JPH02229861A - スルフヒドリル基含有還元剤を含む安定化抽出組成物ならびにクラミジアおよび淋菌の測定におけるその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、安定化スルフヒドリル基含有還元剤を含んで
なる組成物、抽出組成物および診断測定のためのクラミ
ジア生菌体または淋菌生菌体からの抗原抽出に対するそ
の使用に関する。

〔従来の技術〕

最近では、イムノアッセイが感染性疾患の存在を検出す
るのに使用されてきた。このアッセイが有用であるため
には、高度の信頼性を保ちながら特殊な生菌体を検出し
なければならない。これには殆どの場合に、生菌体に関
する特定抗原の単離およびその抗原と対応する抗体との
反応が必要である。商業的に成功するための試金石とし
ては、その上相当安価であり使用が簡便で、かつ迅速で
あることも必要である。

イムノアッセイによって検出することができるかかる生
菌体の１つは、タラミジアーレス（息」一ｙ史ｕ朋）目
、クラミジ７セｘ　（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ）属
の２つの菌種の１つであるクラミジア・トラコマチス（
９　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）　（本明細書では、「Ｃ
．トラコマチス」という）である。トラコーマ、包人体
性結膜炎、性病性リンパ肉芽腫、非淋菌性尿道炎および
直腸肛門炎を包含する多数のヒトの眼および性器の疾病
の原因となるこの種に属する１５以上の菌株が存在する
。Ｃ．　　｝ラコマチスに由来する感染症は、普通の人
々の間で蔓延し、そげ太め非淋菌性尿道炎だけをとって
も各年毎に数百万人存在すると信じられる。

淋病は、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、特にＮ
．ゴノｏｚ工（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）に属する
細菌により惹起される性器接触で一般に伝播される疾て
いるとはいえ、いまだ世界の多くの地域の流行期にある
人々の間に存続している。この細菌の検出および処置の
重要性は、十分に認識されている。

Ｎ．メニンギチジス（Ｎ，　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ
）およびＮ．ラクタミカ（Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａ）も
また、無視できない医療上および診断上の対象の種であ
る。

これらの疾病の広く蔓延する性質のため、クラミジア生
菌体および淋菌生菌体の検出に関する迅速、簡便かつ信
頼性のある試験法を入手することに相当な興味が存在す
る。クラミジア生菌体由来の検出可能な抗原を抽出する
ための有用な方法を見い出すべく相当な数の研究が行わ
れてきた。

固体支持体を使用して実施されるＣ．　　｝ラコマチス
およびＮ．ゴノロエエ用アッセイは、米国特許第４．　
４９７，　８９９号および同４，　４９７，　９００号
明細書に記載されている。抽出は、各種の非イオン界面
活性剤またはアニオン界面活性剤を使用して実施されて
いる。さらに、米国特許第４，　４９７．　８９９号明
細書は、クラミジア抽出媒体中に還元剤（例えば、ジチ
オスレイトール、２−メルカプトエタノールまたはＮ−
アセチルシステイン）を含めることが好ましいと記載し
ている。

〔発明が解決しようとする課題〕

ジチオスレイトールまたは他のスルフヒドリル基含有還
元剤は、外生の蛋白質を可溶化するのにクラミジア抗原
の抽出に有用であることが知られているが、これらの試
薬は一般に不安定であり、迅速に使用しない限りはそれ
らの活性を急速に失う。従って、長期間貯蔵することが
できる抽出組成物および診断試験キットを入手すること
が望まれるであろう。この安定性を有しないので、前記
の物質は商業上の興味を著しく欠いている。

〔課題を解決するための手段〕

既知の抽出組成物および分析方法に伴う前述の課題は、
スルフヒドリル基含有還元剤および１種以上の親水性ポ
リマーを含んでなる組成物によって解決される。

さらに、本発明は、水不溶性支持体および該支持体上に
ある前記組成物の乾燥塗布物からなる製品も提供する。

加えて、スルフヒドリル基含有還元剤右よび１種以上の
親水性ポリマーを含んでなるクラミジア生菌体または淋
菌生菌体から、それぞれクラミジア抗原または淋菌抗原
を抽出するために有用な組成物をも提供する。

さらにまた、（ａ）クラミジア生菌体または淋菌生菌体
からの、それぞれクラミジア抗原または淋菌抗原の抽出
に有用な抽出溶液、ならびに（ｂ）スルフヒドリル基含
有還元剤および１種以上の親水性ポリマー、を含んでな
るクラミジア抗原または淋菌抗原の測定に有用な診断試
験キットが提供される。

また一方、試験キットは、水性組成物に代え、前記乾燥
塗布物を伴う抽出組成物を含んでもよい。

本発明はまた、Ａ．クラミジア生菌体または淋菌生菌体
を含むことが予測される被験体を提供する工程、ならび
に Ｂ．前記抽出組成物を被験体と接触させることにより前
記生菌体からそれぞれクラミジア抗原または淋菌抗原を
抽出する工程、を含んでなるクラミジア生菌体または淋
菌生菌体由来の抗原の抽出方法を含む。

本発明はさらに、Ａ．前記抽出組成物によって、クラミ
ジア生菌体または淋菌生体を含むことが予測される被験
体から、それぞれクラミジア抗原または淋菌抗原を抽出
する工程、 Ｂ．抽出された抗原をそれらに対する抗体と接触させて
免疫複合体を形成する工程、ならびにＣ．被験体におけ
るそれぞれクラミジア生菌体または淋菌生菌体の存在を
表示するものとして前記複合体の存在を測定する工程、
を含んでなるクラミジア抗原または淋菌抗原の測定方法
も包含する。

本発明は、抽出方法ならびに標準的な医療および微生物
学的方法を使用して患者から得られた生物学的被験体中
のクラミジア生菌体または淋菌生菌体の存在を測定する
ための方法を包含する。このような被験体としては、例
えば、患者の頚管、尿道、目、咽喉または肛門および滑
液または病巣由来の流体のような体液から得られる綿棒
被験体が挙げられる。こうして得られる生物学的被験体
は、測定されるべきクラミジア抗原または淋菌抗原を含
む生菌体を含有することが予測される。

当該技術分野では、幾つかのアッセイが全体の細菌細胞
を検出する目的で設計されているとはいえ、細胞を有効
に溶解して細胞物から十分に抗原を抽出することが比較
的短時間で感度のよいアッセイを提供する上で有利であ
る。

本発明に従い一般に検出されるクラミジア抗原は、その
生菌体のりボボリサッカライド（糖脂質群）抗原および
その生菌体の主に外層膜蛋白である。ある態様では両抗
原とも同時に検出される。

しかしながら、本発明を実施する上ではりボポリサッカ
ライドが最も興味を引き起こすものである。

別の態様では、Ｎ．ゴノロエエのような淋菌生菌体が、
その生菌体から抽出された主要な外層膜蛋白ＩＡおよび
ＩＢ抗原の存在を測定することによって検出される。単
一の菌株を測定可能であるが、混合菌株も測定される。

本発明の重要な態様は、抽出方法において還元剤に安定
性を付与する１種以上の親水性ポリマー結合材料と組み
合わせてスルフヒドリル基含有還元剤を使用するにある
。

本発明で有用な還元剤は、蛋白、ペブチドまたはそれら
の成分のジスルフィド結合を切断することができる。限
定されるものでないが、有用な還元剤の例としては、１
．３−ジメルカブト−２−プロパノール、２．３−ジメ
ルカ７”｝−１−７’ロバノール、１．２−ジメルカプ
トエタン、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール
、メルカプトエタノールおよびチオグリセロールのよう
なチオール類が挙げられる。他の有用な化合物は、グル
タチオン、Ｎ−アセチルシステイン、システイン、チオ
グリコール酸、Ｌ−システインメチルエステル、Ｌ−シ
ステインエチルエステル、およびＮ−アセチルーＤ．Ｌ
−インシステインである。

本発明の実施にふいては、チオール類が好ましく、ジチ
オスレイトールが最も好ましいものである。

これらの還元剤は、一般的市販元から入手可能である。

この還元剤は、１種以上の親水性ポリマーと混合して使
用される。このようなポリマーには水溶性または水分散
性であることが考慮に入れられており、ビニルビロリド
ンポリマー、アクリルアミドおよびメタクリルアミドポ
リマー、アクリル酸およびメタクリル酸ポリマー、ポリ
エチレングリコールならびにポリアミンが包含される。

コポリマーを構成する成分の反復単位が所定の親水性を
示すようなものである限り、ホモポリマーもコポリマー
も利用可能である。

限定されるものでないが、代表的なポリマーとしては、
ポリ　（アクリル酸）、ポリ　（メククリル酸）、ポリ
　（アクリル酸−コーアクリル酸メチル）（重量比、９
０：１０）、ポリ　（アクリルアミド）、ポリ　（アク
リルアミドーコーアクリル酸）（重量比、５０：５０）
、ポリ　（メタクリルアミドーユーメタクリル酸）（重
量比、７０：３０）、米国特許第１７０２．　２４９号
および同４，　６８９．　３５９号明細書に記載される
ところのポリアミンならびにポリエチレングリコールが
挙げられる。また、ポリ　（ビニルビロリドン）、ポリ
　（ビニルピロリドンーユーアクリル酸）（重量比、６
０：４０）、ポリ　（ビニルビロリドンーユーアクリル
アミド）（重量比、５０：５０）、およびポリ（ビニル
ビロリドン−三−メタクリルアミトーユーアクリル酸）
（重量比、７５　：　１０　：　１５）のようなビニル
ビロリドンホモポリマーおよびビニルビロリドンコポリ
マーも利用できる。好ましいポリマーは、ビニルビロリ
ドンポリマー、アクリルアミドポリマ−（メタクリルア
ミドポリマーを含む）ならびにビニルピロリドンとアク
リルアミドモノマ一のコポリマーである。本発明の実施
に際して最も好ましいポリマーは、ポリ　（アクリルア
ミド）である。

これらのポリマーは、一般に標準的な乳化重合法を使用
して製造され、ラテックス粒子のようなｙＩ３濁液とし
て使用するか、またはそれらを還元剤と混合して乾燥し
ポリマーフィルムに成形することもできる。殆どのポリ
マーは市販されている。

本発明の実施では、一般に還元剤および親水性ポリマー
がボリマ一対還元剤の重量比で少なくとも１：１０にて
共に使用される。好ましくは、この比はｌ：５〜５：１
である。ポリマーおよび還元剤の水性組成物中では、還
元剤が一般に、少なくとも５ミリモル濃度、好ましくは
２０〜５０ミリモル濃度で存在する。

還元剤と親水性ポリマーは、一般に１種以上の適当な緩
衝剤を含有する水性組成物として供給することができる
。一般に、この組成物はｐＨ５〜７に緩衝化される。こ
れは、クラミジア生菌体または淋菌生菌体からの抗原の
抽出法に有用である。

この組成物は、抽出工程の個々の段階でそのまま使用す
るか、またはさらに１種以上の抽出試薬を含んでなる抽
出組成物の一部として含めることもできる。

好ましい態様では、還元剤と親水性ポリマーが混合状態
で水不溶性支持体上に塗布され、その後の使用のために
乾燥される。例えば、この混合物は、ポリマーフィルム
、ガラススライドのような製品上あるいは試験管内壁、
抽出装置内壁または当業者により容易に決定されるその
他の支持体内壁上に塗布することができる。有用な支持
体は、ポリマーフィルム、セルロース材Ｌ　ガラス、セ
ラミック、金属および当業者により容易に決定される他
の材料から作製することができる。混合物は、もう一つ
の抽出試薬を添加して乾燥物を可溶化し、そして抗原を
抽出することができる抽出装置または試験管の内壁上に
塗布するのが特に好ましい。代表的な抽出装置は、米国
特許第４．　７４６，　６１４号明細書に示されている
。

支持体のある位置に置かれた還元剤とポリマーの乾燥塗
布物、ならびにその支持体の他の分離した位置に置かれ
た１種以上の他の試薬（例えば、緩衝剤または抽出試薬
）の乾燥塗布物を有する前記のような抽出装置を使用す
ることが、本発明を実施する上で特に有用である。好ま
しくは、このような第二の試薬は本明細書に記載するよ
うな緩衝剤である。

抗原の抽出は、クラミジア抗原または淋菌抗原の抽出に
有用な１種以上の試薬、例えば、界面活性剤、酵素、胆
汁酸塩および当該技術分野で既知の他のものを含むいず
れかの標準的抽出組成物を使用して達成することができ
る。このような抽出試薬を記載する文献は相当数存在す
る。

好ましい態様では、少なくともｐＨ８、好ましくは少な
くともｐ１１９の抽出組成物を使用して抽出が実施され
る。少なくともｐＨ１０が最も好ましい。適切なｐｉ｛
は、組成物中に適当量の緩衝剤または強塩基を含ませる
ことにより生せしめる。本明細書で「強塩基」の語は、
２５℃で少なくともｐＫａ　３を有する化合物を意味す
ることを意図する。有用な塩基は当業者には容易にわか
るであろうが、水酸化アルカリ金属、水酸化アルカリ土
類金属および水酸化アンモニウム（例えば、水酸化ナ｝
　ＩＪウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸
化アンモニウムおよび水酸化リチウム）、リン酸塩（例
えば、リン酸三ナトリウムおよびリン酸三カリウム）、
トリ　（ヒドロキシメチル）アミノメタンならびに類似
化合物が含まれる。組成物中の強塩基量は、その塩基の
ｐＫａにより変動するが、一般に１〜３０ｍｇ／ｒＲｌ
で利用でき、２〜２０■／ｍｌが好ましい。

場合により、抽出組成物は、１好ましくは２〜３０ｍｇ
／一の量でアルコールアミンをさらに含ませてもよい。

有用なアルコールアミンとしては、エタノールアミン、
ジエタノールアミン、プロバノールアミン、トリエタノ
ールアミンおよびそれらの塩が挙げられる。他のものは
当業者に容易にわかるであろう。

その他の添加剤、例えば、カチオン界面活性剤（主要外
層膜蛋白の抽出の際には特に望まれる）、過酸化水素活
性を抑制するための保恒剤、ヰレート剤ふよび消泡剤を
抽出組成物に含ませることが好ましい。

本発明の抽出組成物は、前述のスルフヒドリル基含有還
元剤を少な《とも５ミリモル濃度で含むのが好ましく、
より好ましくは２０〜５０ミリモル濃度で含む。また、
好ましい抽出組成物は、前述の１種以上の親水性ポリマ
ーをも適当量含む。

抽出は、クラミジア生菌体および淋菌生菌体を含有する
ことが予測される生物学的被験体を供給し、次いでそれ
を適当な容器中で十分な時間本発明の抽出組成物と接触
（すなわち、インキニベーション）して、細胞を溶解し
そしてアッセイのために抗原を抽出することによって実
施することができる。特定の被験体に関しては長時間要
するが、一般に、抽出工程は１０分まではかからない。

接触は、一般に室温（すなわち、１８〜２５℃）で行わ
れるが、必要があれば４０℃までのより高温を使用して
もよい。しかしながら、当該技術に要求される高温は、
本発明の実施では避けることができる。

被験体の撹拌が好ましい場合もある。抽出は、いずれか
の適当な容器中で行うことができる。好ましくは、目的
に応じて特別に設計される適当な抽出装置でそれが行わ
れる。多数のこのような装置が、米国特許第４．　７４
６．　６１４号明細書のような従来技術で既知である。

適当なインキュベーション後、場合によって、抽出され
た抗原を含有する溶液は、適当な酸を用いてｐＨ６〜８
に低下される目的で中和してもよい。

それはまた、内在性過酸化物を除去するための処理を行
ってもよい。生菌体から抗原が抽出されると、必ずしも
必要ではないが、次の処理の前に前記溶液を予備濾過し
、細胞残屑、粒状物および他の不要物を除去することが
望ましい。予備濾過は、ある種のフィルターを備えた適
当な容器中で行うことができる。

次に、濾過された被験体は、抽出された抗原の存在を測
定するために数種の分析方法のいずれかにかけられる。

これらの方法には、必ずしも好ましくはなく、特定の実
例において選ばれるだけのものもありうるが、培養法、
カウンター免疫電気泳動法および血清法が含まれる。

好ましくは、抽出された抗原が１種以上の適当な抗体と
免疫学的に反応するイムノアッセイを使用してその抗原
を検出する。こうして得られた免疫複合体は、適当な放
射線測定法、比色法、蛍光法または酵素標識試薬を使用
して検出される。ある場合には、試薬が抗原に対する標
識抗体であり、別の場合には、試薬が抗原と反応する未
標識抗体に向けられる標識抗一抗体である。このような
イムノアッセイは、一般に、塗布されているか塗布され
ていないある種の固体支持体上で検出可能な免疫複合体
の形成と、それに続く適当な検出手段を含む。他のアッ
セイでは、前記複合体の少なくとも１種の反応体が、複
合体形成中に共に凝集するある種の標識粒子または未標
識粒子に付着する場合、免疫複合体の凝集を伴う。

有用なアッセイ例としては、コンペティティブイムノア
ッセイまたはエンザイム・リンクド・イムノソルベント
・アッセイ（ＥＬＩＳ＾》が挙げられる。

このようなアッセイは、一般に、米国特許第４，　４２
７，　７８２号明細書（前記）およびＳｃｈｍｅｅｒら
により、Ｊ，ＣＩｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，，　　１
５　（５）．　　８３０　〜８３４ページ（１９８２）
に記載されている。

使用されるクラミジア抗体または淋菌抗体は、生菌体か
ら抽出されるいずれかの抗原または数種の抗原に向ける
ことができるものである。ある態様では、Ｃ．トラコマ
チスのりポボリサッカライドのような単一抗原に抗体が
向けられる。もう一つの態様では、数種の淋菌株から抽
出されるところの数種の抗原に数種の抗体混合物が向け
られる。

類似の面相イムノアッセイは、米国特許第４．　４９７
．　８９９号および同４，　４９７．　９００号明細書
に記載されており、これらにおいては、長時間をかけて
高い温度でインキユベーションすることによって未塗布
支持体に抽出された抗原を吸着させている。

好ましいイムノアッセイは、抽出された抗原を多数の正
荷電基を表面上に有するポリマー固体支持体と接触させ
ることによって行われる。この支持体は、抽出された抗
原とイオン結合し得る適当なカチオン基を表面上に有す
るいずれかの天然または合成ポリマー材料で構築するこ
とができる。

有用なポリマーには、必要な荷電基を有するエチレン系
不飽和ビニルモノマーふよび当該技術分野で既知の他の
モノマーから製造される付加ポリマ、ポリエステル、ポ
リアミド、ボリカーボネート、ボリエチレンイミン、セ
ルロース系材料が含まれる。一般的に、カチオン基とし
ては、四級アンモニウム塩、四級ホスホニウム塩、四級
スルホニウム塩、四級ピリジニウム塩、四級ピリミジニ
ウム塩または四級イミダゾリウム塩が挙げられ、四級ア
ンモニウム塩が好ましいものである。

ポリマー支持体（塗布または未塗布》は、いずれかの適
切な形状、例えば、ビーズ、フィルム、ゲルまたは膜に
成形することができる。界面活性剤が塗布された膜（荷
電または無荷電）も有用である。

本明細書で開示される支持体は、アッセイを実施するた
めの他の備品（ボトル、試験管、綿棒、ビーカーまたは
カップ）と組み合わせて使用することができる。また一
方、好ましくは、アッセイを実施することができ、すべ
ての流体に適応できる使い捨て試験装置中に膜が固定さ
れる微孔質膜を有する。試験装置の存用な形状は、米国
特許第３．　８２５．　４１０号、同３，　８８８．　
６２９号、同３，　９７０．　４２９号および同４，　
４４６．　２３２号明細書を含む当該技術分野で知られ
ている。特に有用な装置は、特開昭６３−２２３５６３
号公報および特願昭６３−２３４６９２号明細書に記載
されている。

殆どの場合に、荷電支持体に抗原が接触するやいなや抗
原はそれに優先的に直接結合する。「直接」とは、支持
体に付着されている結合性生物学的化合物（例えば、抗
体）を介して抗原が結合されるものでないことを意味す
る。「優先的」とは、他の物質が膜に全く結合しないこ
とを意味する。

従って、接触の１０分以内、好ましくは１〜５分以内に
結合された抗原が適当な抗体（クラミジア抗原または淋
菌抗原に向けられるいずれか）と接触され、こうして支
持体上に免疫複合体が形成される。アッセイが使い捨て
試験装置を使用して行われる場合には、支持体は、抗原
が膜に結合されるときに、被験体中の流体および複合体
化しない物質が膜を通過するような微孔質膜であっても
よい。

このアッセイで使用される抗体は、市販されているかま
たは既知の方法を使用して調製されうるポリクロナルま
たはモノクロナルであることができる。

ある態様では、抗原に対する抗体は検出のために標識さ
れる。利用可能な標識は当該技術分野で知られている。

特に好ましい態様では、標識がベルオキシダーゼであっ
て、アッセイのある時点で過酸化水素および適当な色素
生成試薬を添加して検出可能な色素を提供する。例えば
、有用な色素生成試薬としては、テトラメチルベンジジ
ンおよびその誘導体、ならびにトリアリールイミダゾー
ルロイコ染料（米国特許第４．　０８９．　７４７号明
細書に記戟）のようなロイコ染料、またはベルオキシダ
ーゼと過酸化水素の存在下で反応して色素を提供する他
の化合物（すなわち、ベルオキシダーゼの触媒作用によ
り反応して色素を提供する化合物）が挙げられる。

好ましい態様では、クラミジア抗体または淋菌抗体は標
識されておらず、それぞれ、形成されそして支持体に結
合される抗体一抗原の検出は、前記の標識されていない
抗体に対して特異的で、かつ適当に標識されている第二
の抗体（下記）を使用して遂行される。

支持体に結合される免疫複合体の生成を促進するには、
一般に、抗体と抗原を１０分未満１５〜３０℃の温度で
インキユベーションする。好ましくは、このインキコベ
ーションは、５分未満室温くすなわち、１８〜２５℃）
で行う。

インキユベーション後であって、抗体一抗原接触の１０
分以内に結合した複合体は、一般にｐＨ７〜１１を有す
る洗浄液で１度以上洗浄される。

前述の態様でクラミジア抗体または淋菌抗体が標識され
ている場合には、洗浄後のアッセイ手順は直接標識を検
出するか、または適当な試薬の添加後に間接的に標識を
検出することである。これは、結合複合体を洗浄した後
、比較的早く行われる。場合により、試薬がインキコベ
ーションに耐えうるならば、それによって標識の検出を
早めてもよい。次に、標準的な装置および方法を使用し
て標識が検出される。

前記の好ましい態様では、クラミジア抗体または淋菌抗
体は標識されておらず、結合複合体を洗浄した後、それ
が未標識抗体に対する抗体と接触される。この第二の抗
体（すなわち、抗一抗体）は、前述のいずれかの標識で
適当に標識される。

この抗体は、市販されているかまたは既知の方法で調製
されるモノクロナルまたはボリクロナルのいずれであっ
てもよい。

この接触後、支持体に結合されている得られた抗原一抗
体一抗体複合体は、１５〜３０℃の温度でｌＯ分未満イ
ンキユベーションされる。好ましくは、このインキコベ
ーションは室温で５分までである。

さらに洗浄を行って複合体化していない物質を除去し、
次いで適当な酵素基質または他の必要な試薬を添加して
検出可能な種を提供する。次に、結合した抗原一抗体一
標識抗体複合体が、標準的な検出法を使用して支持体上
で検出される。

以下の例は、本発明を具体的に説明するために提供する
が、本発明の範囲を限定するものではない。

〔実施例〕

例７で使用される＾ｍｉｄｅｃｋ■プロテアーゼ（Ｅａ
ｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ　ＣｏｍｐａｎｙのＢｉｏ　Ｐ
ｒｏｄｕｃｔｓ部門より入手）は、７６位のアミノ酸と
してアスパラギン酸を、１０９位右よび２１８位の両方
にセリンを有するサブチリシン類縁物であった。

バタテリオファージＭ１３ｍｐｌ８ａｐｒ４［Ｓｅｒ”
’，　Ｓｅｒ”’］（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能なＭ１３
ｍｐｌ８バクテリオファージ由来）からの一本鎖Ｄ　Ｎ
　Ａを、次のブライマーとアニールした。

５　’　ＧＣＴ　ＣＴＴ　ＧＡＴ　ＡＡＣ　ＴＣＡ　Ａ
ＴＣ　３　’Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　Ａｓｐ　　Ａｓｎ　
　Ｓｅｒ　　ｌｉｅ上記中、Ｇ，Ｃ，Ｔ．Ａはヌクレオ
チド塩基に関する標準的な記号であり、Ａｌａ，　Ｌｅ
ｕ，　　Ａｓｐ，　Ａｓｎ，Ｓｅｒ　Ｊａよびｌｉｅは
アミノ酸についての標準的な略号である。このプライマ
ーは、ＢｅａｕｃａｇｅらによりＴｅｔｒａｈｅｄｒｏ
ｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２，　１８５９〜１８６２ペー
ジ（１９８１）に記載されるフォスファイト法（ｐｈｏ
ｓｐｈｉｔｅ　ｍｅｔｈｏｄ）により合成した。これは
、ａｐｒ　Ａサブチリシンのアミノ酸７４〜７９に対す
るコドンを含むヌクレオチドと塩基１個の交換（星印が
付されている）以外は相同であり、ここではアデニンが
グアニンに変化しており、Ａｓｎ”（コドン＾八Ｔ》が
＾ｓｐ７１ｇ（コドンＧＡＴ）に変化する変異を可能と
している。

このブライマーを６５℃でＭ１３ｍｐｌＢａｐｒ４［Ｓ
ｅｔ１ｏ’３ｅ，４１８］　にアニール化して、このア
ニール化ＤＮＡを徐々に約２２℃まで冷却し、次いでア
ニール化ＤＮＡ溶液１２．５ｄ、１０ミリモル濃度のｄ
ＡＴＰ　，　ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰの各２０ｄ、１２
ミリモル濃度のＡＴＰ　２０ｄ、クレノウＤＮＡポリメ
ラーゼ０．　１７’，　Ｔ４　［）ＮＡリガーゼ０．Ｉ
Ｉならびに滅菌蒸留水１３ｄから成る反応混合物を１５
℃で２時間重合させた。得られた二本鎮を共有結合的に
閉環した環状ＤＮＡを、トランスフェクションによって
Ｅ・コリー（Ｅ，　ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３に導入した。

バタテリオファージ・ブラークをハイブリダイゼーショ
ン膜に移し、目的の塩基交換を伴うＤＮＡ含有物を、４
６℃で放射線標識（γ３２ｐ）合成オリゴヌクレオチド
に対するハイブリダイゼーションによって同定した。あ
るポジティブ・ブラークは、Ｍ１３ｍｐｌ８ａｐｒ４［
Ａｓｐ”，　Ｓｅｒｌ０９，　Ｓｅｔ””ラとして命名
したバタテリオファージを含んでいた。このバタテリオ
ファージ由来の二本鎮ＤＮＡをｌ｛ｉｎｄ■とＫｐｎ　
Ｉとを組み合わせて消化し、次いで予め｝ｆｉｎｄ　Ｉ
ＩＩとκｐｎＩで消化したブラスミドｐＡＭＢ１０６に
ａｐｒ　Ａ　２ブチリシン遺伝子の３箇所に突然変異を
担持する７５０ｂｐ断片を連結させた。得られたブラス
ミド（１）ＡＭＢ１３１）を宿主細胞Ｂ・ズブチリス（
Ｂ，ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に導入し、［Ａｓｐｆｆｌｉ，
　Ｓｅｒ１０９．　３ｅｒ２１１１コサブチリシン（す
なわち、プロテアーゼ）を合成分泌させた。

このプロテアーゼの活性は、次式スクシニルーＬ−＾１
ａ　−　Ｌ　−Ａｌａ　−　Ｌ　−Ｐｒｏ　−　Ｌ　−
Ｐｈｅ　−　ｐ−ニトロアニリドで示される合成ペプチ
ドを基質として使用し、ｐ−ニトロアニリンの放出に起
因する４１０ｎｍにおける吸収の増加率をモニターして
測定した。典型的には、トリス（ヒドロキシーメチル）
アミノメタン塩酸緩衝液（０．５モル濃度、ｐＨ　８　
）、塩化カルシウム（１ミリモル濃度）および前記ペプ
チド（１ミリモル濃度）を含む反応混合物（１７７ｌ１
ｌ！）を調製し、２５℃で連続的にプロテアーゼ活性を
測定した。比活性は、１分以内に４１０ｎｍにおける測
定で吸光度１．０の変化を１単位として、固体１　ｍｇ
当たりの単位数（単位／ｍｇ）として示される。

例１〜３：水性溶液での還元剤の安定性改良これらの例
は、本発明の水性溶液を提供する目的でスルフヒドリル
先含有還元剤を親水性ポリマーと混合することによって
改良された安定性が付与されることを例証する。

数種の保存試験を行った。第１の試験は、水性溶液中１
４日間室温（１８〜２５℃）で行った。第２および第３
の試験は、それぞれ、７週間３５℃（室温で約３９週に
等価）および７週間７０℃（室温で約７９週に等価）で
行った。

ジチオスレイトール活性についてのアッセイは、保存試
験の期間中Ｅｌｌｍａｎの方法（Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏ
ｆＢｉｏｃｈｅｍ／Ｂｉｏ　ｈｙｓｉｃｓ，　８２，　
ＴＯページ、１９５９）とＦ，ｌｌｍａｎ試薬を使用し
て行った。試薬が初めて混合されたときと保存試験期間
中のいろいろな時間に４１２１ｍにおける光学濃度を測
定した。次に、残存するジチオスレイトールのパーセン
テージを試験開始時における光学濃度と保存期間終了時
における光学濃度との間の差違から算出した。Ｅｌｌｍ
ａｎ試薬は、リン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍ！！、０
．１モル濃度、ｐＨ　７．　０　）に５・５′−ジチオ
ビス（２−二トロ安息香酸）　（３９．　６ｍｇ）を溶
解することにより調製した。

還元剤の緩衝溶液と親水性ポリマーは、以下のように調
製した。

例１：２−（Ｎ−モルホリノ》エタンスルホン酸（３０
０ｐ１、１００ミリモル濃度、ｐＨ６．０）、アジ化ナ
トリウム（３０（１’　，　１　ｍｇ／ｒｎｌ水）、エ
チレンジアミン四酢酸（２０ｍｇ／ｍｌ水）、水（３７
２ｌ１ｌ）　、５　．　５ジメチル−１・３−シクロヘ
キザンジオン（エタノール１５０ＩＪ１中９ｍｇ）、ポ
リ　（アクリルアミドーコービニルピロリドン）（重ｍ
比、５０　：　５０）　（１８．　０２％固形分》およ
びジチオスレイトール（８７．５＋ｙ＋ｇ）から調製し
た。この最終ポリマー濃度は約１０重量％であった。

例２：ポリマーがポリ　（アクリルアミド）（水中２５
％溶液１．６ｒｄ）であったことを除き例１と同様に調
製し、最終濃度は１２．７重量％であった。

例３：ポリマー量が水中２５％溶液８００ｄであったこ
とを除き例２と同様に調製し、最終濃度は６．３５重量
％であった。

安定性試験 ジチオスレイトール溶液は以下のように調製した。

ＴＲＩＺＭＡ■緩衝液（２０ｐｌ，　　２００ｍｇ／ｍ
水、チメロサール防腐剤０．０１重量％含有）に２−（
Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（２８０ｐ７　，　
１０ミリモル濃度、ｐ｝１６．（１）、塩化ナトリウム
（５０ミリモル濃度）、塩化カルシウム（５ミリモル濃
度）、１．２−プロパンジオール（１０％Ｗ　／　Ｖ　
）および防腐剤（０．０１重量％）を混合した。

この溶液を、前記例１〜３の溶液（５０ｐｌ）の各々と
共に個別の試験管に加えてその中で混合した。

次に、水９，９−にそれぞれの溶液１００ｐ’を加える
ことにより前記で得られた混合物を１：１００に希釈し
た。これらの最゜終溶液を「ベヒクル」溶液として使用
した。

゛これらのベヒクル溶液の第１画分（９０ｍ）を水（７
４０１１Ｉ）中Ｂｌｌｍａｎ試薬（２０ＩＩＩ）オヨヒ
リン酸カリウム緩衝液（２００ｇ’、０．１モル濃度、
ｐ｝１８．０）に加えた。次に、例１．２および３のそ
れぞれについて光学濃度を記録した。

前記ベヒクル溶液の第２画分（９０ｌ１１）を１４日間
室温に保存した後、Ｂｌｌｍａｎ試薬に前記のように加
えた。次に、例１・２および３のそれぞれについて光学
濃度を記録した。

次に、１４日後に残存するジチオスレイトールのパーセ
ンテージを光学濃度の差違から算出した。

結果を下記に示す。

第　　■　　表 例　　　残存ジチオスレイトール（％）１　　　　　　
　　９５．　９ ２　　　　　　　　９４．２ ３　　　　　　　　９４．３ 米国特許第４，　７４６，　６１４号明細書に記載され
るもののような抽出装置を作製してこれらの例で使用し
た。本発明の製品は、約１５時間室温で装置内に、それ
ぞれ例１〜３の溶液（各５０１ｄ　）を乾燥塗布するこ
とにより作製した。例４の製品は例１の溶液の使用に対
応し、例５および６についても同様である。対照装置は
、ポリマーを除去した以外は例１と同様に調製した対照
溶液から作製した。チメロサール防腐剤（０．０１重量
％）を含有するＴＲＩＺＭ＾■緩衝溶液（２００ｍｇ／
ｍＩ！溶液、２０ｄ）をまた、前記ジチオスレイトール
塗布物から離れた位置で前記抽出装置中に置き、室温で
約１５時間乾燥させた。

乾燥塗布物を含有する抽出装置の一群を、２一（Ｎ−モ
ルホリノ）エタンスルホン酸緩衝剤（１０ミリモル濃度
、ｐＨ６．０）、塩化ナトリウム（５０ミリモル濃度）
、塩化カルシウム（５ミリモル濃度）、１．２−ブロバ
ンジオール（１０％ｗ　／　ｖ　）および防腐剤（　０
．０１重量％）含有溶液（２８０Ｉ１Ｚ）で処理して塗
布物を溶解した。次に、それら（１００ａ／）を水（９
．９１ｎ！！）に添加することにより、前記で得られた
溶液を１：１００に希釈した。次に、この希釈溶液（９
０ｄ）を、水（７４０ｌ１ｌ）中εｌｌｍａｎ試薬（２
０ａ！）とリン酸カリウム緩衝液（２００ｍ　，　０．
　１モル濃度、ｐＨ８．０）含有ヰユベットに加えた。

それぞれの光学濃度を４１２ｎｍで記録した。

乾燥塗布物を含有するもう一群の抽出装置は、脱水剤と
酸素スキャベンジャーを含有する密封した袋の中に置い
た。幾つかの装置を７週間３５℃で保存し、その他を７
週間７０℃で保存した。

保存期間後、それらの装置を、第１群の装置について前
述したように処理（すなわち、緩衝液とＦｉｌｌｍａｎ
試薬で処理）し、４１２ｎｍで光学濃度を測定した。保
存期間後に残存するジチオスレイトール活性のパーセン
テージを算出した。結果を、以下の第■表と第■表に示
す。スルフヒドリル基含有還元剤と一緒に存在する親水
性ポリマーがその保存安定性を高めることは明白である
。

第■表 ５１，９ ９２．９ ８１．７ 第■表 ４　　　　　　　　　　　４３．　１ ５　　　　　　　　　　　１００．　０６　　　　　　
　　　　　９４．　５ 対照　　　　　　　１３．０” ０　７０℃で３週間後 例７：安定化ジチオスレイトールとプロテアーゼこの例
では、前述の＾ｒｎｉｄｅｃｋ■プロテアーゼとポリ　
（アクリルアミド）で安定化したジチオスレイトールを
使用するクラミジア生体のりボボリサッカライド抗原の
測定について本発明の実施態様を具体的に説明する。

１８種の被験体は、子宮頚管内綿棒を使用して女性患者
から得た。これらの被験体は、相当量の全血もしくは粘
液またはそれらの両者を含有してふり、また、Ｃ．トラ
コマチスの存否については標準的な培養法を使用して試
験しておいた。

使用した材料 米国特許第４．　７４６，　６１４号明細書に記載され
るような抽出装置は、（１）チメロサール防腐剤（０．
０１重量％》を伴うトリス（ヒドロキシーメチル）アミ
ノメチン緩衝液（１．６５モル濃度溶液２０Ｉｄ，ｐＨ
１１．１）　、および（２）２−（Ｎ−モルホリノ）エ
タンスルホン酸緩衝剤（ＩＯミ！ｊモル濃度、ｐＨ６．
０）、アジ化ナトリウム（１．５４ミリモル濃度）、エ
チレンジアミン四酢酸（５．４ミリモル濃度）、ジメド
ン（ｄｉｍｅｄｏｎｅ）　（２１．　４ミリモル濃度）
およびポリ　（アクリルアミド）（６．３５重量％）含
有溶液５０Ｉ中ジチオスレイトール（０．１８８モル濃
度）混合物の乾燥塗布物を個別に担持させて作製した。

プロテアーゼ溶液は、Ａｍｉｄｅｃｋ■ブロテアーゼ（
４ｍｇ／ｉｆ、１７０単位／ｍｇ）　、２　−　（Ｎ−
モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝剤（１０ミリモル濃
度、ｐＨ６）、塩化ナトリウム（５０ミリモル濃度）、
塩化カルシウム（５ミリモル濃度）、１．２−プロパン
ジオール（１０％ｗ　／　ｖ　）および防腐剤（０．０
１重量％）を含有せしめて調製した。

過酸化水素溶液は、過酸化水素１２重量％、ジエチレン
トリアミン五酢酸（１０マイクロモル濃度）および防腐
剤（　０．　０１重量％）を含有せしめて調製した。

洗浄液は、３−シクロヘキシルアミノ−２−ヒドロキシ
−１−ブロバンスルホン酸緩衝液（ｐＨ１０．０、０．
０５モル濃度）、６ｍｃａｌ■ＣＣ−９カチオン界面活
性剤（０．７５重量％）および防腐剤（０．旧重量％）
を含ませた。

対照試薬溶液は、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）　（ｐＨ　
７．　２　）中に抗クレアチンキナーゼＭＢ抗体（　５
　ｆｆ　／ｒｒＬｌ）、カゼイン（０．５重量％）　、
Ｌｏｎｚａｉｎｅ■Ｃ両性界面活性剤（　０．　０１重
量％〉、防腐剤（０．０１重量％）を含ませた。

リボポリサッカライド抗原に対するモノクロナル抗体（
　４　ｎ　／ｍｌ）は、前記のようにカゼイン、Ｌｏｎ
ｚａｉｎｅ■Ｃ両性界面活性剤および防腐剤を含有する
リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．２）として供給した。

ワサビペルオキシダーゼに接合させたヤギ抗一マウスＩ
ｇＧ抗体（１：７００希釈物）は、前記のようにカゼイ
ン、Ｌｏｎｚａｉｎｅ■両性界面活性剤および゛防腐剤
ならびに４′−ヒドロキシアセトアニリド（ＩＩＨＩＪ
モル濃度）を有するリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．２）とし
て供給した。

ロイコ染料組成物は、２−　（４−ヒドロキシ−３−メ
トキシフェニル）−４．５−ビス（４−メトキシフェニ
ル）イミダゾールロイコ染料（０．００８重量％）、ポ
リ　（ビニルビロリドン）（１重量％）、リン酸ナトリ
ウムｌＨＪｊ剤（ｐｌｌ　６．　８　、１０ミリモル濃
度）、ジエチレントリアミン五酢酸（１０マイクロモル
！！）、４’−ヒドロキシアセトアニリド（２ミリモル
濃度）および過酸化水素（ＩＯミＩＪモル濃度）を含め
た。

アッセイ アッセイは、各被験体に対する別個の試験装置を使用し
て得られた１８種の被験体それぞれについて、以下のよ
うに行った。前記プロテアーゼ溶液（約２８０４　）を
抽出装置に添加し、次いで患者の綿棒をその中に置いて
５〜１０秒間回転させ、引き続き室温（すなわち、１８
〜２５℃）で３分間インキコベーションした。

次に、さらに５〜１０秒間回転させ、次いで３分間室温
でインヰユベーションした綿棒含有の前記装置に前記抽
出溶液（約２８０ｄ　）を加えた。

前記装置に前記過酸化水素溶液を加え、同じ操作を繰り
返した。

次に、その抽出装置中の得られた溶液をピペットを使用
して装置から採集し、濾過しながら使い捨て試験装置の
各ウェルに移したく各ウエルヘ，の添加量は約１６０７
’　）。各試験装置の第１ウエル（＃１）は対照ウェル
とするが、他の二つのウエル（＃２および＃３）は試験
ウェルとした。装置のベントを開けて全流体を排出させ
た。次に、排液しながら前記洗浄液で各ウエルを洗浄し
た。

対照抗体溶液（約８０Ｉ１１》をウエル＃１に、一方、
抗リボボリサッカライド抗体溶液（約８０ｄ）をそれぞ
れウェル＃２および＃３に排液することなく添加した。

室温でインキュベーションを２分間行った。

排液した後、洗浄工程を繰り返し、次いでベルオキシダ
ーゼ標識抗体溶液（約８０ｐｉ）を排液することなくす
べてのウェルに添加した後、５分間室温でインキユベー
ションした。

排液およびさらなる洗浄工程に続き、前記ロイコ染料組
成物を排液することなく各ウェルに添加した。５分間室
温でインキユベーションした後、各ウェルに０．０１％
のアジ化ナトリウム溶液（約１２０７’　）を加えて色
素生成を停止させた。各ウエルの膜上に生成した色素を
視覚観察し、段階付けした（０〜１０、０は無着色を表
す）。これらの結果を以下の第■表に示し、標準的な培
養法で見い出されているアッセイ結果と比較する。本発
明のアッセイは高い精度を有し、すべてのネガティブ被
験体およびポジティブ被験体の８３％が測定されたこと
が理解できる。

第■表 視覚的な読み値 →− 十 十 ＋ ＋ ｌ ■ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 第 ■ １１　　　　　＋　　　　１−２ １２＋６ １３＋１ １４＋１ １５＋１ １６＋１ １７＋１ １８＋１ ＊　試験せず（すなわち、 表（続き） ｌ１ ７　　　　７　　　　　　＊ ５−６５−６＋ ７−８７−８．＋ １０　　　　　１０　　　　　　　＋ ９　　　　９　　　　　　＋ ５−６５−６＋ アッセイ操作を誤った）。

〔発明の効果〕

本発明の抽出朋成物は、生物学的被験体中のクラミジア
生菌体または淋菌生菌体を迅速かつ効果的に溶菌し、高
感度アッセイ用として十分な抗原を放出する。溶菌は、
一般にせいぜい２または３分で簡単な装置ふよび方法を
使用して室温で極めて迅速に実施することができる。リ
ポボリサツカライド抗原に特に開心が注がれているとは
いえ、リポポリサッカライドおよび主要外層膜蛋白クラ
ミジア抗原の両者とも抽出される。

このような抗原の抽出工程でジチオスレイトールまたは
他のスルフヒドリル基含有還元剤の使用が知られている
とはいえ、本発明は、還元剤の安定化によってそれの長
期間の貯蔵を可能にするので、当該技術分野に著しい進
歩をもたらす。このことが、診断キット成分が製造され
た数週間または数箇月後に行われるアッセイを可能にす
る。従って、本発明のアッセイおよびキットは、従来技
術に示されるものと異り相当な商業上の価値を有する。

ここに記載した利点は、親水性ポリマー（前記）と混合
されている前記還元剤を使用することによって達成され
る。

−第１頁の続き ［相］Ｉｎｔ．　ＣＩ．’ 識別記号 庁内整理番号

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、スルフヒドリル基含有還元剤および１種以上の親水
   性ポリマーを含んでなる組成物。 ２、水不溶性支持体および該支持体上存在する１種以上
   の親水性ポリマーを混合したスルフヒドリル基含有還元
   剤の乾燥塗布物からなる製品。 ３、スルフヒドリル基含有還元剤および１種以上の親水
   性ポリマーを含んでなるクラミジア生菌体または淋菌生
   菌体から、それぞれクラミジア抗原または淋菌抗原を抽
   出するための組成物。 ４、（ａ）クラミジア生菌体または淋菌生菌体からの、
   それぞれクラミジア抗原または淋菌抗原の抽出に有用な
   抽出溶液、ならびに （ｂ）スルフヒドリル基含有還元剤および１種以上の親
   水性ポリマー、を含んでなるクラミジア抗原または淋菌
   抗原の測定に有用な診断試験キット。 ５、（ａ）クラミジア生菌体または淋菌生菌体からの、
   それぞれクラミジア抗原または淋菌抗原の抽出に有用な
   抽出溶液、ならびに （ｂ）水不溶性支持体および該支持体上存在する１種以
   上の親水性ポリマーを混合したスルフヒドリル基含有還
   元剤の乾燥塗布物からなる製品、を含んでなるクラミジ
   ア抗原または淋菌抗原の測定に有用な診断試験キット。 ６、Ａ、クラミジア生菌体または淋菌生菌体を含むこと
   が予測される被験体を提供する工程、ならびに Ｂ、クラミジア抗原または淋菌抗原の抽出に有用な１種
   以上の試薬、スルフヒドリル基含有還元剤および１種以
   上の親水性ポリマーを含んでなる抽出組成物を前記被験
   体と接触させることにより、前記生菌体からそれぞれク
   ラミジア抗原または淋菌抗原を抽出する工程、を含んで
   なるクラミジア生体または淋菌生体由来の抗原の抽出方
   法。 ７、Ａ、クラミジア抗原または淋菌抗原の抽出に有用な
   １種以上の試薬、スルフヒドリル基含有還元剤および１
   種以上の親水性ポリマーを含んでなる抽出組成物により
   、クラミジア生菌体または淋菌生菌体を含むことが予測
   される被験体からそれぞれクラミジア抗原または淋菌抗
   原を抽出する工程、 Ｂ、抽出された抗原をそれらに対する抗体と接触させて
   免疫複合体を形成する工程、ならびにＣ、被験体におけ
   るそれぞれクラミジア生菌体、または淋菌生菌体の存在
   を表示するものとして前記複合体の存在を測定する工程
   、を含んでなるクラミジア抗原または淋菌抗原の測定方
   法。