JPS63164890A - 生物学的に活性な第ｘ３因子の発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、一般的に第ｘ■因子及びその類似体の製造、
そしてより詳しくは、形質転換された又はトランスフェ
クトされた宿主細胞中における生物学的に活性な第ＸＩ
ｊｌ因子及びその類似体の発現に関する。

〔従来の技術〕

血液凝固は、最終的にフィブリンクロットを生じさせる
種々の血液成分又は因子の複雑な相互反応から成る過程
である。一般的に、凝固“カスケード°′と称される現
象に関与する血液成分は、プロ酵素又はチモーゲン、す
なわち活性化因子すなわち活性化された凝固因子自体の
作用によってタンパク質分解酵素に転換される酵素的に
不活性なタンパク質である。そのような転換を受けた凝
固因子は、−ｉ的に“活性化された因子”と称され、そ
して小文字“ａ”の付加によって命名される（たとえば
ＸＩＩｒａ）。

血液凝固系の１つの成分は、第ＸＩＩ［因子（まな、フ
ィブリン安定化因子、フィブリノリガーゼ又は血漿トラ
ンスグルタミナーゼとして知られる）、すなわちプロ酵
素として血液中に循環する血漿糖タンパク質である。血
液凝固の最終段階の間、トロンビンは、第Ｘ■因子のプ
ロ酵素形を中間体形に転換し、次にこれはカルシウムイ
オンの存在下で解離して第Ｘｌ［因子と命名される酵素
の活性形をもたらす、トロンビンはγ−二量体化、次い
てα−多量体化を通してフィブリンの重合を触媒して非
共有的フィブリンクロットを生じさせ、このものは第ｘ
ｍａ因子によって相当な機械的強度の架橋されたクロッ
トに転換される（Ｒ，Ｃｈｅｎ　＆　Ｒ，Ｆ。

Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、
ｓｃｉ、［Ｊｓ＾６Ｂ＋４７２〜４７９ページ、１９７
０　；　Ｊ、Ｊ、Ｐｉｓａｎａなど、、＾ｎｎ、Ｎ、Ｙ
、＾ｃａｄ　。

Ｓｃｉ、　２０２　：　９８〜ｌ１３ページ、１９７２
）、第ＸＩ［ａ因子は、分子間ε（γ−グルタミル）リ
ジン結合の形成を通してフィブリンポリマーの架橋を触
媒するトランスグルタミナーゼである。この架橋反応は
、カルシウムイオンの存在を必要とする（Ｌ、Ｌｏｒａ
ｎｄなど、。

Ｐｒｏ　、Ｈｅｍｏｓｔ、Ｔｈｒｏｍｂ、　’ｑ：　２
４５〜２９０ページ、１９８０　。

Ｊ、Ｅ、Ｆｏｌｋ及びＪ、Ｓ、Ｆｉｎｌａｙｓｏｎ、＾
ｄｖ、Ｐｒｏｔ、Ｃｈｅｍ、］　：１〜１３３ページ、
１９７フ）。

！＞ｅＭで、第ｘｍａ因子は、他のタンパク質分子間の
架橋反応を触媒する。たとえば、第Ｘｌｌ１ａ因子はま
た、α２−プラスミン阻害因子及びフィブロネクチンへ
のフィブリンのγ鎖の架橋、並びに創傷の治癒に関係さ
れるコラーゲン及びフィブロネクチンの架橋も触媒する
（Ｙ、５ａｋａｌａ及びＮ、＾ｏｋｉ、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、
Ｉｎｖｅｓｔ、　６５　：　２９（１−２７９ページ、
１９８０　；　Ｄ、Ｆ、Ｍｏ５ｈｅｒ、Ｊ、Ｂｉｏｌ　
、Ｃｈｅｍ、　２５０　：　６６１４〜６６２１ページ
、１９７５　；　Ｄ、Ｆ、Ｍｏ５ｈｅｒ及びＰ、Ｅ、Ｃ
ｈａｄ、Ｊ、ＣＩ　ｉｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、　６４　：　７８Ｌ　〜７８７ページ、
１９７９　；　Ｆｏｌｋ及びＦｉｎｌａｙｓｏｎ、肛Ｌ
；　Ｌｏｒａｎｄなど、、Ｘ）、フィブリンの網状構造
中へのα２−プラスミン阻害因子の共有結合的な導入は
、溶解に対するクロットの耐性を高めることができる（
Ｌｏｒａｎｄなど、、前ｌυ。

血漿中において、第Ｘｌｌ１ａ因子のための最良のアミ
ノ基供与体及びアミノ基受容体は、それぞれα２−プラ
スミン阻害因子及びフィブリンである（Ｔ、Ｔａｍａｋ
ｉ及びＮ、＾ｏｋｉ、Ｊ、Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｍ、　２５
ヱ：　１４７８７〜１４７７２ページ、１９８２　；　
Ｆ、Ｃａｒｍａｓｓｉ及びＳ、ｒ、Ｃｈｕｎｇ。

ヒ組ゴ」≦μ山！国６：２８１〜２８５ページ、１９８
３）。

第Ｘ■因子又はα２−プラスミン阻害因子のいづれかの
矢先は、これらの個体における初期の止血は正常である
けれども、“遅延された出血”をもたらす（Ｌｏｒａｎ
ｄなど、、藷〉、従って、プラスミンによる消化からの
フィブリンクロットの保護における第ｘ■因子及びα２
−プラスミン阻害因子の両者のための役割が示唆される
。

第Ｘ■因子（Ｍｒ＝約３２０ＫＤ）のチモーゲンは、フ
ィブリノーゲンとの複合体として血液中を循環する（Ｃ
、Ｓ　、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ及びＨ１＾、５ｈｕｍａｎ
、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

翻ヱ：　６０９６〜６１０１ページ、１９８２）、第ｘ
ｍ因子は、２個のａサブユニット（Ｍｒ＝約７５Ｋ［ｌ
）及び２個のｂサブユニット（Ｍｒ＝約８０ＫＤ）から
成るテトラマー（ａ２ｂ２）である（Ｓ、１．Ｃｈｕｎ
ｇなど、、Ｊ、Ｂｉｏｌ　、Ｃｈｅｍ。

世：９４０〜９５０ページ、１９７４）、　ａサブユニ
ットは酵素の触媒部位を含み、そしてｂサブユニットは
、ａサブユニットを安定化し、又は第Ｘ■因子の活性化
を調節するように思われる（Ｆｏｌｋ及びＦ　ｉｎ　Ｉ
　ａｙｓｏｎ　。

前記；　Ｌ、Ｌｏｒａｎｄなど、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂ
ｉｏ　ｈ　ｓ、Ｒｅｓ、ｃｏｍｒａ。

５６　：　９１４〜９２２ページ、１９７４）。第Ｘｌ
ａ因子への第Ｘ■因子の活性化の間、トロンビンによる
切断は、ａサブユニットのそれぞれのアミノ末端から活
性化ペプチド（Ｍｒ　＝４ＫＤ）の開放をもたらす（Ｓ
ｃｈｍａｒｔｓなど、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２
４旦：　１３９５〜１４０７ページ、１９７３）。その
活性化ペプチド及び触媒部位を含むａｍの領域のアミノ
酸配列はすでに決定されている（Ｔ、Ｔａｋａｇｉ及び
Ｒ，Ｆ、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

１３　：　７５０〜７５６ページ、１９７４　；　Ｊ、
Ｊ、Ｈｏ１ｂｒｏｏｋなど、。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、　１３５　：　９０１〜９０３ペ
ージ、１９７３）　。

第Ｘ■因子を欠失する患者のための現在の治療実施は、
一般的に血漿又は血漿誘導体もしくは粗胎盤第Ｘ■因子
濃縮物による代替治療である（Ｌｏｒａｎｄなど、　＋
　ｆｉ　；　Ｆｒｏｂ　１ｓｃｈなど、、Ｄｔｓｃｈ、
Ｈｅｄ。

Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ、　９７　：　４４９〜５０２ペ
ージ、１９７２　；Ｋｕｒａｔｓｕｊｉなど、、　Ｈａ
ｅｍｏｓｔａｓｉｓ　１１　：　２２９〜２３４ページ
、１９８２）　、この濃縮物は、出発原料として比較的
多量の種々のヒト血漿又は胎盤組織の使用を必要とする
。さらに、プールされたヒト胎盤組織から得られた濃縮
物がウィルス及び他の汚染物を含まないことを確認する
ことは困難である。さらに、多量の胎盤第Ｘ■因子の濃
縮物の精製は難かしく且つ費用がかかる。

最近、第Ｘ■因子濃縮物は、手術後の創傷の治癒におけ
る障害（Ｍｉｓｈｉｍａなど、１叶亘μ工５５　：　８
０３〜８０８ページ、１９８４　；　Ｂａｅｒなど、、
Ｚｅｎｔｒａｂｌ　、Ｃｈｉｒ。

１０５　：　８４２〜６５１ページ、１９８１）及び硬
皮症（Ｄｅｌｂａｒｒｅなど、、Ｌａｎｃｅｔ　２−：
　２０４ページ、１９８１）を有する患者に使用されて
来た。さらに第ＸＩＩＩ因子は、組織癒着剤の成分とし
て使用され（アメリカ特許第４．４１４，９７６号；第
４，４５３，９３９号；第４，３７７．５７２号；第４
，３６２，５６７号及び第４，２９８，５９８号）、そ
して手術後の出血の防止のための抗フィブリン溶解治療
に、及びクモ膜下出血、潰瘍性大腸炎及び一般的な創傷
の治癒の処置に使用するために提案されて来た。ヒト第
Ｘ１ｌｒ因子調製物のこれらの可能性ある適用は、組換
え第Ｘ■因子の生成に対してさらに刺激を与える。

従って、比較的多量の第Ｘ■因子の純粋な調製物を生成
する方法が当業界において必要である。

本発明は、組換えＤＮＡ技法の使用によりこの必要性を
満たし、その結果ウィルス汚染の問題を取り除き、そし
て同時に、第Ｘ■因子を欠失する患者及び他のものを治
療するために活性第ＸＩ因子の一貫した、均質の且つ経
済的な入手源を提供する。

以下余白 〔発明の開示〕 手短に言えば、本発明は、第Ｘ■因子と実質的に相同な
生物学的活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配
列を開示する。より詳しくは、第Ｘ■因子のａ、ａ’及
びｂサブユニットに機能的に類似するポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列が開示される。さらに、転写プロモ
ーター、及び続いてその下流にヒト第Ｘ■因子と実質、
的に同じ生物学的活性を有するタンパク質をコードする
ＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクターもまた開示される
。プロモーターの後のＤＮＡ配列は、第Ｘ■因子のａ、
ａ’又はｂサブユニットに機能的に類似するポリペプチ
ドをコードすることができる。

転写プロモーター、及び続いてその下流にヒト第Ｘ■因
子と実質的に同じ生物学的活性を有するタンパク質をコ
ードするＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクターによりト
ランスフェクトされた宿主細胞もまた開示される。その
宿主細胞は、原核宿主細胞又は真核宿主細胞、酵母宿主
細胞及び哺乳類の宿主細胞であることができ、そして特
に真核宿主細胞が好ましい。

本発明のもう１つの観点は、第ＸＩ［Ｉ因子と実質的に
同じ生物学的活性を有するタンパク質を生成するための
種々の方法を開示する。これらの方法の１つにおいては
、第Ｘ１ｌｌ因子のａサブユニットに機能的に相同なポ
リペプチドをコードするＤＮＡ配列が第一の宿主細胞に
導入され、そして第ＸＩＩＩ因子のｂサブユニットに機
能的に相同なポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が第
二の宿主細胞に導入される０次に、宿主細胞は培養され
、そしてａサブユニット及びｂサブユニットが第−及び
第二の宿主細胞から単離される。続いて、ａ及びｂサブ
ユニットは二量体化され、ａ２及びｂ２ホモダイマーが
形成され、そしてそのホモダイマーはａ２ｂ２テトラマ
ーを形成するために組合わされ、そして該テトラマーは
、第Ｘ■因子と実質的に同じ生物学的活性を有する。そ
のようなタンパク質を調製するもう１つの方法は、第Ｘ
■因子のａサブユニットと機能的に相同なポリペプチド
をコードするＤＮＡ配列を第−宿主細胞中に導入し、そ
して第Ｘ■因子のｂサブユニットと機能的に相同なポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ配列を第二宿主細胞中に導
入することを含んで成る。その第−及び第二宿主細胞が
培養され、そしてａ２及びｂ２のホモダイマーが前記宿
主細胞から単離され、そして続いて、ａ２ｂ２テトラマ
ーを形成するために組合わされ、そして該テトラマーは
、第Ｘ■因子と実質的に同じ生物学的活性を有する。

本発明のもう１つの観点においては、カルシウムの存在
下での解離に基づいて、第ＸＩＩＩａ因子と実質的に同
じ生物学的活性を有するタンパク質を調製するための方
法が開示される。１つのそのような方法においては、第
Ｘ■因子のａ′サブユニットと機能的に相同なポリペプ
チドをコードするＤＮＡ配列が第一宿主細胞に導入され
、そして第Ｘ■因子のしサブユニットと機能的に相同な
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が第二宿主細胞中
に導入される。次に、その第−及び第二宿主細胞は培養
され、そしてａ′サブユニット及びｂサブユニットがそ
れぞれ第−及び第二宿主細胞から単離される。次に、ｄ
′及びｂサブユニットは二量体化され、ａ′２及びｂ２
ホモダイマーが形成され、そしてそのホモダイマーは、
ａ’ｚｂｚテトラマーを形成するために組合わされ、そ
して該テトラマーは、解離に基づいて、第ＸＩＩＩａ因
子と実質的に同じ生物学的活性を有する。この事に関す
る他の方法は、第Ｘ■因子のａ′サブユニットと機能的
に相同なポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を第一宿
主細胞に導入し、そして第Ｘ１ｌｌ因子のｂサブユニッ
トと機能的に相同なポリペプチドをコードするＤＮＡ配
列を第二宿主細胞に導入することを一般的に含んで成る
０次に、その第−及び第二宿主細胞は培養され、そして
ａ’２及びｂ２ホモダイマーが前記宿主細胞から単離さ
れる。次に、ａ’ｚ及びｂ２ホモダイマーは、ａ’２ｂ
２テトラマーを形成するために組合わされ、そして該テ
トラマーは解離後に、第ＸＩＩＩａと実質的に同じ生物
学的活性を有する。この事に関するもう１つの方法は、
第Ｘ■因子のａ′サブユニットと機能的に相同なポリペ
プチドをコードするＤＮＡ配列を第一宿主細胞に導入し
、そして第Ｘ■因子のしサブユニットと機能的に相同な
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を第二宿主細胞中
に導入することを一般的に含んで成る０次に、その第−
及び第二宿主細胞は培養され、そしてａ’ｚ及びｂ２ホ
モダイマーが前記宿主細胞から単離される０次に、ａ’
２及びｂ２ホモダイマーは、ａ’２ｂ２テトラマーを形
成するために組合わされ、そして該テトラマーは、解離
後に、第ＸＩ［ａ因子と実質的に同じ生物学的活性を有
する。

本発明のさらにもう１つの観点は、活性化後に第ｘ■、
因子と実質的に同じ生物学的活性を有するタンパク質を
調製するための方法を開示する。

１つのそのような方法においては、転写プロモーター、
及び続いてその下流に第ＸＩ因子のａサブユニットと機
能的に相同なポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含
んで成る発現ベクターが宿主細胞中に導入される。続い
て、その宿主細胞は適切な条件下で培養され、そしてａ
サブユ、ニットがその宿主細胞から単離される０次に、
そのようにして単離されたａサブユニットがａ２ホモダ
イマーを形成するために二量体化される。この事に関す
るもう１つの方法は、転写プロモーター、及び続いてそ
の下流に第Ｘ■因子のａサブユニットと機能的に相同な
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んで成る発現
ベクターを宿主細胞中に導入することを一般的に含んで
成る。次に、その宿主細胞は適切な条件下で培養され、
そしてａ２ホモダイマーが前記宿主細胞から単離される
。

活性化後に第ＸＩＩＩａ因子と実質的に同じ生物学的活
性を有するタンパク質を調製するためのもう１つの方法
は、前記宿主細胞から前記タンパク質を分泌することで
ある。１つのそのような方法においては、転写プロモー
ター、及び続いて下流に第Ｘ■因子のａサブユニットと
機能的に相同なポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と
読み枠を合わせて融合されたシグナルペプチドをコード
するＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクターが宿主細胞中
に導入される。続いて、その宿主は適切な条件下で培養
され、そして培地中に分泌されるａサブユニットがその
培養培地から単離される０次にそのようにして単離され
たａサブユニットがａ２ホモダイマーを形成するために
二量体化される。この事に関するもう１つの方法は、転
写プロモーター、及び続いてその下流に第Ｘ■因子のａ
サブユニットに機能的に相同なポリペプチドをコードす
るＤＮＡ配列と読み枠を合せて融合されたシグナルペプ
チドをコードするＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクター
を宿主細胞中に導入することを一般的に含んで成る０次
に、その宿主細胞は適切な条件下で培養され、そして該
宿主細胞から分泌されるａ２ホモダイマーが前記培養培
地から精製される。

本発明のもう１つの観点は、第ｘｍ＆因子と実質的に同
じ生物学的活性を有するタンパク質を調製するための方
法を開示する。１つのそのような方法においては、転写
プロモーター、及び続いてその下流に第Ｘ■因子のａ′
サブユニットと機能的に相同なポリペプチドをコードす
るＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクターが宿主細胞中に
導入される。続いて、その宿主細胞は適切な条件下で培
養され、そしてａ′サブユニットが前記宿主細胞から単
離される０次に、ａ′サブユニットは二量体化され、ａ
′２ホモダイマーが形成される。そのようなタンパク質
を調製するための類似する方法は、転写プロモーター、
及び続いてその下流に第Ｘ■因子のａ′サブユニットに
機能的に類似するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
を含んで成る発現ベクターを宿主細胞中に導入すること
を一般的に含んで成る０次に、その宿主細胞は適切な条
件下で培養され、そして　Ｆ２ホモダイマーが前記宿主
細胞から単離される。本発明のさらにもう１つの観点に
おいては、活性化後に第ｘｍ、因子と実質的に同じ生物
学的活性を有するタンパク質を調製するための方法が開
示される。１つのそのような方法においては、転写プロ
モーター、及び続いてその下流にある第Ｘ■因子のａ′
サブユニットと機能的に相同なポリペプチドをコードす
るＤＮＡ配列並びに転写プロモーター及び続いてその下
流にある第ｘ■因子のｂサブユニットと機能的に相同な
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んで成る発現
ベクターが宿主細胞中に導入される。続いて、その宿主
細胞は適切な条件下で培養され、そしてタンパク質が前
記宿主細胞から単離される。

簡単に上に記載された方法により生成されたタンパク質
を開示する他に、本発明はまた０、簡単に上に記載され
た方法のそれぞれにより生成された有効量のタンパク質
及び生理学的に許容されるキャリヤー及び希釈剤を含ん
で成る種々の医薬組成物にも向けられる。

本発明の他の観点は、次の詳細な説明及び添付図面によ
り明らかになるであろう。

〔発明実施のための最良の態様〕 本発明を説明する前に、本発明の理解を助けるよう以下
で用いる所定の用語の定義の説明を行なう。

１に笠昨副　：生物学的情況において（すなわち、生物
体中でまたはインビトロ複写において）分子によって行
なわれる１つの機能または一連の複数の機能、タンパク
質の生物学的活性は触媒活性とエフェクター活性とに分
けることができる。

凝固因子の触媒活性は一般に、前駆体の特異的開裂を介
する他の因子の活性化を含んでいる。エフェクター活性
は、カルシウムもしくは他の低分子、高分子例えばタン
パク質、または細胞への生物学的に活性な分子の特異的
結合を含んでいる。エフェクター活性は生理的条件下で
触媒活性を増大させ、または該活性のために必須である
。触媒活性およびエフェクター活性はある場合にはタン
パク質の同じドメイン内に存している。

前記のように、ヒト第Ｘ■因子の生物学的活性は、分子
間Ｅ（γ−グルタミル）リジン結合の形成を介してフィ
ブリンポリマーを架橋することによって血餅を安定化す
る能力によって特徴付けられる。第Ｘ■因子は、フィブ
リンを他の分子、例えばα２−プラスミン阻害剤に架橋
することもできる。チモーゲンは、４つのサブユニット
、すなわち２つのａサブユニットおよび２つのしサブユ
ニットからなる四量体であり、これらのサブユニット非
共有的相互作用によって結合している。鏡開ジスルフィ
ド結合はａサブユニットに不存在であろうが、ｂサブユ
ニットは２０の鎖内ジスルフィド結合を含んでいるもの
“と思われる。

第ＸＩＩ［因子は２段階反応を介して活性化される。

最初に、トロンビンが各ａサブユニットのアミノ末端か
ら短ペプチド（活性化ペプチド）を開裂して、構造ａ’
２ｂｚを生ずる。この中間構造物はカルシウムイオンの
存在下に解離して、不活性ｂ２サブユニットおよび触媒
ａ　’ｚサブユニットを生ずる〔アール、ディー、クー
ク（Ｒ，Ｄ、Ｃｏｏｋｅ）　、バイオケム、ジェイ−（
Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、）　１４１　：　６８３−６９１
頁、１９７４年〕。ｂサブユニットは、ａサブユニット
を保護しまたは安定化すると考えられており、血漿中に
過剰に存在する。ａ２サブユニットは巨核球、血小板、
胎盤、子宮、牌臓、前立腺およびマクロファージ内に見
い出されている〔ニス、アイ、チャン（Ｓ　、　１．Ｃ
ｈｕｎｇ）前掲；ティー、エイチ、キーセルパック（Ｔ
、Ｈ，Ｋｉｅｓｓｅｌｂａｃｋ）およびアール、エイチ
、ワグナ−（Ｒ，ＨＪａｇｎｅｒ）、アン、エヌ、ワイ
。

アカド、サイ、（八ｎｎ、Ｎ、Ｙ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、
）　２０２　：　３１８〜３２８頁、１９７２年；ビー
、ヘンリクソン（Ｐ、１Ｉｅｎｒｉｋｓｓｏｎ）等、ジ
ェイ、タリン、インヴエスト、　（Ｊ、Ｃｌ１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、）７６　：　５２８〜５３４頁、１９８
５年：エル、ムズベク（Ｌ、Ｍｕｓｚｂｅｋ）等、トロ
ンブ、リス、　（Ｔｈｒｏｍｂ、Ｒｅ５）旺：４０１〜
４１０頁、１９８５年〕、年回。のｂサブユニットは、
注入された血漿中の胎盤第Ｘ■因子を安定化するように
思われる。

第Ｘ■のａサブユニットもｂサブユニットも、本明細書
に記載する努力前には、他の当業者による配列決定は十
分になされていなかった。ａサブユニットから放出され
る活性化ペプチドの配列、ならびにａサブユニットの触
媒部位の周囲領域のアミノ酸配列は既に報告されている
〔タカギ（Ｔａｋａｇｉ）およびトウーリットル（Ｄｏ
ｏｌｉｔｔｌｅ）　、前掲；ホルブルック（Ｈｏｌｂｒ
ｏｏｋ）等、前掲〕。第ｘ■因子のｂサブユニットにつ
いて既に得られている唯一のアミノ酸配列情報はアミノ
末端配列Ｇｌｕ−Ｇｌｘ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏである（タカ
ギおよびトウーリットル、前掲）。従って、第Ｘ■因子
は他の血液凝固因子と比べ極めて不十分な特徴付けがな
されているに過ぎない。結果として、第Ｘ■因子をコー
ドする遺伝子についてはほとんど知られていない。

本発明は、ヒト第Ｘ■因子のａ、ａ’およびｂサブユニ
ットと機能的に相同であるポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列を開示する。ヒト第Ｘ■因子の完全なｄおよび
ｂサブユニットおよび該ａおよびｂサブユニットの対応
するアミノ酸配列を開示スる。ａサブユニットはジスル
フィド結合を欠いており、そして存在するとしても炭水
化物の含量は極めてわずかである。さらに、第Ｘ■因子
の翻訳後の１つの変形はａｍのアミノ末端のアセチル化
である。生物学的に活性な第Ｘ■因子は原核細胞ならび
に真核細胞において発現され得る。

ヒト第ｘ■因子ｃＤＮＡは、メツセンジャーＲＮＡの適
当な供給源から調製されたヒトｃＤＮＡライブラリーか
ら単離することができる。ａサブユニットｍＲＮＡの１
つの供給源はヒト胎盤細胞である。この供給源からのｃ
ＤＮＡライブラリーは、ヒト第Ｘ■因子のａサブユニッ
トに対してアフィニティー精製された抗体を用いて、お
よび／または活性化ペプチドのアミノ酸配列に相当する
オリゴヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングす
ることができる。ｂサブユニットｍＲＮＡの好ましい供
給源はヒト肝臓ｍＲＮＡである。

この供給源からのｃＤＮＡライブラリーは、ヒト第Ｘ■
因子のａサブユニットに対してアフィニティー精製され
た抗体を用いてスクリーニングすることができる。この
スクリーニング手順を介して不完全なｃＤＮＡクローン
が固定される場合には、部分的クローンの５′末端また
は３′末端を用いてｃＤＮＡライブラリーを再スクリー
ニングすることが望ましいことがある。

本発明の１態様において、第Ｘ■因子のアミノ酸配列内
のシスティンをセリンに換えるのが望ましい場合がある
。遊離のスルフヒドリル基の存在は第Ｘ■因子の酸化を
導き、従ってタンパク質の望ましくない不安定性を惹起
することがある。−最に、システィンは、例えばシラー
（Ｚｏｌｌｅｒ）等によって記載されているように、オ
リゴヌクレオチド指令部位特異的変異誘発を用いてセリ
ンと置換することができる〔マニュアル・フォー・アド
バンスト・テクニクス・イン・モレキュラー・クローニ
ング・コース（Ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒ　Ａｄｖａｎｃｅ
ｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｃｏｕｒｓｅ）、コールド・スプリン
グ・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９８３年；
シラー（Ｚｏｌｆｅｒ）およびスミス（Ｓｗｉｔｈ）、
ＤＮＡ３：４７９〜４８８頁、１９８４年；クンケル（
Ｋｕｎｋｅｌ）等、ブロク、ナトル、アカド、サイ、ニ
ーニスニー（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、
Ｕｓ八）８２　：　４８８〜４９２頁、１９８５年）、
ＤＮＡ配列内に多型性の相違が存在することがあるので
、本明細書に記載の配列は１つの対立遺伝子の例を与え
るものである。しかしながら、これらの多型性の差違は
なお、第Ｘ■因子のａ、ａ’およびｂサブユニ・ｙトに
機能的に相同なポリペプチドをもたらすことに留意され
たい。細胞質タンパク質のアミノ末端セリン残基をアセ
チル化する酵母細胞の能力によりおよびａｉのジスルフ
ィド結合の数が少ないことにより、第Ｘ■因子のａ鎖は
酵母宿主細胞中に細胞質的（分泌されるのではなく）に
生成され得る。

しかしながら、酵母宿主細胞からの第ＸＩ［Ｉ因子ａサ
ブユニットの分泌はタンパク質の精製を促進する。

ヒト第ＸＩ［ｒ因子のａサブユニット、ａ′サブユニッ
トまたはｂサブユニットに機能的に相同であるポリペプ
チドをコードする全長ＤＮＡ配列が得られた後、このＤ
ＮＡ配列を適当な発現ベクター中に挿入する。本発明の
実施に有用な発現ベクターはさらにａ、ａ’またはｂポ
リペプチドをコードするＤＮＡ配列に作用可能に連結さ
れたプロモーターを含んでいる。この発現ベクターはさ
らに、選択された宿主細胞に応じて、複製起点、ならび
に発現レベルを調節しそして／または高めるヌクレオチ
ド配列を含んでいることが好ましい。適当な発現ベクタ
ーは、プラスミドまたはウィルスから誘導することがで
きるか、または両者の要素を含んでいることができる。

適当なベクターの選択およびそれらベクターの成分のヌ
クレオチド配列は当業者に明白であろう。

ａサブユニットまたはａ′サブユニットは組換え体細胞
中でｂサブユニットと同時発現（ｃｏ−−ｅｘｐｒｅｓ
ｓ）させることができる、この目的のために、２の発現
ユニットを宿主細胞中に導入する。

発現ユニットは、異なる選択マーカーをもった異なるベ
クター上に、または好ましくは単一の発現ベクター上に
あることができる。後者の方法は、等しいコピー数の２
の発現ユニットを与えるという好都合をもたらす。

本発明を実施する際の使用において好ましい原核宿主細
胞は細菌エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
姐丘）の株であるが、他の属も使用可能である。

これらの宿主を形質転換しこれらの中でクローン化され
た外来遺伝子を発現させる技法は当業者によく知られて
いる〔例えば、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、モ
レキュラー・クローニングニア・ラボラトリ−・マニュ
アル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：＾Ｌａ
ｂｏ−ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプ
リング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒｙ）　、１
９８２年を参照されたい〕。細菌宿主中で外来遺伝子を
発現させるため使用するベクターは選択マーカー、例え
ば抗生物質耐性遺伝子、および宿主細胞内で機能するプ
ロモーターを含んでいる。適当なプロモーターとして、
ｔｒｐ　にコルス（Ｎｉｃｈｏｌｓ）およびヤノフスキ
ー（Ｙａｎｏｆｓｋｙ）、メス。

エンザイモル、　（Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ；）１０
１　：　１５５〜１６４頁１９８３年）　、ｌａｃ　（
カサダバン（Ｃａｓａｄａｂａｎ）等、ジェイ、バクチ
リオル、　（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）１４３　：　
９７Ｌ　〜９８０頁、１９８０年〕およびλフアージプ
ロモーター系〔クウィーン（Ｑｕｅｅｎ）、ジエイ９モ
ル、アプル、ジャネット（Ｊ、Ｍｏ１．＾ｐｐ１．Ｇｅ
ｎｅｔ、）ζ：１〜１０頁、１９８３年〕を挙げること
ができる。細菌を形質転換するのに有用なプラスミドと
して、ｐＢＲ３２２Ｃボリヴア−（Ｂｏｌｉｖａｒ）等
、ジーン（Ｇｅｎｅ）　２　：　９５〜１１３頁、１９
７７年）　、ｐｕｃプラスミド類〔スプリング（Ｍｅｓ
ｓｉｎｇ）、メス、エンザイモル、　（Ｍｅｔｈ、Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ、）１０１　：　２０〜７７頁、１９８３年
；ヴイエイラ（Ｖｉｅｉｒａ）およびスプリング（Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）１９　＋　２５９〜
２６８頁、１９８２年）　、ｐＣＱＶ２　（クウイーン
（Ｑｕｅｅｎ）、前掲〕およびそれらの誘導体を挙げる
ことができる。プラスミドはウィルス要素および細菌要
素の両者を含んでいることができる。

真核微生物、例えば、酵母サツカロマイセス・セレヴイ
シアエ（江匹崩μ園１蜆ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾ
サッカロマイセス・ボンベ（Ｓｃｈ　ｉｚｏｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ凹ｍｌ刈）または糸状菌〔例えば、ア
スペルギルス種（υ且肛呈ｕ土ｕｓ　ｓｐｐ、）および
ニューロスポラ種（ヒ旺坦眩１ｓｐｐ−））も本発明の
宿主細胞として使用することができる。酵母を形質転換
する技法は文獣においてよく知られており、例えば、べ
・ングス（Ｂｅｇｇｓ）　Ｃネイチ−？　−（Ｎａｔｕ
ｒｅ）２７５　：　１０４〜１０８頁、１９７８年〕に
記載されている。アスペルギルス（唇匣」」工科）種は
、公知の手順、例えば、イニルトン（Ｙｅｌｔｏｎ）等
の手順〔ブロク、ナトル、アカド、サイ、ニーニスニー
（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ。

ＵＳＡ＞８１　：　１７４０〜１７４７頁、１９８４年
〕に従ッテ形質転換することができる。適当な酵母発現
ベクターとして、ＹＲｐ７　（ストルール（Ｓｔｒｕｈ
ｌ）等、ブロク、ナトル、アカド、サイ、ニーニスニー
（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Δｃａｄ、ｓｃｉ、口Ｓ＾）７６　：　１０３５〜１０
３９頁、１９７９年〕、ＹＥｐ１３　［：ブローチ（Ｂ
ｒｏａｃｈ）等、ジーン（Ｇｅｎｅ）　８　＋１２１〜
１３３頁、１９７９年３　、ｐＪＤＢ２４８およびｐＪ
ＤＢ２１９〔ベッグス（Ｂｅｇｇｓ）　、前掲〕および
それらの誘導体を挙げることができる。このようなベク
ターは一般に選択マーカー、例えば、栄養マーカーＬＥ
Ｕ２を含んでおり、１ｅｕ２突然変異をもつ宿主株の選
択を可能にする。または、このようなベクターは選択マ
ーカーとして「必須遺伝子（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｇｅ
ｎｅ）　」　　を含んでいることができる〔カワサキ（
Ｋａｗａｓａｋ　ｉ　）およびベル（Ｂｅｌｌ）、ヨー
ロッパ特許（ＥＰ）第１７１，１４２号〕。好ましいこ
のような必須遺伝子マーカーは、シゾサッカロマイセス
・ボンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　
ｄ）のＰＯＴＩ遺伝子であり、これは富培地で培養され
たＴＰｒ欠損宿主細胞において安定なプラスミドの維持
を提供する。酵母発現ベクターにおいて有用な好ましい
プロモーターとして、酵母解糖系遺伝子（ｇｌｙｃｏｌ
ｙｔｉｃ　ｇｅｎｅｓ）からのプロモーター〔ヒトゼマ
ン（ｌＩｉｔｚｅ＋１ａｎ）等、ジエイ、パイオル、ケ
ム。

（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　２５５　：　１２０７
３〜１２０８０頁、１９８０年；アルバー（＾Ｉｂｅｒ
）およびカワサキ（Ｋａｗａｓａｋｉ）　、ジェイ１モ
ル、アブル、ジエネット（Ｊ、Ｍｏ１．＾ｐｐｌ。

Ｇｅｎｅｔ、）　Ｌ：　４１９〜４３４頁、１９８２年
；カワサキ（Ｋａｕａｓａｋ　ｉ　）、米国特許第４，
５９９，３１１号〕またはアルコールデヒドロゲナーゼ
遺伝子〔ヤング（Ｙｏｕｎｇ）等、ジェネテイック・エ
ンジニアリング・オブ・マイクロオーガニズムス・フォ
ー・ケミカルズ（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｆｏｒＣ
ｈｅｍｉｃａｌｓ）、ホレンダー（Ｈｏｌ　１ａｅｎｄ
ｅｒ）等（編）、３３５頁、プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ）
、ニューヨーク、１９８２年；アメレルくΔｍｍｅｒｅ
ｒ）、メス、エンザイモル、　（Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、＞１０１　：　１９２〜２０１頁、１
９８３年：ラッセル（Ｒｕｓｓｅ　Ｉ　ｌ　）等、ネイ
チャー（Ｎａｔｕｒｅ）廷ｉ：　６５２〜６５４頁、１
９８３年〕を挙げることができる。これに関して、とり
わけ好ましいプロモーターはＴＰＩＩプロモーター、Ｇ
ＡＬ１０プロモーターおよびＡＤＨ２−４０プロモータ
ーである。さらに、発現ベクター内に転写終結シグナル
、例えばＴＰＩＩターミネータ−を含んでいるのが好ま
しい、酵母形質転換体によって生産されたポリペプチド
の精製を促進するために、好ましくは分泌タンパク質を
コードする酵母遺伝子からのシグナル配列を、注目して
いるタンパク質に対するコード配列に連結することがで
きる。とりわけ好ましいシグナル配列はＭ　Ｆα１遺伝
子のプレープロ領域（ｐｒｅ−ｐｒｏ　ｒｅｇｉｏｎ）
である〔クルシャン（Ｋｕｒｊａｎ）およびヘルスコウ
イツ（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ）、セル（Ｃｅｌｌ）３０
　：　９３：３−９４３頁、１９８２＄　、クルシャン
（Ｋｕｒｊａｎ）等、米国特許第４．５４６，０８２号
〕、別の好ましいシグナルペプチドは、ヴオン・ヘイジ
ン（ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ）の規則〔ニール、ジェイ、
バイオケム（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）１３３　
：１７〜２１頁、１９８３年；ジェイ０モル、パイオル
。

（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）１８４　：　９９〜ＬＯ５
頁、１９８５年；ニュークレイツク・アシッズ・リス、
　（Ｎｕｃｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、）１４　：　
４６８：３−４６９０頁、１９８６年〕に従って設計さ
れた１９残基のシグナルペプチドである。

高等真核細胞も、本発明の範囲内で適当な宿主細胞とし
て働くことができる。その際、培養されな哺乳動物細胞
が好ましい、哺乳動物細胞において使用する発現ベクタ
ーは、補乳動物細胞内に導入される外来遺伝子の転写を
指令することができるプロモーターを含んでいる。とり
わけ好ましいプロモーターは、マウスのメタロチオネイ
ン−１（ＭＴ−１）プロモーター〔バルミテル（Ｐａｌ
ｍｉｔｅｒ）等、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２２２
　：　８０９〜８１４頁、１９８３年〕、またはアデノ
ウィルス２の主要後期（ｌａｔｅ）プロモーターである
。このような発現ベクター中に、ＤＮＡ配列挿入部位の
下流に位置するポリアデニル化シグナルも含めることが
できる。ポリアデニル化シグナルは、クローン化遺伝子
のそれであることができ、または異種（ｈｅｔｅｒｏｌ
ｏｇｏｕｓ）遺伝子から誘導することもできる。他の配
列、例えば、エンハンサ−およびＲＮＡスプライシング
シグナルも含めることができる０発現ベクター造成物は
当業者のレベルの範囲内にある。

次いで、クローニングしたＤＮＡ配列を、例えば、リン
酸カルシウム介在トランスフェクションによって、培養
哺乳動物細胞中に導入することができる〔ウィグラー（
Ｗｉｇｌｅｒ）等、セル（Ｃｅｌｌ）１４ニア２５頁、
１９７８年；コラ口（Ｃｏｒａｒｏ）およびビアーマン
（Ｐｅａｒｓｏｎ）、ソマット、セル・ジェネット。

（Ｓｏｍａｔ、Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔ、）７　：　６０
３頁、１９８１年；グラハム（Ｇｒａｈａｍ）およびヴ
アン・デル・ニブ（Ｖａｎ　ｄｅｒＥｂ）、ヴイロル、
　（Ｖｉｒｏｌ、）５２　：　４５６頁、１９７３年〕
。

ＤＮＡおよびリン酸カルシウムの沈殿を形成せしめ、そ
してこの沈殿を哺乳動物細胞に適用する。

一部の細胞は外来ＤＮＡを取込みそしてそれを数日間該
宿主細胞内部に維持する。これらの細胞の一部（典型的
には１０４中の約１）は異種ＤＮＡをゲノム内に組込む
、これらの組込み体を固定するなめに、一般に、選択可
能な表現型を与える遺伝子（選択マーカー）を注目の遺
伝子と共に細胞内に導入する。好ましい選択マーカーは
、薬物、例えば、ネオマイシン、ヒグロマイシンおよび
メトトレキセートに対する耐性を与える遺伝子を含んで
いる０選択マーカーは、注目の遺伝子と同時に別の発現
ベクター上で細胞内に導入することができ、または該マ
ーカーは同じ発現ベクター上で導入することができる。

別のトランスフェクション技法、例えば、エレクトロポ
レーション〔ニューマン（Ｎｅｕｍａｎｎ）等ＥＭ１３
０　Ｊ、　１：８４１〜８４５頁、１９８２年〕も使用
することができる。ｑ 組込まれた遺伝子配列のコピー数は、選択マーカーに対
する薬剤選択による増幅を介して増加させることができ
る。薬剤濃度は、各段階で耐性細胞を選択することによ
って段階的に高められる。

増加したコピー数のクローン化された配列を選択するこ
とによって、発現レベルを実質的に高めることができる
。

選択した宿主細胞を適当な培地で増殖させ、そして標準
的方法に従って組換え体第ＸＩ［［因子を単離すること
ができる。簡潔に述べれば、第Ｘ■因子をＤＥＡＥ−セ
ルロースクロマトグラフィーによって、次いでセファロ
ース−６Ｂカラム上での分画によって単離する。カラム
は、適当な綬街液、例えば、ＩＩＩＩＭεＤＴ八を含有
する５　０ｎ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｉ’、ｐＨ７，５の
！！街液によって溶離する。活性ピークを、４０％硫酸
アンモニウムによる沈殿によって濃縮する。これに代え
て、イムノアフィニティークロマトグラフィーまたはＩ
ＩＰＬｃのような方法も使用可能である。

本明細書に記載した方法によって生成したタンパク質の
１つの利用は医薬組成物としての利用である。タンパク
質を精製し常法によって製剤化し、治療すべき特定の宿
主に対して適当な濃度を提供するようにする。生理学的
に許容され得る担体または稀釈剤、例えば、滅菌水、生
理的食塩水および緩衝化された塩水も用いることができ
る。このような医薬組成物は種々の方法で投与すること
ができる。このタンパク質は組織シーラントを調製する
際にも用いることができる。

以下の例は説明のために与えるものであり、限定を目的
とするものではない。

〔実施例〕

特にことわらない限り、標準分子生物学的方法を用いた
。

制限エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＢＡＬ−
３１、およびＴ４ＤＮＡリガーゼをベセスダリサーチラ
ボラトリー（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌ
ａｂｏ−ｒａｔｏｒｉｅｓ）またはニューイングランド
バイオラボ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ
）より得た。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ）ＤＮＡポリメラーゼのクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）フ
ラグメント、細菌アルカリホスファターゼ、ＡＴＰ、デ
オキシヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチドトリホス
ファターゼ、Ｍ１３ｍｐｌＯ。

Ｍ１３ｍｐＨ、Ｍ１３ｍｐ１８　、　Ｍ１３ｍｐ１９　
、　ｐｌＪｃ９、およびｐＵｃ１９をベセスダリサーチ
ラボラトリーより得た。人胎ｆｉｃＤＮＡライブラリー
をクロンチックラボ社（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂ、Ｉ
ｎｃ、＞（パロアルト市、カルフォルニア州）より得た
。Ｎａ１２５Ｉおよび３２ｐ−ラベルヌクレオチド並び
に〔α３５Ｓ：］　ｄＡＴＰをニューイングランドニュ
ークリアー（Ｎｅｗεｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）
またはアマ−ジャム（＾ｍｅｒｓｈａｍ）より得た。正
常の人の血漿は、オレゴン州ボートランド市のパシフィ
ックノースウエストレッドクロスブラッドサービス（ｔ
ｈｅ　Ｐａｃｉｆｉｃ　Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ｒｅｓ　
Ｃｒｏｓｓ　ＢｌｏｏｄＳｅｒｖｉｃｅ）、より提供さ
れた。

第Ｘ１ｌｌ因子は、メソド・エンザイモロジー（シ匹垣
」１ｕ！りよ）４５巻、１７７〜１９１頁、１９７６年
の力−ティスおよびロランド（Ｃ，Ｇ、Ｃｕｒｔｉｓ　
ａｎｄ　Ｌ。

Ｌｏｒａｎｄ）の方法に従って人の血漿より精製した。

これをトロンビン存在下で第Ｘ１ｌｌ因子に転化し、次
いでこのトロンビンをヒルジンに不活性化した。

ａ′およびｂサブユニットはのチュン（Ｃｈｕｎｇ）ら
の方法（前掲）に従ってバイオゲルＡ　−５ｍカラムの
ゲルー過により分画された。

第Ｘ■因子のａ′サブユニットおよびｂサブユニットに
対するポリクローナル抗体はウサギ内でつくり、免疫グ
ロブリン画分を硫安分画、ＤＥＡＥ−セファデックスカ
ラムクロマトグラフィー、および固定抗原セファロース
カラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーにより
精製しな。

オリゴヌクレオチドはアプライドバイオシステム（八ｐ
ｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）　（フォスターシ
ティ、カルフォルニア）モデル３８０Δ合成機で合成し
、ポリアクリルアミドゲルで精製した。

以下余白 栗１盪［−し 人胎盤ｍＲＮＡより調製したｃＤＮＡを含むλｇｔｌ＋
発現ライブラリーをヒト第ＸＩ因子のａサブユニットに
ついてスクリーニングした。１２５■ラベルアフィニテ
ィ精製ウサギ抗体（比活性＝６×１０’ｃｐｍ／μｇ）
を用いて、　１５０■のプレートあたり１．５Ｘ１０５
個のプラークの密度でひろげたファージを含むフィルタ
ーをスクリーニングしな。６個の陽性クローンが約３Ｘ
１０’のファージをスクリーニングすることにより単離
され、各陽性ファージは精製された。

プラーク精製したクローンを以下のｆｆ２ｐ−ラベルオ
リゴヌクレオチドプローブでスクリーニングした：　”
　ＣＴＣＣＡＣＧＧＴ　ＧＧＧ　ＣＡＧ　ＧＴＣにＴＣ
ＣＴＣＧ”。

このプローブはａサブユニットの活性化ペプチド中に存
在する八Ｉａ−Ｇｌｕ−＾ｓｐ−＾ｓｐ　−Ｌｅｕ　−
Ｐｒｏ　−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕのアミノ酸配列をコ
ードにする〔タカギおよびドーリットル（Ｄｏｏｌｉｔ
ｔｌｅ）前掲〕。

このプローブのヌクレオチド配列は、多くの異なるヒト
蛋白質のアミノ酸に最も一般的に使用されるコドンを用
いることにより選択された（チェノおよびベーカ−（Ｃ
ｈｅｎ　ａｎｄ　Ｂａｒｋｅｒ）、Ｔｒｅｎｄ　１ｎＧ
ｅｎｅｔｉｃｓ、１巻、２２１〜２２３頁、１９８５年
）、このオリゴヌクレオチドはｆｆ２ｐでラベルされ、
ｉ、１ｘｔｏＩｌｃｐｎ＋／μｇの比活性を有している
。

Ｂ、ばひ校りＬ（Ｉ碍と！Ｎ酌外 ファージＤＮＡは、液体培養溶解法（シルヘビイ（Ｔ、
Ｊ、Ｓｉ　Ｉｈａｖｙ）ら、Ｅｘ　ｅｒｉｍｅｎＬｓ　
ｗｉｔｈ　ＧｅｎｅＦｕｓｉｏｎｓ、　ＣＳＨラボラト
リ−、ニューヨーク、１４０〜１４１頁、１９８４年）
により、さらに続いて塩化セシウム段階勾配で遠心しそ
してバンド化することにより陽性クローンより調製した
。ｃＤＮＡ挿入部はＥｃｏＲＩ　　エンドヌクレアーゼ
によるファージＤＮＡの分解により単離され、各挿入部
の５′および３′末端は配列決定された。大きなｃＤＮ
Ａ挿入部を有するクローンの１種（λ）ＩＦＸＩＩＩａ
３．７７　。

＾ＴＣＣｍ４０２６１）は、さらに配列分析のため選択
された。この挿入部は３個の内部ＥｃｏＲＩ　　サイト
を含み、ＥｃｏＲｌ　　によるファージＤＮＡの分解の
際、４種のｃＤＮＡフラグメントが生じた。これらのフ
ラグメントおよびいくつかの追加の制限フラグメントは
プラスミドｐＵＣ９またはｐＵｃ１９にサブクローンさ
れた。他のｃＤＮＡ挿入部からの追加の制限フラグメン
トは重複する配列を得るためＭ１３ｍｐｌＯ。

Ｍ１３ｍｐＨ、Ｍ１３ｍｐ１８、またはＭ１３ｍｐ１９
にサブクローンされた。次いでこのｃＤＮＡ挿入部は、
〔α”’Ｓ）　ｄＡＴＰおよびバッファー勾配ゲル〔ビ
ギン（Ｍ、Ｄ、Ｂｉｇｇｉｎ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
　、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕｓ＾、８０巻、３９６３〜３
９６５頁、１９８３年〕を用いたジデオキシ法〔サンガ
ー（Ｆ　、Ｓａｎｇｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾
ｃａｄ。

Ｓｃｉ、υＳ＾、７４巻、５４６３〜５４６７頁、１９
７７年〕　により配列決定された。ヌクレアーゼＢＡＬ
−３１による分解は、ＥｃｏＲｉ　　制限フラグメント
てとオーバーラツプする配列を与える５種の追加のフラ
グメントを生じさせた。

これらのオーバーラツプするクローンからの３８３１塩
基対の配列および予想アミノ酸配列を第１図に示す、こ
のＤＮＡ配列は、血中を循環するヒト第Ｘ■因子の完全
なａサブユニットのアミノ酸配列全体をコードする。こ
のａサブユニットは７３１個のアミノ酸よりなり、　５
ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒのアミノ末端配列で開始
する。このアミノ末端配列はタカギおよびドーリットル
（前掲）により以前に報告された。カルボキシ末端Ｍｅ
ｔ（ヌクレオチド２２８１〜２２８３）に続き停止コド
ン（Ｔ　Ｇ　Ａ　）、非コード配列の１５３５塩基対、
および潜在するポリアデニル化または＾＾ＴＡＡ＾シグ
ナルが存在する。このポリアデニル化配列は１０個のヌ
クレオチドのポリ（Ａ）テイルから１４ヌクレオチド上
流に配置されている。このポリ（Ａ）テイルはλ旺ＸＩ
ＩＩａ３．８２と呼ばれる第二ｃＤＮＡクローンにのみ
存在する。

λｆｌＦＸ　ＩＩＩ　ａ３．７７中のｃＤＮＡ挿入部は
またフレーム内配列をコードすると思われる３０個のア
ミノ酸残基をコードする。完全な第Ｘ■因子を生ずるプ
ロセシングプロテアーゼによるＭｅｔとＳｅｔの間の結
合の開裂は、アミノ末端Ｓｅｒを有する完全な蛋白質を
生ずるために追加のプロセシングプロテアーゼを必要と
する。この後アセチル化反応がおこり、成熟蛋白質のア
ミノ末端におけるアセチル−セリンの形成が導かれる（
タカギおよびドーリットル（Ｔａｋａｇｉ　ａｎｄ　Ｄ
ｏｏｌｉｔｔｌｅ）、朋；ナカムラ（Ｓ、Ｎａｋａｍｕ
ｒａ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、７８巻、１２４７〜１
２６６頁、１９７５年）。

第Ｘ■因子のａサブユニットのためのヌクレオチド配列
の違いは、重複配列が得られた領域でｃＤＮＡの比較を
行った際、３か所で発見された。

＾ＩＩＦＸ　ｍ　ａ３．７７はヌクレオチド２０３８　
、２０４１、および２７２７においてそれぞれＡ、Ｃ，
およびＴを含み、一方λＨＦＸ　ｍ　ａ３．８２は同じ
位置においてＧ、Ｇ、およびＡを含んでいた。これらの
違いは２種類のアミノ酸の変化（Ｉ　１ｅ６５０および
Ｇ１ｎ８５１からＶａｔおよびＧｌｕへ〉となり、第ｘ
■因子のａサブユニ・フトにおけるミクロへテロゲナイ
テイーに寄与する多形を示す（ボートおよびコガン（Ｐ
、Ｇ、Ｂｏａｒｄ　ａｎｄ　Ｍ。

Ｃｏｇｇａｎ）、Ｈｕｍ、Ｇｅｎｅｔ、５９巻、１３５
〜１３６頁、１９８１年）。

以下余白 ０．１まノ」ｌこＩ ヒト第Ｘ■因子のａサブユニットの臭化シアンフラグメ
ントに対しアミノ酸分析を行った。１０ｍｇの第ｘｍ因
子を５％ＨＣＯＯＨに対し一晩透析し、透析液を水酸化
アンモニウムでｐＨ４にあわせた。

ａサブユニットに富んだ（８３％がａおよび１７％がａ
サブユニット）沈殿をＳ−力ルボキシメチル化し、臭化
シアン、で分解した。生じたフラグメントを５％ｌＩＣ
０ＯＨを用いたセファデックスＧ−５０スーパーフアイ
ンカラムのゲルｒ過により分離し、さらにウルトラボア
ーＣ３逆相カラム（アルテックス）を用いたウォーター
ズＨＰＬＣシステムで精製した。用いた勾配は移動相と
して０．１％トリフルオロ酢酸および移動相モディファ
イア−として８０％アセトニトリル中の０．８％トリフ
ルオロ酢酸を用いた。カラムは流速１．５ｍ１１／ｍｉ
ｎで行ない、溶出は２１４ｎｍの吸収でモニターした。

ｃＤＮＡより予想される１８個の臭化シアンフラグメン
トのうち１１個を単離した。ｂサブユニットから生ずる
ペプチド（イチノセ（＾、　Ｉｃｈ　ｉｎｏｓｅ）ら、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２５巻、４６３３〜４６３８頁、１
９８６年）は容易に確認でき、ａサブユニッ）・由来の
残りのペプチドから除いた。精製した各々の臭化シアン
フラグメントの配列分析をベックマン自動シークエンサ
ー、モデル８９０を用い、エドマンおよびベツグ（Ｐ、
Ｅｄｍａｎ　ａｎｄ　Ｇ、Ｂｅｇｇ）のＥｕｒ、Ｊ、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、　１巻、８０〜９１頁、１９６７年の方
法により行った。ＰＴＨ−アミノ酸は２種の補足的逆相
カラムシステム（エリクソン（Ｌ、Ｈ，Ｅｒ１ｃｓｓｏ
ｎ）ら、５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓ組」
圧還力じ灯硯赳憇」μ山１幻、プレピエロおよびコレチ
プレビエロ（八、Ｐｒｅｖｉｅｒｏ　ａｎｃｌ　Ｍ、＾
、Ｃｏ１ｅｔｔｉ−Ｐｒｅｖｉｅｒｏ）、１３〜１４２
頁、１９７７年；グリコシ（Ｊ、Ｌ。

Ｇｌａｊｃｈ）ら、Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、　３１
８巻、２３〜２９頁、１９８５年）により同定された。

総計３６３個の残基が明確に同定された（残基は第１図
に示す）、これらのアミノ酸配列はｃＤＮＡより予想さ
れたものと完全に一致した。

ｃＤＮＡより予想された蛋白配列はＡｓｎ　−Ｘ　−５
ｅｒまたは＾５ｎ−Ｘ−Ｔｈｒの配列を有する６種の潜
在的Ａｓｎ−結合グリコシル化サイトを含む。これらの
Ａｓｎ残基は、１７　、４６　、５４１　、５５６　、
６１３、および６８６の位置にあるにれらのＡｓｎ残基
のうち２つは炭水化物をほとんどまたは全く有さない。

６１３と６８６の位置にあるＡｓｎはアミノ酸配列分析
により容易に同定されるがらである。さらに、タカギお
よびドーリットル（前掲）によりＡｓｎ　１７中には炭
水化物は報告されなかった。従って第Ｘ■因子のａサブ
ユニットは炭水化物を１．５％のみ含み、４６゜５４１
および５５６の位置はほとんどまたは全く炭水化物を含
まないこともありうる。しがしこれらのＡｓｎ残基のい
くつかの部分的グリコジル化はヒＩ・第Ｘ■因子のａサ
ブユニットのミクロヘテロゲナイティーに寄与するかも
しれない（ボードおよびコガン、前掲〉。

第Ｘ■因子のａサブユニットは以下の組成の７３１個の
アミノ酸残基からなる。ΔＩａコ、　、＾ｒｇａｓ　。

＾Ｓｎ＜（＋＋＾３１）４ｙ　、　１／　２　Ｃｙｓｓ
　、　Ｇｌｎｚｔ　、　Ｇｌｕ４ｓ　、　ｃｌｙ、。。

）ｆｉｓ、　、　ＩＩｅ３ｇ　、　Ｌｅｕ＜ｇ　、　Ｌ
Ｙｓｙｇ　＋　Ｍｅｔ＋ｇ、　Ｐｈｅｚｚ　＋Ｐｒｏ３
３　＋　Ｓ　ｅ　ｒ　４５、アセチル５ｅｒｌ　、　Ｔ
ｈｒ＋ｓ　、　Ｔｒｐ＋ｓ　＋ｂｒ２ｓ　＋　ＶａＬｏ
。この分子のポリペプチド部分の分子量は８０，４８８
と計算された。１．５％の炭水化物を加えると、ヒト第
Ｘ■因子のａサブユニット各々に対し約８１，７００の
分子量となる。これはＳＤＳポリアクリルアミド電気泳
動により推定される７５．０００の値（チュンら、肋、
）とよく一致する。

トロンビンによる第Ｘ■因子の活性化は、この分子のａ
サブユニットのアミノ末端から活性化ペプチドが開裂す
ることによる　（シュワルツら、前掲）。６種のｃＤＮ
Ａクローンすべてからの第Ｘ■因子のｄサブユニットの
アミノ末端配列は、第３４の残基における追加のＶ　ａ
　ｌを除いてタカギおよびドーリットル（ｉｂｉｃｌ、
）により報告されたものと同じであった。従って、ｃＤ
ＮＡのデータは３６個のアミノ酸ではなく、むしろ３７
個の活性化ペプチドに基づく。ウシの第Ｘ■因子のａサ
ブユニットは３４位においてＶ　ａ　［のかわりにＬｅ
ｕ残渣を含み、活性化ペプチドは長さ３７個のアミノ酸
である（ナカムラら、前掲） 第Ｘ■因子のａサブユニットのカルボキシ末端残基はＭ
ｅｔと同定され、それはウシの分子のちのと同じである
。しかし第Ｘ■因子のアミノおよびカルボキシ末端配列
の両方とも、全く組織トランスグルタミナーゼのものと
は異る（コネラン（Ｊ、阿。

Ｃｏｎｎｅｌ　ｆａｎ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、
　２４６巻、１０９３〜１０９８頁、１９７２年）。

血漿第ＸＩＩ［因子および組織トランスグルタミナーゼ
の活性サイトにおけるアミノ酸配列はそれぞれＧｌｙ−
Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−ＴｒｐおよびＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ
−Ｃｙｓ−Ｔｒｐと同定された（タック（Ｃｏｏｋｅ）
、前掲；フォルクおよびコール（Ｊ、Ｅ、Ｆｏｌｋ　ａ
ｎｄ　Ｐ、Ｗ、Ｃｏ１ｅ）、しＢｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、
２４１巻、３２３８　へ３２４０頁、１９６６年）。

ｃＤＮＡおよびアミノ酸配列分析の結果はＴｙｒ　−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐの活性サイト配列がＴｙ
ｒ３１１がら始まることを示している。

アップルマツキントラシュコンピューターを用い、テキ
ストコ（Ｔｅｘｔｃｏ＞のコンピュータープログラムに
より、ＤＮＡ配列を分析しな。ディホッフ（Ｄａｙｈｏ
ｆｆ）プログラムを用いたコンピューター分析（デイホ
ッフら、ル匹恒」且Ｕ！リユ９１巻、５２４〜５４５頁
、１９８３年）はヒト第Ｘｍ因子のａサブユニットのア
ミノ酸配列が独特であり、トランスグルタミナーゼの活
性サイトおよび少数の配列がアセチルコリンレセプター
のγサブユニットと相同である以外は他のどの蛋白質と
も明確な相同はみられなかった。

ヒト肝ｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡを含有するλｇｔ
ｌ１発現ライブラリーから、１′Ｉ　で標識し、アフィ
ニティ精製したウサギ抗体を用いて、ヒト第Ｘ１ｌｌ因
子のｂサブユニットをスクリーニングした。この精製抗
体を、Ｎａ１２５（で比活性４　Ｘ　１０’ｃｐｍ／μ
ｇに標識し、これを用いて、１５０１のプレート当たり
１．５Ｘ１０’個のプラーク密度でおおっているファー
ジ含有フィルターをスクリーニングした。２Ｘ１０’個
のファージをスクリーニングして、９個の陽性クローン
を単離し、その後各クローンをプラーク精製した。

Ｂ、ｃＤＮＡｔ　　ＱのＤＮＡ　ＩＩ 液体培養溶菌法〔シルハヴイ（Ｓｉｌｌ＋ａｖｙ）等、
同書〕により、ファージＤＮＡを陽性クローンから調製
した。このファージＤＮＡを遠心分離し、塩化セシウム
ステップ勾配でバンドを形成した。最も大きなｃＤＮＡ
挿入部（約２．２キロベース）を有するクローンを、λ
ＨＦＸＩＩＩｂＺ、２と命名し、それをその後の研究に
用いた。λ肝ＸｌｌＩｂ２．２から得たファージＤＮＡ
を、ＥｃｏＲｉ　　で切断し、２．２ｋｂのｃＤＮＡ挿
入部を単離した。ＥｃｏＲＩ　　で消火して線状化した
プラスミドｐＵｃ９にサブクローニングし、プラスミド
ｐＵｃ９ｂ２．２（＾ＴＣＣ寄託番号第４０２６０号）
を造成した。その後、この挿入部からの適当な制限断片
を、Ｍ１３ｍｐｌＯあるいはＭ１３ｍｐ１８にサブクロ
ーニングして、〔α”Ｓ）　ｄＡＴＰ及び）Ｊ［法勾配
ゲル〔ビギン（Ｂｉｇｇｉｎ）等、同書〕を用いて、ジ
デオキシ法〔サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）等、同書〕によ
り配列を決定した。ヌクレアーゼＢＡＬ−３１で制御さ
れた消化を行い１、制限断片と重複する配列を与える適
当な断片を生成した。全ての配列決定を、ＤＮＡの両方
の鎖について少なくとも３回行つな。

その結果、ｃＤＮＡが、血液を循環する第ＸＩＩＩ因子
のｂサブユニットのアミノ酸配列全体をコードする２１
８０塩基対から構成されていることが判明した（第２図
参照）、成熟サブユニットは、アミノ末端Ｇｌｕ（ヌク
レヌトチド５６〜５８）から始まる６４１個のアミノ酸
から構成されている。ヒト第ＸＩＩＩ因子のｂサブユニ
ットに関するアミノ末端配列Ｇｌｕ−Ｇｌｘ−Ｌｙｓ−
Ｐｒｏは、既に高木及びドーリトリ（Ｄｏｏｌｉｔｔｌ
ｅ）　（前掲）により決定されていたが、本発明により
更に広範囲の配列が決定された。カルボキシル末端Ｔｈ
ｒ（ヌクレヌトチド１９７９〜１９８１）の次には、停
止コドン（ＴＡＧ）、１８７塩基対の非コード配列及び
９塩基対のポリ（Ａ）テイルが続いている。ポリアデニ
ル化あるいはプロセシングシグナル＾＾Ｔ＾＾＾が、ポ
リ（Ａ）テイルから１９個のヌクレヌトチド上流に確認
された。

ｃＤＮＡクローンは、リーダーペプチドの一部分を構成
する１９個のアミノ酸残基をもコードしている。１９個
のアミノ酸の部分リーダー配列には、典型的な疎水性コ
アー及びポジション−１のＡｌａ残基並びにポジション
−３のＬｅｕ残基が含まれている。これらの残基は、ポ
ジション−１がシグナル配列におけるＡｌｔにより主に
占めらる［−１及び−３ルール」と一致する〔ディ・パ
ールマン及びエイチ、オー、ハルヴオソン（Ｄ、Ｐｅｒ
ｌｍａｎａｎｄ　Ｈ，０，Ｈａｌｖｏｒｓｏｎ）、ジエ
イ・モレク・パイオル（Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、Ｂｉｏｌ　、
）、厘、３９１〜４０９（１９８３）　ニジイー・フオ
ンハイネ（Ｇ、ｖｏｎ　ｌ１ｅｉｊｎｅ）、ジェイ・モ
レク・パイオル（Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、Ｂｉｏｌ　、）、１
７３．２４３〜２５１（１９８４）参照〕、その後、イ
ンタクトなタンパク質のアミノ酸配列の解析を、ベック
マンシークエネーターで行い、１９個のアミノ酸が確認
された。これは、高木及びドーリトル（Ｄｏｏｌｉｔｔ
ｌｅ）　、前掲により最初に報告されたアミノ末端配列
を延長したものである。

Ｃ，７１ノｆｆｉ凱 ヒト第ＸＩＩＩ因子のｂサブユニットの臭化シアン断片
についてもアミノ酸配列の解析を行った。力−チス（Ｃ
ｕｒｔｉｓ）及びローランド（Ｌｏｒａｎｄ）、玉揚、
の方法に準じて、第ＸＩＩＩ因子をヒト血漿から精製し
た。トロンビンと共にインキュベーションした後、ゲル
濾過により、ａサブユニットから第ＸＩＩＩ因子のｂサ
ブユニットを分離した。次に、精製ｂサブユニット（１
０ｗｇ）を、Ｓ−ピリジルエチル化〔エム・フリートマ
ン（Ｈ，Ｆｒｉｅｄｍａｎ）等、ジェイ・パイオル・ケ
ム（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、２４５．３８６８〜
３８７１（１９７０）　Ｌ、その後、臭化シアンで消化
した。得られた断片を分離し、上述の実施例１．Ｃ，に
述べた方法に準じて精製した。

ｃＤＮＡから得られたアミノ酸配列より推測された１０
個の臭化シアン断片のうちの９個が単離された。それら
は、タンパク質のアミノ末端からカルボキシル末端の方
向に番号を付けた時の、臭化シアン断片１〜４及び６〜
１０に相当した（第３図参照）。その後、これらの各断
片を、実施例１、Ｃ，に述べた方法により、アミノ酸配
列の解析を行い、合計で２９９個の残基が正確に確認さ
れた。

これらのアミノ酸配列は、ｃＤＮＡ、及びインタクトな
タンパク質のアミノ末端配列の解析により推定したもの
と完全に一致した。

第ＸＩＩＩ因子のｂサブユニットは、６４１個のアミノ
酸残基からなり、次の組成を有している：　Ａｌａ、７
、＾ｒｌ？２ｇ、　＾９ｎ３０、　八Ｆ３ｐ２□、　１
／２Ｃｙｓ＜ｏ、　　Ｇ１ｎ２ｏ、　Ｇｌｕｇｏ、Ｇｌ
）’４ｓ、旧ｓｌｌ、ｌ１ｅ２ｓ、Ｌｅｕ　４　、、Ｌ
ｙｓ４４、Ｎｅｔ、、Ｐｈｅ２ｏ、　Ｐｒｏ４＋、５ｅ
ｒｆｓ、Ｔｈｒ４．、Ｔｒｐ＋ｏ、Ｔｙｒ４２、Ｖａｌ
□１．ポリベズチド部分の分子量を計算したところ６９
，９７３であった。炭水化物が８．５％付加すると、ヒ
ト第Ｘ１ｌｌ因子の各ｂサブユニットの分子量は約７６
　、５００になる。この分子量は、ＳＤＳポリアクリル
アミドゲル電気泳動により推定した分子量ａｏ、ｏｏｏ
とよく一致しな〔シュワルツ（Ｓｃｗａｒｔｚ）等、同
書；チオン（Ｃｕｎｇ）等、前掲〕。

ｃＤＮＡから推定されたタンパク質の配列には、アミノ
酸残基１４２及び５２５からそれぞれ交合まる、＾ｓｎ
　−Ｔｙｒ　−Ｓｅｒ及び＾５ｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒの配
列を有する２個の潜在的Ａｓｎ結合グリコジル化部位が
含まれている。更に、三番めの潜在的炭水化物結合部位
が、残基２５２から始まる＾ｓｎ−＾ｒｇ　−Ｃｙｓの
配列に存在する。＾５ｎ−ｘ−Ｃｙｓの配列におけるＡ
ｓｎ残基への炭水化物鎖の結合は、最初に牛プロティン
Ｃにおいて報告され〔ジエイ・ステンフロ（Ｊ、５ｔｅ
ｎｆ　Ｉｏ）及びビー・フェルンランド（Ｐ、Ｆｅｒｅ
ｎｌｕｎｄ）　、ジエイ、パイオル・ケム（Ｊ、Ｂｉｏ
ｌ、Ｃｈｅｉ、）、翻ヱ、１２１８０〜１２１８５　（
１９８２）’ｌ　、その後、ヒト・フォノ・ビルブラン
ド因子において報告された〔ケイ・チタニ（Ｋ、Ｔｉｔ
ａｎｉ）等、バイオケム（Ｂｉｏｃｈｅｍ）、翻−１３
１７１〜３１８４（１９８６）　）。これらのＡｓｎ残
基の特異的なグリコジル化は、一部分、ヒト第ｘｒｒｒ
因子のしサブユニットのミクロヘトロゲナイテイーの原
因になるものと思われる〔シー・ジー・カーチス（Ｃ，
Ｇ。

Ｃｕｒｔｉｓ）等、バイオケム（Ｂｉｏｃｈｅｍ）、■
、３７７４〜３７８０（１９７４）　、ビー・ジー・ボ
ード（Ｐ、Ｇ、Ｂｏａｒｄ）、アム・ジェイ・ヒユーム
・ジエネテ（＾ｍ、Ｊ、Ｈｕｍ。

Ｇｅｎｅｔ、）、設、３４８〜３５３（１９８０））。

第ＸＩＩＩ因子のｂサブユニットをコードするｃ　Ｄ　
Ｎ　Ａにより確認された２０個の潜在的ジスルフィド結
合は、以前に報告された１６〜１７個のジスルフィド結
合とかなりよく一致する〔千オン（Ｃｕｎｇ）等、前掲
〕。又、第ＸＩＩＩ因子のｂサブユニットには、遊離の
−ＳＨ基がない。

第ＸＩＩＩ因子のｂサブユニットのアミノ酸配列は、約
６０個のアミノ酸の反復配列１０個を含むかなりの内部
遺伝子重複があることを裏付けている。

これらの反復配列を、４つの別個のグループに下位分類
しな（第４図参照）。グループ１，２．３及び４内の同
一性は、それぞれ、３４〜４２％、３４〜４２％、３８
％及び４１％であった。４つのグループの反復の間の同
一性は、明らかに各内部同一性よりも小さいが、デイホ
ッフ（Ｄａｙｈｏｆｆ）プログラムを用いた時の整列ス
コア〔デイホッフ（Ｄａｙｈｏｆｆ）等、同書〕が高く
、これらの４つのグループが一つのプロトタイプから分
かれたものであることを示している。例えば、反復３及
び４の間の整列スコアは７，７、反復５及び７の間の整
列スコアは１２．１、反復６及び８の間の整列スコアは
３．４であった。

１０個の反復（１〜１０）は、分子の９８％を通じて連
続して整列しており、１〜６２６個のアミノ酸残基を含
んでいる。分子のカルボキシル未満での最後の反復に続
く１５個のアミノ酸（残基６２７〜６４１）からなる短
い配列は、反復１〜１０とは相同ではなかった。デイホ
ッフ（Ｄａｙｈｏｆｆ）プログラムを用いたコンピュー
ターでの解析により、第屓ＩＩ因子のｂサブユニットに
おける反復配列は、ヒト補体の因子ＢのＢａ鎖に存在す
る３つの反復セグメント〔ジェイ・イー・モレ（Ｊ、Ｅ
、Ｍｏ１ｅ）等、ジエイ。

パイオル・ケム（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　、２５
９．３４０７〜３４１２（１９８４）、ヒトβ２−グリ
コプロティン■中の５つのセグメント〔ジェイ・ロッツ
エル（Ｊ、Ｌｏｚｉｅｒ）等、ブロク・ナチュル・アカ
ド・サイ・ニーニスエイ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　、＾ｃ
ａｄ、ｓｃｉ、Ｕｓ＾）、壮、３６４０〜３６４４（１
９８４））　、活性プロティンＣ結合プロティンと同一
の１ａプロテイン〔ダブリュ・エム・キャンフィールド
側、Ｍ、Ｃａｎｆｉｅｌｄ）及びダブリュ・キシール（
Ｗ、Ｋ１５ｉｅｌ）、ジェイ・クリソ・インベスト（Ｊ
、Ｃｌ１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、）、互、１２６０〜１２７２（１９８２
）及びヒトハプトグロビンα１鎖〔ニー・クロスキー（
＾、Ｋｕｒｏｓｋｙ）等、ブロク・ナチュル・アカド・
サイ・ニーニスエイ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ
、ｓｃｉ、Ｕｓ＾）、　ηη、　３３８８〜３３９２（
１９８０＞　）に非常に類似している種類の反復に入る
。

この配列の相同性を第３図に示す。Ｒ２−グリコプロテ
ィン■の４番目のセグメント、補体因子Ｂａの２番目の
セグメント及びヒトハプトグロビンα１鎖は、ヒト第Ｘ
ＩＩＩ因子のｂサブユニットの反復６と最も高い整列ス
コア（それぞれ１１　、８．０及び４．２）を示す。こ
れらのデータは、これらの４つのタンパク質が共通の系
統を有し、おそらく、進化の過程でエクソン・シー’ｔ
”ｙフリング（ｅｘｏｎ　ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）により
生じたものであることを示している。

Ｒ２−グリコプロティンエの５つの相同セグメントにお
ける５個のジスルフィド結合の位置を決定し、それらの
結合が各セグメントの第１及び第３Ｃｙｓ残基の間、並
びに第２及び第４Ｃｙｓ残基の間で生じることが示され
ている〔ロッツェル（Ｌｏｚｉｅｒ）、前掲〕。従って
、第ＸＩＩＩ因子のｂサブユニットにおける１０個の反
復のジスルフィド結合で同様な対が生じているものと思
われる。

以下余白 実九１し−」 ニング Ａ、已■基りυＡ 次のベクターの造成におけるＴＰＩＩプロモーターの起
源として用いられるプラスミドｐＭＶＲ１は、ベクター
ｐＩｃ７Ｒ１中のＴＰＩＩプロモーター、α−１−アン
チトリプシン（ＡＡＴ）　ｃＤＮＡ及びＴＰＩＩターミ
ネータ−を含む。プラスミドｐＭＶＲ１は次のように造
成された（第５図）、プラスミドｐｌｃ７（Ｍａｒｓｈ
等、旺岨剣二４８１〜４８６．１９８４）をＥｃｏＲＩ
で消化し、そのフラグメント端をＤＮＡポリメラーゼ■
（フレノウフラグメント）で平滑化し、そしてその線状
ＤＮＡを、Ｔ、ＤＮＡリガーゼを用いて再び環状化した
。その生成プラスミドを用いてＥ、ｃｏｌ　ｉ株ＲＲＩ
を形質転換した。プラスミドＤＮＡをその形質転換細胞
から調製し、そしてＥｃｏＲＩ　　部位の損失について
スクリーニングした。正しい制限パターンをもつプラス
ミドはｐＩｃ７Ｒ１と呼ばれた。

ＴＰＩＩプロモーターフラグメントはプラスミドｐＴＰ
Ｉｃ１０　（＾Ｉ　ｂｅｒ及びＫａｗａｓａｋ　ｉ、前
掲）から得られた。このプラスミドを、ＴＰＩＩ遺伝子
内のユニークＫｐｎ　（部位で切断し、そしてそのＴＰ
ＩＩをコードする領域を、ヌクレアーゼＢＡＬ−３１で
の処理によって除去した。キナーゼ処理されたＥｃｏＲ
）リンカ−（ＧＧ＾＾ＴＴＣＣ）をそのフラグメントに
付加し、次いでそのフラグメントをＢｇｌ　ＩＩ及びＥ
ｃｏＲＩ　　で消化し０．９ｋｂのＴＰＩＩプロモータ
ーフラグメントを得な。このフラグメントをＢｇｌ　Ｉ
Ｉ及びＥｃｏＲＩで切断されているプラスミドＹＲｐ７
’　（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ等、Ｎａｔｕｒｅ　２８２
　：　３９−４３．１９７９）に連結した。その生成プ
ラスミドｐＴＥ３２、をＥｃｏＲ［及びＢａｍＨＩで開
裂させてテトラサイクリン耐性遺伝子の一部を取り出し
た。その線状化されたプラスミドを次いで、キナーゼ処
理されたＥｃｏ　Ｒ１１３ａｍ　ｔｌＩオリゴヌクレオ
チドアダプター（５′＾＾Ｔ　ＴＣＡ　ＴＧＧ　ＡＧ３
’及び５’　ＧＡＴ　ＣＣＴ　ＣＣＡ　ＴＧ３’　）の
付加によって再び環状化させた。その生成プラスミドｐ
ＴＥΔ３２、をＢｇＩ　ｎ及びＥｃｏＲＩ　で消化して
、９００ｂｐのＴＰＩ上プロモーターフラグメントを単
離した二゛このフラグメントを、Ｂｇｌ　ＩＩ及びＥｃ
ｏＲＩ　　での消化によって線状化されているｐ　ＩＣ
１９Ｈ（Ｍａｒｓｈ等、前掲）と連結しな。その生成プ
ラスミドはρＩＣＴＰＩと呼ばれた。プラスミドｐＦＡ
ＴＰＯＴ（株Ｅ１８にＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ形資転
ｍｍ胞として寄託サレテイル、ＡＴＣＣＩｔ２０６９９
）をＳｐｈ　Ｉ及び旧ｎｄｌｌＩで消化して、部分的な
ＴＰＩｌプロモーター、ｃＤＮＡをコードするヒトα−
１−アンチトリプシン、及びＴＰＩＩターミネータ−を
含む１７５０ｂｐの２ラグメントを単離した。プラスミ
ドｐＩＣＴＰＩをＮａｒ　’Ｉ及びＳｐｈ　　Ｉで消化
し、部分的なＴＰｒｌプロモーター及びＩａｃＺ’をコ
ードする配列を含む１．１ｋｂのフラグメントを単離し
た。プラスミドｐｌｃ７ＲＩを旧ｎｄＩＩＩ及びＮａｒ
　Ｉで消化し、２．５ｋｂのベクターフラグメントを単
離した。

そのｐｌｃ７ＲＩフラグメント、プラスミドｐｌｃＴＰ
Ｉから誘導された部分的なＴＰＩＩプロモーターフラグ
メント及びグラスミドｐＦＡＴＰＯＴから誘導された１
、７５ｋｂのフラグメントを３つの部分の連結反応で連
結してプラスミドｐＭＶＲ１を製造した。

以下余白 Ｂ、ｉ叫鋪ぼυＬ咬 ＾ＤＩ＋２−４°プロモーターをプラスミドｐＢＲ３２
２−＾ＤＲ２−ＢＳａ（Ｖ、Ｍ、Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ
等、Ｃｅ１ｌ　２３　：　６０５〜６１４．１９８１）
及びＹＲｐ７−＾ＤＲ３−４Ｃ（Ｄｊ４．Ｒｕ５ｓｅｌ
１等、前掲）から誘導しな、ＥｃｏＲｌ　　部位を、生
体外での変異誘発によって、プラスミドｐＢＲ３２２−
＾ＤＲ２−ＢＳａから誘導されたＡＤＨ２プロモータ、
−の翻訳開始コドンに対してちょうど３′に配置した。

変異誘発に続いて、八〇）Ｊ２−４ｃ表現型を与える５
′フランキング配列を用いて、ＡＤＨ２プロモーターの
類似の配列を置き換えな。ＡＤＨ２構造遺伝子及び５′
フランキング配列を含有するｐＢＲ３２２−＾ＤＲ２−
ＢＳａからの２．２ｋｂＬニア）Ｂａｍ　ＨＩ　　フラ
グメン）−３、Ｂａｍ　ＨＩで線状化されたＭ１３ｍｐ
１９と連結反応させた。その挿入方向は制限分析によっ
て決定された。生成したファージクローンから一本鎖鋳
型ＤＮＡを作った。部位特異的生体外変異誘発（Ｍ、Ｊ
、Ｚｏｌ　Ｉｅｒ及びＭ、Ｓｍ１ｔｈ、０８人３　：　
４７９〜４８８．１９８４）を、オリゴヌクレオチドＺ
Ｃ２３７（第１表）を用いて、上記の鋳型で実施するこ
とにより、ＡＤＨ２遺伝子の構造部分をループアウトし
、翻訳開始シグナルを含有する５′側面配列をＭ１３ｍ
ｐ１９ポリリンカーのＥｃｏＲｉ部位と融合させた。変
異誘発されたファージの複製型分子を作りそしてＢａｍ
ＨＩ及びＥｃｏＲＩで切断して１．２ｋｂのプロモータ
ーフラグメントを単離した。このフラグメントを、Ｂａ
ｍＨＩ及びＥｃｏＲＩでの消化によって線状化されてい
るｐＵｃ１３中に連結してプラスミドｐ２３７ＷＴを形
成した。ｐ２３７１１１Ｔプロモーターを゛プロモータ
ーアップ”突然変異体ＡＤＨ２−４ｃに変化させるため
に、ＹＲｐ７−＾ＤＲ３−４°からのｉ、ｎｂのＢａｍ
　ＨＩ　−５ｐｈ　　Ｉ部分的プロモーターフラグメン
トを、ＢａｍＨＩ　　及びＳｐｈ　Ｉで切断されたｐ２
３７ＷＴのベクターフラグメントにサブクローニングし
た。

その生成プラスミドはｐ２３７−４°と呼ばれた。

以下余白 １」−ス ＺＣ８７５ＴＣＣＣＡＧ　　ＴＣＡ　　ＣにＡ　　ＣＯ
Ｔコ′ＺＣ２１２Ｓ　’ＧＡＣＣＴＧ　　ＣＡＧ　　Ｇ
ＡＴ　　ＣＣＡ　　ＴＧＣＡＧＣＧＣＧ　　ＴＧＡ　　
ＡＣＡ　　ＴＣＡ　ＴＣＡＴＧＧ３′ ＺＣ２１３’　℃ΔＧ　　ＧＣＣＴＧＧ　　ＴＧＡ　　
ＴＴＣＴＧＣＣＡＴ　　ＧＡＴ　　ＣＡＴ　　ＣＴＴ　
　ＣＡＣ（：ＣＧＣＴＧコ′ ＺＣ２３５５′ＧＡＴ　ＣＣＡ　　ＴＧＣＡＧＣＧＣ”
ＺＣ２３７”ＧＣＣＡＧＴ　　ＣＡＡ　　ＴＴＣＣＡＴ
　　ＴＧＴ　　ＧＴＡ　　ＴＴＡ”ＺＣ４１０５’ＣＧ
Ｔ　　ＡＴＴ　ＡＣＡ　　ＧＡＡ　ＴＴＣＣＣＧ　　Ｇ
Ｇ”　’ＺＣ８１３２５ＴＣＡ　ＡＴＣｍ　ＴＧＡ　　
ＧＣＴ　ＣＡＧ　ＡＡＡ　ＣＡＣＣ”ＺＣ１０１９５’
ＡＣＣＣＡＡ　　ＧＧＡ　　ＴＣＴ　　　ＣＴＴ　ＧＴ
ＣＣＡＡ　　　ＡＧＡ　　ＡＡＣＡＣＣＴＣＣ’ｒｒｃ
” ＺＣ１０５６５’＾ＴＴ　ＴＡＧ　ＡＴＣＴＧＣ八３′
ＺＣ１０５７５′ＣＡＴ　（Ｔ” ＺＣ１０５９５ＴＣＡ　　ＡＡＧ　　ＡＡＣＣＣＡ　　
　ＡＧＣＡＡＧ　　ＣＴＴ　　　ＣＡＧ　　ＣＣＴ　　
ＣＴＣＴＴＴ　　ＴＡＣＣＣ＾＾ΔＧ＾晶Ｃ３′ ＺＣ１１１３５′ＣＧＡ　　ＣＣＴ　　ＴＣＣＡＴＧ　
　　ＴＧＡ　　ＴＡＡ　　ＣＴＣＧＡＧ　　ＡＡＣＣＴ
Ｇ　　ＡＧＡ　　ＴＧＡＧＡＡ′ ＺＣ１２０Ｂ　　　　　Ｓ　’ＧＧＡ　　ＣＣＴ　　Ｔ
にＴ　　ＡＡＡ　　　ＧＴＧ　　ＡＧＡ　　ＡＧＣＴＴ
ＣＡＧＡ　　ＡＡＣＴＴＣＣＡＣＧ＾３′ ＺＣ１２０９５’ＧＡＴ　　ＧＴＴ　　ＧＴＴ　ＣＣＡ
　　ＡＣＣＴｒＴ　　ＣＴＴ　　　ＧＴＴ　　ＣＴＴ　
ＧＴｒ　　（：ＧＣＴＧＧｍ　ＣＧＣＡＧＧ　ＴＡＣＣ
ＧＡ” ＺＣ１２１０５’ＡＧＣＴＴＣＧＧＴ　　ＡＣＣ丁（：
Ｇ　　ＡＧＣＧＡＡ　　　ＡＣＣＡＧＣＣＡＡ　　ＣＡ
Ａ　　ＧＡＡＣ＾＾　ＧＡＡ　　ＡＧＣＴＴＧ　　　Ｃ
ＡＡ　　ＣＡＡ　ＣＡＴ　　ＣＴＧ　　Ｃへ３　′第６
図を参照にして、ρ２３７ＷＴからのＡＤＨ２プロモー
ターを変性させて“ユニバーサル”ＡＤＨ２プロモータ
ーを作った。そのプロモーターを最初にプラスミドｃｃ
ＰＯＴ（Ｅ、Ｃｏ（ｉ株）ＩＢ１ｐｌ形質転換細胞とし
てΔＴＣＣに寄託されたもの、＾ＴＣＣ１ｌｈ　３９８
８５）にサブクローニングしな。それは完全な２ミクロ
ンプラスミドＤＮＡ、１ｅｕ２−ｄ遺伝子、ｐ１３Ｒ３
２２ベクター配列及びシゾサツカロミセス・ボンベ（Ｓ
ｃｈｉｚｏ−ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　７）ＰＯＴ
Ｉ遺伝子を含んでいる。

プラスミドｐｃＰＯＴをＢａｍＨＩ及びＳａｌ　　ｌで
完全消化し、はぼ１０ｋｂの線状ベクターフラグメント
を単離した。プラスミドｐＭＶＲＩ（実施例１［、Ａ、
）をＥｃｏＲＩ及びＸｈｏ　ｒで切断して１．５ｋｂの
ＡＡＴ　ｃＤＮ＾−１１ターミネータ−フラグメントを
単離した。１．２ｋｂのＡＤＨ２プロモーターフラグメ
ントをプラスミドｐ２３７ＷＴからＲａｍ　ＨＩ　−Ｅ
ｃｏ　ＲＩフラグメントとして単離し、そして１．５ｋ
ｂのＡＡＴ　ｃＤＮ＾−−■ターミネーターフラグメン
ト及び線状化されたｐｃＰＯＴと、３部分連結反応で連
結反応してｐＡＴ　−１と呼ばれるプラスミドを得た。

プラスミドｐＡＴ−１中に存在するＡＤＨ２プロモータ
ーを次いで、翻訳開始コドンの除去及びＥｃｏＲＩ　　
部位へのプロモーターの融合によって変形して“ユニバ
ーサル”プロモーターを作った。プラスミドｐＡＴ−１
をＳｐｈ　　Ｉ及び８ｔｔｍＨＩで消化し、ＡＡＴ　ｃ
ＤＮ＾のＳｐｈ　Ｉ部位からＢａｍＨＩ　　部位までの
ＡＤＨ２プロモーターを含む１９０ｂｐのフラグメント
を単離しな。このフラグメントを、ＢａｍＨＩ　　及び
Ｓｐｈ　Ｉでの消化によって線状化されている８１３ｍ
ｐｌａ中に連結した。陽性クローンを制限分析によって
確認した。鋳型ＤＮＡをその陽性クローンから作った。

オリゴヌクレオチドＺＣ４１０（第１表）は、ＡＤＨ２
翻訳開始シグナル及びｐｌＪｃｉ８ポリリンカー配列を
Ｓｍａ　　Ｉ部位でＭ１３ｎ＋ｐ１８ポリリンカーに融
合した単一のＥｃｏＲｌ　　部位により置き換るように
設計されている。その鋳型を、オリゴヌクレオチドＺＣ
４１０及びＺＣ８７（第１表）を用いる２プライマー法
（Ｚｏｌｌｅｒ及びＳｍ１ｔｈ、同書、１９８４）を用
いて生体外変異誘発にかけた。陽性クローンを融合点ま
でのジデオキシ配列決定によって確認した。操作を容易
にするために、１７５ｂｐのＳｐｈ　Ｉ　　ＥｃｏＲＩ
変異されたプロモーターフラグメントを、Ｓｐｈ　　Ｉ
及びＥｃｏＲＩ″Ｃ線状化されているｐ［Ｉｃ１９中に
連結した。ｐ４１０Ｅｓと呼ばれるその生成したプラス
ミドは“′ユニバーサル”ＡＤＨ２プロモーターの３′
部分を含む。

゛ユニバーサル°°ＡＤＨ２−４°プロモーターを、ｐ
４１０Ｅｓからの変異誘発されたＡＤＨ２プロモーター
フラグメント及びｐ２３７−４ｃからのＡＤＨ２−４’
プロモーターフラグメントを用いて造成した。プラスミ
ドｐ４１０ＥｓをＳｐｈ　　Ｉ及びＥｃｏＲｌ　で消化
して１７５ｂｐの部分的ＡＤＨ２プロモーターフラグメ
ントを単離した。プラスミドｐ２３７−４ｃをＢａｍＨ
Ｉ　及び５ｐｈＩテ切断しテ１　ｋｂ（１）部分的ＡＤ
Ｈ２−４ｃフｏモーターフラグメントを単離した。その
へＤＨ２−４ｃプロモーターを、ｐ２３７−４°からの
Ｂａｍ　ＩＩ　　−５ｐｈ　Ｉプロモーターフラグメン
ト、ｐ４１０Ｅｓからの５ｐｈＩ−ＥｃｏＲＩプロモー
ターフラグメント、及びＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲｒ　　
での消化によって線状化されているｐＵＣ１３を用いて
の３部分連結反応で再構成した。

その生成プラスミドであるρ４１０−４ｃは“ユニバー
サル”ＡＤＨ２−４’プロモーターを含んでいた。

第７図に説明されているように、プラスミドｐ４１０−
４ｃからのその“ユニバーサル”プロモーターを用いて
、プラスミドｐＭＶＲ１（実施例Ｉ［［、Ａ、）中に存
在しているＴＰＩＩプロモーターを置き換えた。

プラスミドｐ４１０−４°をＢａｎＨＩ及びＥｃｏＲｌ
で切断Ｌテ１．２ｋｂノＡＤＩ（２−４’７ｏモーター
７ラクメンＩ−を単離した。プラスミドｐＭＶＲ１をＢ
ａｍＦＩＩ及びＥｃｏＲＩ　　で切断して１．２ｋｂの
ＡＤＨ２−４ｃプロモーターフラグメントを単離しな。

プラスミドｐＭＶＲ１ｔＥｃｏＲＩ　　で完全に消化し
且つＢｇｌ　Ｉ［で部分的に消化して４．２ｋｂの＾＾
Ｔ−ＴＰＩＩターミネータ−・ベクターフラグメントを
単離した。これらの２つのフラグメントを連結してｐＴ
ＲＫ４ｃと呼ばれるプラスミドを生成させた。

ベクターＹ１．５及びｐＪＤＤ２０７の各々の一部を含
むプラスミドｐＥＡｓ１０２を次のようにして造成した
。

ｐＪＤＢ２１９（Ｊ、Ｄ、Ｂｅｇｇｓ、　Ｎａｔｕｒｅ
　２７５　：　１０４〜１０８．１９７８）の誘導体で
あるプラスミドｐＪＤＢ２０７（Ｊ、Ｄ、Ｂｅｇｇｓ、
ヒ匹肛紅坦ｓ　ｏｆ　Ａｌｆ刈ム旺眩咀ｊ巳肛吐現硯：
３８３〜３８９、”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ″デンマーク国コペンハーゲン
、１９８１）をＢａｍＨＩ　　及びＰａｔ　Ｉで消化し
、Ｉｅｕ２　　ｄｆｆｉ伝子及び２ミクロンＤＮＡ及び
ｐＢＲ３２２配列を含む４．４ｋｂのフラグメントを単
離した。プラスミドＹＩｐ５（Ｓｔｒｕ旧等、前掲）を
Ｐｓｔ　Ｉでの部分消化及びＢａｍＨＩ　　での完全消
化にかけ、ＵＲＡ３遺伝子及びｐＢＲ３２２配列を含む
４．３ｋｂのフラグメントを単離した。これらの２つの
フラグメントを連結した。その生成プラスミドはｐＥＡ
ｓ１０２　（第９図に説明されている）と呼ばれた。

第Ｘ■因子ａサブユニット（ａｓＦ　Ｘ　Ｉ［）ｃＤＮ
Ａを、生体外変異誘発によって変形して、３′非コード
領域をＸｈｏ　Ｉ部位で置き換えたく第８図）。操作を
容易にするために、ファージクローン＾旺ＸＩａ３．８
２中に含まれる３、８ｋｂのａｓＦ　ＸＩＩＩ　ｃＤＮ
Ａ挿入部をｐＵｃ１８中にサブクローニングした。ファ
ージクローンλ旺ＸＩＩＩａ３．８２をＰｓｔ　　ｌで
完全消化してａｓＦ　Ｘ１ｌｌ　ｃＤＮＡを含む２．３
ｋｂのフラグメントを単離した。このフラグメントを、
Ｐｓｔ　　Ｉでの消化によって線状化されているｐＵｃ
１８と連結した。その生成プラスミドであるｐＵｃ１８
＃９は、アンチセンス方向に２．３ｋｂのＰｓｔ　　■
挿入部をもっていると決定された。ｐＵｃ１８＃９中に
存在するａｓＦ　ｘｍ　ｃＤＮＡ挿入部は翻訳開始部へ
の５′側１９ｂｐ、　ａｓＦ　Ｘ１ｌｒをコードする領
域、及び翻訳終止部への３′側１２０ｂｐを含んでいた
。

そのａｓＦ　ＸＩＩ［ｃＤＮＡ挿入部を次いで単離し、
そしてベクターｐＵｃ１１８（Ｊ、Ｖｉｃｉｒａ及びＪ
、Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｗａｋｓｍａｎ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ
ｅ　ｏｆ　ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＳＲｕｔｇｅｒｓ
、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪから得られたもの）に
サブクローニングした。２．３ｋｂのａｓＦＸＩＩ［挿
入部をＰｓｔ　Ｉでの消化によってｐＵｃ１８＃９から
単離し、ｐＵｃ］、１８のＰｓｔ　Ｉ部位にサブクロー
ニングし、そしてＥ、ｃｏｌｉ株ＪＭ１０９に形質転換
した。２．３ｋｂのａｓＦＸ　Ｈ［挿入部をアンチセン
ス方向に含んでいる陽性クローンはｐＲｓ２０１と呼ば
れた。

ａｓＦ　ＸＩ［Ｉ　ｃＤＮＡの１２０ｂｐの３′非翻訳
領域を除去し、そしてＸｈｏ　Ｉ部位を部位特定突然変
異誘発によって翻訳停止コドンに対して３′に挿入した
。

プラスミドｐＲＳ２０１をＥ、ｃｏｌｉ株ＭＶ１１９３
に形質転換し、そして一本鎖鋳型ＤＮＡを単離しな、オ
リゴヌクレオチドＺＣ１１１３（第１表）は、ａｓＦＸ
Ｉ［Ｉをコードする配列に続く３′非翻訳領域を除去し
、そして翻訳終止部位の３′側にＸｈｏ　Ｉ部位を導入
するように設計されている。ｐＲｓ２０１の一本鎖鋳型
を、突然変異誘発オリゴヌクレオチドＺＣ１１１３を用
いてのＺｏｌ！ｅｒ及びＳｍ１ｔｈの方法（１９８４、
同書）によって生体外変異誘発にかけた。制限分析によ
って確認された陽性クローンはｐＲｓ２０２と呼ばれた
。

Ｂ、ブースミドＲ５２１フの告 第９図に示されているように、プラスミドｐＲｓ２０２
からの２．２ｋｂのａｓＦ　ＸＩ［Ｉ　ｃＤＮ＾フラグ
メントを八ＤＨ２−４ｃプロモーターの後３に配置し、
そしてプラスミドｐＥＡｓ１０Ｚ　（実施例■）中に配
置した。

プラスミドｐＴＲＫ４ｃ　（実施例１．Ｂ、）をＥｃｏ
Ｒｌ及びＳａｔ　　Ｉで完全消化し、へＤＨ２−４°プ
ロモーター、ＴＰＩＩターミネータ−及びｐｌｃ７Ｒ１
ベクター配列を含む４ｋｂのフラグメントを単離した。

オリゴヌクレオチドＺＣ１０５６及びＺＣ１０５７（第
１表）は、ＥｃｏＲＩ付着末端、Ｂｇｌ　ＩＩ部位及び
Ｐｓｔ　Ｉ付着末端を有するアダプターを形成するよう
に設計されている。

アダプターのＥｃｏＲＩ付着端は、その他のＥｃｏＲＩ
付着端への連結の後、ＥｃｏＲｌ　　部位を破壊する。

オリゴヌクレオチドＺＣ１０５６及びＺＣ１０５７をキ
ナーゼ処理し且つアニーリング処理してＥｃｏＲＩ　　
アダプターを形成させた。プラスミドｐＲｓ２０２　（
実施例Ｖ、Ａ、）から単離した２、２ｋｂのＰｓｔ　　
ｌ　−Ｘｈｏ　　Ｉ　　ａｓＦＸ■フラグメントを３部
分連結反応でＺＣ１０５６／１０５７アダプター及び４
ｋｂのｐＴＲＫ４ｃフラグメントと連結させた。その生
成プラスミドはｐＲｓ２１５と呼ばれた。

ｐＲｓ２１５中に存在する発現ユニットを酵母ベクター
ｐＥΔ５１０２中に配置した。プラスミドｐＥＡｓ１０
２をＨｉｎｄ　ｍで完全消化し、次いで細菌性アルカリ
性ホスファターゼで処理して再環状化を防止した。

プラスミドｐＲｓ２１５を旧ｎｄ　ｍで消化し、ＡＤＨ
２−４ｃプロモーター、ａｓＦ　ＸＩＩ［ｃＤＮ＾及び
ＴＰＩＩターミネータ−を含む３．５ｋｂの発現ユニッ
トを単離した。これらの２つのフラグメントを一緒に連
結してプラスミドｐＲｓ２１７を作った。

プラスミドｐＲｓ２１７を、Ｂｅｇｇｓによってに記載
された方法（Ｎａｔｕｒｅ　２７５　：　１０４〜１０
８．１９７８）と本質的に同じ方法を用いてサツカロミ
セス・セレビシェ−（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＸＶ７９４−７−　ＩＣ細胞を
、ウラシルを欠いている合成培地（−ＵｒａＤ）で増殖
する能力について還択した。

株ＸＶ７９４−７−ＩＣに形質転換したｐＲｓ２１７７
ラスミドからの第Ｘ■因子ａサブユニットの発現は、最
初にその形質転換細胞を一晩’５ｍｌの−ＵｒａＤ中で
増殖させることによって達成された。その−晩の培養物
を１１の−ＵｒａＤ中に接種し、そして３０℃で４８時
間増殖させた。その培養物を遠心分離して細胞ベレット
を得、それを一度蒸留水で洗浄し、そして−８０℃で貯
蔵した。

細胞ペレットを実施例℃で記載したようにして活性第Ｘ
■因子のサブユニットにってい検定した。

ｐＲｓ２１７で形質転換されたＸＶ７９４−７−　ＩＣ
細胞は１１当り５０ｍｇの第Ｘ■因子ａサブユニットを
もたらした。

Ｃ，ブースミドＲ５２１Ｂの゛。

第９図に示されているように、プラスミドｐＲｓ２０２
からの２．２ｋｂのａｓＦ　ＸＩ［Ｉ　ｃＤＮ＾フラグ
メントをＴＰＩＩプロモーターの後に配置しそしてプラ
スミドｐＥＡｓ１０２　（実施例■）中に挿入した。プ
ラスミドｐＭＶＲ１（実施例１［［、Ａ、）をＥｃｏＲ
７及Ｓａｌ　　Ｉで完全消化して、ＴＰＩＩプロモータ
ー、Ｔ’Ｐ　Ｉ　１ターミネータ−及びｐｌｃ７ＲＩベ
クター配列を含む３．７ｋｂのフラグメントを単離した
。プラスミドｐＲ３２０２（実施例Ｖ、Ａ、）をＰｓｔ
　Ｉ及びＸｈｏ　Ｉで消化して２．２ｋｂのａｓＦＸＩ
［［フラグメントを単離した。その２．２ｋｂのａｓＦ
ＸＩＩＩフラグメント、キナーゼ処理し且つアニーリン
グ処理したＺＣ１０５６／ＺＣ１０５７アダプター（実
施例Ｖ、Ｂ、）及び線状化されたｐＭＶＲｌを３部分連
結反応で連結してプラスミドｐＲｓ２１４を作った。

ｐＲｓ２１４中に存在する発現ユニットを酵母ベクター
　ｐＥＡｓ１０２中に配置した。プラスミドｐＥＡｓ１
０２番Ｈｉｎｄ　ＩＩ［での消化によって線状化し、そ
して細菌性アルカリ性ホスファターゼで処理して再環状
化を防止した。プラスミドｐＲｓ２１４を旧ｎｄ　ＩＩ
Ｉで消化し、ＴＰＩＩプロモーター、ａｓＦ　ＸＩＩ［
ｃＤＮ＾及びＴＰＩＩターミネータ−を含む３．２ｋｂ
の発現ユニットを単離した。これらの２つのフラグメン
トを一緒に連結してプラスミドｐＲ３２１６を作った。

酵母宿主細胞を前記したようにして形質転換しそして増
殖させた。ｐＲｓ２１Ｂで形質転換されたＸＶ７９４−
７−ＩＣは、実施測道で検定されているように、１１当
りｌｏｍｇの活性第ｘ■因子ａサブユニットをもたらし
た。

以下余白 ！ＪＬＬｊＬ　　　、から　ＸＩＩＩ　　ａ　ブユ第Ｘ
■因子ａサブユニットタンパク買の分泌を指令し得る発
現ユニットを造成するために、ａｓＦ　ＸＩ［Ｉ　ｃＤ
Ｎ＾を改変し、分泌シグナル配列の挿入するための旧ｎ
ｄ　ｍ部位を翻訳開始部位の３′側に挿入した。オリゴ
ヌクレオチドＺＣ１２０６（第１表）は、５′非翻訳領
域ＤＮＡの１９ｂｐを除去しそして翻訳開始部位の３′
側に旧ｎｄ　ｍ部位を挿入するように設計されている。

１本鎖鋳型ＤＮＡを、ｐＲ３２０２（実施例Ｖ、Ａ、）
で形質転換した大腸菌株ＭＶ１１９３から調製した。　
ＺＣ１２０６、およびＺｏｌｌｅｒとＳ＋ｗｉｔｈが記
載した方法（１９８４、前記文献）、を用いて、この鋳
型を試験管中で変異させた。目的のクローンは制、限酵
素切断解析により確認し、これをｐＲ５２０３（第８図
）と命名した。

Ｂ−゛　　されたＭＦα１の゛【Ｊ コドンが最適化されたＭＦα１シグナルペプチド配列を
、インシュリン前駆体Ｂ（１−２９）−Δｌａ−Ａｌａ
−Ｌｙｓ−＾（１−２１）の遺伝子を含む発現ベクター
（Ｍａｒｋｕｓｓｅｎら、ＥＰ　１６４５２９）から得
た。ＭＦａｌシグナルペプチド配列およびインシュリン
配列を含むＥｃｏ　ＲＩ　−Ｘｂａ　Ｉ断片をｐＭＴ６
１０　（Ｍａｒｋｕｓｓｅｎら、上記文献）から得て、
これをＥｃｏＲＩおよびＸｂａ　ｒで切断したｐＵｃ１
１８（第１０図）にクローン化し、１本鎖鋳型ＤＮＡを
調製した。次に、この鋳型に、ＺｏｌｌｅｒとＳｍ　ｉ
　ｔｈの方法（１９８４、上記文献）および変異源であ
るオリゴヌクレオチドＺＣ８６２（第１表）を用いて変
異処理を行った。この処理によって、ＭＦα１シグナル
ペプチド配列の３′末端にＳｓｔ　　ｉ部位が生じた。

」已α１シグナルペプチド配列の３′側にＳｓｔ　Ｉ部
位３′を含む陽性クローンを選択し、ｐＫＰ２３と命名
した。ＭＦα１シグナルペプチド配列をプラスミドｐＫ
Ｐ２３から取り出し、ｐＩｃ１９１１（Ｍｏｒｓｈら、
ｒ　Ｇｅｎｅ　」３２　：　４８１−４８５．１９８４
）に再びクローン化した。これで得られたプラスミドを
ｐＫＰ２４と命名した。

ＴＰＩユプロモーター、旺α１シグナルペプチド配列、
ヒトＰＤＧＦ　Ｂ鎖をコードするＤＮＡ配列、ＴＰＩＩ
ターミネータ−１およびｐｌｃ１９Ｈベクター配列を含
んで成るプラスミドｐＢＩＺをＥｃｏＲＩ　　およびＸ
ｂａ　ｌで切断し、ＭＦα１シグナルペプチドおよびＰ
ＤＧＦ　Ｂｆｆｉをコードする断片を単離した。

ＴＰＩＩプロモーター、」Ｌα１シグナル配列、Ｖ−Ｓ
ＩＳ配列、ＴＰ工１ターミネータ−発現ユニットを含ん
で成るプラスミドｐＫＰ１０は、ＥｃｏＲＩ　　部位を
欠＜　ｐＢＲ３２２ベクターに挿入されており、このｐ
ＫＰｌｏをＥｃｏＲＩおよびＸｂａ　Ｉで切断して、Ｍ
ニーα１シグナル配列およびＢｆｉ配列を除去した。

ｐＫＰｌｏのベクター断片をプラスミドルＢ１２由来の
断片と連結した。この結果得られたプラスミドｐＫＰ２
６をＥｃｏＲＩおよびＸｂａ　Ｉで切断し、ＴＰＩＩ７
０−１＝−９−１Ｖ−ＳＩＳ配列、ＴＰＩｌターミネー
タ−およびＰＢ８３２２ベクター配列を含んで成る断片
を単離した。プラスミドｐＫＰ２４をＥｃｏＲ（および
Ｓｓｔ　１で切断して、コドンが最適化されたＭＦα１
シグナルペプチド配列をコードする断片を単離した。コ
ドンが最適化されているＭＦα１シグナルペプチドをコ
ードする断片とｐＫＰ２６のＥｃｏ　ＲＩ　−５ｓｔ　
　Ｉベクター断片とを連結し、プラスミドｐＫＰ２８を
造成した。

ｐＫＰ２８を造成しやすくするようにＭＦ（２１シグナ
ルペプチド配列に導入されたＳｓｔ　Ｉ部位を次に除去
して、野生型のコード配列を回復させた。プラスミドｐ
ＫＰ２８をＥｃｏＲＩ　　およびＸｂａ　　Ｉで切断し
、コドンが最適化されたＭＦα１シグナルペプチド配列
およびＰＤＧＦ　ＢＭをコードする断片を単離した。

この断片を、ＥｃｏＲＩ　　およびＸｂａ　Ｉで切断し
て線状になったｐＵｃ’ｌ１８にクローン化した。１本
鎖鋳型を単離し、オリゴヌクレオチドＺＣ１０１９（第
１表）を用いたＺｏｌｌｅｒとＳｍ１ｔｈの方法（１９
８４、前記の文献）によって変異処理した。目的どおり
に変異したプラスミドをｐＫＰ３２と命名した。

プラスミドｐＫＰ３２中に存在する、コドンが最適化さ
れたＭＦα１シグナルペプチド配列を試験管内変異によ
り変形し、天然のＧｌｕ−＾１ａ−Ｇｌｕ−＾１ａ配列
及びＭＦαｌシグナル配列中に見られるＨｉｎｄ　ｍ部
位を導入した。　ｐＫＰ３２から得た１本鎖鋳型ＤＮＡ
を、ＺＣ１０５９（第１表）を用いたＺｏｌｌｅｒとＳ
ｍ１ｔｈの方法（１９８４、前記の文献）によって変異
処理した。陽性コロニーからのＤＮＡを旧ｎｄ　ｌＩ［
で切断し、シグナル配列の３′末端への１ｌｉｎｄ　ｍ
部位の導入についてスクリーニングしな。続いて、変異
の発生を一層確実に調べるために配列を決定しな、コド
ンが最適化されたＭＦα１シグナルペプチドについて正
しい配列を有する目的のクローンは、天然のＧｌｕ−＾
１ａ−Ｇｌｕ−ΔＩａ配列およびＨｉｎｄ　ｍ部位を含
んでおり、ｐＲｓｌｌｌと命名した。

変異しなＭＦα１シグナルペプチドをベクターｐＵｃ１
１８に再びクローン化しな。プラスミドｐＲｓ１１１を
旧ｎｄ　ｍで切断し、Ｂ鎖を除去した。再び環化したプ
ラスミドをｐＲ５１１２（第１０図）と命名した。

八〇Ｉ（２−４Ｃプロモーター、コドンが最適化された
ＭＦ（２１シグナルペプチド、ａｓＦ　ＸＩ［Ｉ　ｃＤ
ＮＡ−およびＴＰＩＩターミネークーを含んで成る発現
ユニットを造成するために、プラスミドｐＴＲＫ４ｃを
ＡＤＨ２−４ｃプロモーター源およびＴＰＩＩターミネ
ータ−源として使用した。プラスミドｐＴＲＫ４ｃをＥ
ｃｏＲＩ　　およびＳａｌ　　Ｉで切断し、＾０１１２
−４Ｃプロモーター、ＴＰＩＩターミネータ−１および
ｐＩｃ７ＲＩ”ベクター配列を含んで成る４ｋｂ断片を
単離した。

プラスミドｐＲｓ２０３（実施例■、Ａ、）を旧ｎｄ　
ｍおよびＸｈｏ　Ｉで切断し、２．２ｋｂのａｓＦ　Ｘ
１ｌｒ　ｃＤＮ＾断片を単離した。プラスミド１１２を
ＥｃｏＲｌ　　およびＨｉｎｄ　ｍで切断し、０．３４
ｋｂのＭＦ（２１プロモ一ター断片を単離した。ＰＴＲ
Ｋ４ｃ断片、ａｓＦ　Ｘｍ　ｃＤＮ＾断片、および旺α
１シグナルペプチドの３つの部分をリガーゼによって連
結した。この結果生じたプラスミドをｐＲｓ２３１と命
名した（第１１図）。

ｐＲｓ２３１中に存在する発現ユニットをベクターＹＥ
ｐ１３およびｐＥＡｓ１０２へ挿入した。プラスミドＰ
ＲＳ２３１をＸｈｏ　Ｉで消化して５ｋｂの発現ユニッ
トを単離した。この断片を、Ｘｈｏ　Ｉの切断により線
状になったＹＥＰ１０に連結した。その結果得られたプ
ラスミドをプラスミド２３３と命名した。

ｐＲｓ２３１から単離した５ｋｂＸｈｏｌ　　断片を、
Ｓａｌ　　Ｉで切断して線状になったＰＥＡＳ１０２に
連結した。これで生じたプラスミドをＰＢＳ２３２と命
名した。

実質的にＢｅｇｇｓの方法（１９７８、前記の文献）通
り、上記のプラスミドにより株Ｖ−７９４−７−１ｃ等
の適当な酵母宿主を形質転換した。形質転換細胞は、ウ
ラシルを含まない合成培地（ＵｒａＤ）上で選択し、か
つ培養した。形質転換細胞を’ｉｍ１の−ＵｒａＤ上に
接種し、３０℃で一晩増殖させる。続いて、培養物を遠
心して細胞を除き、そして上清分画を収得する。上清は
、実施例Ｘ１．Ｂ、に記載した方法を用いてアッセイし
、第Ｘ■因子ａサブユニットの存在を調べた。

ＡＤＨ２−４Ｃプロモーター、ｗｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ　
（前記の文献）の規則により合成した１９個のアミノ酸
のシグナルペプチド、ａｓＦ　ＸＩＩ［ｅＤＮ＾、およ
びＴＰＩ上ターミネータ−を含んで成る発現ユニットを
造成した。オリゴヌクレオチドＺＣ１２０９およびＺＣ
１２１０（第１表）は、アニーリングを実施すれば、５
′Ｐｓｔ　Ｉ粘着末端、１９個のアミノ酸のシグナルペ
プチド（Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−＾１ａ−Ｐ
ｈｅ−Ｌｅｕ　−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−＾１ａ−Ｇ
ｌｙ−Ｐｈｅ−＾１ａ−Ｐｒｏ−ＧｌｙＴｈｒ　　Ｇｌ
ｕ−＾１ａのアミノ酸配列を有するもの）をコードする
配列、および３　’　１ｌｉｎｄ　［［粘着末端を含ん
で成るアダプターを形成するように設計されている。オ
リゴヌクレオチドへのキナーゼ処理およびアニーリング
は、Ｍａｉａｔｉｓらの記載する方法、（「分子のクロ
ーニング：実験法（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＣＩｏｎｉｎＨ
：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）　Ｊ　、
　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、
　Ｎ、Ｙ、、１９８２）に従って実施した。

ＡＤ１１２−４ｃ７０−［−−ター源オＪ：びＴＰ工１
ターミネータ−源としては、プラスミドｐＴＲＫ４ｃ　
（実施例１［［、Ｂ、）を用いた。プラスミドｐＴＲＫ
４ｃをＡＤＨ２−４゜プロモーターの３′側にＰｓｔ　
１部位を配置するような修飾した。プラスミドｐＴＲＫ
４ｃをＰｓｔ　ＩおよびＥｃｏＲｌ　　で切断して、Ａ
ＤＨ２−４ｃプロモーター、ＴＰＩＩターミネータ−５
およびｐｌｃ７ＲＩ”ベクター配列を含んで成る３、７
ｋｂ断片を単離した。キナーゼ処理およびアニーリング
処理したＺＣ１０５６／ＺＣ１０５７（実施例Ｖ、Ｂ、
）のアダプターをｐＴＲＫ４ｃ断片と連結した。これに
よって生じたプラスミドをｐＲｓ１８５（第７図）と命
名した。プラスミドｐＲｓ１８５をＰｓｔ　ＩおよびＳ
ａｌ　　Ｉで切断して線状化した。プラスミドｐＲｓ２
０３（実施例■、Ａ８）を旧ｎｄ　ＩＩＩおよびＸｈｏ
　Ｉで切断して２．２ｋｂのａｓＦ　ＸＩ［［ｃＤＮ＾
断片を単離した。そして、この断片を、線状化しなｐＲ
ｓ１８５、およびキナーゼ処理ならびにアニーリング処
理しりＺＣ１２０９／ＺＣ１２１０７ダブターに連結し
て、プラスミドｐＢＲ２２０（第１１図）を造成した。

プラスミドｐＲｓ２２０中に存在する発現ユニットをベ
クターｐＥＡｓ１０２　（実施例■）中にクローン化し
、プラスミドｐＲｓ２２１を造成する。プラスミドｐＲ
ｓ２２０をＸｈｏ　Ｉで切断して５ｋｂの発現ユニット
を単離する。プラスミドｐＥＡｓ１０２をＳａｌ　　Ｉ
で切断し、そして細菌アルカリフォスファターゼで処理
して、再び環化することを防ぐ、そして、５ｋｂの発現
ユニットと線状化されたｐＥＡｓ１０２ベクターを連結
する。

その結果生じたプラスミドをｐＥ２２０と命名し、これ
には、へＤＨ２−４°プロモーター、１９個のアミノ酸
の合成シグナルペプチドをコードするアダプター、ａｓ
Ｆ　ＸＩＩ［ｃＤＮ＾、ＴＰ■１ターミネータ−５およ
びｐＥＡｓ１０２ベクター配列が含まれている。

酵母細胞を上記の通り形質転換し、そして培養する。第
Ｘ■因子ａサブユニットの存在は、実施例Ｘ１．Ｂ、に
記載したアッセイ法を用いて調べる。

第ＸＩＩＩ因子のｄサブユニットはトロンビン開裂によ
ってａ′サブユニットに活性化され、この開裂によりタ
ンパク質のアミノ末端から３７個のアミノ酸が除去され
る。ａｓＦＸＩＩＩ　ｃＤＮ＾を、アミノ末端の３７個
のアミノ酸をコード配列を除くように変更する。一本鎖
の鋳型ＤＮＡを、ベクターｐＵｃ１１８中にａｓＦＸＩ
ＩＩ　ｃＤＮ＾を有するプラスミドｐＲｓ２０２　（実
施例Ｖ、Ａ、）から調製した。オリゴヌクレオチドは、
３７ｂｐ活性化ペプチドをコードする５′配列を除きそ
してこれをＥｃｏＲＩ部位及びこれに続く開始メチオニ
ンをコード化する配列であってａｓＦＸＩＩＩ　ｃＤＮ
＾コード領域の＋３８におけるＧＧＣとフレームに融合
しているもので置換するように設計されている。このオ
リゴヌクレオチドは、シーラー（Ｚｏｌｌｅｒ）とスミ
ス（Ｓｍｉｔｈ）　（同上）によって記載された方法を
用いてｐＲｓ２０２一本鎖鋳型ＤＮＡを変異誘発させる
のに用いる。生成する配列は、ａ′サブユニット（ａ　
’５ＦＸＩＩＩ）のアミノ末端部分をコードし、アミノ
酸＋３８をコードするコドンに融合した開始メチオニン
コドンの５′側のＥｃｏＲ１部位を伴う。変異誘発され
たファージから調製される複製型ＤＮＡを、Ｅｃｏ　Ｒ
ＩとＸｈｏ　Ｉとで消化して、ａ’５ＦＸＩＩＩ　ｃＤ
Ｎ＾を単離する。

ＡＤＨ２−４ｃプロモーター、ａ’５ＦＸＩＩＩ　ｃＤ
Ｎ＾およびＴＰＩＩターミネータ−を含んで成る発現ベ
クター配列成すル、　ＡＤｆ１２−４ｃ７ｏモー９−ト
ＴＰ　Ｉ　１ターミネータ−の源は、プラスミドｐＴＲ
Ｋ４ｃ　（実施例１１１．Ｂ、）である、プラスミドｐ
ＴＲＫ４ｃをＥｃｏＲＩと５ａｌＩで消化して、ＡＤＨ
２−４ｃプロモーター、ＴＰ１１ターミネータ−および
ｐＩｃ７ＲＩ”ベクター配列を有する４ｋｂフラグメン
トを単離する。この線形化したベクターフラグメントを
、ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩａ’５ＦＸＩＩＩ　ｃＤＮ＾フ
ラグメントと連結する。生成するプラスミドは、ｐａ　
’ＴＲＫ４ｃと呼ばれる。

ｐａ　’ＴＲＫ４ｃに存在する発現ユニットを、酵母ベ
クターｐＥＡｓ１０２中に入れる。　ａ’５ＦＸＩＩＩ
　ｃＤＮ＾フラグメントを旧ｎｄＩＩＩで消化すること
によってプラスミドｐａ　’ＴＲＫ４ｃから単離する。

ａ’５ＦＸＩＩＩ　ｃＤＮＡフラグメントを旧ｎｄＩＩ
Ｉで消化し、細菌性アルカリホスファターゼで処理して
再環化を防止し、線形化したプラスミドｐＥＡｓ１０２
と連結する。連結混合物を、Ｅ、コーリー（Ｅ、ｃｏｌ
ｉ）株ＲＲＩ中に形質転換する。生成する形質転換体か
ら調製されるプラスミドＤＮＡを制限分析によって分析
して、挿入部の方向を決定する。陽性のクローンをｐａ
　’ＥＡＳ１０２と呼ぶ。

酵母細菌は、上記のように形質転換され、培養される。

第ＸＩＩＩ因子ａサブユニットは、実施例Ｘ１．Ｂに記
載の方法を用いて検定する。

以下余白 実用ｊ［二＼ 第Ｘ１ｌｌ因子のｂサブユニットの分泌は、ＭＦ（Ｚ１
シグナルペプチド配列をファクターＸＩＩＩのｂサブユ
ニットの成熟型のコード配列に連結することによって達
成される。プラスミドｐＫＰ２４　（実施例ＶＩＩ１．
Ａ、）に存在するコドンを最適化したＭＦ（Ｚ１シグナ
ルペプチド配列と第ＸＩＩＩ因子りサブユニットｃＤＮ
＾（ＦＸＩＩＩｂ）との融合は、生体外変異誘発を用い
る。旺α１シグナルペプチド配列のアミノ酸８１をコー
ドするコドンの後に挿入される５ｓｔＩ部位と共にコド
ンが最適化されたＭＦα１シグナルペプチド配列を含有
するプラスミドｐＫＰ２４を、ＢａｍＨＩと５ｓｔＩで
消化して、」旦α１シグナルペプチド配列を単離する。

ファージクローンＡＨＦＸＩｒｌｂ２．２から単離され
る２、２ｋｂのＥｃｏＲＩ　ＦＨＩＩｂ　ｃＤＮＡフラ
グメントを、ＥｃｏＲＩで消化することによって線形化
しなｐＵｃ１１８にサブクローニングする。連結混合物
を、Ｅ、コー９−（Ｅ、　ｃｏｌｉ）株ＪＭ８３中に形
ゴ転換する。プラスミドＤＮＡはこの形質転換体から作
られ、５ｔｕＩおよび５ｓｔＩで消化されて、挿入部の
方向を決定する。ｐＦＸＩＩＩｂと呼ばれる陽性クロー
ンは１ａｃＺ’遺伝子に関してアンチセンス（ａｎｔｉ
−ｓｅｎｓｅ）の方向でＦＸＩＩＩｂ　ｃＤＮＡを有す
る。プラスミドＦＸＩＩｒｂをＢａｍＨＩとＳｓｔ！で
消化することによって線形化して、ｐＫＰ２４から単離
されたコドンが最適化された旺α１シグナルペプチド配
列フラグメントに連結する。生成するプラスミドをｐ１
１８ＦＸＩＩｌｂと命名する。

合成オリゴヌクレオチドは、５ｓｔＩ部位と成熟ＦＸＩ
ＩＩｂサブユニットをコードする配列との間の配列をル
ープ・アウト（ｌｏｏｐ　ｏｕｔ）Ｌそして旺α１のア
ミノ酸８２−８５をコード化する天然配列を挿入するよ
うに設計されている。プラスミドｐＨ８ＦＸＩＩＩｂは
、Ｅ、コーリー（Ｅ、　ｃｏｌｉ）株ＭＶ１１９３　中
４：１ｍ形質転換される。形質転換体から作られた一本
鎖鋳型Ｄ　Ｎ　Ａを、標準的処理法にしたがって生体外
変異誘発にかける。陽性クローンを制限分析によって配
列決定しそして分析し、変異誘発を確認する。

正確に変異誘発したクローンをｐＭＦＦＸＩＩＩｂと命
名する。

ｐＭＦＦＸＨＩｂ　ニ存在すルＦＸＩＩＩｂ　ｃＤＮＡ
を、３′フランキング配列を除きそして停止コドンの３
側にＸｂａ１部位３′を挿入する合成オリゴヌクレオチ
ドを用いて変異誘発させる。一本鎖鋳型ＤＮＡを、ｐＭ
ＦＦＸＩＩＩｂ”Ｑ形質転換しなＥ、コーリー（Ｅ、　
ｃｏｌｉ）株ＭＶ１１９３から作る。一本鎖鋳型を、生
体外で変異誘発させる。陽性クローンを制限分析によっ
て配列決定しそして分析し、変異誘発を確認する。正確
に変異誘発したクローンをｐＭＦＦＸＩＩＩｂと命名す
る。

プラスミドｐＭＦＦＸＩＩＩｂＸ中に存在する挿入部を
、プラスミドｐＭＶＲ１（実施例１１１．Ａ　、）中に
存在するＴＰＩＩの後ろに置く。プラスミドｐＭＶＲ１
をＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化して、ＴＰＩＩプロ
モーター、ＴＰＩＩターミネータ−および、ＩＣ７ＲＩ
’ベクタ一配列を有する４ｋｂフラグメントを単離する
。プラスミドｐＭＦＦＸＩＩＩｂＸをＥｃｏＲＩとＸｂ
ａ　Ｉで消化して、鼠ヱメ１シグナルペプチド配列とＦ
ＸＩＩＩｂ　ｃＤＮＡを含有するフラグメントを単離す
る。このフラグメントをｐＭＶＲ１フラグメントと連結
して、生成するプラスミドをｐＭＶＲＩＦＸＩＩＩｂと
命名する。

プラスミド−ＶＲＩＦＸＩＩｒｂマ中に存在する発現ユ
ニットを、酵母ベクターＹＥｐｌａ中にサブクローニン
グする。プラスミド°ｐＭＶＲＩＦＸＩＩ　Ｉｂを５ｓ
ｔｌで消化して３．２ｋｂ発現ユニットを単離する。こ
のフラグメントを、５ｓｔｌで消化することによって線
形化したＹＥｐ１３に連結した。この連結混合物をＥ、
コーリー　（Ｅ、　ｃｏｌｉ）株Ｒ，Ｒｕ中に形質転換
する。これらの形質転換体から作られるプラスミドＤＮ
Ａを制限分析によって分析を行い、挿入部の方向を決定
する。ＬＥＵ２遺伝子と同じ配向の転写方向の挿入部を
有するクローンを規定する陽性クローンをｐＹＥＦＸＩ
ＩＩｂｌと命名し、反対の配向の挿入部を有するものを
ｐＹＥＦＸＩＩＩｂ２と命名する。

プラスミドｐＥＦｘＩＩＩｂ１オよびｐＹＥＦＸＩＩＩ
ｂ２を適当な酵母宿主細胞中に形質転換し、これらの細
胞を上記のように培養する。

以下余白 Ｂ、　　　の　　にお（る　ＸＩＩＩ　　　　　ブユ第
ＸＩＩＩ因子のｂサブユニットハ、ＦＩＸ／ＶＩＩ／ｐ
Ｄ２に由来する発現ベクター中のＦＸｒｌｌｂフラグメ
ント（３９ｂｐ）に融合しり７ｒり９−ＩＸ　（ＦＩＸ
）！Ｊ　−ダー配列を用いることによって哺乳類細胞中
で発現する。ＦＩＸリーダー配列は、以下のように造成
されりＦＩＸ（−Ｇ）−＞ｐＵＣ１３カ１４な。

適当な分泌シグナル配列を得るために、ヒト第１Ｘ因子
をコードするｃＤＮＡを、ヒト肝臓からのｍＲＮＡで作
ったライブラリーから得た（クラチ（Ｋｕｒａｃｈｉ）
とデビツク（Ｄａｖｉｃ）のＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃ
ａｄ　。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７９巻、６４６１〜〜６４６４頁、１
９８２年）。第１Ｘ因子配列を、ｐ！１ｌＲ３２２ベク
ターをＰｓｔｌで消化することによって単離し、ｐＵｃ
１３のＰｓｔＩ部位中に挿入した。このプラスミドをＰ
ＩＸ−ｐＵｃ１３と命名した。

ｃＤＮＡクローニングの結果として第■ｘ因子挿入部の
５′末端に存在するＧに富んでいる領域を除くために、
合成オリゴヌクレオチドアダプターによりクローン化し
たフラグメントの５′末端を置換した。オリゴヌクレオ
チドＺＣ２１２およびＺＣ２１３（表−１）を合成し、
アニーリングして２２ｂｐのオーバーラップヲ生じさせ
、フラグメント末端を適当な制限エンドヌクレアーゼで
満たして、切断し、生成するフラグメントを第１Ｘ因子
配列に結合させた。

アダプターを構成するなめ、ＺＣ２１２およびＺＣ２１
３のそれぞれ１００ピコモルを凍結乾燥し、１０μＩの
１０×キナーゼ／リガーゼ緩街液（６００ｍＭ　トリス
、ｐ１１８．０．１００ｍＭのＭｇＣｌ２．１１００ｎ
のＤＴＴ）に８６μｍの水を加えたものに再分散した。

アニーリング反応は６５℃で１０分間行い、混合物を徐
々に室温に冷却し、氷上に置いた。この混合物に２．５
ｍＭのｄＮＴＰミックス４μｍとＴ、ＤＮＡポリメラー
ゼ１μＩを加えた。反応を１４℃で４５分間進行させた
。次いで、５ＭのＮｌ＋、０＾ｃｌｏμｌを加え、ＤＮ
Ａをフェノール／ＣＨＣｌ３で一度、ＣＨＣｌ３で２回
抽出して、エタノールで沈澱させた。ＤＮＡを遠心分離
し、１００μｌの中間塩濃度ｔＩｌ衝液（マニアチス（
Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、同上、１００頁）中に再分散し
、９単位のＰｓｔｌおよび８単位のＣｆｏＩで消化し、
上記のように抽出した。

次に、改変された第１Ｘ因子配列を、６０ｍＭのトリス
−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、１０ｎ＋ＭのＭｇＣｌ２．
１０ｍＭのＤＴＴおよび０．９単位のＴ、リガーゼを含
む２０μｍの反応溶液中で、０．１６ピコモルの合成Ｐ
ｓｔｌ　−ＣｆｏＩアダプターフラグメント、０．１４
ピコモルのＦＩＸ−ｐＵｃ１３由来の１．４ｋｂのＣｆ
ｏｌＢａｍ［（Ｉフラグメントおよび０．１４ピコモル
の２．７ｋｂのＢａｎ＋ＨＩ−Ｐｓｔ　ＩｐＵＣ１３ベ
クターフラグメントを組み合わせることによって造成し
な。反応混合物を室温で３時間インキュベーションし、
コンピテント・Ｅ・コーリー（Ｅ。

ｃｏｌｉ）ＪＭ８３を形質転換するのに用いた（メッシ
ング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮ
Ａ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ。

ＮＩＨ出版７９〜９９号、２頁；２号、４３〜４８頁、
１９７９年）、これらの細胞を、５０μＩの２％Ｘ−ｇ
ａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−
Ｄ−ガラクトシド）と共に４０Ｍｇ／ｍｌのアンピシリ
ンを含むし一グロス上に置いて、３７℃で一晩インキユ
ベーションした。白色コロ丑−をアンピシリンを含む別
のプレートへ移し、３７℃で一晩インキユベーションし
た。コロニーをワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）　５４０
Ｆ紙およびクロラムフェニコールプレート上で一晩イン
キユベーションすることを省略することを除いて、ウオ
ーレス（Ｗａｌｌａｃｅ）らの方法＜Ｇｅｎｅ、１６巻
、２１頁、１９８１年）に従ってハイブリダイゼーショ
ン用のＰ紙にプロットした。

これらのＰ紙を、０．９ＭのＮａＣｌ、０．０９Ｍのト
リス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，６ｍＭのＥＤＴ＾、０．５
％のノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）　Ｐ−４０，１５０
μｇ／ｍｌのＥ−コーリー（Ｅ。

ｃｏｌｉ）ｔＲＮＡ中で４４℃で２時間インキュベーシ
ョンした。Ｐ紙を、コ２Ｐ標識ＺＣ２３５（表−１）、
すなわち変更した５′末端舵列に特異的な１４−マーで
検査した。フィルター当たり１〜２ｘｌＯ’ｃｐｍで４
４℃、で−晩予備ハイブリダイゼーションＩＩＩ液中で
ハイブリダイゼーションを行った。

次いで、フィルターを６ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中で
３回洗浄し、Ｘ５ＳＣ１０，１％ＳＤＳ中で４４℃で３
回洗浄し、Ｘ−線フイルムに暴露した。

２種の陽性のクローンが得られた。これらのクローンの
一方をＦＩＸ（−Ｇ）　　＞ｐＵｃ１３と命名した。

ＦＩＸ（−Ｇ）−＞ｐｔｌｃ１３　ｍ酸物の第１Ｘ因子
配分の変更した領域の配列を確かめるために、ＲＲＬ逆
ブラブライマーいてｐＵＣプラスミド上に直接にジデオ
キシ配列決定を、ポリマーヌクレオチドキナーゼおよび
チャフナス（Ｃｈａｃｕｎａｓ）ら（（１３ｉｏｃｈｅ
ｍ　。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、、６０巻、９６２
頁、１９７５年）の方法によってＹ”ＰＡＴＰで標識し
たプライマー末端を用いて、つオーレス（Ｗａｌｌａｃ
ｅ）ら（Ｇｅｎｅ、１６巻、２１頁、１９８１年）の方
法を用いて行った。この配列は予測された通りであった
。

プラスミドＦＩＸ（−Ｇ）　　＞ｐＵｃ１３を、Ｐｓｔ
ＩとＨａｅＩＩＩを用いて消化し、３９ｂｐのＦＩＸリ
ーダー配列を単離した。ＦＸＩｒｌｂサブユニットは、
ＦＸｒｌｒｂがら得られる。プラスミドｐＦＸＩＩＩｂ
をＥｃｏＲＩで線形化して、末端をＤＮＡポリメラーゼ
のクレナウンラグメントで平滑化する。次に、ＤＮＡフ
ラグメントをＨｉｎｄｌＩＩで消化して、０．１４ｋｂ
　ＦＸＩＩＩｂフラグメントを単離する。操作を簡単に
するために、３９ｂｐのＦＩＸリーダーフラグメントお
よび０．１４ｋｂのＦＸＩＩＩｂフラグメントを、Ｐｓ
ｔｌと旧ｎｄＩＩＩで線形化したｐＵｃ１２中に連結す
る。生成するプラスミドをＰｓｔＪと旧ｎｄＩＩＩで開
裂して、０．１８ｋｂＦＩＸ−ＦＸＩ　ＩＩｂ融合フラ
グメントを単離する。このフラグメントを、Ｐｓｔｌと
旧ｎｄＩＩＩで線形化したＭ１３ｍｐ１１に連結する。

ＦＩＸリーダーの末端とＦＸＩＩｌｂの成熟型における
グルタミン酸との間の介在配列をループアウトするよう
に設計されたオリゴヌクレオチドを用いて、生体外の部
位特定変異誘導によってＦＩＸリーダー配列を正確にＦ
ＸＩＩＩｂに連結させる。複製型ＤＮＡを変異誘導され
たファージから調製し、Ｐｓｔｌと旧ｎｄ１１１で切断
し、０．１ｋｂのＦＩＸ−ＦＸＩＩｌｂ融合フラグメン
トを単離する。操作を簡単にするため、このフラグメン
トを、旧ｎｄｌｌｌとＰｓｔｌで線形化したｐＵｃ１３
中にサブクローンする。生成するプラスミドをＨｉｎｄ
ｌＩＩとＢａｍ旧で消化して、０．１ｋｂＦＩＸ−ＦＸ
ＩＩＩｂ融合フラグメントを単離する。

λ旺χ１１１ｂ２．２を１ＩｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ
で切断し、ＦＸＩＩＴｂの２ｋｂの３′末端を単離する
。このフラグメントを旧ｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで線形
化したｐＵｃ１３中にサブクローン化した。生成するプ
ラスミドをＥｃｏＲＩで線形化し、末端をＤＮＡポリメ
ラーゼ■のＫｌｅｎｏｗフラグメントで平滑化し、キナ
ーゼを作用させたＢｇｌｌＩリンカ−に連結する。過剰
のＢｇｌｌＩリンカ−をＢｇｌｌＩで消化して除去し、
線状のフラグメントをＴ、ＤＮＡリガーゼで再環化する
。生成するプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩとＢｇｌｌＩで
切断して、２ｋｂのＦＸＩＩＩｂフラグメントを単離す
る。

第ＸｌｌＩｂ因子発現ベクターを、プラスミドＦＩＸ／
ＶＩｒ／ｐＤ２　（ＡＴＣＣ５３０６８号）から誘導す
る。ＦＩＸ／Ｖｌｌ／ｐＤ２をＢａｍ旧で消化すると、
５　ｋｂＦＩＸ／　ＶＩＩ７　ラグメントを放出し、全
アデノウィルス２三分節リーダー、ＳＶ４０ポリマーア
デニル化シグナルおよびｐＢＲ３２２ベクター配列を含
んで成るｐＤ２ベクターフラグメントが残る。このベク
ターフラグメントを細菌性アルカリホスファターゼで処
理して再環化を防止し、０．１ｋｂのＦＩＸ−ＦＸＩＩ
Ｉｂ融合フラグメントと２ｋｂＦＸＩＩｌｂフラグメン
トに３部連結で連結する。正確な挿入部を有するプラス
ミドをＢａｍ旧とＨｉｎｄＩＩＩで消化することによっ
て決定する。このプラスミドをｐＭＦＸＩＩＩｂと命名
する。

仔ハムスターの腎（ＢＨＫ）細胞（アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクションから入手、ＡＴＣＣＣＣ１
１０号）にｐＭＦＸＩＩｂをトランスフェクションする
のに用いる処理法は、既報の方法〔例えば、ウィグラー
（Ｗｉｒｉｅｒ）、ら、Ｃｅ１ｌ、１４巻、７２５頁１
９７８年；コルサロ（Ｃｏｒｓａｒｏ）とピアソン（Ｐ
ｅａｒｓｏｎ）、Ｓｏｍｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ、７巻、６０３頁、１９８１年；グラハム（Ｇｒ
ａｈａｍ）とファン・デル・ニブ（Ｖａｎ　ｄｅｒＥｂ
）、Ｖｉｒｏｌ、　、５２巻、４５６頁、１９７３年〕
と同じである。ＢＨＫ細胞は、ダルベツコの培地（に１
０％加熱によって不活性化したウシ胎児血清を加え、グ
ルタミンおよびペニシリン−ストレプトマイシンを補充
したもの）を６０ｍｍｆｆ１織培養用ベトリ皿に入れて
、３７℃で５％ＣＯ□で２０％のコンフルエントに増殖
させる。１０μｇのＤＮＡの全量を用いて一つの６０ｍ
ｍ皿をトランスフェルトする。

３．７５μｇのｐＭＦＸＩＩＩｂ、１．２５μｇのｐＫ
Ｏ−ｎｅｏ　（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）とベルブ（
Ｂｅｒｇ）Ｊ、Ｍｏｌ　、＾ｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、、１
巻、３２７〜３４１頁、１９８２年〕および５μｇのサ
ケ精子ＤＮＡをトランスフェクションに用いる。

ＤＮＡを０．３ＭのＮａＯ＾Ｃ及び７５％エタノールで
沈澱せしめ、７０％エタノールで洗浄し、２０μｍの１
１０１１Ｉトリス−１１ｃＩ（ｐｔ１８）、１ｍＨのＥ
ＤＴ八に再溶解する。ＤＮＡを４４０μｍの水と５００
μｍの２８０ｍＭのＮａＣＩ、５−のＮａｔｌＰＯ，，
１２ｍＭのデキストロース、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ　（
ｐＨ７，１２）と、混合する。

２ＭのＣａＣｌ２６０μｍを上記混合物に滴下して加え
、溶液を室温で３０分間放置する。次いで、溶液を細胞
に加え、これらの細胞を４時間３７℃に戻す。

培地を除去し、そして２０％ＤＭＳＯ／ダルベツコの培
地に血清を加えたちの５ｍｌを加えて２分間室温に放置
する０次いで、培地を２回交換して手早く皿を洗浄し、
新たな培地中で一晩インキユベーションする。ＤＮＡを
加えてから２４時間後、培地を除き選択培地（１０ｍｇ
／＋ｍｌのＧ４１８．４９８μｇ／ｍｇのギプコ／血清
を有するダルベツコの培地）を加える。１０日後および
１３日後に、ｐＫＯ−ｎｅｏ遺伝子を含有し、そしてそ
れ故に６４１８に耐性を有する細胞を代表するそれぞれ
のクローンを９６ウェル（または２４ウエル）プレート
に移し増殖させてタンパク質の検討を行う。

細胞をダルベツコ培地に１０％ウシ胎児血清を含むもの
で増殖させる。培地を遠心分離によって細胞および細胞
破砕物から分能して、第ＸＩＩＩ因子すブユニットｂポ
リペプチドおよび生物活性について検討する　（例えば
、ＥＬＩＳ＾による）。細胞をトリプシンでプレートか
ら除いて、新鮮な培地で洗浄し、遠心分離し、−２０℃
で凍結する。細胞ベレットをＰＢＳ中で解凍し、ペレッ
ト化し、０．２５％トリトンｘ　−ｉｏｏを含むＰＢＳ
に再分散する。

試料を希釈し、そしてポリマーペプチドおよび活性を検
査する。

上記節で記載した適当に増殖した酵母細胞を遠心分離し
て、細胞をベレツＩ〜化し、スペント地地を廃棄した。

細胞をペレット化して、蒸留水で洗浄した。洗浄したベ
レットをアッセイを行うまで＝８０℃で凍結した。

凍結した細胞ベレッＩへから、粗いガラス玉による細胞
溶解物を作った。洗浄した細胞ベレットを氷上で解凍し
、等容量のリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ、シグマ（Ｓｉ
ｇｍａ）社、セン１−−ルイス、ミズリー）、１ｍＭの
β−メルカプトエタノール（シグマ社）で希釈した。ガ
ラス玉（４５０〜５００μｍ）を総量の半分に加えた。

この混合物を１分間全力で３回撹拌し、撹拌の間に試料
を氷上で冷却した。

液体をパスツール・ピペットで試験管から抜き取り、微
量遠心管に移した。ガラス玉を、β−メルカプトエタノ
ール１ｍＭを含むＰＢＳの最初の量で洗浄した。ガラス
玉を１分間撹拌し、液体をパスツールピペットで抜き取
り、もとの溶解物と一緒にした。この溶解物を次にエツ
ペンドルフ遠心管〔ブリンクマン（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ
）、ウェストバリー、二ニー・ヨーク〕中で最高速度で
５分間遠心分離した。上澄液を注意深く抜き取ってアッ
セイした。

Ｂ、第ＸＴＩＩ　　子の？性分子 第ＸＩＩＩ因子の活性を、カーチス（Ｃｕｒｔｉｓ）お
よびローランド（Ｌｏｒａｎｄ）　（同上）によって記
載されている方法と本質的に同じ方法を用いて測定する
。溶解物はローリ−（Ｉｏｗｒｙ）らが記載した方法（
Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、１９３巻、２６５〜２７５頁、１９５１年）
によって、総酵母タンパク質について測定する。試料を
ＰＢＳ＋１ｍＨのＢＭＥを有する１０μｇ／μ！の総酵
母タンパク質に希釈する。市販の第ＸＩＩＩ因子（表−
２）を用いる標準を、５０ｍＭのトリス−１１ｃＩ（ｐ
Ｈ７，５）、１０ｍＭのジチオスレイトール中で段暗希
釈で希釈する。５μｍの試料または標準を３５μｍの５
０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ１７，６）および１μｌ
のトロンビンに加える（第２表）。混合物を３７℃で３
０分間インキュベーションする。反応混合物に２Ｕのヒ
ルジン（シグマ社）を加えることによって反応を停止す
る。３７℃の６０μｍの反応混合物（表−２）を加えて
、混合物を３０分間インキュベーションする。

７．５％トリクロロ酢酸（Ｔ　ＣＡ）　１　ｍｌを加え
ることによって、反応を停止する。試料を微量遠心管中
で最高速度で５分間遠心分離して、上澄液を廃棄する。

ベレットを７，５％ＴＣＡで２回洗浄する。

次いで、ベレットを１００μｍの氷酢酸に溶解する。

５ｍｌのシンチレーションカクテル〔オブテイフローア
（Ｏｐｔｉｆ　１ｕｏｒ）、パラカード・インスツルメ
ンツ・カンパニー（（Ｐａｃｋａｒｄ　Ｉｎｓｔｒｕｍ
ｅｎｔｓ　Ｃｏ、）、ダウナーズグローブ（Ｄｏｗｎｅ
ｒｓ　Ｇｒｏｖｅ）、イリノイ〕を加え、試料をシンチ
レーションカウンター上で〔ベックマン（Ｂｅｃｋｍａ
ｎ）、バロアルト、カリフォルニア〕計測する。

１−１−民 トロンビン：凍結トロンビン〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）、
セントルイス、ミズーリー〕を５０％グリセロール、０
．２５Ｍ　トリス−１１ｃＩ（ｐＨ７，５）４．：溶解
しテ１００ｏＵ／ｍｌとする。この溶液を一２０℃で保
存する。

市販の第ＸＩＩＩ因子＝１ｍｌの５０％グリセロール、
５０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、１０ｍＭジ
チオスレイトール（ＤＴＴ、シグマ社、セントルイス、
ミズーリー）１ｍｌに第ＸＩＩＩ因子（緑十字、大阪、
日本）を溶解する。この溶液を一２０℃で保存する。

Ｎ、Ｎ−ジメチルカゼイン：Ｎ、Ｎ−ジメチルカゼイン
（シグマ社、セントルイス、ミズーリー）を０．５Ｍ　
トリス−ＦＩＣＩ、ｐＨ７，５に溶解して１０ｍｇ／ｍ
ｌとする。

′Ｈ−ヒスタミンニ塩酸塩：１ｍＣ１の３Ｈ−ヒスタミ
ン２塩酸塩〔ニューイングランド・ニューフレア−ＣＮ
ｅｗｒ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）ボストン、
マサチューセッツ〕を１０＋ｅＭの非標識ヒスタミン二
塩酸塩４ｍｌに溶解した。この溶液を一２０℃で保存す
る。

反応Ｍ街液：　　１．４Ｍ　ＮａＣｌ、１．０Ｍ　　）
リス塩基、 ０．１Ｍ　ＣａＣｌ２． ０．２Ｍ　ＤＴＴ、 ｐＨを７．５に調整する。

反応混合物：　　２．Ｏｍｌ　３Ｈ−ヒスタミン二塩酸
塩 ８、Ｏｍｌ　Ｎ　、　Ｎ−ジメチル カゼイン １．８１反応Ｍ街液。

以下余白

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒト第ＸＩＩ［因子のａ及びａ′サブユニッ
トをコードするヌクレオチド配列及びこれらのサブユニ
ットの推定アミノ酸配列を示す。第一３０番〜第一１番
ａアミノ酸は、イン−フレーム配列を表わしているよう
に思われ、他方＋１　（セリン）〜＋７３１（メチオニ
ン）のアミノ酸は、成熟ａサブユニットに存在するアミ
ノ酸を表わす。 ＋３８（グリシン）〜＋７３１（メチオニン）のアミノ
酸は、成熟ａ′サブユニットに存在するアミノ酸を表わ
す。 残基＋３１５の活性部位Ｃｙｓは、円で囲まれている。 曲がっている矢印は、アミノ末端のＳｅｒを有する成熟
タンパク質を生成する。プロセシングプロテアーゼ（た
とえばＭＥＴアミノペプチダーゼ）による切断の部位を
示す。まっすぐな矢印は、トロンビンによる第Ｘ■因子
ａ′サブユニットへの第Ｘ■因子ａサブユニットの転換
のための切断部位を明らかにする。黒くぬりつぶされた
ひし形で印されな残基は、Ａｓｎ　−Ｘ　−Ｓｅｒまた
は＾５ｎ−Ｘ−Ｔｈｒ配列での潜在的なＡｓｎ−結合の
グリコジル化部位である。中空のひし形は、はとんで又
は全く炭水化物を持たないＡｓｎ残基を特定する。 第２図は、ヒト第Ｘ■因子のしサブユニットをコードす
るｃＤＮＡのヌクレオチド配列及びこの推定アミノ酸配
列を示す。−１９〜−１のアミノ酸は、リーダー配列の
部分を表わし、そして＋１（グルタメート）〜＋６４１
（トレオニン）のアミノ酸は、成熟しサブユニットに存
在するアミノ酸を表わす。 上線を引かれたアミノ酸残基はまた、アミノ酸配列分析
によって決定された。（シかしながら、残基３９４　、
５３６　、５３７は、この分析によって同定されなかっ
た。）黒くぬりつぶされたひし形により印された残基は
、Ａｓｎ　−Ｘ　−Ｓｅｒ配列での潜在的なＡｓｎ−結
合のグリコジル化部位であり、他方中空のひし形により
印された残基は、Ａｓｎ　−Ｘ　−Ｃｙｓ配列での潜在
的なＡｓｎ−結合のグリコジル化部位である。ポリアデ
ニル化シグナル及びｐｏｌｙ　（＾）末端に対応するヌ
クレオチド配列は、ボックス内に示される。 第３図は、β２−グリコプロティン■における５回の反
復、ヒト補体のＢ因子のＢの鎖における３回の反復及び
ヒトへブトグロビンα１鎖のアミノ酸配列と、第Ｘ■因
子のｂサブユニットの反復４．５及び６におけるアミノ
酸配列との比較を示す。同じ位置における４又はそれよ
りも多くの同一の残基はボックスで囲まれる。最大の平
面図を得るために、ギャップは最少にされた。それぞれ
の反復の前の数字は、それぞれの反復における最初のア
ミノ酸の残基番号を示す。 第４図は、第ｘ■因子のｂサブユニットに存在する１０
個のアミノ酸反復の平面図を示す。その反復は、反復１
，２及び３；４，５及び６；７及び９；並びに８及び１
０を含む４種のグループに分けられた。それぞれの反復
の前の数字は−すれぞれの反復における最初のアミノ酸
の残基の番号を示す。反復のそれぞれのグループにおけ
る同じ位置での２又はそれよりも多くの同一の残基はボ
ックスで囲まれている。１０個の反復された部分の間の
ギャップは、最大の平面図を得るために最少にされた。 第５図はプラスミドｐＭＶＲ１の造成法を示す。 第６図はプラスミドｐＡＴ　　１の造成法を示す。 第７図はプラスミドｐＴＲＫ４ｃ及びその誘導体ｐＲｓ
１８５の造成法を示す。 第８図はｐＲｓ２０１の造成法及びプラスミドｐＲｓ２
０２及びｐＲＳ２０３の造成法を導びく突然変異誘発を
示す。 第９図は酵母発現ベクターｐＲｓ２１６及びｐＲｓ２１
７の造成法を示す。 第１０図は天然のＧｌｕ−ΔＩ　ａ　−Ｇ　Ｉ　ｕ−＾
１ａを有する、コドンを最適化された旺α１シグナルペ
プチド配列及びＨｉｎｄ　ｍ配列を含んで成るプラスミ
ドｐＲｓ１１１の造成法を示す。 第１１図はｐＲｓ２２０及びｐＲｓ２３１の造成法を示
す。 以下余白 ＆、：、ｉ７α７．７＋　、ｒ　、＋、、　ＺＴ、！、
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Ａ　　八ｃＡ　　ＡＣＡ　　ＴへＧＦＩＧ。２（その５
） 一　　へ−凶　ム 手続補正書（方式） 昭和６２年　１１月　３０日 特許庁長官　小　川　邦　夫　殿 １、事件の表示 昭和６２年特許願第２３６０６９号 ２、　発明の名称 ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号自発
補正 ６、補正の対象 明細書 ７、補正の内容 明細書の浄書（内容に変更なし） ８、添附書類の目録 浄書明細書　　　　　　１通 手続補正書（方式） １．　事件の表示 昭和６２年特許願第２３６０６９号 ２、　発明の名称 生物学的に活性な第Ｘ■因子の発現 ３、補正をする者 事件との関係　　　　　特許出願人 名称　ザイモジェネティクス、インコーポレイテイド（
外１名） ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号静光
虎ノ門ビル　電話５０４−０７２１　、−氏名　弁理士
（６５７９）青　木　　　朗１　　、＝＝Ｉ１１４．・
、−ｊ （外４名）しＩ ５、補正命令の日付 ６、補正の対象 （１）　　ＴＲ書の「出願人の代表者」の欄（２）委任
状 （３）明細書 （４）図　面 ７、補正の内容 （１）（２）　　別紙の通り （３）につきましては、昭和６２年１１月３０日付手続
補正書（方式）に於て既に提出数しております。 （４）図面の浄書（内容に変更なし） ８、添付書類の目録 （１）訂正願書　　　　　１通 （２）委任状及び訳文　　　　　　　　　各２通（３）
浄書図面　　　　　１通

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、第ＸIII因子のａ又はａ′サブユニットと機能的に
   相同なポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。 ２、第１図中のｂｐ９１からｂｐ２２８３まで、又はｂ
   ｐ２０２からｂｐ２２８３までの配列を含んで成る特許
   請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ配列。 ３、第１図中の第１位のセリンから始まり第７３１位の
   メチオニンで終るか、又は第３８位のグリシンから始ま
   つて第７３１位のメチオニンで終るアミノ配配列をコー
   ドするＤＮＡ配列を含んで成る特許請求の範囲第１項に
   記載のＤＮＡ配列。 ４、第ＸIII因子のｂサブユニットと機能的に相同なポ
   リペプチドをコードするＤＮＡ配列。 ５、第２図中ｂｐ５６からｂｐ１９８１までの配列を含
   んで成る特許請求の範囲第４項に記載のＤＮＡ配列。 ６、第２図中第１位のグルタミン酸から始まり第６４１
   位のトレオニンで終るアミノ酸配列をコードする特許請
   求の範囲第４項に記載のＤＮＡ配列。 ７、転写プロモーター、及びこれに続きその下流にヒト
   第ＸIII因子と実質的に同じ生物学的活性を有する蛋白
   質をコードするＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクター。 ８、転写プロモーター、及びこれに続きその下流に特許
   請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載のＤＮ
   Ａ配列を含んで成る発現ベクター。 ９、前記プロモーターがＡＤＨ２−４６ＴＰ I １又は
   ＧＡＬ１０である特許請求の範囲第７項又は第８項に記
   載の発現ベクター。 １０、特許請求の範囲第７項〜第９項のいずれか１項に
   記載の発現ベクターによりトランスフェクトされた宿主
   細胞。 １１、前記宿主細胞が酵母宿主細胞である特許請求の範
   囲第１０項に記載の宿主細胞。 １２、活性化後に第ＸIIIａ因子と実質的に同一の活物
   学的活性を有する蛋白質の製造方法であって、転写プロ
   モーター及びこれに続きその下流にある第ＸIII因子の
   ａサブユニットと機能的に相同なポリペプチドをコード
   するＤＮＡ配列並びに転写プロモーター及びこれに続き
   その下流にある第ＸIII因子のｂサブユニットと機能的
   に相同なポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んで
   成る発現ベクターを宿主細胞に導入し； 該宿主細胞を適切な条件下で培養し；そして該宿主細胞
   から前記蛋白質を単離する； ことを含んで成る方法。 １３、活性化後に第ＸIIIａ因子と実質的に同一の生物
   学的活性を有する蛋白質の製造方法であつて、転写プロ
   モーター及びこれに続きその下流にある第ＸIII因子の
   ａ′サブユニットと機能的に相同なポリペプチドをコー
   ドするＤＮＡ配列並びに転写プロモーター及びこれに続
   きその下流にある第ＸIII因子のｂサブユニットと機能
   的に相同なポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含ん
   で成る発現ベクターを宿主細胞に導入し； 該宿主細胞を適切な条件下で培養し、そして該宿主細胞
   から前記蛋白質を単離する； ことを含んで成る方法。 １４、活性化後に第ＸIIIａ因子と実質的に同一の生物
   学的活性を有する蛋白質の製造方法であって、転写プロ
   モーター及びこれに続きその下流に存在する第ＸIII因
   子のａサブユニットと機能的に相同なポリペプチドをコ
   ードするＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクターを宿主細
   胞に導入し； 該宿主細胞を適切な条件下で培養し； 該宿主細胞から前記ａサブユニットを単離し；そして該
   ａサブユニットをダイマー化する；ことを含んで成る方
   法。 １５、活性化後に第ＸIII因子と実質的に同じ生物学的
   活性を有する蛋白質の製造方法であつて、転写プロモー
   ター及びこれに続きその下流に存在する第ＸIII因子の
   ａサブユニットと機能的に相同なポリペプチドをコード
   するＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクターを宿主細胞に
   導入し； 該宿主細胞を適切な条件下で培養し；そして該宿主細胞
   からａ２ホモダイマーダイマーを単離する；ことを含ん
   で成る方法。 １６、第ＸIIIａ因子と実質的に同一な生物学的活性を
   有する蛋白質の製造方法であつて、 転写プロモーター及びこれに続きその下流に存在する第
   ＸIII因子のａ′サブユニットと機能的に相同なポリペ
   プチドをコードするＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクタ
   ーを宿主に導入し； 該宿主細胞を適当な条件下で培養し； 該宿主細胞からａ′サブユニットを単離し；そして 該ａ′サブユニットをダイマー化してａ′２ホモダイマ
   ーを形成する； ことを含んで成る方法。 １７、第ＸIIIａ因子と実質的に同一の生物学的活性を
   有する蛋白質の製造方法であって、 転写プロモーター及びこれに続きその下流に第ＸIII因
   子のａ′サブユニットと機能的に相同なポリペプチドを
   コードするＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクターを宿主
   細胞に導入し； 該宿主細胞を適切な条件下で培養し；そして該宿主細胞
   からａ′２ホモダイマーを単離することを含んで成る方
   法。 １８、特許請求の範囲第１２項〜第１７項のいずかの方
   法に従って製造された蛋白質。 １９、特許請求の範囲第１２項〜第１７項のいずれかに
   記載の蛋白質の有意量、及び生理的に許容されるキャリ
   ャー又は稀釈剤を含んで成る医薬組成物。 ２０、活性療法剤として使用するための、特許請求の範
   囲第１２項〜第１７項のいずれかに従って製造された蛋
   白質。