JPH02227091A - 新規プラスミン阻害蛋白 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ａ）産業上の利用分野 本発明は新規なプラスミン阻害蛋白に関する。

ｂ）従来技術 ヒトのα２−プラスミンインヒビタ−は、青水と緒井に
よって最初に単離・精製され、線維素溶解酵素のプラス
ミン（ｐｌａｓ＋ｎ１ｎ）のエステラーゼ活性を瞬間的
に阻害する強力なプラスミンインヒビタ−であり、１１
．７％の糖鎖を含む分子量的６７、０００の１本鎖の糖
蛋白質であることが知られている［Ｍ、Ｍｏｒｏｉ　＆
　Ｎ、Ａｏｋｉ　；　Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　
Ｂｉｏｌｏｇｉ−ｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２５
１．５９５６−５９６５　（１９７６）参照］。

本発明者は、すでに特願昭６１−２２５００８号（昭和
６１年９月２５日出願）、特願昭６１−３０１７５３号
（昭和６１年１２月１９日出願）および特願昭６２−１
５４４９５号（昭和６２年６月２３日出願）において、
ヒトα２プラスミンインヒビタ−のアミノ酸配列および
遺伝子断片を出願した通り、ヒト肝細胞のｃＤＮＡライ
ブラリーより、ヒトα２−プラスミンインヒビタ−の相
補ＤＮＡ　（以下ｃＤＮＡという）を単離しその構造か
らヒトα２−プラスミンインヒビタ−（α２ＰＩ）のア
ミノ酸配列を決定した。

ところが本発明者らの研究によれば第１図に示した如き
、通常のα２ＰＩよりもかなり長いアミノ酸配列を有す
るポリペプチドが、α２ＰＩと同様のプラスミン阻害活
性を有しており、またフィブリンへの架橋結合能は通常
のα２ＰＩの２０〜４０％となっていることが判った。

しかもそれをコードする遺伝子を用いてトランスフェク
トした細胞からの産生も通常のα２　　ＰＩよりも効率
的であることを見出し、本発明に到達した。

Ｃ）　発明の構成 本発明は、下記１〜４６４ ＭｅｔＧｌｕＰｒｏＬｅｕＧＩｙＡｒｇＧＩｎＬｕｅＴ
ｈｒＳｅｒＧｌｙＰｒｏＡｓｎＧＩｎＧＩｕＧｌｎＶａ
ｌＳｅｒＰｒｏＬｅｕＴｈｒＬｅｕＬｅｕＬｙｓＬｅｕ
ＧＩｙＡｓｎＧｌｎＧＩｕＰｒ。

ＧＩｙＧＩｙＧＩｎＴｈｒＡＩａＬｅａＬｙｇＳｅｒＰ
ｒｏＰｒ。

ＧＩｙＶａｌＣｙｓＳｅｒＡｒｇＡｓｐＰｒｏＴｈｒＰ
ｒｏＧＩｕＧＩｎＴｈｒＨｉｓＡｒｇＬｅｕＡｌａＡｒ
ｇＡＩａＭｅｔＭｅｔＡＩａＰｈｅＴｈｒＡｌａＡｓｐ
ＬｅｕＰｈｅＳｅｒＬｅｕＶａ１ＧｌｕＡｓｐＡｓｐＬ
ｅｕＡｌａＡｓｎｌｌｅＡｓｎＧＩｎＴｒｐＶａｌＬｙ
ｓＧＩｕＡＩａＴｈｒＧｌｕＧＩｙＬｙｓｌｌｅＧＩｎ
ＧＩｕＰｈｅＬｅｕＳｅｒＧＩｙＬｅａＰｒｏＧｌｕＡ
ｓｐＴｈｒＶａｌＬｅｕＬｅｕＬｅｕＬｅｕＡｓｎＡＩ
ａｌｌｅ）ＩｉｓＰｈｅＧＩｎＧＩｙＰｈｅＴｒｐＡｒ
ｇＡｇｎＬｙｓＰｈｅＡｓｐＰｒ。

ＳｅｒＬｅｕＴｈｒＧｌｎＡｒｇＡｓｐＳｅｒＰｈｅＨ
ｉｓＬｅｕＡｓｐＧＩｕＧｌｎＰｈｅＴｈｒＶａｌＰｒ
ｏＶａ　ｌＧｌｕＭｅｔｇＯ ＭｅｔＧＩｎＡＩａＡｒｇＴｈｒＴｙｒＰｒｏＬｅｕＡ
ｒｇＴｒｐＰｈｅＬｅｕＬｅｎＧＩｕＧｌｎＰｒｏＧＩ
ｎｌｌｅＧｌｎＶａ１２フ−Ｏ Ａｌａ）ｌｉｇＰｈｅＰｒｏＰｈｅＬｙｓＡｓｎＡｓｎ
ＭｅｔＳｅｒＡＩａＧＩｎＴｈｒＳｅｒＴｈｒＣｙｓＰ
ｒｏＡｓｎＬｅｕｌｌｅＬｅｕＳｅｒＰｒｏＬｅｕＳｅ
ｒＶａｌＡＩａＬｅｎＡｌａＬｅｕ０Ｏ ３ｅｒＨ１ｓＬｅｕＡｌａＬｅｕＧＩｙＡＩａＧＩｎＡ
ｓｎＨｉｓＴｈｒＬｅｕＧＩｎＡｒｇＬｅａＧＩｎＧｆ
ｎＶａｌＬｅａＨｉｓＡＩａＧＩｙＳｅｒＧｌｙＰｒｏ
ＣｙｓＬｅｕＰｒｏＨｉｓＬｅｕＬｅｕＳｅｒＡｒｇＬ
ｅｕＣｙｓＧｌｎＡｓｐＬｅｕＧＩｙＰｒ。

ＧＩｙＡＩａＰｈｅＡｒｇＬｅｕＡＩａＡｌａＡｒｇＭ
ｅｔＴｙｒＬｅｕＧＩｎＬｙｓＧｌｙＰｈｅＰｒｏｌｌ
ｅＬｙｓＧｌｎＡｓｐＰｈｅＬｅｕＧｌｕＧＩｎＳｅｒ
ＧＩｕＧＩｎＬｅｕＰｈｅＧＩｙＡｌａＬｙｓＰｒｏＶ
ａｌＳｅｒＬｅｕＴｈｒＧＩｙＬｙｓＧＩｎＰｈｅＶａ
ｌＶａｌＬｅｕＶａｌＰｒｏＴｈｒＨｉｓＰｈｅＧｌｕ
ＴｒｐＡｓｎＶａｌＳｅｒＧｌｎＶａｌＬｅｕＡＩａＡ
ｓｎＬｅｕＳｅｒＴｒｐＡｓｐＴｈｒＬｅｕＨｉｓＰｒ
ｏＰｒｏＬｅｕＶａ１ＴｒｐＧＩｕＡｒｇＰｒｏＴｈｒ
ＬｙｓＶａ　ｌＡｒｇＬｅｕＰｒ。

ＬｙｓＬｅｕＴｙｒＬｅｕＬｙｓ旧ｓＧｌｎＭｅｔＡｓ
ｐＬｅｕＶａｌＡｌａＴｈｒＬｅｕＳｅｒＧＩｎＬｅｕ
ＧｌｙＬｅｕＧＩｎＧｌｕＬｅｕＰｈｅＧｌｎＡＩａＰ
ｒｏＡｓｐＬｅｕＡｒｇＧｌｙ１１ｅＳｅｒＧｌｕＧＩ
ｎＳｅｒＬｅｕＶａｌＶａｌＳｅｒＧＩｙＶａｌＧＩｎ
ＨｉｓＧＩｎＳｅｒＴｈｒＬｅｕＧｌｎＬｅｕＳｅｒＧ
ｌｕＶａｌＧｌｙＶａｌＧＩｕＡｌａＡＩａＡｌａＡＩ
ａＴｈｒＳｅｒｌｌｅＡＩａｉ［ｅｔＳｅｒＡｒｇＭｅ
ｔＳｅｒＬｅｎＳｅｒＳｅｒＰｈｅＳｅｒＶａｌＡｓｎ
ＡｒｇＰｒｏＰｈｅＬｅｕＰｈｅＰｈｅ　ＩＩｅＰｈｅ
ＧＩｕＡｓｐＴｈｒＴｈｒＧＩｙＬｅｎＰｒｏＬｅｕＰ
ｈｅＶａｌＧＩｙＳｅｒＶａｌＡｒｇＡｓｎＰｒｏＡｓ
ｎＰｒｏＳｅｒＡＩａＰｒｏＡｒｇＧＩｎＬｅｕＬｙｓ
ＧＩｔ＋Ｇｌｎのアミノ酸配列を有するポリペブチド及
びそれをコードする遺伝子断片である。

上記ポリベプチドは後述する実施例に示すような発現ベ
クターを用いて細胞をトランスフェクトすることにより
従来公知のα２ＰＩよりも効率的に産生され、しかも同
様のプラスミン阻害活性を有していることが特徴である
。

前記ポリベプチドをコードする遺伝子としては、例えば
当該ポリペプチドのアミノ酸配列に対応して示す、下記
ＤＮＡ配列［ｎ］ ＧＩｎＡｓｐＳｅｒＰｒｏＧＩｙＡｓｎＬｙｓＡｓｐＰ
ｈｅＬｅｕＧＩｎＳｅｒＬｅｕＬｙ＋ＧｌｙＰｈｅＰｒ
ｏＡｒｇＧＩｙＡｓｐＭｅｔＧＩｕ ＡＴＧＧＡＧ ＬｙｓＬｅｎＰｈｅＧＩｙＰｒｏＡｓｐＬｅｕＬｙｓＬ
ｅｕＶａ　ＩＰｒｏＬｅｕＧＩｙＡｒｇＧＩｎＬｅｕＴ
ｈｒＳｅｒＧＩｙＰｒｏＣＣＣＴＴＧＧＧＣＣＧＧＣＡ
ＧＣＴＡＡＣＴＡＧＣＧＧＧＣＣＧ　　　　３６Ｐｒｏ
ＰｒｏＭｅｔＧｌ＋ＧＩｕＡｓｐＴｙｒＰｒｏＧＩｎＰ
ｈｅＡｓｎＧＩｎＧＩｔ＋ＧＩｎＶａｌＳｅｒＰｒｏＬ
ｅｕＴｈｒＬｅｕＡＡＣＣＡＧＧＡＧＣＡＧＧＴＧＴＣ
ＣＣＣＡＣＴＴＡＣＣＣＴＣＧＩｙＳｅｒＰｒｏＬｙｓ ＬｅｕＬｙｓＬｅｕＧＩｙＡｓｎＧＩｎＧＩｕＰｒｏＧ
ＩｙＧＩｙＣＴＣＡＡＧＴＴＧＧＧＣＡＡＣｅＡＧＧＡ
ＧＣＣＴＧＧＴＧＧＣＧＩｎＡｒｇＬｅｕＧＩｎＧＩｎ
ＶａｌＬｅｕＨｉｓＡＩａＧＩｙｅＡＧＡＧＧＣＴＧＣ
ＡＡｅＡＧＧＴＧＣＴＧｅＡＣＧＣＡＧＧＣＧＩｎＴｈ
ｒＡＩａＬｅｕＬｙｓＳｅｒＰｒｏＰｒｏＧｌｙＶａｌ
ＣＡＧＡＣＴＧＣＣＣＴＧＡＡＧＡＧＴＣＣＣＣＣＡＧ
ＧＡＧＴＣＳｅ　ｒＧＩｙＰｒｏｃｙｓＬｅｕＰｒｏＨ
　ｉｓＬｅｕＬｅｕｓｅ　ｒＴＣＡＧＧＧＣＣＣＴＧＣ
ＣＴＣＣＣｅＣＡＴＣＴＧＣＴＧＡＧＣＣｙｓＳｅｒＡ
ｒｇＡｓｐＰｒｏＴｈｒＰｒｏＧＩｕＧＩｎＴｈｒＴＧ
ＣＡＧＣＡＧＡＧＡＣＣＣＣＡＣＣＣＣＡＧＡＧＣＡＧ
ＡＣＣＡｒｇＬｅｔ＋ＣｙｓＧＩｎＡｓｐＬｅｕＧＩｙ
ＰｒｏＧＩｙＡｌａＣＧＣＣＴＣＴＧＣＣＡＧＧＡＣＣ
ＴＧＧＧＣＣＣＣＧＧＣＧＣＧＨｉｇＡｒｇＬｅｔｉＡ
ＩａＡｒｇＡＩａＭｅｔＭｅｔＡＩａＰｈｅＣＡｅＡＧ
ＧＣ：ＴＧＧＣｅＣＧＧＧＣＣＡＴＧＡＴＧＧＣＣＴＴ
ＣＰｈｅＡｒｇＬｅｎＡＩａＡＩａＡｒｇＭｅｔＴｙｒ
ＬｅｍＧＩｎＴＴＣＣＧＡＣ：ＴＧＧＣＴＧＣ：ＣＡＧ
ＧＡＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＴｈｒＡＩａＡｓｐＬＥＵ
ＰｈｅＳｅｒＬｅｕＶａ　ＩＡＩａＧＩｎＡＣＴＧＣＣ
ＧＡＣＣＴＧＴＴＣＴＣＣＣＴＧＧＴＧＧＣＴＣＡＡＬ
ｙｓＧＩｙＰｈｅＰｒｏｌｌｅＬｙｓＧＩｕＡｇｐＰｈ
ｅＬｅｕＡＡＡＧＧＡＴＴＴＣＣ：ＣＡＴＣＡＡＡＧＡ
ＡＧＡＴＴＴＣＣＴＧＴｈｒＳｅｒＴｈｒＣｙｓＰｒｏ
ＡｓｎＬｅｕｌｌｅＬｅｔ＋ＳｅｒＡＣＧＴＣＣＡＣＣ
ＴＧＣＣＣＣＡＡＣＣＴＣＡＴＣＣＴＧＴＣＡＧＩｕＧ
ＩａＳｅｒＧＩｕＧｌａＬｅｕＰｈｅＧｌｙＡＩａＬｙ
ｓＧＡＡＣＡＡＴＣＣＧＡＡＣＡＧＣＴＡＴＴＴＧＧＧ
ＧＣＡＡＡＧ１フ２ ＰｒｏＬｅｔ＋ＳｅｒＶａｌＡＩａＬｅｕＡＩａＬｅｕ
ＳｅｒＨｉｓ（Ｃ：ｅＣＴＧＡＧＴＧＴＧＧＣＣＣＴＧ
ＧＣＧＣＴＧＴＣＴＣＡＣＰｒｏＶａｌＳｅｒＬｅｕＴ
ｈｒＧＩｙＬｙｓＧＩｎＧＩｎＡｓｐＣＣＣＧＴＧＡＧ
ＣＣＴＧＡＣＧＧＧＡＡＡＧＣＡＧＧＡＡＧＡＴＬｅｕ
ＡｌａＬｅｕＧＩｙＡＩａＧＩｎＡｓａＨｉｓＴｈｒｌ
；ｅｕＣＴＧＧＣＡＣＴＡＧＧＴＧＣＴＣＡＧＡＡＣＣ
ＡＣＡｅＧＴＴＧＡｓｐＬｅｔ＋ＡＩａＡｓｎｌ　Ｉｅ
ＡｇｎＧＩｎＴｒｐＶａｌＬｙｓＧＡＣＣＴＧＧＣ：Ａ
ＡＡＣＡＴＣＡＡＣＣＡＡＴＧＧＧＴＧＡＡＧＧＩｕＡ
ｌａＴｈｒＧＩｕＧＩｙＬｙｓ　ＩＩｅＧＩｎＧＩｕＰ
ｈｅＧＡＧＧＣＣＡＣＧＧＡＧＧＧＧＡＡＧＡＴＴＣＡ
ＧＧＡＡＴＴＣＰｈｅＰｒｏＰｈｅＬｙｓＡｓｎＡｓｎ
ＭｅｔＳｅｒＰｈｅＶａｌＴＴＣＣＣＣＴＴＴＡＡＧＡ
ＡＣＡＡＣＡＴＧＡＧＣＴＴＴＧＴＧＬｅａＳｅｒＧＩ
ｙＬｅｕＰｒｏＧＩｕＡｇｐＴｈｒＶａｌＬｅｎＣＴＣ
ＴＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＧＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＴＧＴ
ＴＧＶａｌＬｅ＋＋ＶａｌＰｒｏＴｈｒＨｉｓＰｈｅＧ
ｌｕＴｒｐＡｓｎＧＴＣＣＴＴＧＴＡＣＣＣＡＣＣＣＡ
ＣＴＴＴＧＡＡＴＧＧＡＡＣＬｅｕＬｅｕＬｅｕＡｓｎ
Ａｌａｌ　ＩｅＨｉｇＰｈｅＧＩｎＧＩｙＣＴＴＣＴＣ
ＣＴＣＡＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＴＴＣＣＡＧＧＧＴＶ
ａｌＳｅｒＧＩｎＶａｌＬｅｎＡＩａＡｓｎＬｅｎＳｅ
ｒＴｒｐＧＴＧＴＣＣＣＡＧＧＴＡＣＴＧＧＣＣＡＡＣ
ＣＴＧＡＧＴＴＧＧＰｈｅＴｒｐＡｒｇＡｓａＬｙｓＰ
ｈｅＡｓｐＰｒｏＳｅ　ｒＬｅｕＴＴＣＴＧＧＡＧＧＡ
ＡｅＡＡＧＴＴＴＧＡＣＣＣＧＡＧＣＣＴＴＡｓｐＴｈ
ｒＬｅｕＨｉｓＰｒｏＰｒｏＬｅｕＶａｌＴｒｐＧｌｕ
ＧＡＣＡＣＣＣＴＧＣＡＣｅＣＡＣＣＴＣＴＧＧＴＧＴ
ＧＧＧＡＧＴｈｒＧＩｎＡｒｇＡｓｐＳｅｒＰｈｅＨｉ
ｓＬｅｕＡｓｐＧｌｕＡＣＣｅＡＧＡＧＡＧＡｅＴＣ：
ｅＴＴｅｃＡｃｃＴＧＧＡｃＧＡＧＡｒｇＰｒｏＴｈｒ
ＬｙｓＶａ　ｌＡｒｇＬｅｕＰｒｏＬｙｓＬｅｕＡＧＧ
ＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＴＣＣＧＧＣＴＧＣＣＴＡＡＧＣ
ＴＧＧｌｎＰｈｅＴｈｒＶａ　ｌＰｒｏＶａｌＧＩｎＭ
ｅｔＭｅｔＧＩｎＣＡＧＴＴＣＡＣＧＧＴＧＣＣＣＧＴ
ＧＧＡＡＡＴＧＡＴＧＣＡＧＴｙｒＬｅｕＬｙｓＨｉｓ
ＧＩｎＭｅｔＡｓｐＬｅａＶａ　ＩＡＩａＴＡＴＣＴＧ
ＡＡＡＣＡＣＣＡＡＡＴＧＧＡＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＡ
ＩａＡｒｇＴｈｒＴｙｒＰｒｏＬｅｕＡｒｇＴｒｐＰｈ
ｅＬｅｕＧＣＣＣＧＣＡＣＧＴＡＣＣＣＧＣＴＧＣＧＣ
ＴＧＧＴＴＣＴＴＧＴｈｒＬｅｕＳｅｒＧＩｎＬｅｕＧ
ｌｙＬｅｕＧＩｎＧＩｕＬｅｕＡＣＣＣＴＣＡＧＣＣＡ
ＧＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＴＧＬｅａＧＩｕ
ＧＩｎＰｒｏＧＩｏｌｌｅＧＩｎＶａｌＡＩａＨｉｓＣ
ＴＧＧＡＧＣＡＧＣｅＴＧＡＧＡＴｅＣＡＧＧＴＧＧＣ
ＴＣＡＴＰｈｅＧＩｎＡＩａＰｒｏＡｓｐＬｅｕＡｒｇ
ＧＩｙｌｌｅＳｅｒＴＴＣＣＡＧＧＣＣＣＣＡＧＡＣｅ
ＴＧｅＧＴＧＧＧＡＴＣＴＣｅ３ラ２ ＧＩｕＧＩｎＳｅｒＬｅｕＶａｌＶａｌＳｅｒＧＩｙＶ
ａｌＧＩｎＧＡＧＣＡＧＡＧＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＴＣ
ＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＳｅｒＰｒｏＧＩｙＡｇｎＬｙｓ
ＡｓｐＰｈｅＬｅｕＧＩｎＳｅｒＴｅＣＣＣ：ＧＧＧＣ
ＡＡＣ：ＡＡＧＧＡＣＴＴＣＣＴ（Ｃ：ＡＧＡＧｅ　　
１２９６ＨｉｓＧＩｎＳｅｒＴｈｒＬｅｕＧｌｕＬｅｕ
ＳｅｒＧＩｕＶａｌＣＡＴＣＡＧＴＣＣＡＣＣＣＴＧＧ
ＡＧＣＴｅＡＧＣＧＡＧＧＴｅＬｅｕＬｙｓＧｌｙＰｈ
ｅＰｒｏＡｒｇＧｌｙＡｓｐＬｙｓＬｅｕＣＴＧＡＡＡ
ＧＧＣ：ＴＴｅｅＣＣＣＧＣＧＧＡＧＡＣＡＡＧｅＴＴ
３フ２ ＧＩｙＶａｌＧＩｕＡＩａＡＩａＡＩａＡｌａＴｈｒＳ
ｅｒｌｌｅＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣ
ＣＡＣＣＡＧＣＡＴＴｌ１１６ ＰｈｅＧｌｙＰｒｏＡｓｐＬｅｕＬｙｓＬｅｕＶａｌＰ
ｒｏＰｒｏＴＴＣＧＧＣＣｅＴＧＡＣＴＴＡＡＡＡＣＴ
ＴＧＴＧｅＣＣＣＣｅ　　１３５６ＡＩａＭｅｔＳｅｒ
ＡｒｇＭｅｔＳｅｒＬｅｕＳｅｒＳｅｒＰｈｅＧＣＣＡ
ＴＧＴＣＣＣＧＣＡＴＧＴＣＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＴＴ
ＣＭｅｔＧＩｕＧＩｕＡｓｐＴｙｒＰｒｏＧｌｎＰｈｅ
ＧＩｙＳｅｒＡＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＴＡＣＣＣＣＣ
ＡＧＴＴＴＧＧＣＡＧＣＳｅｒＶａｌＡｓｎＡｒｇＰｒ
ｏＰｈｅＬｅｕＰｈｅＰｈｅｌｌｅＡＧＣＧＴＧＡＡｅ
ｅＧＣＣ：ＣＣ：ＴＴｅＣＴＣＴＴＣＴＴＣＡＴＣＰｒ
ｏＬｙｓ ＣＣＣＡＡＧ　　１３９２　　　　　　　．．−［１］
ＰｈｅＧＩｕＡｓｐＴｈｒＴｈｒＧＩｙＬｅｏＰｒｏＬ
ｅｎＰｈｅＴＴＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＡＣＡＧＧｅＣＴ
ＴｅＣＣＣＴｅＴＴｅＶａ　ＩＧ　Ｉ　ｙｓｅ　ｒＶａ
　ＩＡｒｇＡＳｎＰｒｏＡｇｎＰｒｏＳｅ　ｒＧＴＧＧ
ＧＣＡＧＣＧＴＧＡＧＧＡＡＣＣＣＣＡＡｅＣＣＣＡＧ
ＴＡｌａＰｒｏＡｒｇＧＩｕＬｅｕＬｙｓＧｌｕＧＩｎ
ＧＩｎＡｔｐＧＣＡＣＣＧｅＧＧＧＡＧＣＴＣＡＡＧＧ
ＡＡＣＡＧＣＡＧＧＡＴが挙げられる。

このＤＮＡ配列［Ｉ］はその途中を１以上のイントロン
で中断されていてもよい。

本発明の更なる特徴は、当該蛋白を発現させるのに、ヒ
トα２−プラスミンインヒビターの発現ベクターを利用
しうる点にあり、選ばれた細胞に導入（トランスフェク
ト）することにより当該新規プラスミン阻害蛋白を発現
させることができる。

本発明の１具体例によれば、第３図におけるヒトα２−
プラスミンインヒビタ−染色体遺伝子のエクソン■の上
流２０塩基対（ｂａｇｅｐａｉｒ　；以降ｈｐと略記す
る）の制限酵素Ａｌｕ切断部位より３′下流域を含み、
エクソン■の５′の上流から下流へ向かって１４１番目
にある制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位までの約２６００　
ｂｐのヒトα２−プラスミンインヒビタ−染色体遺伝子
断片（第４図）と、第５図におけるヒトα２−プラスミ
ンインヒビタ−のｃＤＮＡの部分断片すなわち５′上流
側の制限酵素ＥｃｏＲＩ切断から３′下流側のＥｃｏＲ
Ｉ　リンカ−結合部位までを含む約１，７Ｋｂｐとを添
付第６図に示した方法で結合させて新規プラスミンイン
ヒビタ−をコードするハイブリッドＤＮＡを作成し、こ
れを発現ベクターに組込んで新規プラスミン阻害蛋白を
発現するベクターとすることができる。

この新規プラスミン阻害蛋白発現ベクターを選ばれた細
胞に導入（トランスフェクト）することにより新規プラ
スミン阻害蛋白を細ｌで発現させることか可能となる。

かかる細胞としてはＢＨＫ。

ＣＨＯ細胞等が例示される。

かかる本発明における新規プラスミン阻害蛋白の発現ベ
クターに用いるヒトα２−プラスミンインヒビタ−をコ
ードする領域は、上記した染色体遺伝子とｃＤＮＡとの
組合せに限定されず、正しく当該新規プラスミン阻害蛋
白をコードするならば、各々の構成割合は種々変えられ
る。更には、全ＣＤＮＡを利用する場合も、また全染色
体遺伝子を利用する場合であっても、細胞を選んだり、
培養条件を選定することにより、新規プラスミン阻害蛋
白を効率的に発現させることが可能である。

以下実施例を掲げてヒトα２−プラスミンインヒビタ−
ｃＤＮＡのクローニング、ヒトα２−プラスミンインヒ
ビタ−染色体遺伝子のクローニング、新規プラスミン阻
害蛋白の発現ベクターの作製、新規プラスミン阻害蛋白
の動物細胞への導入。

新規プラスミン阻害蛋白の精製とアミノ末端の構造決定
及び新規プラスミン阻害蛋白の活性などについて詳細に
説明する。

なお、本明細書及び図面において、アミノ酸。

ポリペプチドはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢ
Ｎ）で採用された方法により略記するものとし、たとえ
ば下記の略号を用いる。

Ａｌａ　　Ｌ−アラニン Ａｒｇ　　Ｌ−アルギニン Ａｓｎ　　Ｌ−アスパラギン Ａｓｐ　　Ｌ−アスパラギン酸 Ｃｙｓ　　Ｌ−システィン Ｇｌｎ　　Ｌ−グルタミン Ｇｌｕ　　Ｌ−グルタミン酸 Ｇｌｙ　　グリシン Ｈｓ　　Ｌ−ヒスチジン Ｉｌｅ　　Ｌ−インロイシン Ｌｅａ　　Ｌ−ロイシン Ｌｙｇ　　Ｌ−リジン Ｍｅｔ　　Ｌ−メチオニン Ｐｈｅ　　Ｌ−フェニルアラニン Ｐｒｏ　　Ｌ−プロリン Ｓｅｒ　　Ｌ−セリン Ｔｈｒ　　Ｌ−スレオニン ＴｒｐＬ−トリプトファン Ｔｙｒ　　Ｌ−チロシン Ｖａｌ　　Ｌ−バリン また、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　（デオキシチミ
ジル酸を示す。）実施例１ ヒトα２−プラスミンインヒビタ−のスクリーニング λｇｔｌＧをベクターとするヒト肝細胞由来のｃＤＮＡ
ライブラリーを大腸菌Ｃ６００ｈｆ、Ｑ−株に感染させ
、プラークを形成させた。ヒトα２−プラスミンインヒ
ビタ−遺伝子を含むクローンは、［３２ｐ］で標識した
合成りＮＡＰ−１及びＰ−２をプローブとして用いＢｅ
ｎｔｏｎとＤａｖｉｓのプラークパイプリダイゼーショ
ン法［Ｗ、Ｄ、Ｂｅｎｔｏｎ＆　Ｒ，Ｗ、Ｄａｖｉｓ；
　５ｃｉｅｎｃｅ。

１９６、１８０　（１９７７）参照］に従って選別した
。プローブとして用いた合成りＮＡはＣｏ１１ｅｎらに
よって報告されていたしトα２−プラスミンインヒビタ
−の部分アミノ酸配列［Ｄ、Ｃｏ１１ｅｎ　ｅｔ　ａｌ
、；Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｇ　ａｎｄ　Ｈａｅｍｏｓｔａ
ｓｉｇ、　４８．３１１−３１４（１９８２＞参照］と
対応するＤＮＡ配列をＤＮＡシンセサイザー（アプライ
ド・バイオシステムズ製）を用いて合成した。

（Ｐ−１）　　Ｍｅｔ　Ｇｌａ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｔｙ
ｒ　Ｐｒ。

３’　　ＴＡＣＣＴＴ　ＣＴＴ　ｅＴＧ　ＡＴＧ　ＧＧ
　　５’ＣＡＡ （Ｐ−２）　　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｍｅｔ　Ｍｅｔ　Ｇｌ
ｎ　Ａｌａ３’　　ＣＡＧ　ＴＣＴ　ＴＡＧ　ＴＡＣＧ
ＴＴ　ＣＧ　　５’ＡＣＣ ヒトα２−プラスミンインヒビタ−ｃＤＮＡを含むλｇ
ｔ　１０　ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、挿入されてい
たしトα２−プラスミンインヒビタ−ｃＤＮＡを切り出
し、０．８％アガロースゲル電気泳動によって単離した
。このヒトα２−プラスミンインヒビタ−ｃＤＮＡ断片
０．１μｇを制限酵素消化用バッファ　−［ＥｃｏＲＩ
消化では１００ｍＭ　　ＮａＣ１，５０ｍＭ↑ｒｉｓ−
ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）、　１０ｍ１ｌ　　ｉｌｇｃｈ
　、　１ｍＭジチオスレイトール水溶液を、ＢａｍＨＩ
　、　Ｐｓｔｌ、　Ｈｉｎｄｍ消化では５０ｍＭ　　Ｎ
ａ１ｌ、　１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，
５）。

１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ□、　１ｍＭジチオスレイトール
水溶液を、５ＩｌｌａＩ消化では２０ｍＭ　　ＫＣＩ、
　１０ｍＭ　　Ｔｒｉｇ−Ｈｅｌ　（ｐＨ８，０）、　
１０ｍＭ　　ＭｇＣＩｚ　、　１ｍＭジチオスレイトー
ル水溶液をそれぞれ用いた。］１０μｍに溶解させ、制
限酵素（宝酒造製）２ｉニツトを添加して３７℃で１時
間消化した。なお、二種類の制限酵素による消化を行う
場合には、まず低塩濃度で作用する制限酵素で処理し、
次に所定濃度まで塩濃度を上げてから、より高塩濃度で
作用する制限酵素で処理した。制限酵素による消化後、
１μｍの０．２５％ブロモフェノールブルー、５０％グ
リセロール水溶液を加え１μｇ／ｍｌのエチジウムブロ
マイドを含む０．８％〜１．２％アガロースでゲル電気
泳動をおこなった。この電気泳動の際、ＤＮＡ断片の分
子量マーカーとしてλファージのＤＮＡを旧ａｄｌｌ［
で消化したものを用いた。電気泳動後、このゲルに対し
て紫外線を照射して消化パターンを観察した。

各種制限酵素単独による消化、及び二種の制限酵素の組
合せによる消化での消化パターンを解析して後述する各
制限酵素切断点の相対位置関係を決定した。かくして得
られた約２．２ｋｂのヒトα２−プラスミンインヒビタ
−ｃＤＮＡの制限酵素地図を第５図に示した。

大腸菌用プラスミドｐＵ０８２μｇを制限酵素ＥｃｏＲ
■で消化したものに対してアルカリ性ホスファターゼ（
Ｌｃｏｌｌ　Ｃ７５）　　（宝酒造製）を１．０ユニッ
ト加えて５８℃で２時間反応させた。反応終了後、反応
液中のアルカリ性フォスファターゼを失活・除去するた
めにフェノール抽出を３回繰返した。このようにして得
られたｐＵｃ８のＥｃｏＲＩ　／アルカリ性フォスファ
ターゼ処理液に、上記λｇｔｌＱＤ　Ｎ　Ａ由来のヒト
α２−プラスミンインヒビタ−ＥｃｏＲＩ消化ｃＤＮＡ
断片を加え、２ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼを１２
℃で１６時間反応させて連結させた。

大腸菌ＬＥ３９２株の形質転換は、通常のＣａＣｌ　２
法［Ｍ、Ｖ、Ｎｏｒｇａｒｄ　ｅｔ　ａｌ、；　Ｇｅｎ
ｅ、　３．２９７　（１９７８）参照］に従い調製し、
前記のｐＵＣ８にヒトα２−プラスミンインヒビタ−Ｅ
ｃｏＲＩ消化して得られる約１、７ｋｂのｃ　ＤＮＡ断
片を連結させたハイブリッドＤＮＡで形質転換した。形
質転換した大腸菌ＬＢ３９２を５０μｇ／ｍｌの濃度の
アンピシリンを含んだし−プロスプレートに接種した。

このプレートを３７℃で１晩培養して形質転換株を成育
させた。得られたコロニーより公知の方法を用いてＤＮ
Ａを調製し、アガロースゲル電気泳動により目的のハイ
ブリッドＤＮＡを確認し、この１つをｐＰＩ３９と命名
した。

実施例２ ヒト胎盤より抽出したＤＮＡを制限酵素Ａｌｕｌ及びＨ
ａｅ　ｌｌ［で消化した後、ＥｃｏＲＩリンカ−を介し
てシャロン４Ａ　（Ｃｈａｒｏｎ　４Ａ）バクテリオフ
ァージベクターアームに組込みライブラリーとした。こ
のライブラリー１．２Ｘ１０’プラークを、α２−プラ
スミンインヒビタ−のＮ末より３１番目から１３０番目
のアミノ酸配列及び１７９番目から４２９番目のアミノ
酸配列に対応するｃＤＮＡ断片をプローブとしてＢｅｎ
ｔｏｎ−Ｄａｖｉｓの方法［Ｂｅｎｔｏｎ、Ｗ、Ｄ、　
＆　Ｄａｖｉｓ。

Ｒ，！、　５ｃｉｅｎｃｅ　１９６．１８０−１８２　
（１９７７）参照］によってスクリーニングした。また
、３′上流側のクローンのスクリーニングには、１５塩
基から成る合成りＮＡ　（５’　ＡＣＴＣＣＣＣＴＧＣ
ＣＡＧＣＣ３’）をプローブとして用いた。ｃＤＮＡを
プローブとして用いたときには、ｃＤＮＡ断片はニック
トランスレーションによって３２ｐでラベルした。また
合成りＮＡのラベルはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（
７４Ｐｏ１ｙ−ｎｎｃｌｅｏｔｉｄｅｋｉｎａｓｅ）に
より５′側を３２ｐでラベルした。

スクリーニングの結果、α２−プラスミンインヒビタ−
染色体遺伝子全域をコードする３個のクローン、λｐＨ
、λＰＩ２　、及びλＰＩ６を得た。各々のクローンの
染色体遺伝子への対応は添付第３図（１）〜（３）に示
した。

実施例３ 規プラスミン阻害蛋白の発現ベクターの　製実施例１で
得たヒトα２−プラスミンインヒビタ−ｃＤＮＡをクロ
ーン化したプラスミドｐＰＩ３９を、実施例１に示した
方法に準じて制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、ヒトα２−
プラスミンインヒビタ−ｃＤＮＡフラグメント（１，７
ｋｂｐ）　　（第５図参照）を単離した。

一方、実施例２で得たヒトα２−プラスミンインヒビタ
−染色体遺伝子クローンλＰＩ６をＥｃｏＲＩで消化し
、挿入されていたしトα２−プラスミンインヒビター染
色体遺伝子を切り出し、０．９〜１．５％アガロースゲ
ル電気泳動によって単離した。

このヒトα２−プラスミンインヒビタ−染色体遺伝子の
エクソン■より５′上流側２０ｂｐにある制限酵素Ａｌ
ｕｌから、エクソン■の５′上流部から１４１ｂｐにあ
る制限酵素ＥｃｏＲＩまでの約２．６ｋｂｐの、ヒトα
２−プラスミンインヒビタ−染色体遺伝子のエクソンｍ
、　ｍ、　ｒｖ、　Ｖ、　Ｖｌ、及び■の一部を含んだ
フラグメント（第４図参照）を得た。

上記で得たヒトα２−プラスミンインヒビタ−ＣＤＮＡ
フラグメント（約１゜７ｋｂｐ）と、ヒトα２−プラス
ミンインヒビタ−染色体遺伝子のエクソンｎ、ｍ、　■
、Ｖ、Ｖｌ、及び■の一部を含んだフラグメント（約２
．６ｋｂｐ）とをリガーゼで結合した。

発現ベクターｐＳＶ２を制限酵素器ｎｄｎＩで切断し、
Ｋｌｅｎｏｗ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで平滑化しさらに
制限酵素Ｅｃｏ旧で切断したものと、上記リガーゼで結
合したＤＮＡとを、リガーゼにより結合し、大腸菌Ｃ６
００株にトランスフェクトした。このようにして作製し
た発現ベクターの中からヒトα２−プラスミンインヒビ
タ−染色体遺伝子とヒトα２−プラスミンインヒビタ−
〇ＤＮＡとが制限酵素ＥｃｏＲＩによる切断部位を介し
て正しくヒトα２−プラスミンインヒビタ−をコードす
る向きに結合して新規プラスミン阻害蛋白を発現させる
ようになっているものを制限酵素地図を作製して選んだ
。かくして、添付第６図に示す新規プラスミン阻害蛋白
の発現ベクターｐＳＶ２ＰＩを得た。

実施例４ 新規プラスミン阻害蛋白発現ベクターの細胞へのトラン
スフェクションは、ファルマシア社製のＣｅ１ｌ　Ｐｈ
ｅｃｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｌｏｎ　Ｋｉｔを用い、そ
のプロトコールに従っておこなった。

新規ブラスミシ阻害蛋白発現ベクターｐＳＶ２Ｐ１１０
μｇト選択マーカー発現ベクターｐｓｉ−ＤＨＰＲ３μ
ｇを１２０μｍの蒸溜水に溶解し、１２０μｍのＡバッ
ファーを加えた。撹拌後１０分間室温に放置した。この
溶液に２４０μｍのＢバッファーをすばやく加え１５分
間室温に放置した。この溶液を直径１０ｃｍのシャーレ
−で培養しているＢＨＫ−２１（Ｃ−１３）細胞上に添
加した。このＢＨＫ細胞を３７℃。

５％Ｃ０２濃度で６時間インキュベートした後、培養液
を除き、これに２ｍｌの１５％グリセロール、ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液（ｐＨ７，５）を加え、３分間室温に置いた。

この上清液を取り除いた後、５ｍｌの１０％ＦＣ８（ウ
シ胎児血清）を含んだＤ−Ｍ　Ｅ　Ｍで洗浄した後、１
０ｍ１の１０％ＦＣ８を含んだＤ−ＭＥＭ培地を加え、
３７℃、５％ＣＯ２濃度でインキュベートした。

４８時間後いったん細胞をプレートよりはがし、細胞数
を１７２から１／５０程度に希釈し、２５０ｎＭのメト
トレキセートを含む１０％ＦＣＳダルベツコＭＥＭ培地
で培養した。約２週間接数十個のコロニを得た。これら
のコロニーを単離し、各々の細胞培養上清中のヒトα２
−プラスミンインヒビタ−抗原量を測定することにより
、新規プラスミン阻害蛋白産生細胞ＢＨＫ−ＰＩＩＯを
得た。

実施例５ 新規プラスミン阻害蛋白発現ベクターのＣＨＯ細胞への
トランスフェクションは、ファルマシア社製のＣｅ１ｌ
　Ｐｈｅｃｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用
い、そのプロトコールに従っておこなった。

新規プラスミン阻害蛋白発現ベクターｐＳＶ２Ｐ１１０
μｇと選択マーカー発現ベクターｐＳＶ−ＤＨＰＲ３μ
ｇを１２０μｇの蒸溜水に溶解し、１２０μｇのＡバッ
ファーを加えた。撹拌後１０分間室温に放置した。この
溶液に２４０μｇのＢバッファーをすばやく加え１５分
間室温に放置した。この溶液を直径１０ｃｍのシャーレ
−で培養しているＣＨＯ−Ｋｌ細胞上に添加した。この
ＣＨＯ−Ｋｌ細胞を３７℃、５％Ｃｑ濃度で６時間イン
キュベートした後、培養液を除き、これに２ｍｌの１５
％グリセロール、ＨＥＰＥＳＭ街液（ｐＨ７，５）を加
え、３分間室温に置いた。

この上清液を取り除いた後、５ｍｌの１０％ＦＣ３（ウ
シ胎児血清）を含んだＤ−Ｍ　Ｅ　Ｍで洗浄した後、１
０ｍ１の１０％ＦＣ８を含んだＤ−Ｍ　Ｅ　Ｍ培地を加
え、３７℃、５％ＣＯ２濃度でインキュベートした。

４８時間後いったん細胞をプレートよりはがし、細胞数
を１７２から１／５０程度に希釈し、２５ｎＭのメトト
レキセートを含む１０％ＦＣＳダルベツコＭＥＭ培地で
培養した。約２週間接数十個のコロニーを得た。これら
のコロニーを単離し、各々の細胞培養上清中のヒトα２
−プラスミンインヒビタ−抗原量を測定することにより
、新規プラスミン阻害蛋白産生細胞ＣＨＯ−Ｐ　Ｉ　１
５を得た。

実施例６ 新規プラスミン阻害蛋白発現ベクターの細胞へのトラン
スフェクションは、ファルマシア社製のＣｅ１ｌ　Ｐｈ
ｅｃｔ　Ｔｒａａｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用い、そ
のプロトコールに従っておこなった。

新規プラスミン阻害蛋白発現ベクターｐＳＶ２Ｐ１１０
ｕ　ｇと選択マーカー発現ベクターｐｓｉ−ｎｅｏ　３
μｇを１２０μｇの蒸溜水に溶解し、１２０μρのＡバ
ッファーを加えた。撹拌後１０分間室温に放置した。こ
の溶液に２４０μｇのＢバッファーをすばやく加え１５
分間室温に放置した。この溶液を直径１０ｃｍのシャー
レ−で培養している２９３細胞上に添加した。この２９
３細胞を３７℃、５％ＣＯ２濃度で６時間インキュベー
トした後、培養液を除き、これに２ｍｌの１５％グリセ
ロール、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，５）を加え、３分
間室温に置いた。この上清液を取り除いた後、５ｍｌの
１０％ＦＣ３（ウシ胎児血清）を含んだＤ−Ｍ　Ｅ　Ｍ
で洗浄した後、ｌＱｍｌの１０％ＦＣ８を含んだＤ−Ｍ
　Ｅ　Ｍ培地を加え、３７℃、５％ＣＯ２濃度でインキ
ュベートした。

４８時間後いったん細胞をプレートよりはがし、細胞数
を１／２から１／５０程度に希釈し、２５０ｎＭのＧ−
４１８を含む１０％ＦＣＳダルベツコＭＥＭ培地で培養
した。約２週間接数十個のコロニーを得た。

これらのコロニーを単離し、各々の細胞培養上清中のヒ
トα２−プラスミンインヒビタ−抗原量を測定すること
により、新規プラスミン阻害蛋白産生細胞２９３−ＰＩ
３を得た。

実施例７ 新規プラスミン阻害蛋白発現ベクターのＣｈａｎｇ−Ｌ
ｉｖｅｒ細胞へのトランスフェクションは、ファルマシ
ア社製のＣｅ１ｌ　Ｐｈｅｃｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉ
ｏｎ　Ｋｉｔを用い、そのプロトコールに従っておこな
った。

新規プラスミン阻害蛋白発現ベクターｐＳＶ２Ｐ１１０
ｔｔ　ｇと選択マーカー発現ベクターｐｓｉ−ＤＨＰＲ
３μｇを１２０μｍの蒸溜水に溶解し、１２０μｐのＡ
バッフアルを加えた。撹拌後１０分間室温に放置した。

この溶液に２４０μｍのＢバッファーをすばやく加え１
５分間室温に放置した。この溶液を直径１０ｃｍのシャ
ーレ−で培養しているＣｈａｎｇ−Ｌｉｖｅｒ細胞上に
添加した。このＣｈａｎｇ−Ｌｉｖｅｒ細胞を３７℃、
５％ＣＯ２濃度で６時間インキュベートした後、培養液
を除き、これに２ｍｌの１５％グリセロール、ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液（ｐＨ７，５）を加え、３分間室温に置いた。

この上清液を取り除いた後、５ｍｌの１０％ＦＣ８（ウ
シ胎児血清）を含んだＤ−Ｍ　Ｅ　Ｍで洗浄した後、１
０ｍ１の１０％ＦＣ８を含んだＤ−Ｍ　Ｅ　Ｍ培地を加
え、３７℃、５％ＣＯ２濃度でインキュベートした。

４８時間後いったん細胞をプレートよりはがし、細胞数
を１７２から１７５０程度に希釈し、２５ｎＨのメトト
レキセートを含む１０％ＦＣＳダルベツコＭＥＭ培地で
培養した。約２週間接数十個のコロニーを得た。これら
のコロニーを単離し、各々の細胞培養上清中のヒトα２
−プラスミンインヒビタ−抗原量を測定することにより
、新規プラスミン阻害蛋白産生細胞ＣＬ−ＰＩ　６を得
た。

実施例８ 新規プラスミン阻害蛋白の精製とアミノ末端の構造決定 新規プラスミン阻害蛋白の精製は、ヒトα２−プラスミ
ンインヒビタ−に対するモノクローナル抗体を用いたア
フィニティークロマトグラフィーを利用して行った。こ
のモノクローナル抗体を用いた精製は、特開昭６１−２
９１５２７号公報に記載された方法に準じた。

実施例４，５及び６で得た新規プラスミン阻害蛋白産生
細胞ＢＨＫ−Ｐ　Ｉ　１０．　ＣＨＯ−Ｐ　Ｉ　１５゜
２９３−Ｐ　Ｉ　３．　ＣＬ−Ｐ　Ｉ　６を１０％ＦＣ
３を含むダルベツコＭＥＭ培地で各々培養した。培養液
２５０　ｍｌを蛋白濃縮器（アミコンコンセントレータ
−）で約３０ｍ１に濃縮した。この濃縮液を抗α２一ブ
ラスミンモノクローナル抗体カラムにかけ、ＰＢ　Ｓ　
（ｐＨ７，５）でよく洗浄した後６Ｍグアニジン塩酸（
ｐＨ７，４）で溶出した。溶出液をただちにＰＢＳｐＨ
７，６で３回透析して、新規プラスミン阻害蛋白を精製
した。この精製した新規プラスミン阻害蛋白について５
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ったところ
、第７図に示すように単一バンドであり、分子量的６７
、０００〜７０．０００であることを確認した。

さらにこの精製した新規プラスミン阻害蛋白１０μｇを
用い、アミノ末端側からのアミノ酸配列を、プロティン
シーケンサ−４７７Ａ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅａ
ｃｅｒ４７７Ａ）及びＰＴＨアナライザー１２ＯＡ（Ｐ
ＴＨＡｎａｌｙｚｅｒ　１２０Ａ）　（ともにアブライ
ドバイオシステムズ社製）により解析しな。その結果を
表１に示す。

表　　１ 実施例９ 実施例８で精製した新規プラスミン阻害蛋白或いは血漿
α２Ｐ１１μｇにあらかじめ３７℃で３０分間インキュ
ベートしたプラスミノーゲン０．０２５ユニツトとウロ
キナーゼ０．０３１ユニツトの混合液を加え、液量を４
０μｍとした。このうち１０μｍをフィブリンプレート
（第一化学薬品■製）にのせた。

フィブリンプレートは３７℃、湿度９５％以上の条件下
で１８時間靜１し、溶解した面積を測定した。また、α
２ＰＩのリアクティブサイト近傍を認識して結合し、α
２ＰＩ活性を阻害するモノクローナル抗体ＪＴＰＩ−１
２，５μｇと新規プラスミン阻害蛋白或いは血漿α２　
Ｐ　Ｉ　１μｇとの混合液２０μｇを３７’Ｃで３０分
間インキュベートした後、あらかじめ３７℃で３０分間
インキュベートしておいたプラスミノーゲン０．０２５
ユニツトとウロキナーゼ０．０３１ユニツトの混合液２
０μｐを加え、液量を４０μｍとした。このうちｌＯμ
ｐをフィブリンプレートにのせ、３７℃、湿度９５％以
上の条件下で１８時間靜１し、溶解した面積を測定した
。これらの結果を表２に示す。

表　　２ 実施例１０ 新　プラスミン阻害蛋白のプラスミン阻害活性（ＩＦ） 実施例８で精製した新規プラスミン阻害蛋白溶液（７，
１４μｏ＋ｏｌ　／ｌ　）　３ｔｔｌとプラスミン溶液
＜　０．０３カゼイン　ユニット／１　）　１００μｐ
とトリス緩衝液（トリス０．０５　ｍｏｌ／Ｎ　、Ｎａ
Ｃｌ　Ｏ，１４ｍｏｌ／ｆｌ　ｐＨ７，６）　４００μ
ｍとを混合し０秒、３０秒、１分、３分、５分、１５分
、及び３０分後、ε−アミノカプロン酸（０，１ｍｏｌ
　／ｌ　）　５０μｊ！及びＳ−２２５１（３，４ｍｍ
ｏ　Ｉ　／ρ；第一化学薬品）１００μｍを加え、残存
プラスミンによる基質分解の程度を分光光度計ＤＯ−６
４（ベックマン　インスティテユート）によって測定し
た。その結果を第８図に示した。新規プラスミン阻害蛋
白と、血漿α２ＰＩとはほぼ同等のプラスミン阻害活性
を示した。

実施例１１ ｉ区Ｏユニ上皿罠北 血漿由来のα２ＰＩ及び新規プラスミン阻害蛋白の１２
５Ｉ標識化は、１ａｃｔｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、　ｇ
ｌｕｃｏｇｅｏｘｉｄａｓｅを固相化したビーズ（Ｅｎ
ｘｙｍｏｂｅａｄ；　Ｂｉｏ−Ｒｅｄ）とＮａ　１２’
Ｉ　（１３ｍ　Ｃｉ／μｇ　　；　Ａｍｅｒｓｈａｍ）
を用いて、Ｍｉｍｕｒｏ　Ｊ、らの方法（Ｍｉｍｕｒｏ
、　Ｊ、ら；Ｊ。

Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７７、１００６−１０１
３　（１９８６）を参照）に従っておこなった。

血漿由来のα２Ｐ１１００μｇ及び本発明の新規プラス
ミン阻害蛋白３６μｇを各々０．５ｍＣ１のＮａ１２５
■存在下、Ｅｎｘｙｍｏ−ｂｅａｄ、　０．１％β−Ｄ
−Ｇｌｔ＋ｃｏｓｅを室温、３０分反応させて１２５Ｉ
を取り込ませた。反応は１０％ＮａＮ５を５μｇ加えて
停止させた０反応液をＰＤ−１０カラム（ファルマシア
）にかけ、０．５ｍｌずつフラクションに分けた。各フ
ラクションのうち１μ」をγ−カウンターにかけてγ線
の量を定量した。また各フラクションの蛋白量は２８０
ｎｍにおける吸光度を測定して求めた。

その結果、０．７０μＣｉ／μｇの比放射活性の血漿α
２ＰＩを４７μｇ得た。また、１．９２μＣｉ／μｇの
比放射活性の新規プラスミン阻害蛋白を１２．５μｇ得
た。

実施例１２ フィブリンへの架　結合能の測　（Ｉ）血漿由来α２Ｐ
Ｉ及び本発明の新規プラスミン阻害蛋白のフィブリンへ
の架橋結合能の測定は、Ｍｉｍｎｒｏ　Ｊ、らの方法（
Ｍｉｍａｒｏ、　Ｊ、ら；　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、　７７．１００６−１０１３　（１９８
６）を参照）に従っておこなった。２５０μｇのフィブ
リノーゲン、０．６μｇの１２５Ｉ標識化した新規プラ
スミン阻害蛋白或いは１２５１１１ｉ１化した血漿α２
ＰＩ、及び１ユニツトのアプロチニンの混合液８５μｐ
に５μｍの塩化カルシウム（５０ｍＭ＞　、１０μｍの
トロンビン溶液（２ｈ、／ｍｌ）を加えて凝固を開始さ
せた。３７’Ｃで５分、３０分、６０分或いは１２０分
インキュベートし、０．２ＭＥＤＴＡ液１００μρを加
え、反応を停止させた。竹ぐしでよくほぐし、２ｍＭＭ
ＥＤＴＡ、ＩＩＩＩＭイオドアセトアミドを含む５０ｍ
Ｍ　）リス緩衝生理食塩水（以下ＴＢＳと略すことがあ
る）１ｍｌで３回よく洗浄し、凝固物をγカウンターに
てγ線の量を測定した。その結果を第９図に示す。新規
プラスミン阻害蛋白のフィブリンへの架橋結合能は、血
漿α２ＰＩのそれの２５〜４０％であることが判った。

実施例１３ フィブリンへの架橋結合能の測　（ｆｆ）実施例１２の
方法に準じ、血漿をフィブリノーゲン源として、同様の
実験をおこなった。６０ｕｇの正常ヒト血漿、０．６μ
ｇの１２５Ｉ標識化した新規プラスミン阻害蛋白或いは
１２５ＩＷＡ識化した血漿α２ＰＩ、及び１ユニツトの
アプロチニンの混合液８５μｍに５μρの塩化カルシウ
ム（５０ｍＭ）、１０μｍのトロンビン溶液（２０ｕ、
／ｍｌ＞を加えて凝固を開始させた。３７℃で５分、３
０分、６０分或いは１２０分インキュベートし、０．２
ＭＥＤＴＡ液１００μｇを加え、反応を停止させた。竹
ぐしでよくほぐし、２ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭイオドアセ
トアミド倉含む５０ｍＭＴ　Ｂ　Ｓ　１　ｍｌで３回よ
く洗浄し、凝固物をγカウンターにてγ線の量を測定し
な。その結果を第１０図に示す。新規プラスミン阻害蛋
白のフィブリンへの架橋結合能は血漿α２ＰＩのそれの
２０〜２２％であることが判った。

実施例１４ フィブリンへの架橋結合能の判定（ＩＩＩ＞実施例１２
．１３の方法に準じ、α２ＰＩ除去血漿をフィブリノー
ゲン源として、同様の実験をおこなった。α２ＰＩ除去
血漿は抗α２ＰＩモノクロ一ナル抗体固定化カラムに血
漿をかけ、素通りした血漿を用いた。α２ＰＩ除去血漿
中のα２ＰＩ量は０．１μｇ　／　ｍｌ以下であること
を確認した。

６０ｕｇのα２ＰＩ除去血漿、０．６μｇの１２５■標
識化した新規プラスミン阻害蛋白或いは１２５■標識化
した血漿α２　Ｐ　Ｉ　、及び１ユニツトのアプロチニ
ンの混合液８５μｐに５μｇの塩化カルシウム（５０ｍ
Ｍ）　、１０ＡｔＪｌのトロンビン溶液（２ｈ、／ｍｌ
）を加えて凝固を開始させた。　０．２１１ＥＤＴＡ液
１００μｍを加え、反応を停止させた。竹ぐしでよくほ
ぐし、２ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭイオドアセトアミドを含
む５０ｍＭＴ　Ｂ　３１　ｍｌで３回よく洗浄し、凝固
物をγカウンターにてγ線の量を測定した。その結果を
第１１図に示す。新規プラスミン阻害蛋白のフィブリン
への架橋結合能は血漿α２ＰＩのそれの２０〜２７％で
あることが判った。

【図面の簡単な説明】

第１図は新規プラスミン阻害蛋白の一次構造である。 第２図は新規プラスミン阻害蛋白をコードするＤＮＡ配
列の１例であり、当該蛋白のアミノ酸配列と対応させて
記されている。 第３図は、ヒトα２−プラスミンインヒビタ−染色体遺
伝子である。 第３図（１）はヒトα２−プラスミンインヒビタ−ゲノ
ム遺伝子のイントロン−エクソンを示したものであり、
１０個のエクソンは四角で示した。 第３図（２）はヒトα２−プラスミンインヒビタ−ゲノ
ム遺伝子の制限酵素地図である。各記号は次の制限酵素
を示す。Ｂ　；ＢａｍＨＩ　、　Ｄ　；Ｄｒａ　工。 Ｅ　；　ＥｃｏＲＩ　、　Ｈ；　Ｈｉｎｄｌ［、Ｘ　；
　Ｘｈｏ　Ｉ第３図（３）は、本発明に用いるヒトα２
−プラスミンインヒビタ−ゲノム遺伝子をコードするフ
ァージクローン中の遺伝子断片を示す。第３図の（１）
〜（３）は、各々上下対応している。 第４図は発現ベクターに挿入された染色体遺伝子断片の
１例である。 第５図は、約２．２Ｋｂのヒトα２−プラスミンインヒ
ビタ−ｃＮＤＡの制限酵素地図を示すものである。黒色
部分はノンコーディング領域である。 第６図はゲノム遺伝子断片とｃＤＮＡ断片とを結合する
方法を示す。各記号は次の制限酵素を示す。Ａ；Ａｌｕ
　Ｉ、　Ｅ；ＥｃｏＲ］：、　Ｈ；Ｈｉｎｄ■、　Ｐ；
ｓｔ　Ｉ 第７図は新規プラスミン阻害蛋白の５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動のパターンを示した。分子量マー
カーはゲルトツブ側からそれぞれフォスフォリラーゼｂ
　　（１３０，０００＞、ウシ血清アルブミン（７５，
０００）　、オヴアルブミン（５０，０００）　。 カーボニックアンヒドラーゼ＜３９，０００）　、大豆
トリプシンインヒビター（２７，０００）　、リゾチー
ム（１７，０００）である。 第８図は新規プラスミン阻害蛋白のプラスミン阻害活性
を示す。横軸はインキュベーションの時間（単位二分）
を、縦軸は残存プラスミンによる基質分解の程度を４０
５ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの変化で示した。 ロー・−口はプラスミンのみの場合、Ｏ・・Ｏはプラス
ミンと血漿α２ＰＩでの系、・□・はプラスミンと新規
プラスミン阻害蛋白での系の結果を示す。 第９図、第１０図及び第１１図は新規プラスミン阻害蛋
白のフィブリンへの架橋結合能の測定結果を示す。横軸
はインキュベーション時間（単位：分）を、縦軸は添加
した１２５Ｉ標識蛋白のうちフィブリンへ架橋結合した
蛋白の割合を％で表わした。〇・〇は血漿α２　Ｐ　Ｉ
　、・は新規プラスミン阻害蛋白を示す。 第２図（その１／２） Ｐｈ　ｅＴｒｐＡｒｚＡｓ　ｎＬｙｓ　Ｐｈ　ｅＡｓ　
ｐＰｒｏ　５ｅｒＬｅｕＴｈ　ｒＧ　ｌ　ｎＡ　ｒｇＡ
ｓ　ｐｓｅ　ｒＰｈ　ｅＨｌ　ｓ　ＬｅｕＡｓ　ｐＧ　
Ｉ　ｕＴＴＣＴＧＧＡＧＯ＾＾Ｃ＾＾ＧＴＴＴＧＡＣＣ
ＣＧＡＧＣＣＴＴＡＣＣＣＡ（ｉＡＧＡ（ｉへＣＴＣＣ
ＴＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＧＡ０　６９６第２図（その
２／２） 図面の浄書 第７図 ↓ ↓ 第９図 インキュベーション時間 （分） 第１Ｏ図 （％） インキュベージコン時間 （分）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記１〜４６４のアミノ酸配列［ I ］ 【遺伝子配列があります】 を有するプラスミン阻害蛋白。 ２、前記アミノ酸配列［ I ］をコードする遺伝子断片
   。 ３、下記ＤＮＡ配列［II］をイントロンの介在又は非介
   在で有する遺伝子断片。 【遺伝子配列があります】 ４、当該遺伝子断片が第４図で表わされる染色体遺伝子
   断片と第５図で表わされるヒトα＿２−ＰＩ・ｃＤＮＡ
   のＥｃｏＲ I （ＥｃｏＲ I リンカー）部分とからなる
   ものである請求項３記載の遺伝子断片。 ５、ｐＳＶ２Ｐ I ベクター。 ６、ｐＳＶ２Ｐ I ベクターをＢＨＫ−２１（Ｃ−１３
   ）細胞に導入した細胞が産生することができる、本質的
   に式［ I ］で表わされるアミノ酸配列を有するプラス
   ミン阻害蛋白。 ７、請求項３又は４記載の遺伝子断片を含有する発現型
   ベクターによりトランスフェクトされた動物細胞を培養
   することからなる本質的に式［ I ］で表わされるアミ
   ノ酸配列を有するプラスミン阻害蛋白の製造法。 ８、細胞がＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞または
   Ｃｈａｎｇ−Ｌｉｖｅｒ細胞である請求項７記載のプラ
   スミン阻害蛋白の製造法。