は約０゜０１〜５０ｐｍ、好ましくは約０．
１−１０ｐｒｎ、最も好ましくは約０．４〜１．０μｍ
の大きさを有している。ラテックスは体積に対する重量
に基づいて約０．０１−１０、好ましくは約０．１〜４
、最も好ましくは約↓、θ％固体である。

アミジンで修飾されたラテックス粒子をクラミジア抗原
とインキュベーションする。抗原はクラミジア菌体を含
んでいると推定される患者の体液サンプルから得ること
かでさる。スワブで採取された生殖器サンプルが一般的
には好ましい。サンプルを、緩衝液中に菌体を放出させ
るためにスワブを撹拌することによって緩衝液のような
液体中に懸濁する。

しかし、本アッセイを完全な細胞で行う場合クラミジア
菌体を前処理して細胞がクラミジア抗原をより多く露出
するように変化させることが好ましい。クラミジア菌体
をその抗原がアミジン修飾ラテックスに付着しそしてト
レーサーに結合できるようになるように変化させるどの
ような試薬も使用できる。アームストロング（Ａｒ朧５
ｔｒｏ＋４）ら（上記）により述べられている慣用的技
術や、Ｏ−ズ（ｆｆｉｏｓｅ）の特許された方法（上記
）を使用できる。

クラミジア細胞の変化のための好ましい試薬には緩衝液
中のキレート剤、蛋白質及び表面活性剤が含まれており
、そして実施例の一つに詳細に述べられている。

クラミジア抗原のアミジンラテックス粒子への付着はど
のような長さの時間でも行うことができるが、好ましく
は約１〜６０分間であり、温度にも制限はないが好まし
くは約ｌθ〜４０℃で、十分に確実な付着を起こさせる
ことができる。−収約には、抗原の付着は容易に起こり
、そして３７℃で約１５分間後には実質的に完了してい
る。

本発明によれば、大幅に改善されたアッセイがアミジン
修飾ラテックスを用いることによって達成される。まだ
実証されてはいないが、アミジン基が存在しない条件下
では良くない結果しか得られないという証拠から判断す
ると、ラテックス粒子上のアミジン基とクラミジア抗原
との間に特異的相互作用があると考えられる。

アミジン修飾ラテックスＩこ付着したクラミジア抗原を
抗原についてのトレーサーと接触させる。

トレーサーは好ましくは抗原に特異的な抗体であり、そ
の抗体に結合している標識を有している。

標識はその標識に関連した信号によって検出可能な放射
線活性原子、蛍光染料もしくは酵素である。

最も好ましいトレーサーは慣用的な融合及び選択手法に
よって調製され且つ酵素が結合している抗−クラミジア
モノクロナール抗体である。七ノクロナール抗体の調製
及び放射線標識、染料もしくは酵素を抗体に結合させる
ための方法は良く知られており、当業者が本発明のこの
態様を完全に理解するために更に詳細に述べる必要はな
い。

抗体に結合させることができ且つ基質を宵色の生成物に
変換することのできるどのような酵素も標識として使用
できる。好ましい酵素はぺＪレオキシダーゼ、例えば西
洋ワサビのペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）もしくは、最も
好ましくは加水分解酵素である。適切な加水分解酵素は
、例えばペプチダーゼ、カルボキシエステラーゼのよう
なエステラーゼ、ガラクトシダーゼのようなグリコシダ
ーゼ又は最も好ましくはアルカリホスファターゼ（ＡＰ
）のようなホスファターゼである。

トレーサーの抗体成分とラテックスに付着した抗原の結
合は全く慣用的であり、そして−収約には室温で約１な
いし１０分間で完了する。

その上に結合画分を有しているラテックス粒子を慣用的
方法で液体から分離する。例えば、アッセイ媒体を遠心
分離し、粒子からなるペレットを液体をデカントするこ
とによって分離し、そしてペレットを第２の液体に再懸
濁する。本発明のこの実施態様においては、基質をその
第２の液体に添加して、そして体液サンプル中のクラミ
ジアの存在を第２の液体の発色によって確認する。抗原
を定量することが望ましい場合には本発明のこの実施態
様は好ましい。従って、色の濃度は比色計やスペクトロ
７オトメニ°ターのような装置によって測定され、そし
て既知量の抗原を含んでいる液体について行われたアッ
セイで得られる色の濃度と比較する。もし、染料もしく
は放射線標識を用いた場合、そのような場合には抗原は
励起光を照射して後の染料からの蛍光又は放射線活性の
計数の測定によって検出されが、やはりこの実施態様が
好ましいことは明白である。

抗原の検出のみを必要とする本発明の好ましい実施態様
においては、液体からの粒子の分離は粒子が膜表面上に
残留するのに適した孔径を有する膜を使用する濾過によ
って行われる。適当な膜は、例えばイムノダイン（登録
商標）　（ＩｍｍｌＩ＋ｕｄｙｏｅ）　（ボール・コー
ホ（ＰｘＩＩ　Ｃａｒｐ、）ニューヨーク、グレンコー
ベ）のようなナイロン膜：イモピロン（登録商標）　（
Ｉｍｇｎｂｉｌｏａ）　（ミリボア・コーホ（Ｍｉｌｌ
ｉｐｏｒｅＣａｒｐ−＞、マサ７チウセツツ州ベトフオ
ード）；及びＭＳ！（マサッチウセッツ州ウェストポａ
）及びミリポアから入手可能なニトロセルロース膜であ
る。最も好ましくは、その膜はカゼインもしくはアルブ
ミンのような不活性蛋白質で前処理されており、それに
より結合抗原に由来しない発色を起こす原因となる液体
中の結合していないトレーサーと非特異的結合をする膜
上の結合部位を満たす。もし、必要ならば、膜濾過材は
慣用的マイクロタイタープレートのウェルのような形態
で提供されても良く、そして濾過を補助する構造物、例
えば真空供給源との接続物もしくはフィルターの下Ｉこ
置く吸収層と共に提供しても良い。

濾過後、膜表面上の粒子を、好ましくは硫酸ドデシルナ
トリウム（Ｓ　ＯＳ）のような洗浄剤を用いそして最後
に脱イオン水で洗浄することが好ましい。次に、洗浄し
た膜を基質溶液で処理する。

酵素標識と反応して有色生成物を生成するどのような基
質も使用できる。従って、もし酵素がＨＲＰであるなら
ば、適当な基質はジアミノベンジジン又は＆’Ｔｔしく
はオルトフェニレンジアミンである。もし、酵素がエス
テラーゼであるならば、その基質は例えばｐ−ニトロフ
ェニルアセテートもしくはブチレートである。もし、酵
素がホスファターゼ例えば好ましくはアルカリホスファ
ターゼであるならば、適当な基質は例えばｐ−ニトロフ
ェニルホスフェート又はインドキシルホスフェートのよ
うなホスフェート類である。基質は基質溶液中で約０．
１〜ｌｏｍＭの濃度で、好ましくは約１〜５ｍＭの濃度
で存在すれば良い。適当な基質の選択及び用いるべきそ
の濃度は当業者の通常の知識の範囲内である。

もし、基質溶液が少量の色増強剤を更に含んでいるなら
ば、色の強度が増強されることが分かった。適当な色増
強剤は、例えばテトラゾリウム塩である。従って、最も
好ましい基質溶液はメタノール中にニトロブルーテトラ
ゾリウム約０６０１〜０．１ｍｇ／ｍａを含んでいる。

−収約には、有色生成物を生成する酵素と基質の反応は
早く、そして約１〜１５分間、好ましくは３〜５分間の
反応時間で色形成には十分である。

色形成反応は陽性（発色、抗原の存在）であるか陰性（
発色無し、抗原は存在しない）であるかを判断できるま
でのどのような長さの時間行っても良い。別法として、
反応は酵素及び基質を混合後のどのような時機でも停止
溶液で停止される。停止溶液は酵素活性を阻害し、そし
てそれによって停止溶液を添加した時点での発色状態を
凍結する。

適当な停止溶液は、例えば０．２Ｍリン酸ナトリウ云中
の１０ｒｎＭエチレンジアミン四酢酸である。

上記のように、もし標識がフルオレセインのような蛍光
染料であるならば、抗原は染料に励起光をあててそして
蛍光を検出することによって検出される。もし、放射線
標識を用いるならば、抗原検出は放射線活性計数測定に
よって行われる。

本発明の他の態様は本発明の方法を実施するための物か
ら成るキットである。そのキットはアミジン修飾ポリス
チレン粒子のラテックス、酵素と結合した抗−クラミジ
ア菌体、前記酵素と反応する基質、及びラテックスを膜
を通過させる時にその粒子を除去するのに十分な孔径を
有している膜を含んでいる。キットはクラミジア菌体を
変化させるための試薬、緩衝液及び生理食塩水のような
溶液、予め決められた量のクラミジア抗原を含んでいる
ｌもしくはそれ以上の溶液、及び本発明のアッセイを実
施する場合に有用な容器やドロンバーのような種々の器
具を更に含んでいても良い。

このキットはハウジング内に組み立てられ、好ましくは
プラスチックであり、吸収紙のような膜の下に置くもの
を含んでいても良く、それらにより膜を通過するアッセ
イ液体の流れを容易にする。

下記の実施例は本発明を更に説明するために提供されも
のであって、いかなる場合であっても本発明を制限する
意図ではない。

実施例１ ディスペンスチューブ（ＤｉｓｐｅｎｓＴｏｂｅ）　（
Ｊ録商標）（ベクトン・ディキンソン）に抽出試薬４０
μｌ　　（５ｍＭエチレンジアミン四酢酸、０．５％ウ
シ血清アルブミン、０．５％Ｗ／Ｖヶノデオキシコレー
ト／リン酸緩衝生理食塩水中のポリオキシエチレン−ｐ
−を−オクチルフェノール界面活性剤５％ｖ／ｖ、ｐＨ
７，２）及び前記緩衝液中のクラミジア臨床サンプル１
３０μ此を入れた。

最終用量２００μ症をポルテックス攪拌し、周囲温度で
５分間放置し、そして５０μｔの１％アミジンポリスチ
レンラテックス１．１５μを添加した。得られた混合物
をポルテックス撹拌し３７℃で１５分間インキュベージ
コンした。

４０％Ｖ／Ｖウシ胎児血清及びｌＯｒｎＭトリス及び１
５４ｍＭＮａＣａを含むカゼイン緩衝液（ｐＨ７，６）
ｏ、ｓ％Ｗ／ｖで希釈さしｆ：、モ／りａナール抗−ク
ラミジアＡＰ結合物の溶液２５０μｌを添加して結合物
の濃度を１．５μｇ　／　ｍ　１としｊ；。ポルテック
ス撹拌後５分間インキュベーションして、その混合物を
シュレイチャー・アンド・シュ、１ネル（Ｓｃｋｌｅｉ
ｅｋｅｒ　１１１１５ｃｂｔｅｌｌ）＃　５−　Ｓレイ
ヨンの一片で３層吸収パッドから分離されたカゼインで
ブロックされｆニー０．６５μイムノダイン（１膳鳳ｗ
ｍｏｄｙａｅ）　（登録商標）膜上にピペットで滴下し
た。

そして、膜表面上に濾過されたアミジン−ラテックス粒
子にｐＨ７の５ｍＭ５Ｄ５６００μａを添加し、次に蒸
留水３００μａを添加した。洗浄用の水を濾過した後、
１５０μ此の基質溶液（１゜５ｍＭインドキシルリン酸
二ナトリウム、０．５ｍＭ塩化マグネシウム及び０．Ｏ
１％Ｗ／Ｖニトロブルーテトラゾリウム）を添加しｔ；
。色は３〜５分間で発色し、そして０．２Ｍリン酸ナト
リウム及び１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含む溶液
で停止した。

臨床サンプル中のクラミジアの存在は膜上の黒ずんだ色
によって示された。陰性の対照サンプル（クラミジアが
入っていない）は膜上に色を示さなかった。

実施例２ 実施例１の方法を組織で増殖したタラミジアサンブル及
びアミジン基を含んでいない数種のラテックスについて
同様に行った。次に示す結果が得られ、色濃度の任意単
位でデンシトメーターでの信号の値を示したニ ラテックス デンシトメーター の信号（ＯＤ） ペンシルバニア州ワごリントン） ０．４７ Ｄｙｕ履１ｃｓ）、オレゴン州ボートランド）０．３７ メチルメタアクリレート（０，３〜０．４ｊ）０．１７ カルボキシ修飾（セラゲン（Ｓｅｒａ（ｅｍ）、インデ
イアナ州インデイアナポリス）　　　　　　０．２７ア
ミジン（実施例１のラテックス）２．１ｇ色の濃度はア
ミジン修飾ラテックスを使用するとｌＯ＠近く濃くなっ
ていることが分かる。従って、アミジン修飾ラテックス
を使用する本発明のアッセイは高い感度を有し、そして
アミジン修飾ラテックスを使用せずにアッセイしたとき
には陰性であると診断される可能性のあるサンプル中の
クラミジア菌体を検出できることが期待される。

（発明の効果） 上記のように、本方法はクラミジア抗原のアミジン修飾
ラテックス粒子への付着を含んでいる。

アミジン修飾ラテックスの使用は、アミジン修飾されて
いない他のラテックスで起こるよりも多い量の抗原がア
ミジン修飾ラテックスに固く付着するので増強された感
度を有するアッセイを提供する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）抗原を測定する
   方法であって； ａ）アミジン修飾ラテックスの粒子をクラミジア抗原を
   含んでいると推定される液体と接触させて、それによっ
   て前記抗原を前記粒子に付着させ；ｂ）抗原が付着した
   前記粒子を酵素と結合している抗−クラミジア抗体と接
   触させて、それによって前記粒子上の前記抗原を前記抗
   体と結合させて前記粒子上に前記酵素を含んでいる結合
   画分を生成させ； ｃ）前記結合画分を含んでいる前記粒子を前記液体から
   分離し； ｄ）前記分離された粒子上の酵素を該酵素と反応する基
   質と接触させて、それによって前記酵素が前記基質を生
   成物に変換し；及び ｅ）前記液体中のクラミジア抗原の存在を前記生成物に
   関連した色の出現によつて検出すること；からなる上記
   方法。 ２、前記酵素がペルオキシダーゼ及び加水分解酵素から
   なる群から選択される、請求項１記載の方法。 ３、前記分離を膜濾過によって行う、請求項１記載の方
   法。 ４、前記膜が不活性蛋白質で前処理されている、請求項
   ３記載の方法。 ５、分離された粒子上の酵素をテトラゾリウム塩と更に
   接触させる、請求項１記載の方法。 ６、クラミジア抗原を測定する方法であって；ａ）液体
   中のクラミジア抗原をアミジン誘導固体支持体に付着さ
   せ； ｂ）前記支持体に付着した抗原を標識が結合している抗
   体と接触させ、それによって前記抗原と前記抗体を結合
   させて前記支持体上に前記標識を含む結合画分を生成さ
   せ； ｃ）前記支持体を前記液体から分離し；及びｄ）前記抗
   原を前記標識に関連した信号によつて検出すること からなる上記方法。 ７、前記標識が放射線活性原子、蛍光染料及び酵素から
   なる群から選択される、請求項６記載の方法。 ８、アミジン修飾ポリスチレン粒子のラテックス、酵素
   と結合した抗−クラミジア抗体、該酵素と反応する基質
   、及び前記粒子を濾過するための膜からなるクラミジア
   についてのアッセイを実施するための物質からなるキッ
   ト。 ９、クラミジア菌体を変化させるための試薬を更に含ん
   でいる請求項８記載のキット。 １０、前記膜の下に置くための吸収材を含んでいる前記
   キットの成分を組み立てるためのハウジングを更に含ん
   でいる請求項８記載のキット。