JPH02231083A - 組換ナチュラルキラー細胞活性化因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はナチニラルキラー細胞（ＮＫ細胞）によるヒト
腫瘍細胞溶解の活性を増強させる新規ポリペブチドの発
明及び生産に係る遺伝子組換技術並びに該ペプチドを含
有する医薬に関する。

従って本発明は、医薬品の分野において利用することが
できる。

〔従来技術及び発明が解決しようとする課題〕ある種の
癌細胞に対して破壊的に作用する細胞としてナチュラル
キラー細胞（ＮＫ細胞と略す）の存在が知られており、
当該細胞の活性に影響のあるリンホカインに関心が寄せ
られている。

例えば、インターロイキン−２及びインターフェロンは
ＮＫ細胞の活性の増大を誘導することが示されているＣ
Ｈｅｒｂｅｒｍａｎ，Ｒ，Ｂ，，　ｅｔ　ａｌ，，　Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，　４４．　１３　（１９７９
）　　；　Ｖａｓｅ，Ｂ．Ｍ．，　ｅｔ　ａｌ，，Ｊ，
　Ｉｍｍｕｎｏｌ，，　１３０，　７６８　（１９８３
）　：　ＤＯｆｌｌＺｉｇ．Ｗ．．ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　１３０　１９７０　（１９８３
））。

ＮＫ細胞は、非特異的生体防禦系の一つとして、癌細胞
に対する所期防禦、癌細胞の転移の抑制、ウイルス感染
に対する抵抗性、骨髄での血球細胞増殖の調節など、重
要な働きを担っている〔熊谷勝男，伊東恭悟，日本臨床
，春期臨時増刊号，　４２，　８５９　（１９８４））
。

特に、癌に対する生体防禦反応においてＮＫ細胞が重要
な働きをすることは、Ｔ細胞を欠如するが、高いＮＫ活
性（ＮＫ細胞が癌細胞を破壊する活性）を有するヌード
マウスに自然発生癌や化学発癌剤による発癌の頻度が必
ずしも高くないことｌ：Ｒｙｇａａｒｄ　Ｊ．，　ｅｔ
　ａｌ．，　Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ，，２８．　４３
　（１９７５）　　；Ｓｔｕｔｍａｎ　Ｄ．，　ｅｔ　
ａｌ，，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８３．　５３４　（１９
７４）　］や、Ｔ細胞は有するが遺伝的にＮＫ活性の低
いベージュマウス〔島村和男，玉置憲一，実験医学．　
　２．　３９８（１９８４）　；Ｊａｍｅｓ　Ｂ．，Ｔ
ａｌｍａｄｇｅ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ，　
２８４．　６２２　（１９８０）　）や人為的にＮＫ活
性を低下させたマウス〔島村和男，玉置憲一，実験医学
，　　２，　３９８　（１９８４）］では、移植癌の転
移が冗進するという事実から考えられる。

設楽らはマウスにおいてインターロイキンー２と異なる
ＮＫ細胞増強因子が胸腺細胞から産生放出されることを
報告している（Ｓｉｔａｒａ．Ｋ．，　０，Ｉｃｈｉｍ
ｕｒａ，　Ｔ．Ｍｉｔｓｕｎｏ　ａｎｄ　Ｔ．Ｏｓａｗ
ａ，　Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３４．　１０３９　（
１９８５）］。

本発明者の中の一部の者はＮＫ細胞を活性化するリンホ
カインの存在を想定して、リンホカくン産生ヒ｝Ｔ細胞
ハイブリドーマについて数種のセルラインを樹立し、Ｍ
ＩＦ（マクロファージ遊走阻止因子）　、ＭＡＦ（マク
ロファージ活性化因子）等のリンホカインの存在を明ら
かにしてきた〔Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｙ．，　Ａｓａｄ
ａ，Ｍ，，　｝Ｉｉｇｕｃｈｉ，Ｍ，　ａｎｄＯｓａｗ
ａ，Ｔ，，　Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　１２８．　２７
１４　（１９８２）　　；Ａｓａｄａ，Ｍ．，　Ｈｉｇ
ｕｃｈｉ，Ｍ．，　Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｙ，　ａｎｄ
Ｏｓａｗａ，Ｔ，，　Ｃｅｌｌ，　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，
　７７，　１５０　（１９８３）　：Ｈｉｇｕｃｈｉ，
Ｍ，，　Ａｓａｄａ，Ｍ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｙ．ａ
ｎｄＯｓａｗａ，Ｔ．，　Ｃｅｌｌ，　Ｉｍｍｕｎｏｌ
．，　７８．　２５７　（１９８３））。

特に、ヒトＴ細胞をスカシ貝ヘモシアニンによって処理
し、これを出発細胞としてヒ｝Ｔ細胞ハイブリドーマを
取得すれば、当該ハイブリドーマは既知のリンホカイン
とは異なる全く新規なＮＫ細胞活性化因子（以下、ＮＫ
ＡＦと略記する）を産生ずるものであることを知り、特
開昭６１−９７２２４の発明として先に開示した。なお
、特開昭６　１−９　７　２　２　４の発明においては
、得られるＮＫＡＦはそれ自体が天然物であり、ペプチ
ドとしてのアミノ酸配列は明確ではなかった。

ところで、ＮＫＡＦが医薬として工業化されるためには
、ペプチドとしてのアミノ酸配列が明確となり、遺伝子
組換技術による組換物として量産化される必要がある。

本発明者は、ＮＫ細胞の活性を増強させるＮＫＡＦを単
離、同定し、その遺伝子を取得することを目的として研
究に着手した。

即ち、まず、第一手段として特開昭６１−９７２２４の
ＮＫＡＦ天然物を精製して、その部分アミノ酸配列を特
定すること、及び第二手段として該配列に基づいて特開
昭６　１−９　７　２　２　４におけるヒ｝Ｔ細胞ハイ
ブリドーマのｍＲＮＡより作成したｃＤＮＡライブラリ
ーより所定のｃＤＮＡクローンをつりあげ、最終的にＮ
ＫＡＦ組換体を得ることを本発明の課題とした。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者は、前述の課題に対し、まず第一段として、抗
体力ラムアフィニティークロマトグラフィーによりＮＫ
ＡＦ天然物を精製し、そのアミノ酸部分配列を特定した
。

次に、特定した一つのアミノ酸配列（ＫＲ−２１）に基
づいてヒトＴ細胞ハイブリドーマ（Ｃ−１０８）のｍＲ
ＮＡより作成したｃＤＮＡライブラリーから所定のｃＤ
ＮＡクローンをつりあげた。次に、得られたｃＤＮＡク
ローン、ｐＮＫ　８３０８の塩基配列からＮＫＡＦのア
ミノ酸配列を後記するごとく特定するとともに組換ＮＫ
ＡＦの発現を行い、その活性を確認した。

以上の諸知見をもとにさらに検討を加え、本発明を完成
するに至った。

以下本発明の詳細を説明する。

〔構　　成〕

本発明組換ＮＫＡＦは例えばその分子中に下記一次構造
式で示されるアミノ酸配列（以下、本発明に係るアミノ
酸配列と呼ぶ）を含有する。

ＬｅｕＨ　ｉｓＬｅｕＡｒｇＳｅｒＧ　１ｕＴｈｒＳｅ
ｒＴｈｒＰｈｅＧ　１ｕＴｈｒＰｒｏＬｅｕ９ｎ ＾１ａＶａｌＧ１ｕＳｅｒｌｌｅＳｅｒＶａｌＰｒｏＡ
ｓｐＭｅｔＶａｌＡｓｐＬｙｓＡｓｎＬｅｕＴｈｒＣｙ
ｓＰｒｏＧ１ｕＧ１ｕＧ１ｕＡｓｐＴｈｒＶａＩＬｙｓ
ＶａＩＶａＩＧｌｙｑ０ ＴｙｒＡｒｇ　Ｉ　１ｅＧ　１ｎＣｙｓＳｅｒＶａ　Ｉ
ＳｅｒＡ　１ａＬｅｕＡｓｎＧ　１ｎＧ　１　ｙＧ　Ｉ
ｎＶａｌＴｒｐｌｌｅＧｌｙＧ１ｙＡｒｇｌｌｅＴｈｒ
Ｇ１ｙＳｅｒＧ１ｙＡｒｇＣｙｓＡｒｇＡｒｇＰｈｅＧ
１ｎＴｒｐＶａｌＡｓｐＧ１ｙＳｅｒＡｒｇＴｒｐＡｓ
ｎＰｈｅＡ１ａＴｙｒＴｒｐＡ１ａＡｌａＨｉｓＧ１ｎ
ＰｒｏＴｒｐＳｅｒＡｒｇＧ１ｙＧ１ｙｌ｛ｉｓｃｙｓ
Ｖａｌ１ｑｎ 本発明の最終目的物質は遺伝子組換技術によって生産す
ることができる。

従って本発明組換ＮκＡＦをコードするｃＤＮＡ１該ｃ
ＤＮＡを外来遺伝子として含み、かつ選択した宿主内で
制御及び発現が可能となるように連結して得られた発現
プラスミドはいずれも本発明の最終目的物質の生産のた
めに必要な中間的物質であり、同一の問題点を解決する
意味において発明としては共に一体となることができる
。

また、発現ブラスミドによって形質転換された宿主もｃ
ＤＮＡ及び発現プラスミドと同様に発明としては共に一
体となることができる。宿主としては大腸菌や酵母、動
物細胞、例えば、ＢＨＫ細胞、ＣＨＤ細胞が使用される
。

ｃＤＮＡを保有する大腸菌株の一つとしてＸＬＩ−Ｂｌ
ｕｅ／ｐＮＫ　８３０８　Ｂによって識別表示されるも
のをあげることができる。これは後記実施例１において
示され、かつ微工研に寄託されている。

受託番号はＦεＲＭ　Ｐ−１０１６１（ＦＥＲＭ　ＢＰ
−２４６８）である。

最終目的物質である本発明組換ＮＫＡＦは後記実験例に
よって示されるごとく、抗腫瘍活性を有している。

従って、天然ＮＫＡＦが医薬組成物の必須の有効成分と
なって、その活性を利用する医療目的に提供され得るの
と同様に、本発明組換ＮＫＡＦもその活性を利用する治
療目的のための医薬組成物の必須の有効成分となること
ができる。

この場合に、該乙、薬組成物は主として注射剤であり、
静脈内投与される。

注射剤として製造されるためには、微量生理活性物質を
注射剤とするときの常法に従って行えばよい。

従って、例えば、本発明組換ＮＫＡＦを単独或いは適当
な賦形剤、溶解剤と共に水溶液とし、無菌濾過して充填
し、凍結乾燥し、他方溶解用水溶液を添付して用時溶解
型注射剤とすればよい。

〔方　法〕

天然ＮＫＡＰの製造方法及び測定方法について説明する
。

１．精製天然ＮＫＡＦの製造 組換ＮＫＡＦを製造するにあたって、まず天然ＮＫＡＦ
の精製と構造解析を以下のごとく行った。

天然ＮＫＡＦを産生するヒ｝Ｔ細胞ハイブリドーマＫＣ
８−１−１０　（特開昭６１−９７２２４）のクローン
Ｃ−１０８株の無血清培養上清より、イオン交換クロマ
トグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニ
ティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィ
ー等の種々の方法によって天然ＮκＡＦを精製できる。

この精製ＮＫＡＦのＮ末端アミノ酸配列及びトリブシン
を用いて酵素消化した精製ＮＫＡＦ断片ペプチドのアミ
ノ酸配列を決定することにより、ｃＤＮＡのクローニン
グが可能となる。

なお、ＮＫＡＦのＮＫ細胞活性に対する増強効果の測定
は、プラスチック非附着性のヒト末梢血リンパ球（プラ
スチック非附着性ＰＢＬと略称）が、ヒト癌細胞株Ｋ−
５６２細胞を破壊する活性（ＮＫ活性）を指標として測
定することができる。即ち、牛胎児血清１０％を含有す
るＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ−
１６４０と略す）で２倍系列稀釈をした検液５０μｌを
９６穴マイクロプレートに入れ、次にプラスチック非附
着性ＰＢＬ１×１０ｓ個／５０μｌヲ加エ、３７℃、１
６時間培養した。これにＳＩＣｒでラベルしたＫ−５６
２細胞液をＩ　ＸＩＯ’個／１００μｌを加え、さらに
４時間、３７℃で培養する。

別に対照として１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ−１６４０培地
１００μｌを用意し、１６時間培養し、この培養液にＳ
ＩＣｒでラベルしたκ−５６２細胞液１００μｌを加え
、さらに４時間培養する。次に、ここから１００μｌを
とり、遊離ｓＩＣｒを測定する。

ＮＫＡＦの活性は、この条件において最大の増強効果の
５０％増強を示す活性をもってＩＵと定義することがで
きる。

Ｃ−ａ ただし、式中ｂは試料に係る遊離”　Ｃｒ　（ｃｐｍ）
を示し、ａは対照に係る遊離”　Ｃｒ　（ｃｐｍ）を示
し、また、ＣはＳ　ＩＣｒでラベルしたＫ−５６２細胞
液（１０’／ｍｉ’）１００１２における総”　Ｃｒ　
（ｃｐｍ）を示す。なお、３回の測定の平均値を求める
。

天然ＮＫＡＦの製造の一例を以下に示す。

■　天然ＮＫＡＦの精製 ヒトＴ細胞ハイブリドーマＫＣ８−１−１０　Ｃ−１０
８株をＩＨのガラス製ジャー中で１０％ＦＣＳ−ＲＰＭ
［−１６４０培地で１　〜２ｘｌＯ’　ｃｅｌｌｓ／ｍ
ｌまで増殖させた。

培養後、細胞を遠心分離して集め、ＲＤＦ培地で細胞を
洗った後、細胞をＩ　ＸＩＯ’ｃｅｌｌｓ／ｒＩＴｌに
なるようＲＤＦ培地に懸濁した。

ガラスジャー中で３７℃、１４〜２０日間連続培養を行
った。

１０ｌ／日の割合で上清を連続的に交換し、ＮκＡＦを
含む培養上清より以下の方法で精製した。

無血清培養上清２００　！！をガラス繊維濾紙ＧＦ／Ｆ
（Ｗｈａｔｍａｎ　Ｉｎｃ，）で濾過し、細胞破片を除
去した後、Ｓｅｐａｂｅａｄｓ　ＳＰ−９００カラム（
三菱化成ｇｅｌ　ｖｏｌ　２ｊ！　）に、２５　Ｉ！／
時の流速で溶出し、フェノールレッドなどの疎水性低分
子物質を除去した。次にカラム素通り画分をプールし、
０．２Ｍ　ＮａＣ１含有のＩＱｍＭ７ｒｉｓ−ＨＣＩ緩
衝液　（ｐＨ８）の電導度に合わせた後、０．２Ｍ　Ｎ
ａＣ１含有１（ｌｍＭ　Ｔｒｉｓ−｝ＩＣＩ緩衝液（ｐ
Ｈ８）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ力ラ
ム（ファルマシアｇｅｔ　ｖｏｌ　２１）に１２ｌ／時
の流速で処理し、このカラムを同じ緩衝液で洗った後、
０．６ＭＮａＣ１含有のｌＱｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩
衝液（ｐＨ８）で溶出した。

ＮＫＡＦ活性を有する溶出画分４Ｉ！を限外濾過膜（Ｙ
Ｍ−乳　アミコン）上で約１０００倍に濃縮した。この
濃縮画分をＯ．　ＩＭ　ＮＨ．ＨＣＯ３水溶液で平衡化
したＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−７５ゲル濾過力ラム（ファ
ルマシア．５０φＸ９００ｍｍ）に１０〇一／時の流速
で処理し、核酸などの高分子物質を除去し、活性画分を
プールした。この活性画分を集め（約９００ｍｊ２）　
ＹＭ−５膜上で約２０倍に濃縮した後、凍結乾燥を行っ
た。

この凍結乾燥物をＯ，　ＬＭ　ＣＨ，ＣＯＯＮａ緩衝液
（１）８５）／Ｏ．　ＬＭ　Ｈａ２Ｓｏ．緩衝液（ｐ｝
１５）　＝　１　／　１の溶液５ｒｎｌに溶解した。

この溶液を分取用Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷ−ＲＰ力ラム（
東ソー、２１．５φＸ１５０ｍｍ）に吸着させた。

溶出溶媒として０．ＩＭ　ＣＨｓＣＤＤＮａ緩衡液（ｐ
｝１５）／Ｏ．　ＩＭ　Ｎａ，ＳＯ４緩衝液（ｐＨ５．
　０）　＝　１　／　１を溶出溶媒Ａとし、Ａ／ＣＨ．
ＣＮ　＝　１　／　１を溶出溶媒Ｂとする。

溶出条件は溶出溶媒Ｂを３時間で０％→１００％に直線
的に増加させ、ＮＫＡＦを溶出させた。

即ち、本条件下で保持時間１００〜１１０分に主活性画
分が溶出され、一部は１１０〜１４０分にも溶出された
。

これらの活性画分は後述のモノクロナル抗体と反応する
ことがＥＩＡで確認された。

従って、保持時間１００〜１１０分に溶出される主活性
画分を集め、凍結乾燥し、部分精製した天然ＮＫＡＦを
得た。

■　天然ＮＫＡＦに対するモノクロナル抗体及びそのカ
ラムの作製 ■の項の方法で得た部分精製した天然 ＮＫＡＦを免疫抗原として、フロイント完全アジュバン
トと混合し、エマルジョンを作製し、マウス１匹あたり
０．２ｍｉ’ずつ３回腹腔内に投与し、免疫した。

次に、この部分精製天然ＮκＡＦをマウス尾静脈より投
与し、３日後膵臓を取り出した。

この膵臓より得た膵臓細胞とマウス骨髄腫、細胞Ｘ６３
−Ａｇ　８，　６，　５．　３（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂ）　
　とを４５％ポリエチレングリコールー３３５０（Ｓｉ
ｇｍａ）を用いて融合させた。

以下、通常の方法Ｃ　Ｇ．Ｇａｌｆｒ’ｅ　ａｎｄ　Ｃ
．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，　ｅｔ　ａｌ，，　Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　ｉｎ　Ｂｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７３．　３　（１９
８１））に従って融合細胞を増殖させた。

ＮＫＡＦ活性を吸収する抗体を産生ずる融合細胞２種１
９−８−７．　２９−Ｃ−８を選択した。

得られた融合細胞を１週間以上前にプリスタン（アルド
リッチ）０．５ｍｆずつ腹腔内投与したマウスの腹腔内
に移植し、貯留した腹水を採取した。

２種のモノクロナル抗体（２９−Ｃ−８．　１９−ト７
）はいずれもＩｇＧ．であった。

次に、プロテインＡ−アガロース（レブリゲン）を用い
て精製し、これをプロムシアン活性化セファロース４Ｂ
（ファルマシア）と反応させ、固定化モノクロナル抗体
ゲルを作成した。

２．高純度精製天然ＮＫＡＦの構造解析１−■の項で部
分精製した天然ＮＫＡＦ　（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−７５
画分）を■の項で作製したモノクロナル抗体を固定化し
たゲルを用いてアフィニティークロマトグラフィーを行
い、活性画分を採取した（図１参照）。

本品は高純度に精製した天然ＮＫＡＰであり、その比活
性は約１　ｘｌＯ’Ｕ／ｍｇ蛋白質であった。

本品を用いて以下の諸性質について解析した。

■　アミノ酸組成分析 脱塩した天然ＮＫＡＦを加水分解用小試験管の底部で乾
固させた後、ガラスバイアル内に立て、バイアル底部に
６Ｎ　｝ＩＣ１　５００μｌを注入後、バイアルごと減
圧し、１１０℃で２４時間塩酸加水分解した。このＮＫ
ＡＦ塩酸加水分解物をアミノ酸分析計（Ｂｅｃｋｍａｎ
　Ｓｙｓｔｅｍ６３００アミノ酸アナライザー》でアミ
ノ酸含量を測定した。

結果を表１に示す。

表　１　アミノ酸分析 ■　糖組成分析 中性糖の含量をオルシノール硫酸法により定量したとこ
ろ、約１２０μｇ／ｍｇ蛋白質であった。また、ウロン
酸含量をカルバゾール硫酸法により定量したところ、約
３００μｇ／ｍｇ蛋白質であった。

次に、糖組成分析を行ったところ、表２のごとくであっ
た。

以上の結果より、０−グリコシド型糖鎖（ムコ多糖及び
ムチン型糖鎮）を多く含む糖蛋白質であることが確認さ
れた。

表　２　糖組成分析 ■　巳！八によるＮκ八Ｆの定量 ２種のモノクロナル抗体のうち、２９−Ｃ−８をｗｅｌ
ｌにｃｏａｔ　Ｌ、洗浄後ＮＫＡＦを加え、室温で１時
間反応後洗浄し、もう一方のモノクロナル抗体１９−８
−７をビオチン化したものを加え、室温で１時間反応後
、洗浄し、次に＾ｖｉｄｉｎ−Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅを
加え室温３０分反応後洗浄し、基質であるオルトフェニ
レンジアミン液を加え、室温で発色させ１５分後にＩＮ
｝ＩＣＩで反応をとめ、プレートリーダーで００４９２
の吸光度を測定した。その検量線を図２に示す。

■　糖鎮の除去 ＮＫＡＦは多《の糖を有しているので、アミノ酸配列分
析のために、糖鎖除去法の検討を行った。

分析はＳＯＳ−ＰＡＧＥ　（ドデシル硫酸ナトリウムー
ポリアクリルアミドゲル電気泳動）銀染色法と、Ｗｅｓ
ｔｅｒｎ−１ｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔ　ｉｎｇ法により行
った。即ち、脱塩した精製ＮＫＡＦをシアリダーゼ、０
−グリカナーゼ、コンドロイチナーゼ、ヘパリチナーゼ
で処理し、ＳＯＳ−ＰＡＧＥによって糖が切断されたか
どうか検討．した。

ヘパリチナーゼでは反応前後の変化はなく、シアリダー
ゼ、０−グリカナーゼではメインバンドは低分子化した
が、スメアーは消失しなかった。コンドロイチナーゼを
用いるとスメアーは消失し３５ＫＯにメインバンドを生
じた。このバンドはＷｅｓｔｅｒｎＩｍｍｕｎｏｂｌｏ
ｔｔｉｎｇで抗ＮＫＡＦモノクロナル抗体及びウサギ抗
ＮＫＡＦ抗体と反応することが確かめられた。また、コ
ンドロイチナーゼ処理で活性は保持された。

脱塩した精製ＮＫＡＦを還元力ルポキサミドメチル化後
、コンドロイチナーゼ０．５Ｕ含有の１００ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８）　、３０ｍＭ　ＣＨｓＣＯＯＮ
ａに溶解し、３７℃で６０分反応させ、コンドロイチン
硫酸鎮を切断した。

この反応物を逆相ＨＰＬＣ　（カラムはＶｙｄａｃＣ４
、溶媒として０．１％ＴＦ＾（トリフルオ口酢酸）　／
ＣＨ．ＣＮ系でＣＨ．ＣＮを０％→１００％直線的に３
０分間で１．　５ｒｎｌ／分の流速）で精製した（図３
参照）。

図３のクロマトグラム上のＦｒ．１とＦｒ，２のＳＯＳ
−ＰＡＧＢを行うと、図４に示したようにＦｒ，　１は
３５κＤのモノバンドとなり、Ｆｒ，２は３５κＤ以上
のスメアーのバンドとなった。Ｆｒ，　２を６Ｍ塩酸グ
アニジンを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ９）
　　ｌ：溶解して逆相１１ＰＬｃを行うと、Ｆｒ．１に
移行することから、Ｆｒ．２はＦｒ．１のアグリゲーシ
ョンしたものであると推定される。

■　Ｎ末端アミノ酸配列分析 図３のＦｒ，　１を用いてＮ末端アミノ酸配列分析を行
い、ロイシンから始まるＮ末端２８残基を次式の如く決
定した。

Ｌｅｕ−Ｈ　ｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇ　ｌｕ
−Ｔｈｒ−ＸＸＸ−ＸＸＸ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−ＸＸＸ−
Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌ
ｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈ
ｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ８，　９．　１２残基はア
ミノ酸が出現せず、〇−グリコシド型糖鎮の付加したＳ
ｅｔ又はＴｈｒと推定した。

■　トリプシンで酵素消化した天然ＮＫＡＦのペプチド
マッピング 図３のＦｒ．１を２Ｍ尿素含有の０．１Ｍ重炭酸アンモ
ニウム（ｐ｝１８）　に溶解し、トリプシンを加え、３
７℃で１６時間反応し、反応後、逆相ＨＰＬＣ　（カラ
ムはＶｙｄａｃ　Ｃ４，溶媒として０．１％ＴＦ＾／Ｃ
Ｈ．ＣＮ系でＣＨ．ＣＮを０％→６０％直線的に１時間
で１．５ｍｉ’／分の流速》で精製した。

生じたペプチド２１個の断片についてアミノ酸分析、ア
ミノ酸配列分析した（表３参照）。

各ペプチドのアミノ酸配列は全て後記の組換ＮκＡＦの
ｃＤＮＡ配列上に同定された（図５、図６参照）。

■　Ｃ末端アミノ酸配列 トリブシン切断ペプチドを０．　０２Ｍ塩化カルシウム
を含む０．　０５Ｍ炭酸ナトリウム（ｐ｝１５）で平衡
化したアンハイドロトリブシンアガロースカラムで非吸
着画分を集め、前述の逆相ＨＰＬＣの条件でＣ末端ペブ
チドフラグメントを分離した（図７参照）。

アミノ酸配列分析を行ったところ、＾ｒｇ一しｅｕ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｈｅ−１　１ｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ　と
決定し、ＫＲ−１７のアミノ酸配列に一致した。

〔実　施　例〕

前述した天然ＮＫＡＦ精製標品のトリプシン氷解フラグ
メントのアミノ酸配列をもとに、ＮＫＡＦをコードする
ｍＲＮＡの塩基配列を推定し、それに対応するＤＮＡオ
リゴマーを合成する。次に、このオリゴマーをプローブ
としてＣ−１０８細胞のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブ
ラリーをハイブリダイゼーションによりスクリーニング
してＮＫＡＦをコードする配列を有するｃＤＮＡクロー
ンを選び出した。

以下の実施例により本発明を更に詳細に説明する。

実施例１ （１）　　ｍＲＮＡＯ単離 ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＰＩＩＩＭ（ＧＩＢＣＯ社製
Ｐｏｋｅ１リｅｅｄ　Ｍｉｔｏｇｅｎ）　４　μｉ　／
一にて８時間刺激したＫＣ８−１−１０　Ｃ−１０８株
１．２Ｘ１０９個を集め、Ｃｈｉｒｇｗｉｎらの方法Ｃ
Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏ−ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ，　１８．　５２９４　（１９７９）］を
用いてＲＮＡを抽出・した。

抽出液３容を１容の５．　７Ｍ　Ｃ．ＣＩ−０．　１Ｍ
　ＥＤＴＡ溶液上に重層し、超遠心分離機（ＳＲＰ　２
８　ＳＡローター、日立）を用い、２６００Ｏｒｐｍで
２５℃下３６時間遠心分離し、ＲＮＡをペレットとして
回収した。

得られたＲＮＡを１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（
ｐＨ７．４）に溶解し、エタノールを加えて−７０℃下
１時間放置した。次に遠心により沈殿させたＲＮ＾を１
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７．　４）に溶解し
、０．５ＭＫＣＩをさらに加えた。

これを同じ緩衝液を用いて平衡化したオリゴ（ｄＴ）セ
ルロース力ラム（２０ｍｍφＸ　１５０ｍｍ）に付し、
０．５ＭＫＣＩ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩで十分に
洗浄後、ｌＱｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ水溶液でｍＲＮＡ
を溶出させた。

Ｃ−１０８細胞由来ｍＲＮＡ　５００μｇを５０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７．　４）、０．２Ｍ　Ｎａ
Ｃ１　，　１ｍＭ　ＢＤＴＡを含む１０％から２８％シ
ヨ糖濃度勾配を形成させた溶液１５ｍｌ！に重層し、超
遠心分離機（ＳＲＰ　２８　０−ター、日立〉を用いて
２６００Ｏｒｐｍで２０℃下１６時間遠心分離した。

次に５００μβずつ分画し、各分画にエタノールを加え
、ｍＲＮＡを沈殿させた。

各分画ｍＲＮＡは滅菌水で溶解し、ｍＲＮＡ濃度１μｇ
／ｍｌ！に調製した。

約２ｋｂからＱ．５ｋｂに至るサイズのｍＲＮＡを主に
含む画分を集めｃＤＮＡ合成反応に供した。

（２）　　Ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーの作製ロ．Ｇｕ
ｂｌｅｒらの方法（Ｕ，Ｇｕｂｌｅｒ，　ｅｔ　ａｌ，
，Ｇｅｎｅ，　２５，　２６３　（１９８３）］　ニ従
ッテｃＤＮＡを合成した。

即ち、１μｇの精製ｍＲＮＡを用い、Ａｍｅｒｓｈａｍ
のｃＤＮＡ合成キット　（コード番号ＲＰＮ　１２５６
）’Ｅ−使用した。

二本鎮ｃ　Ｄ　Ｎ　ＡはセファロースＣＬ−６Ｂカラム
を用いてゲル濾過を行い精製した後、修飾酵素ＢｃｏＲ
Ｉ　メチラーゼを用いてメチル化した。メチル化したｃ
ＤＮＡにＢｃｏＲＩリンカー（ｐＧＧＡＡＴＴＣＣ）を
結合させ、εｃｏＲＩで切断してＥｃｏＲＩ粘着末端を
作製した。このｃＤＮＡをセファロースＣＬ−６Ｂカラ
ムを用いてゲル濾過を行い、過剰なＢｃｏＲＩリンカー
を除去した。

この精製ｃＤＮＡを、ＢｃｏＲＩで切断しフォスファタ
ーゼ処理したλｇｔ　１１と結合させ（モル比０．８：
１）、ファージ粒子にパッケージングして８　ＸＩＯ’
〜１．４　ＸＩＯ’個の独立したクローンからなるｃＤ
ＮＡライブラリーを得た。

このファージを１５ｃｍφのプレート１０枚にプレーテ
ィングし、ファージを増殖させて１×１０”ｐｆｕ／ｍ
ｊ！のファージ溶液１６０ｍｆ！を得た。

ライブラリーの約９０％がインサートを有し、ランダム
にとった１０クローンのうち８クローンに３００ｂｐ〜
２　ｋｂｐまでのインサートが入っていた。インサート
の平均サイズは１，　２ｋｂｐであった。

（３）　　ＤＮＡブローブの作製 天然ＮＫＡＦのトリプシン水解フラグメントＫＲ−２１
　（Ｗ−Ｎ−Ｆ−Ａ−Ｙ−Ｘ−＾−Ａ−Ｈ−Ｑ−Ｐ−Ｗ
−Ｓ−Ｒ）　（７）　７　ミ／酸配列のうち、トリプト
ファンに始まりトリプトファンに終わる最初の１２残基
の配列に対応するブローブを作製した。

この配列の中程の未同定（Ｘで示す）の残基は、Ｓｅｔ
と仮定した。即ち、この残基には糖鎮が付加していると
仮定すればＳｅｔ又はＴｈｒであるが、アミノ酸組成分
析よりＴｈｒの存在はないのでＳｅｒと仮定してプロー
ブを作製した。

一方、ヒト遺伝子のコドン使用頻度に関する考察（Ｒ．
Ｌａｔｈｅ，　Ｊ．Ｍｏｌ，　Ｂｉｏｌ．，　１８３．
　１（１９８５）　）を参考にしてＫＲ−２１をコード
するｍＲＮＡの配列を推定し、それと相補的な３６ヌク
レオチドからなるＤＮＡハイブリダイゼーションブロー
ブＰＫＲ−２１を設計した。

ＰＫＲ−２１の配列は ５’　ＣＣＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＡＧ
ＴＡＧＧＣＡＡＡＧＴＴＣＣＡ　３’で示され、その合
成は自動ＤＮＡ合成機（ＡｐｐｌｉｅｄＥｌｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ）を用いて行った。常法に従ってこのブローブを
γ一”Ｐ−ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによ
ってリン酸化し、ラベルを導入した。

（４）ＮＫＡＦのコーディング配列を含むｃＤＮＡクロ
ーンの同定 λｇｔ１１ｃＤＮＡライフラリーカラノ約１６０．　０
００個の組換ファージを３２ｐ−ラベルＰＫＲ−２１プ
ローブを用いてＤＮＡハイブリダイゼーション法により
スクリーニングした。

１０Ｘ１４Ｃｍ角プレート１０枚に約１６０００個ずつ
の組換体プラークを生じさせ、これを常法（Ｔ．Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ，　ｅｔ　ａｌ，，　”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇ’３２０−３２１ｐ．　Ｃｏｌｄ　Ｓ
ｐｒｉｎｇ　ｔｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（
１９８２）　）に従ってニトロセルロースメンブレン上
に転写し、ＤＮＡを変性・固定化した。

これらメンブレンは６　ｘＳＳＣ（　１　ｘＳＳＣ＝１
５０ｍＭ　ＮａＣ１．　１５ｍＭクエン酸ナトリウム＜
ｐＨ７））、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）　　
、５　ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ（１００　ｘ　Ｄｅｎｈ
ａｒｄｔ’　ｓ　＝　２％牛血清アルブミン、２％ポリ
ビニルピロリドン−２％フイコール）、１００μｇ／一
仔牛胸腺ＤＮＡ溶液中５８℃で２時間プレハイブリダイ
ズした。

次いで、６　ＸＳＳＣ　，　５０ｍＭリン酸ナトリウム
（ｐＨ７）　、５　ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ中で３２ｐ
−ラベルＰＫＲ−２１ブロー．ブと５８℃で約１２時間
ハイブリダイゼーションし、６　ｘ　ＳＳＣ　−　５０
ｍＭリン酸ナトリウムで室温で１０分間洗浄を２回、５
８℃、３０分間洗浄を２回、６５℃、４５分間洗浄を１
回行った後、オートラジオグラフィーによりＰＫＲ−２
１とハイブリダイズするクローンを検出した。

約３０個の別々のプラークがＰＫＲ−２１とハイブリダ
イズした。このうち、４個のクローンよりそれぞれｃＤ
ＮＡを８ｃｏＲＩで切出し、プラスミドベクターｐ　Ｂ
ＩＬＩｅｓｃｒｉｐｔ＠　ＫＳ，　　Ｍ１３”（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ社）にサブクローニングし、ｐＮκ８３
０２、ｐＮＫ　８３０３、ｐＮＫ　８３０６、ｐＮκ８
３０８（微工研寄託ＦＥＲＭ　Ｐ−１０１６１（ＦＥＲ
Ｍ　ＯＦ−２４６８））を得た。

これらのｃＤＮＡインサートの塩基配列の一部をｄｉｄ
ｅｏｘｙ　ｃｈａｉｎ　ｔｅｒ＋ｎｉｎａｔｉｏｎ法〔
Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｂｎｚｙｍｏｌ
，　６５，　５６０　；　Ｆ，Ｓａｎｇｅｒｅｔ　ａｌ
，，　Ｐｒｏｃ，　Ｎａｔｈ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，　
７４．　５４６３（１９７７））により決定したところ
、いずれもＮＫＡＦのアミノ酸配列をコードするＳｅｑ
ｕｅｎｃｅを含む種々の長さのｃＤＮ八であることがわ
かった。

それらの制限酵素切断地図を図８に示す。

これらのうち、最長のｃＤＮＡ（ｐＮＫ　８３０８）は
ｐｏｌｙ（Ａ）を除いて８５０ｂｐの配列を有し、その
中に開始コドンより始まり、とぎれることな＜２２２ア
ミノ酸残基をコードする６６６ｂｐのオーブンリーディ
ングフレーム（ＯＲＦ）が存在したく図９参照）。この
ＧＲＦ中にκＲ−２１のベプチド配列は１６４ｗからｌ
ｆｆ？Ｒに至るフラグメ・ントとして同定された。ただ
し、ＫＲ−２１においては未同定であったＸはＳではな
くＷであった。

その他のトリプシン氷解ペプチドの配列はすべてこのＯ
ＲＦ上に同定され、このｃＤＮＡがＮＫＡＦをコードす
るｍＲＮＡ由来のものであることが確かめられた。

ＮκＡＦ精製標品のＮ末端のアミノ酸配列はＬＬ−２Ｈ
−３Ｌ４Ｒ　　・・・・・であることが知られているが
、このｐＮＫ　８３０８のｃＤＮＡのコードするポリペ
ブチドには、このＮ末端配列の前にさらに１６残基の疎
水性の高い配列があることが示された。

これは、細胞外にＮＫＡＦを分泌するためのシグナル配
列であり、分泌時に切断されてＩＬから始まるｍａｔｕ
ｒｅ　ＮＫＡＦを生じるものと考えられる。

実施例２ ｃＤＮＡのＣＯＳ７細胞による発現 ｐｃＤベクター（Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．ａｎｄ　Ｐ．Ｂ
ｅｒｇ，，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，　　Ｂｉｏｌ．，　　３
．　　２８０　（１９８３）　　）はＳＶ４０ウイルス
のＤＮＡ複製開始点と初期プロモーターを持ち、このプ
ロモーター下流にｃＤＮＡを組み込み、ＳＶ４０のＴ　
ａｎｔｉｇｅｎを産生する細胞株ＣＯＳ７　［Ｙ，Ｇｌ
ｕｔｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ，，　２３．　　１７５　（１
９８１）　）に導入すると、この組換プラスミドの増幅
が起こり、一過性にｃＤＮＡの強い発現が起こる。

Ｆｕｌｌ−Ｌｅｕｇｔｈ　ｃＤＮＡクローンであるｐＮ
Ｋ　８３０８　Ｂよりコーディング領域すべてを含むＢ
ｇｌ　Ｉ［−Ｘｈｏ　Ｉ断片を切り出し、Ｘｈｏ　Ｉ　
＋Ｈｉｎｄ　ｍで開裂したｐｃＤＶ　１ベクター［”Ｆ
．Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｈ
，Ａｃａｄ，　９ｃｉ，，　７４．　５４６３　（１９
７７）］　、ｐＬ１の旧ｎｄＩＩ［一Ｂａｍ　Ｉフラグ
メントとともに結合してｐＮＫ　８６０２を作製した（
図１０参照）。

この操作によりｃＤＮＡがプロモーター下流に正しい向
きに組み込まれた。

ｐＮκ８６０２のブラスミドＤＮＡを調製し、ＤＥＡＥ
−ｄｅＸｔｒｅｎ法（Ｔ，Ｙｏｋｏｔａ　ｅｔ　ａｌ１
Ｐｒｏｃ，　Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，　Ｓｃｉ，，　８２
．　６８　（１９８５）　）により、ＣＯＳ７細胞にト
ランスフェクトした形質転換細胞は約１日後よりその培
養上清中にＮκＡＦを産生し、約５日間その産生を続け
た（表４参照）。

なお、培地としては５％ＦＣＳを添加した０旺ｊＡもし
くは無血清のＨＬ−１培地のいずれもが利用できた（表
５参照）。

表　　　５ ｐＮＫ　８６０２をトランスフェクトしたＣ［ｌＳ７細
胞培養上清中のＮＫＡＦ（６日間培養） モノクロナル抗体を用いたＢＩＡで定量実施例３ ＮＫＡＦの晴乳類動物細胞株における発現実施例１で得
たｐＮＫ　８６０２とｐＳＶ，−ｄｈｆｒ　　（Ｓ．Ｓ
ｕｂｒａｍａｎ５　Ｒ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ，　Ｐ．Ｂｅ
ｒｇ，　Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，Ｂｉｏｌ，，ユ．　８５４
　（１９８１））をＥｌｅｃｔｒｏ　ｐｏｒａｔｉｏｎ
法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ■０．
４ｋＶ／０．４ｃｍ．　５００ｐＦ．　１０−１５ｍｓ
ｅｃ，　２回）もしくはリン酸カルシウム法（ｐｔＩａ
ｒｍａｃｉａ社、キットＣｅｌｌ　Ｐｈｅｃｔ■）を用
いてＢ）ＩＫ細胞（ＡＴＣＣ，　ＣＲＬ　１６３２　ｔ
Ｋ−　ｔｓｌ３、大日本製薬）にｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅ
ｃｔｉｏｎ　Ｌ、メトトレキサート（ＭＴＸ）　２５０
ｎＭテ選択しテＭＴＸ耐性クローンを得た。

これらのクローンは約１００〜１．０００　ｎｇ／ｍｆ
ｆのｒＮＫＡＦを培地中に産生じた（表６参照），，ま
た、ｐＮＫ　８６０２をｐＳＶ．−ｄｈｆｒ及びｐＳＶ
２−ｎｅｏ（Ｐ．Ｊ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　＆　Ｐ．Ｂｅ
ｒｇ，　Ｊ，　Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ，　Ｇｅｎｔ，，１．
　３２７　（１９８２）］とともに、リン酸カルシウム
法（Ｋａｏ，Ｆ．Ｔ，　ａｎｄ　Ｔ，Ｔ，Ｐｕｃｋ，　
Ｐｒｏｃ，　Ｎａｔｈ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．，　６０．
　１２７５　（１９８１）　）を用いてＣｌ｛０−Ｋｌ
細胞（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　６１）　　にｃｏ−ｔｒａｎ
ｓｆｅｃｔｉｏｎ　　Ｌ／、ｌｍｇ／一のＧ−４１８で
選択してｎｅｏ耐性クローンを得た。

次に、このクローンを更に５μＭのＭＴＸ含有培地で培
養して約３０〜４００ｎｇ／一のｒＮＫＡＦを産生する
クローンを得たく表７参照）。

実施例４ 大腸閑によるＮＫＡＦの発現 １．発現ブラスミドの作製 ＮＫＡＦ　ｃＤＮＡよりシグナル配列を除いた成熟型蛋
白をコードするＯＮ八を作製し、これをλファージのＰ
Ｌプロモーターと大腸閑のｒｒｎＢターミネーターの間
に挿入し、高コピー数を安定に保つベクターｐＢＲ　３
２２　ｄ−ｒｏｐに結合して発現ブラスミドｐＮκ８０
０１を構築した。

１）　　ｐＢＲＤ　５００１の構築（図１１参照）ｐＢ
ＲＤ　５００１はリンホトキシン発現プラスミドｐＴＴ
　５００１（特願昭６２−２７２０３４）のベクタ一部
分をｐＢＲ　３２２　ｄ−ｒａｐ（特願昭６２−２７２
０３４）に置換したもので、安定に高いプラスミドコピ
ー数を保持できると期待される。この発現ヘクターはｐ
ＫＫ　２３３−２（ファルマシア）由来のｔｒｃプロモ
ーターとｒｒｎＢターミネーターを有する。

２）　　ｐＰＬ９−５００１の構築（図１２参照）次に
ｐＢＲＤ　５００１のブロモータ一部分をλファージの
ＰＬプロモーターに変換したブラスミド倚構築した。ｐ
Ｐシーλ　（７　７　）Ｌｔ　”？　’／ア）をＢＣＯ
Ｒ　ＩとＨｐａ　Ｉで切断し、ＰＬブ０％一ターを含む
４７０ｂｐ断片を分取した。これを｝ＩｆｌｅＩＩＩで
切断してプロモーターを含む約２６５ｂｐの断片を分取
し、下記の合成ＳＯ配列ＤＮＡ断片 ５゜　　　ＴＴ八八ＣＡＡＣＴＡＡＧＧＡＧＧ八　　　
　３゜３゜　ＡＡＴＴＧＴＴＧＡＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴ
ＡＧ　　５゜トトもに、ＢｃｏＲ　Ｉ　トＢｇｌ　Ｉｔ
　テ開裂したｐＵＧ１３１ブラスミド（ｐｕｃ　１３　
（ファノレマシア）のｐｏ　Ｉｙ　１　ｉｎｋｅｒ部分
をＭ　１３　ｔｇ　１３１（アマシャム）のｐｏｌｙｌ
ｉｎｋｅｒ部分と入れ換えたブラスミド（特願昭６２−
２７２０３４）　）と結合してｐＰＬ９を得た。ｐＢＲ
Ｄ　５０（１１をＥＣＱＲ　ＩとＢｇｌ　Ｉ［で切断し
てｔｒｃプロモーターを含む約３００ｂｐの断片を除き
、ｐＰＬ９をＢｃｏＲ　ＩとＢｇｌ　ＩＩで切断して得
た（ＰＬプロモーター＋ＳＩｌｌｌ）断片（約２８０ｂ
ｐ）を挿入してｐＰＬ９−５００１を得た。

３）　　ｐＢＲＤ　７０２の構築（図１３及び図１４参
照）ＮＫＡＦ　ｃＤＮＡの２８ｉｓ３Ｌｅｕをコードす
る塩基配列をｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉ
ｓによりＣＡＴ．：ＴＡからＣＡＣＴＴＡに変換した。

これにより新たにＡｆｌ　ｎ切断部位が導入された。

この変異ＮＫＡＦ　ｃＤＮＡを＾ｆｌ［で切り出すこと
によりシグナル配列を含まないＮＫＡＦｃＤＮＡ断片を
得た。この断片の前にＢｇｌ　ＩＩ切断配列、開始コド
ン及び’Ｌｅｕ’Ｈｉｓの配列を有する合成ＤＮＡリン
カーを挿入し、ｐＢ８　７０８４（特願昭６３−２５３
３０２）のベクター断片（ＢｇｌＩＩ−Ｓａｌ　Ｉ）に
結合した（図１３参照）。得られたｐＥＮＫ　７０２で
はｔｒｃプロモーター下流にＢｇｌ　ｍ部位を介してシ
グナル配列を持たないＮＫＡＰ　ｃＤＮＡが接続してい
る。次にｐＢＲＤ５００１のＢｇｌ　ＩＩ−ＰＶＵ　Ｉ
ベクター断片とｐＥＮＫ７０２のＢｇｌ　ＩＩ−Ｐｖｕ
　Ｉ　ＮＫＡＦ　ｃＤＮＡ断片を結合することによりｐ
ＢＲＤ　７０２を得たく図１４参照）。

４）　　ｐＮＫ　８００１の構築（図１５参照）ｐＰＬ
９−５００１をＢｇｌ　ＩＩで切断し、次いでＨｉｎｄ
Ｉ［Ｉで部分的に切断してアガロースゲル電気泳動で分
離し、プロモーター、ターミネーターを含むベクター断
片を分取した。

一方、ｐＢＲＤ　７０２をＢｇｌＩＩと旧ｎｄＩ［で切
断してＮＫＡＦ　ｃＤＮＡ断片を分取し、上記ベクター
断片を結合してｐＮＫ　８（１０１を得た。これにより
、ｐＢＲ　３２２　ｄ−ｒｏＩ）ベクター上にＰＬプロ
モーター−　ｍａｔｕｒｅ　ＮＫＡＦ　ｃＤＮＡ−ｒｒ
ｎＢターミネーターを接続した発現プラスミドが構築さ
れた。ｐＮＫ　８００１を用いて以下の発現実験を行っ
た。

２．　　ＮＫＡＦの大腸菌における発現ε．ｃｏｌｉ　
Ｎ　４８４０　Ｃｌ　８５７は高温感受性のλリプレッ
サー変異を有し、温度を高温にシフトすることによりＰ
Ｌプロモーターの誘発がおこる。

ｐＮＫ　８００１及びそれと等価のリンホトキシン発現
プラスミドｐＰＬ９−５００１をＮ　４８４０株にトラ
ンスフォーメーションで導入し、３０℃でアンビシリン
耐性トランスフォーマントを得た。

これらのトランスフォーマントをＬＢ培地中３２℃で振
盪培養し、００ｓ。。＝約０．２に達したところで（ｔ
ｉｍｅ　Ｄ）温度を４２℃にシフトし、培養を続けた。

シフト後各時点で培養液をサンプリングし分析に供した
。

菌体１０　０Ｄｓｏａ相当分（ＯＤ＝１ならば培地１０
ｍｊｉ分）を遠心で集め、０，４ｒｄの破砕バッファ一
（０．２Ｍ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ＝７．６．　０．２Ｍ　Ｎ
ａＣｌ，　０．ＯＩＭ　Ｍｇ　・アセテー｝．　０．Ｏ
ＩＭ　２−メルカブトエタノール，５％グリセロール）
に懸濁し、ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎで破砕した後、遠心し
て上清を天然ＮＫＡＦに対するウサギ抗体を用いたＩＥ
ＩＡにより測定した。

結果を次の表に示す。ＮＫＡＦの産生はｐＮＫ　８００
１を保有するトランスフォーマントのみに認められ、そ
の発現は温度シフトにより誘発された。産生はシフト後
３〜５時間にピークとなった。

ｐＮＫ８００１　　　　３　　　５　　　２６　　３３
　　１９　　ｎｇ／ｍ１実施例５ 酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）におけるＮＫＡＦの発現 １．分泌発現ベクターの作製 ＮＫＡＰ　ｃＤＮ＾よりシグナル配列を除いた成熟タン
パクをコードするＤＮＡをＧＡＬＴプロモーター．ａｔ
ｐｈａ−ｐｒｅｐｒｏシグナルシーケンスの下流に挿入
し、２μｍを複製起点にもつＹａｐ　１３に結合して、
分泌発現ベクターｐＹＮκ１９０２を得た。

１）　　ｐＴＮ　１０７１の構築（図１６）ｐＴＮ　１
０７１は、ＧＡＬ７プロモーター（特開昭６０−２４８
１８１）とｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ＧＬＩＧＯ　＃０１と
ａｌｐｈａ−ｐｒｅｐｒｏシグナルシーケンス（Ｈｅｒ
ｓｋｏｗ　ｉｔｚｅｔ　ａｌ，，　Ｃｅｌｌ，　　３０
．　９３３−９４３．　　１９８２）がｐＵｃ１２に挿
入されたものである。このベクターは、ｎａｔ　ｉｖｅ
なＧＡＬ７と同一なところに開始ｃｏｄｏｎ　ＡＴＧが
あるので、高い転写量が期待できる。

２）　　ｐＹＮκ１９０２の構築（図１７）ｐＴＮ　１
０７１のεｃｏＲ　Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントと
ｐＮＫ　８３０８のＢｇｌ　ＩＩ−Ｘｂａ　Ｉ　７　５
グメントトｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ＯＬＩＧＯ　＃０２を
Ｍ１３　ｍｐｌ９　（Ｍｅｓｓｉｎｇｅｔ　ａｌ，，　
Ｇｅｎｅ，　　３３．　　１０３−１１９．　　１９８
５）のＩＩ，ｃｏＲＩ．　ＸｂａＩ　ｓｉｔｅに挿入し
た（ｐＭ　１９０１）。

このｐｈａｇｅを鋳型にして、ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｏ
ＬＩＧＯ＃０３を用いて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏｍｕｔａｇ
ｅｎｅｓｉｓを行った（ｐＭ　１９０２）　．これによ
り、ａｌｐｈａ−ｐｒｅｐｒｏシグナルシーケンスのす
ぐ後にＮＫＡＦの成熟タンパクをコードするＤＮＡが付
加された。

同時にアミノ酸配列を変えずにＡｆｌＩＩ　ｓｉｔｅを
挿入できた。このｐＭ　１９０２をＲａｍ｝Ｉ　Ｉで切
断して、そのフラグメントをＹＢｐ　１３のＢａｍｔｌ
（　ｓｉｔｅに挿入してできたのがｐＹＮＫ　１９０２
である。このプラスミドはＧＡＬ７プロモーターを持つ
ので、培地中のグルコースがなく、ガラクトースが存在
するときのみ、転写の高発現が期待でき、またａｌｐｈ
ａ−ｐｒｅｐｒｏシグナルシーケンスにより培地中へＮ
ＫＡＦの分泌が期待できる。

２．　　ＮκＡＦの酵母における発現 ｐＹＮＫ　１９０２をＬｉｔｈｉｕｍ法（Ｉｔｏ　ａｔ
　ａｌ．，　Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，，　１５３．　
１６３−１６８．　１９８３）　　により、酵母εＨＡ
−ＩＣ及びＥＨＦ−２Ｃ　（表■）を形質転換した。得
られた形質転換体をロイシン抜きの選択培地中２５℃で
振盪培養した後、Ｃ源をグルコースからガラクトースに
換え、温度も３４℃に上げて振盪培養を続け、適当な時
点でサンプリングを行った。サンプルは遠心により菌体
と培地上清に分離した。菌体はＰＢＳとｇｌａｓｓ　ｂ
ｅａｄｓを加え、ｖｏｌｔｅＸによって破砕した上清を
、培地上清はそのまま希釈して、天然ＮＫＡＦに対する
ポリクロナル抗体とモノクロナル抗体によるεＩＡを行
った（表■）。ＮＫＡＦは菌体内にも存在するが、培地
上清にも分泌発現されていた。

表　　　Ｉ 零ｏｃｈ２（特開昭６３−３０９１８０）は温度感受性
にマンノースの付加ができなくなった変異。

〔発明の効果〕

実験例をもって本発明の効果を説明する。

実験例１ １．天然ＮＫＡＦの抗腫瘍活性 プラスチック非附着性ＰＢＬとＮＫＡＦを１０％Ｆ［：
Ｓ−ＲＰＭＩ−１６４０培地に入れ、３７℃で２．５時
間及び１６時間培養し、ＳＩＣｒでラベルしたＫ−５６
２．　Ｍｏｌｔ−・４或いはＤａｕｄ　ｉ細胞に対する
細胞障害活性を測定し、これよりＮＫＡＦの増強効果を
求めたところ表８、表９の結果を得た。ただしコントロ
ールの増強効果を１００％とした。

一４９１− 表 天然ＮＫＡＦのＮＫ活性増強効果 ＢＸＰ，　１ ８ＸＰ，　２ コントロールのＮＫ活性を １００％として示した。

ＥＸＰ．１ のコントロールのＮＫ活性 ６７％ ＥＸＰ．　２ のコントロールのＮＫ活性 ４０％ 表８、表９より天然ＮＫＡＦは組換インターロイキンー
２（ｒ−ＩＬ−２．塩野義製薬）や組換インターフェロ
ンーｒ　（ＩＦＮ−γ．　ＣＥＬＬＵＬＡＲ　ＰＲＯＤ
ＵＣＴＳＩＮＣ．）　と同様にＮＫ活性を増強する作用
を示した。

また、プラスチック非附着性ＰＢＬとマイトマイシンＣ
処理したＲａｊｉ細胞と混合し、１０％ＦＣＳ−ＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地中で３７℃、６日間培養し、これにＮ
ＫＡＦを加え、さらに１日培養した。これに、ＳＩＣｒ
でラベルした”Ｃｒ−Ｒａｊｉ細胞を加え、４時間培養
し、上清の各１００μｌをとり、Ｓ　＋　Ｃｒの放射活
性を測定することにより、ＭＬＴＲ（Ｍｉｘｅｄ　Ｌｙ
ｍｐｈｏｃｙｔｅ　Ｔｕｍｏｒ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅａｃｔ
ｉｏｎ）により誘導されたキラーＴ細胞の活性を調べた
。

その結果を表１０に示す。

コレヨり、ＮＫＡＦはＭＬＴＲにより誘導されたキラー
Ｔ細胞の活性を増強することがわかる。

表 実験例２ 組換ＮＫＡＦの抗腫瘍活性 ＢＨＫ／ｐＮＫ　８６０２　・ｐＳＶ２−　ｄｈｆｒク
ローン上清のＮＫＡＦ活性を、ヒト癌細胞株Ｋ−５６２
細胞を標的細胞として用いたＮＫ細胞活性の増強により
測定したところ表１１の結果を得た。

ＮＫＡＦの増強効果のコントロールを１００％として求
めたところ表１２の結果を得た。

従って、天然ＮＫＡＦとほぼ同様の効果が得られた。

表　　　　１１ ＢＨＫ／ｐＮＫ　８６０２　・ｐＳＶｚ−ｄｈｆｒクロ
ーン上清のＮＫＡＦ活性表 コントロールのＮＫ活性を １００％として示した。

【図面の簡単な説明】

図１は天然ＮκＡＦのモノクロナル抗体力ラムによる精
製の結果を示すクロマトグラム、図２はモノクロナル抗
体によるｉＥＩＡ　，図３は逆相ＨＰＬＣによる精製の
結果を示すクロマトグラム、 図４はＳＯＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図、図５、図６は
ＮＫＡＦの各ペプチド鎮のアミノ酸配列を示す図、 図７はＣ末端ベブチドの分離及び同定結果を示す図、 図８はｃＤＮＡクローンの制限酵素切断地図、図９はｐ
ＮＫ　８３０８のｃＤＮＡ塩基配列及びそれから推定さ
れるＮＫＡＦのアミノ酸配列を示す図、図１０はｐｃＤ
ベクターを用いたｐＮＫ　８６０２（７）ｅｔ築工程図
、 図１１はｐＢＲＤ　５００１の構築工程図、図１２はｐ
ＰＬ９−５００１の構築工程図、図１３はｐＥＮＫ　７
０２の構築工程図、図１４はｐＢＲＤ　７０２の構築工
程図、図１５はｐＮＫ ８００１の構築工程図、 図１６はｐＴＮ １０７１の構築工程図、 図１７はｐＹＮＫ １９０２の構築工程図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　組換ナチュラルキラー細胞活性化因子。 ２　分子中に下記アミノ酸配列のペプチドを有する請求
   項第１項記載の組換ナチュラルキラー細胞活性化因子。 【遺伝子配列があります。】 ３　組換ナチュラルキラー細胞活性化因子をコードする
   ｃＤＮＡ。 ４　請求項第２項記載の組換ナチュラルキラー細胞活性
   化因子をコードするｃＤＮＡ。 ５　下記配列によって示される塩基配列を含む請求項第
   ４項記載のｃＤＮＡ。 【遺伝子配列があります。】 ６　請求項第３項記載のｃＤＮＡを外来遺伝子として含
   み、かつ選択した宿主内で制御及び発現が可能となるよ
   うに連結して得られた発現プラスミド。 ７　請求項第４項記載のｃＤＮＡを外来遺伝子として含
   み、かつ選択した宿主内で制御及び発現が可能となるよ
   うに連結して得られた発現プラスミド。 ８　請求項第６項記載のプラスミドによって形質転換さ
   れた宿主。 ９　請求項第７項記載のプラスミドによって形質転換さ
   れた宿主。 １０　組換ナチュラルキラー細胞活性化因子を有効成分
   として含有する抗腫瘍剤。 １１　請求項第２項記載の組換ナチュラルキラー細胞活
   性化因子を有効成分として含有する抗腫瘍剤。