JPH03201985A - ヒトｍａｃｉｆ活性蛋白遺伝子、該遺伝子を結合した発現ベクター、形質転換細胞及びヒトｍａｃｉｆ活性蛋白 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ヒトＭＭＣＩＦ活性を示す蛋白質をコードす
る遺伝子、該遺伝子を結合した発現ベクター該発現ベク
ターで形質転換した細胞およびヒトＭＡＣＩＦ活性を有
する蛋白質に関する。ヒトＭＭＣＩＦ活性を示す蛋白質
とは、補体系の一連の活性化の最終段階を制御し、膜障
害複合体（ＭＭＣ，Ｍｅｍｂｒａｎｅａｔｔａｃｋ　ｃ
ｏｍｐｌｅｘ）形成を介する自己細胞、自己組織の損傷
を阻止する作用を有する一群の補体系制御蛋白である。

（従来の技術） 本発明者等は、さきにヒト正常赤血球膜から新規な補体
制御蛋白である天然型ヒトＭＡＣＩＦ（ＭＡＣＩｎｈｉ
ｂｉｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ）を純粋に単離することに
成功し、特許出願を行った（特願昭６３−３１０６４２
号）。

そして、ヒ）　ＭＡＣＩＦが、補体系の後半戒分群の活
球の溶血を阻止する点で、補体系前半威分群の活性化を
阻止する既知の補体制御物質とは相違する優れた性質を
有するものであること、およびこの天然型ヒトＭＭＣＩ
ＦがＮ−末端アミノ酸配列としてを有すること等を明ら
かにした。また、この天然型ヒトＭＡＣＩＦはＣ末端側
にフオスファチジルイノシトールアンカー（ｐｈｏｓｐ
ｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ　ａｎｃｈｏｒ。

以下ＰＩアンカーと略す）を有する分子量１８，０００
±１０００　（ＳＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法）の糖蛋白であることも明らかにした。

（発明が解決しようとする課題） 上記ヒトＭＡＣ４Ｆ活性を示す蛋白質について、さらに
研究し、医薬として実用化をはかるためには、純粋で均
質な蛋白を必要十分な量入手することが必要となる。こ
のための最も有効な方法は、組換えＤＮＡ技術の適用で
あると考えられるが、この方法を行うために必要な遺伝
子は、未だ単離されていない、したがって、本発明の目
的は、ヒトＭＭＣＩＦ活性を示す蛋白をコードする遺伝
子を提供することである０本発明の他の目的は、ヒｌ−
ＭＡＣＩＦ活性を示す蛋白をコードする遺伝子を発現し
うる複製可能な発現ベクターを提供することである０本
発明の別の目的は、該発現ベクターで形質転換された微
生物又は細胞を提供することである。さらに別の目的は
、遺伝子組換え法により得られたヒトＭＭＣＩＦ活性を
示す蛋白を提供することである。

ここに、本発明のヒトＭＭＣＩＦ活性を示す蛋白をコー
ドする遺伝子としては、下記式（１）のアミノ酸配列で
示されるポリペプチドをコードする遺伝子である。

式（り （式中、ＸおよびＹは、つぎの意味を示す。

Ｘ　　：　　Ｈ。

Ｍｅｔ又は Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓ
ｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　ＰｈｅＧｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ
　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　
ＣｙｓＨ４ｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒからな
るアミノ酸配列’ｉ’：ｏｎ、又は Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｐｒ。

からなるアミノ酸配列があります】からなるアミノ酸配
列のＣ末端側から１乃至３２個のアミノ酸を欠失したア
ご〕酸配列）。

上記アミノ酸配列をコードする遺伝子をさらに説明する
。

ヒト白血球から本発明者等が分離した遺伝子の一例は、
第１図で示されるＤＮＡ配列で示される遺伝子である。

この遺伝子は、天然型ヒ＋ＭＡＣＩＰの生理活性を発現
する部分のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を含ん
でいるほか、天然型ヒトＭＭＣＩＦ前駆体アミノ酸配列
（分泌シグナルペプチドやＰＩアンカー結合シグナルア
ミノ酸配列等を含む）をコードする遺伝子をも含んでい
る。

しかして分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子は、
宿主細胞内で産生されたヒトＭＭＣＩＦ活性を示す蛋白
を細胞外に放出させる際に必要なペプチドをコードする
遺伝子であり、また、ＰＩアンカー結合シグナルアミノ
酸配列をコードする遺伝子は、ヒトＭＭＣＩＦ活性を示
す蛋白にＰＩアンカーが付加するために必要な疎水性ア
ミノ酸配列部分をコードする遺伝子である。

本発明者等は、精製した天然型ヒトＭＭＣＩＦのＣ−末
端の解析から、天然型ヒ）Ｍ＾ＣＩＦにおいては第２図
のアミノ酸配列の７６番目のグルタミン酸にＰＩアンカ
ーが結合していることを知ることができた。ＰＩアンカ
ーとは、フォスフォエタノールアミン、グリカン、フォ
スファチジルイノシトール（ＰＩ　”）が連結した骨格
構造を有し、フォスフォエタノールアミンのアミノ基が
ペプチドのＣ末端アミノ酸のカルボキシ基に結合し、ま
たＰＩの脂肪酸が細胞膜に各々結合することにより、Ｐ
Ｉアンカーを介してペプチドを細胞膜に結合させる碇の
役目を為す構造を指す、かくして、第２図に示されるア
ミノ酸配列の内、−２５番目のメチオニンから−１番目
のセリン迄を含む配列が分泌シグナル配列であり、７７
番目のアスパラギンから１０３番目のプロリン迄を含む
配列がＰＩファンー結合シグナル配列であることが明ら
かになった。

従って、１〜７６番目迄のアミノ酸配列は、天然型ヒト
ＭＡＣｒＦのペプチド・コアをなすものである。

本明細書において、「ヒトＭＡＣＩＦ　Ｊとは、１番目
のロイシンから７６番目のグルタミン酸迄を含むペプチ
ドであって、該ペプチドのＣ末端にＰＩアンカーが付加
した蛋白質をいう、このヒトＭＭＣＩＦには、発現に使
用する宿主細胞の種類により、或いは生産の条件により
、糖鎖の構造を異にするもの、或いは＃ｉｕｉを有しな
いものが得られるが、いずれも本発明のヒトＭＭＣＩＦ
に含まれる。

ヒトＭＡＣＩＦの生理活性を有する医薬の実用化をはか
るためには、上に述べたヒトＭＡＣＩＦの構成要素の全
てを含む必要はなく、ＰＩアンカーを欠くものまたは、
ヒトＭＭＣＩＦと部分的にアミノ酸配列を異にするもの
であっても、ヒトＭＡＣＩＦの活性を発現するものであ
れば十分である。したがって、本発明の目的蛋白には、
ヒトＭＭＣＩＦと同様の生理活性を有しながら、ヒト門
＾ＣＩＦのアミノ酸配列の一部を欠失し、或は他のア〔
）酸配列で置き換え、或は他のアミノ酸配列を付加又は
挿入し、或はＰＩアンカーを欠き、或は糖鎖を欠きまた
はその種類を異にする蛋白質群も含まれる０本明細書で
は、これらの目的物を「ヒト？ＩＡＣＩＦ改変蛋白Ｊと
称する。

しかして、本発明の遺伝子には、上述のヒト阿＾ＣＩＦ
またはヒトＭＭＣＩＦ改変蛋白をコードする遺１０含ま
れる。ヒトＭＭＣＩＦ改変蛋白をコードする遺伝子の代
表的なものとしては、前記（Ｉ）式のアミノ酸配列の内
、７０番目のＡｓｎ迄のアミノ酸配列をコードするもの
、７５番目のＬｅｕ迄のアミノ酸配列をコードするもの
、７７番目のＡｓｎ迄のアミノ酸配列をコードするもの
、８２番目のＬｅｕ迄のアミノ酸配列をコードするもの
および８６番目のＴｈｒ迄のアミノ酸配列をコードする
ものを例示することができる。このほか、１０３番目の
Ｐｒｏ迄のアミノ酸配列をコードする遺伝子を挙げるこ
ともできる。この遺伝子は、高等動物細胞を宿主とした
場合には７６番目のＧｌｕにＰＩアンカーが付加された
ヒトＭＭＣＩＦを発現させるが、たとえば細菌を宿主と
して発現させた場合にはＰＩアンカーの付加は行われず
、１０３番目のＰｒｏ迄のペプチドからなるヒト門へＣ
ＩＦ改変蛋白を発現させる。したがって、この様な遺伝
子は便宜的に改変蛋白をコードする遺伝子に含めること
ができる。

また、ヒトＭＭＣＩＦのペプチド・コアをなす７６番目
のＧｌｕ迄のアミノ酸をコードする遺伝子をベクター上
で発現させると、ＰＩアンカーを持たない可溶性のヒト
ＭＭＣＩＦポリペプチド部分を生じる。

この様な遺伝子も、上記定義に基づき、改変蛋白をコー
ドする遺伝子に含めることができる。これら例示した遺
伝子以外でも７１番目乃至８５番目迄のアミノ酸配列を
コードする遺伝子であれば、ヒトＭＭＣＩＦ活性を示す
蛋白を産生できるものであり、本発明の遺伝子に包含さ
れる。

（製造方法） 本発明の遺伝子は、種々の方法で製造できる。

例えばヒトＭＡＣＩＦ産生細胞から得られるｍＲＮＡよ
り調製されたｃＤＮＡライブラリーよりヒトＭＭＣＩＦ
をコ−ドするｃＤＮＡを含むクローンを単離し、この単
離されたクローンよりＭＡＣＩＦ　ｃＤＮＡを分離する
方法および本明細書に開示されたヒトＭＭＣＩＦをコー
ドする遺伝情報に基づいて、例えばホスホアミダイト法
（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　
Ｎａｔｕｒｅ、　３ＩＱ　。

１０５〜１１１　（１９８４））等の常法に従って、核
酸の化学合成を行う方法、或は上記各方法を併用する方
法等を例示できる。この中、上記ｍＲＮＡを経る方法に
つき、より詳細に説明する。

オｉゴヌクレオチドブローブの ヒト赤血球から得られた精製天然型ヒ）ＭＡＣＩＦのＮ
末端アミノ酸配列にもとづいて、これらのアミノ酸をコ
ードするｍＲＮＡに相補的なオリゴデオキシリボヌクレ
オチドプローブを調製する。この調製は、市販のＤＮＡ
合威機（たとえば、アプライド・バイオシステムズ（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅａ＋ｓ　）社製３８０
Ａ型ＤＮ八合戒機）を用いてホスホアミダイト法により
化学合成できる。

ｃＤＮＡ−イフ゛−Ｉ−の富。＋＋ （］）原料細胞の調製 本発明方法においてヒトＭＡＣＩＦ　ｍＲＮＡの材料と
しては、本発明のヒトＭＭＣＩＦを発現するヒト細胞で
あればどのようなものを用いても良い。該細胞としては
、ｍＲＮＡ含有量が多い点からヒト末梢血由来のヒト白
血球系細胞、ヒトリンパ球系細胞、その他の組繊細胞及
びそれらを株化した適切な細胞株（Ｃｅ１ｌ　１ｉｎｅ
　）が有利に用いられる。

ヒト末梢血由来の白血球、リンパ球は健常人から採取し
たバフィーコートからデキストラン法あるいはフィコー
ルハイパツク法等の比重遠心法〔Ｂφｙｕｌｌ＋　Ａ、
、５ｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　
Ｃ１１ｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｉｎｖｅｓ
ｔｉｇａｔｉｏｎ、　　２Ｌ　　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ
　　９７゜７７〜８９　（１９６８）　）によって分離
され得る。組繊細胞は常法に従い、組織ホモジェネート
等から調製することができる。

株化ヒト細胞としては、例えばに５６２のようなヒト赤
芽球系白血病細胞、ＲａｊｉのようなヒトＢ細胞系白血
病細胞、ＭＴ−２のようなヒトＴ細胞系白血病細胞、Ｕ
９３７．　ＨＬ６０のようなヒト単球系白血病細胞及び
、ボウニス・メラノーマ（Ｂｏｗｅｓ　ｍｅｌａｎｏｍ
ａ　）のごときその他の組織癌細胞などが挙げられるが
、これらに限定されるものではない。これらの細胞株は
ソークインスティテユート細胞銀行（アメリカ、カリフ
ォルニア州）などの機関から容易に人手し得る。これら
の細胞の培養に際しては、たとえばその培養に通した動
物細胞培養培地（たとえば市販のＲＰＭＩ　１６４０培
地（Ｍｏｏｒｅ、　Ｇ、　Ｅ、　ｅｔ　ａＬＪｏｕｒｎ
ａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓ
５ｏｃｉａｔｉｏｎ＋　１９９＋５１９〜５２４　（１
９６７））など）を用いて、静置培養、スピンナー培養
、ローラーボトル培養等により行われる。

細胞を培養中に刺戟することにより、細胞中のヒトＭＭ
ＣＩＦ　ｍＲＮＡを大量に発現させることが出来る場合
がある。刺戟物質としては、免疫複合体が有利に用いら
れるが、更に例えばレクチン（例、コンカナバリンＡ　
（Ｃｏｎ　Ａ　）　、フィトヘマグルチニン（Ｐ　ＨＡ
　）など）、各種の抗原、ホルボールエステル（１２−
０−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート（
ＴＰＡ））、その他生体内刺激因子（例、インターロイ
キン群、インターフェロン群、コロニー刺激因子群、な
ど）などが挙げられる。

またこれらの二種または三種を組み合わせて使用しても
よい。

（２）　　ｖａ　ＲＮ　Ａの抽出 ヒトＭＡＣＩＦをコードするｍＲＮＡを含むＲＮＡ画分
は、上記各種細胞から常法に従い抽出される。この抽出
操作は、例えば上記細胞をチオシアン酸グアニジン混合
液又は適当な界面活性剤、例えばＳＯＳ　。

ＮＰ−４０，！−リドンーＸ　１００．デオキシコール
酸等を用いて、或はホモジエナイザーや溶血融解等の物
理的方法によって部分的又は完全に破壊、可溶化した後
に、染色体ＤＮＡをポリトロン等のミキサーもしくは注
射筒を用いである程度せん断し、その後、蛋白質と核酸
画分とを分別することにより行われる。この操作には、
特にフェノール・クロロホルム抽出もしくは超遠心を用
いる塩化セシウム重層法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、　Ｊ、　
Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

１４、５２９４〜５２９９　（１９７９）、　Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ、　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ。

Ｍｏ１ｅ−ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ。

ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ、（１９８２）　）等が採用される。

また上記方法に於ては、ＲＮａｓｅによるＲＮＡの分解
を防ぐために、ＲＮａｓｅインヒビター、例えばヘパリ
ン、ポリビニル硫酸、ジエチルピロカーボネート、バナ
ジウム複合体等を添加使用することもできる。

上記抽出操作によって得られるＲＮＡからのａ＋ＲＮＡ
の分離、精製は、例えばオリゴｄＴ−セルロース（コラ
ボレイティブ　リサーチ（Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ）社）、ポリＵセファロース（ファル
マシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社）等の吸着カラムを用
いる方法により、又はバッチ法により実施できる。

かくして得られるｍＲＮＡは、多種類の蛋白をコードす
るｍＲＮＡの混合物であるから、ｃＤＮＡライブラリー
の調製に先立って、ヒトＭＭＣＩＦに対応する目的のｍ
ＲＮＡの精製濃縮を行ってもよい。この精製濃縮は、次
の如くして行い得る。即ち、例えば上記で得られるｍＲ
ＮＡをショ糖密度勾配遠心等によって分画し、その両分
につき、例えば、ドツト・プロントハイブリダイゼーシ
ョン法により目的のヒトＭＡＣＩＦ　ｓ＋ＲＮＡの存在
を確認できる。

（３）　　ライブラリーの調製 上記で得られる精製−ＲＮＡは、通常不安定であるため
、これを安定な相補ＤＮＡ　　（ｃＤＮＡ）に変換し、
目的遺伝子の増幅を可能とするために微生物由来のレプ
リコンに接続する。インビトロでの、ｍＲＮＡの相補Ｄ
ＮＡへの変換、一般にオカヤマ・バーブ法（Ｏｋａｙａ
ｍａ、　Ｈ，ａｎｄ　Ｂｅｒｇ、Ｐ、＋　Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ　ａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　
　２．１６１〜１７０　（１９８２））に従って行うこ
とが出来る。

即ち、まずオリゴｄＴをプライマーとしくこのブライマ
ーは遊離のオリゴｄＴもしくは既にベクタープライマー
に付加されたオリゴｄＴのいずれでもよい）　、ｓ＋Ｒ
ＮＡを鋳型としてｄＮＴＰ　（ｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、
　ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）の存在下で逆転写酵素を用い
てｍＲＮＡに相補的な一本鎖ｃＤＮＡを合成する。次の
ステップは、上記に於て遊離のオリゴｄＴを用いたか、
ベクタープライマーに付加されたオリゴｄＴを用いたか
により、異なる。

前者の場合、鋳型としたｍＲＮＡをアルカリ処理等によ
り分解して除去し、その後−本鎖ＤＮＡを鋳型として逆
転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼ■を用いて二本鎖ＤＮ
Ａを作成する。次に得られる二本鎖ＤＮＡの両端をＳ！
ヌクレアーゼで処理し、そのそれぞれに適当なリンカ−
ＤＮＡ又はアニーリング可能な組合せの塩基を複数付加
し、これを適当なベクター、例えばＥＫ系プラスミドベ
クター（ストリンジェント型もしくはリラックス型のい
ずれでもよい）やλｇｔ系ファージベクターに組込む。

また、後者の場合、鋳型としたーＲＮ＾を残存させたま
ま、上記と同様のリンカ−を付与した開環状プラスミド
と、リンカ−ＤＮＡ　　（Ｌばしば細胞で自立複製でき
る領域と−ＲＮ＾の転写プロモーター領域を含むＤＮＡ
断片が用いられる）とを、アニーリングさせて閉環状と
した後、ｄＮＴＰの存在下で、　ＲＮａｓｅＨとＤＮＡ
ポリメラーゼ■とを共存させて、輪ＲＮＡをＤＮＡｔ！
４に置換し、完全なプラスミドＤＮＡを作成することが
できる。

上記のごとくして得られるｃＤＮＡを含むプラスミド・
ベクターを宿主内に導入し、これを形質転換できる。上
記宿主としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏ
ｌｉ）が代表的であるが、特にこれに限定されず、その
他に枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）
＋酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ）等も使用できる。

上記ＤＮＡの宿主への導入及びこれによる形質転換の方
法としては、一般に用いられている各種方法、例えば主
として対数増殖期にある細胞を集め、塩化カルシウム処
理により自然にＤＮＡを取り込みやすい状態にして、プ
ラスミドを取り込ませる方法等を採用できる。上記方法
においては、通常知られているように形質転換の効率を
一層向上させるために塩化マグネシウムや塩化ルビジウ
ムを共存させることもできる。また、宿主細胞をスフェ
ロプラスト又はプロトプラスト化してから形質転換させ
る方法も採用できる。

ｃＤＮＡのクローニング 上記により得られる形質転換株から、目的のヒトＭＡＣ
ＩＦのｃＤＮＡを有する株を検出する方法としては、例
えば以下に示す各種方法を採用できる。

■　合成オリゴヌクレオチド・プローブを用いるスクリ
ーニング法 本発明の如く目的蛋白質のアミノ酸配列の一部が解明さ
れている場合、該アミノ酸に対応するオリゴヌクレオチ
ドを合或しくこの場合、コドン使用頻度を用いて導いた
塩基配列又は考えられる塩基配列の組合せの複数個のど
ちらでもよく、また後者の場合、イノシンを含ませてそ
の種類を減らすこともできる〉、これをプローブ（３２
Ｐ又は１５３ラベルとする）として形質転換株のＤＮＡ
を変性固定したニトロセルロース・フィルターとハイブ
リダイゼーションし、得られた陽性株を検索して、これ
を選出する。

■　ヒトＭＭＣＩＦに対する抗体を用いて選出する方法 予めｃＤＮＡを形質転換株内で蛋白質を発現し得るベク
ターに組み込み、形質転換株内で蛋白質を生産させ、ヒ
ｌ−ＭＡＣＩＦに対する抗体及び該抗体に対する第二抗
体を用いて、所望のヒトＭＡＣＩＦ産出株を検出し、目
的株を得る。

■　他の動物細胞でヒ）　ＭＡＣＩＦを産生させてスク
リーニングする方法 形質転換株を培養し、遺伝子を増幅させ、その遺伝子を
動物細胞にトランスフェクトしくこの場合、自己複製可
能でＲＮ＾転写プロモーター領域を含むプラスくドもし
くは動物細胞染色体にインチグレートするようなプラス
ミドのいずれでもよい）、遺伝子にコードされた蛋白質
を産生させ、その培養上清もしくは細胞抽出物のヒ）　
ＭＭＣＩＦ活性を測定するか、又はヒ）　？ＩＡＣＩＦ
に対する抗体を用いて産生されたヒｌ−ＭＡＣＩＦを検
出することにより、元の形質転換株より目的のヒｌ−Ｍ
ＭＣＩＦをコードするｃＤＮＡを有する株を選択する。

互上慧ＣＩＦ迎Ｍ坐鏡認 ｍＲＮＡを介する方法で得られた本発明の遺伝子は、適
切な翻訳系を用いて、これが正しくヒトＭＭＣＩＦをコ
ードする遺伝子であることを確認することが出来る。こ
の方法としては例えばクリーブら〔にｒｉｅｇ、　Ｐ、
　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ１２　、７０５７−７０７０　（１９
８４））により開発された、強力なプロモーターと該プ
ロモーターに特異的なＲＮＡポリメラーゼを用いてｉｎ
　ｖｉｔｒｏで大量のｍＲＮＡを合成し、これを簡易な
翻訳系を用いて蛋白に翻訳する方法が汎用される。即ち
上記方法に於いては先ず、本発明のｃＤＮＡをＳＰ　６
プロモーターＴ７プロモーター、　　Ｔ３プロモーター
等の強力なプロモーターの下流に接続しくｗＲＮＡを介
する方法の場合は、ライブラリー作成の際に予めこれら
のプロモーターを有するベクターを用いることが出来る
）、該挿入プラスミドを精製後、各プロモーターの下流
に接続したヒトＭＡＣＩＦ　ｃＤＮＡの更に下流に存在
する適切な制限酵素部位で切断して直鎖２本１１ＤＮＡ
とした後、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでＳＰ６ボリメラーゼ、　
　Ｔ７ポリメラーゼ、　　Ｔ３ポリメラーゼ等の各プロ
モーターに特異的なポリメラーゼを用いてｍＲＮＡに転
写する。次いで転写されたｍＲＮＡを、ウサギ網状赤血
球ライゼート、または小麦胚芽ライゼート等の無細胞蛋
白合成系を用いるか、アフリカ・ツメガエル卵母細胞に
注入する方法を用いて、蛋白質に翻訳する。翻訳された
蛋白質についてＭＭＣＩＦ活性を測定するか、またはヒ
）ＭＡＣＩＦに特異的な抗体を用いた免疫学的方法によ
って、正しくヒトＭＭＣＩＦをコードする遺１０得られ
ていることを確認することが出来る。

這旦王父剋皇迭足 かくして得られる本発明遺伝子のＤＮＡ配列は、たとえ
ば、プラスミドベクターを用いるジデオキシ法（Ｃｈｅ
ｎ、　Ｅ、　Ｙ、、　ＤＮＡ、　　４．　１６５〜１７
０　（１９８５））および７−ＤＥＡＺＡ法（Ｍｉｚｕ
ｓａｗａ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃ
ｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１４　、１３１９〜１３
２４　（１９８６））により決定することができる。そ
の結果得られた遺伝子を第１図に示す。

以上ｍＲＮＡを経由する本発明の遺伝子の調製方法を詳
述したが、ヒトＭＭＣＩＦをコードする遺伝子は、ここ
に明らかにされた遺伝子配列に基づき、化学合成法によ
って調製することもできる。その代表的な方法として、
ホスホアミダイド法を挙げることができる。

発寒でノ３シづｍ匪腋 （１）　　宿主・ベクター系の選択 こうして得られたヒトＭＭＣＩＦ遺伝子のコード領域の
全長部分は真核及び原核生物を宿主として用いて発現さ
せることが可能である。これら宿主細胞に組込まれるベ
クターは、宿主細胞に応じて適宜構築される。

原核生物の宿主としては、大腸菌の菌株、例えば大腸菌
Ｋ　１２株２９４　（ＡＴＣＣ３１４４６）　、大腸菌
Ｂ３大腸菌ｘ１７７６　（ＡＴＣＣ３１５３７）、大腸
菌Ｃ６００及び大腸菌−３１１０（Ｆ−、λ−，プロト
ト口フインク。

ＡＴＣＣ２７３７５）　、バチラス属の菌株、例えば枯
草菌、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐ
ｈｉｍｕｒｉｕｍ）或は霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａ
ｒｃｅｓｃｅｎｓ）等の大腸菌以外の腸内細菌、シュー
ドモナス属の菌株等が挙げられる。

上記微生物を宿主として使用する場合のベクターとして
は、本発明遺１０発現できるように該遺伝子の上流にプ
ロモーター及びＳＤ塩基配列（Ｓｈｉｎｅ、　Ｊ、　ｅ
ｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　
Ｎａｔｉｏｎａｌ八ｃａｄｅｍｙへ　ｏｆ　　５ｃｉｅ
ｎｃｅｓ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　ＩＪ、Ｓ、八、、　　
７１．　１３４２〜１３４６　（１９７４）　）　、更
に蛋白合成開始に必要なＡＴＧを付与した発現プラスミ
ドが使用できる。

大腸菌株等のベクターとしては一般にｐＢＲ３２２゜ｐ
ＢＲ３２７等がよく用いられる。

プロモーターとしては、例えばトリプトファン・プロモ
ーター　Ｐｔプロモーター、　Ｉａｃプロモーター、　
ｔｐｐプロモーター、β−ラクタマーゼプロモーター等
を使用することが出来る。

マーカー遺伝子の例としては、アンピシリン耐性遺伝子
、テトラサイクリン耐性遺１０挙げられる。

また真核微生物としては酵母が一般によく用いられ、そ
の中でもサツカロミセス属酵母が有利に利用できる。該
酵母等の真核微生物の発現ベクターとしては、例えばＹ
Ｒｐ７等を用いることが出来る。

酵母発現用の発現ベクターのプロモーターの例としては
、３−ホスホグリセレートキナーゼ又はエノラーゼ、グ
リセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ
、ヘキソキナーゼなどを利用することが出来る。

マーカー遺伝子としてはｔｒｐｌ遺伝子等を利用するこ
とが出来る。

酵母細胞中に於ける転写や翻訳を制御するための複製起
源や終止コドン及びその他のＤＮＡ配列としては、酵母
細胞に適している通常の公知のＤＮＡ配列を用いること
が出来る。

高等動物の培養細胞を宿主とする場合は、赤毛ザル腎臓
細胞、蚊の幼虫の細胞、アフリカミトリサル腎臓細胞、
マウス胎児繊維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細
胞、及びそのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（Ｕｒｌ
ａｕｂ、　Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒ。

ｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　
Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓｏｆ　ｔｈｅ
　ＩＪ、Ｓ、Ａ、、　７７、４２１６〜４２２０　（１
９８０））　、ヒト頚上皮細胞、ヒト胎児腎臓細胞、蛾
卵巣細胞、ヒト骨髄腫細胞、マウス繊維芽細胞等が用い
られる。

そのベクターは、一般に本発明のＤＮＡを宿主細胞内で
発現させるための機能配列、例えば複製開始点、本発明
ＤＮＡの上流に位置すべきプロモータ、リボゾーム結合
部位、ポリアデニル化部位、転写終止配列を含有してい
る。

プロモーターは、例えばアデノウィルス２主後期プロモ
ーター　ＳＶ４０初期プロモーター　ＳＶ４０後期プロ
モーター、真核生物遺伝子からのプロモーター（例えば
、エストロゲン誘導ニワトリ卵アルブミン遺伝子、イン
ターフェロン遺伝子、グルココルチコイド誘導チロシン
アミノトランスフェラーゼ遺伝子、チミジンキナーゼ遺
伝子、主初期及び後期アデノウィルス遺伝子、ホスホグ
リセレートキナーゼ遺伝子、α因子遺伝子等）が好まし
い。

複製開始点としては、アデノウィルス、　ＳＶ４０ウシ
パピローマウィルス（ＢＰＶ）、水庖性口内炎ウィルス
（ＶＳＶ）、又はそれらの誘導体ベクター由来のものを
用いることが出来る。

またこの際のマーカー遺伝子としては、例えばネオマイ
シン耐性遺伝子、メトトレキセート耐性ジヒドロ葉酸還
元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子、等を用いる事が出来る。

以上、ヒトＭＡＣＩＦ　ｃＤＮＡおよびヒトＭＭＣＩＦ
改変蛋白ｃＤＮＡの発現に利用出来る宿主、ベクターお
よびその構成要素を例示したが、これらに限定されるわ
けではない。

（２）　　ヒトＭＭＣＩＦ発現ベクターの構築前述のよ
うに、ヒトＭＭＣＩＦはポリペプチドのＣ−末端にＰ！
アンカーを有する蛋白質であるため、その発現のための
宿主としてはＰＩアンカー合成機構を備えた細胞を選ば
ねばならない。ＰＩアンカー合合成機構は、原生動物・
酵母・枯菌から昆虫・哺乳動物まで幅広い細胞に分布し
ていることが知られている。既存の技術からＣ−末端に
ＰＩアンカーが付与したポリペプチドを生じることが期
待される宿主細胞の例として、ＣＨＯ細胞（Ｃａｒａｓ
。

１、　Ｗ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３２２
．５４５−５４９　（１９８７））、ＣＯＳ細胞（Ｃａ
ｒａｓ、　１．　Ｗ、　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ
、　２４３゜１１９６−１１９８　（１９８９））　、
Ｒ１，１胸腺腫細胞（Ｗａｎｅｃｋ。

Ｇ、　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｊｅｎｃｅ、　２４
１．６９７−６９９　（１９８８））等が例示できるが
、これらに限定されない。ここでは特に、宿主細胞とし
てチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）を用
いる場合の、ヒトＭＡＣＩＦ　ｃＤＮＡ発現ベクターの
作成法を詳述する。

市販のインビトロ転写用ベクターｐＧＥＭ　４のマルチ
クローニング・サイトにヒトＭＡＣＩＦ　ｃＤＮＡの挿
入されたプラスミドｐＧＥＭ　３５２−３を制限酵素Ｓ
ａｃ　Ｔおよび旧ｎｃＩＩを用いて切断後、アガロース
・ゲル電気泳動により、約４２５塩基対のＳａｃ　Ｉ　
／旧ｎｃＵ　ＤＮＡＵＴ片を調製する。これをマング・
ビーン・ヌクレアーゼ処理することにより平滑末端とす
る。

一方、ＣＨＯ細胞用発現ベクターとしては、第４図で示
される。）ＶＹ−１をＢｇｌＵを用いて切断後、マング
・ビーン・ヌクレアーゼ処理することにより、ＢｇｌＵ
切断末端を平滑末端としたものをベクター本体として用
いる。本ベクターと、先述の平滑末端にしたＳａｃ　Ｉ
　／旧ｎｃ　Ｉｆ　ＤＮＡ断片とを、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて結合後、大腸菌）ＩＢ　１０１株を形質転換
することにより形質転換体を得る。これより、プラスミ
ドをアルカリ法により調製し、制限酵素解析により、当
該遺伝子を発現するプラスミドを選択する。

このようにして調製した発現プラスミドを、メソトレキ
セート（Ｍｔｘ）非耐性のＣＨＯ細胞に、リン酸カルシ
ウム法により遺伝子導入する。形質転換体は肘に耐性と
なるので、Ｍｔｘ耐性株中より、当該ポリペプチドを発
現する細胞株を選択する。当該遺１０ＣＨＯ細胞中で発
現されると、発現生産されるポリペプチドからシグナル
ペプチドが除去され、あるいは更にプロセシングを受け
て、主としてＣ末端にＰ！アンカーが付加した蛋白を生
じる。

Ｃ末端にフォスファチジル　イノシトール　アンカーを
有するヒトＭＡＣＩＦを発現させるためのベクターは、
下記の公知技術により、本発明の弐（Ｉ）のポリペプチ
ドをコードする遺伝子の内、７７番目のＡｓｎ以降のＰ
Ｉアンカー付加疎水性シグナル配列をコードする部分を
改変した遺伝子を用いても構築することが出来る。

即ち、カラスらの類例（Ｃａｒａｓ、　１．　Ｗ、　ｅ
Ｌ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、　２３８．１２８０−１
２８３（１９８７））から、フォスファチジル　イノシ
トール　アンカーをそのＣ末端に有する公知の蛋白質の
前駆体Ｃ末端ＰＩアンカー付加疎水性シグナル配列をコ
ードするＤＮＡを、目的とする任意の蛋白質をコードす
るＤＮＡの３゛末端に付加したハイブリッドＤＮＡを作
威し、これを既に例示した如き遺伝子組換えベクターを
用いて発現すれば、任意の目的蛋白質のＣ末端にフォス
ファチジル　イノシトール　アンカーを付加させること
が可能なことは、当該業者にはよく知られている。該Ｐ
Ｉ　アンカー付加疎水性シグナル配列は、ファーガソン
らの総説（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ、　Ｍ、　Ａ。

ｅｔ　ａｌ、　Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　５７２８５−３２０　（１
９８８））等に記載の公知のＰＩチアンカー蛋白質前駆
体のＰＩアンカー付加シグナル配列を用いればよい。

或は、同じくカラスら（Ｃａｒａｓ、　１．　Ｗ、　ｅ
ｔ　ａｌ。

５ｃｉｅｎｃｅ、　２４３．１１９６−１１９８（１９
８９）　）は、Ｃ末端ＰＩアンカー付加シグナルとして
利用可能なポリペプチド配列として、ヒト成長ホルモン
のＮ〜末分泌シグナル配列でもよく、あるいはランダム
な疎水性ペプチド配列が利用可能なことを報告している
。即ちこれにより、ヒトＭＭＣＩＦの７６番目のＧｌｕ
迄をコードするＤＮＡ配列の３°側に、上記の如き疎水
性配列をコードするＤＮＡを結合したハイブリッド遺伝
子を用いても、ＰＩアンカーを付加せしめたヒｌ−ＭＡ
ＣＩＦを発現し得る可能性が示唆されている。

以上により、ＰＩアンカーをそのＣ−末端に付加したヒ
ｌ−ＭＡＣＩＦを得るための発現ベクターの構築の際に
用いる遺伝子配列は、第１図に示したＤＮＡ配列に限定
されないことは明白である。

Ｃ末端にＰＩ　アンカーが付加したし）　ＭＭＣＩＦポ
リペプチドは通常形質転換細胞膜上に発現される。

従って常法により、該形質転換細胞に抗ヒトＭＡＣＩＦ
抗体及び螢光標識した第二抗体を反応させた後、フロー
サイトメーターもしくは螢光活性化細胞選択装置（ＦＡ
Ｃ３）を用いて細胞表面の組換えヒトＭＡＣＩＦを検出
する事が出来る。又、該形質転換細胞をｐｈｏｓｐｈａ
ｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｈ
ｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ　Ｃ（ＰＩ−ＰＬＣ）で処理し
た際に、上記方法で細胞表面に組換えヒ）ＭＡＣＩＦが
検出されなくなれば、該方法により得られる組換えヒト
ＭＭＣＩＦにＰＩアンカーが付加している事を逆に証明
する事が出来る。

上記のような方法により、本方法で得られる形質転換細
胞で組換えヒ）　ＭＡＣＩＦが生産される事を確認する
事が出来る。

（３）　　ヒｌ−ＭＭＣＩＦ改変蛋白発現ベクターの構
築衣に、ヒトＭＭＣＩＦ改変蛋白を発現するためのベク
ターの作成法について説明する。

これらは第１図に示したＤＮＡ塩基配列を基本として、
その任意の一部、例えばＮ−末端部又はＣ末端部のアミ
ノ酸配列の一部を欠失するか、或はこれらを任意のアミ
ノ酸配列に置換するか、或は任意のアミノ酸配列を付加
したＤＮＡ配列に、（１１で述べた各々の宿主系での発
現に必要な構成要素を具備させたベクターであって、ヒ
トＭＡＣＩＦと同様の生理活性を有する蛋白を発現し得
る組換えベクターである。より具体的には、これらの発
現ベクターには、前記式（１）のアミノ酸配列で示され
るポリペプチドをコードする遺１０、式（ｒ）のアミノ
酸配列で示されるポリペプチドを発現させうる調節遺伝
子ＤＮＡに有効に結合している一連の組換えベクターが
含まれる。

細菌はＰＩアンカーの合成機構を持たないので、細菌を
宿主として上記発現ベクターで発現すると、何れの場合
もＰＩアンカーを持たないポリペプチドが発現する。

哺乳動物細胞を宿主とした場合は、ＰＩアンカー付加の
如何は複雑に制御される。一般に、ＰＩアンカーがポリ
ペプチドのＣ−末端に付加される際には、その前駆体か
ら特定の疎水性Ｃ−末端ポリペプチド部分（付加シグナ
ル配列）が除かれた後、ＰＩ　アンカー修飾されること
が知られてし）る。

ヒトＭＡＣＩＦの場合は、７７番目のＡｓｎから１０３
番目のＰｒｏ迄のポリペプチドがＰＩアンカー付加シグ
ナルとして働くが、上記の１番目から７０番目〜８６番
目までのアミノ酸からなる改変蛋白の発現ベクターに組
み込まれた各改変蛋白遺伝手番よ、ＰＩアンカー付加シ
グナル配列の全体又は一部をコードするＤＮＡを欠いて
いる。ＰＩアンカーが付加されるべき蛋白前駆体をコー
ドする遺伝子から、疎水性付加シグナル配列の一部をコ
ードする遺伝子断片を除くと、可溶性の蛋白質が産生さ
れることが知られている（Ｂｅｒｇｅｒ、　Ｊ、　ｅｔ
　ａｔ、、　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ　Ｃｈｅｓ＋１ｓｔｒｙ＋　２６３＋　１００１６　
１００２１（１９８Ｂ）　）。このことから、改変蛋白
をコードする本発明の遺伝子は、可溶性ヒｌ−ＭＭＣＩ
Ｆ改変蛋白を製造する遺伝子として利用できるものがあ
る。

以下、これらの改変蛋白を発現するためのベクターの中
、大腸菌内で第２図の１０３番目のアミノ酸迄を含む蛋
白質を発現するためのベクターおよび大腸菌内および哺
乳動物細胞内で８６番目、７７番目、７０番目のアミノ
酸までを含む各ＭＭＣＩＦ改変蛋白を発現させるための
ベクターにつき、その作成法および発現法を説明する。

（イ）１〜１０３番目のアミノ酸迄を含む蛋白質を大腸
菌を用いて発現させる場合 プラスミドｐＧＥＭ３５２−３を制限酵素Ｐｓｔｌおよ
びＨｉｎｃｌＩを用いて切断後、アガロース・ゲル電気
泳動により、約３１０塩基対のＰｓｔｌ／旧ｎｃｎ　Ｄ
Ｎ＾断片を分離精製する。

このようにして調製したＰｓｔ　Ｉ　／　Ｈｉｎｃ　Ｉ
Ｉ断片のＰｓｔ　Ｉ切断部位には、式（ＩＩ） （Ｉｆ） で示されるＰｓｔｌ切断部位をリン酸化した合成りＮＡ
を、Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼを用いて結合する。このよ
うにして、合成りＮＡを結合したＤＮＡ断片（Ｅｃ。

Ｒ１／ＨｉｎｃＩＩ断片）は、アガロース・ゲル電気泳
動により分離精製する。

一方、大腸菌用発現ベクターとしては、たとえば第３図
に示されるｐＫＫ　２２３−３をＥｃｏＲＩおよびＳｅ
ａ　　Ｉを用いて切断することにより作製したベクター
本体を用いる。本ベクターと、先述のＥｃ。

Ｒ１／）ｌｉｎｅＩＩ　ＤＮＡ断片とを、Ｔ４　　ＤＮ
Ａリガーゼを用いて結合後、塩化カルシウム法により大
腸菌に１２　ＪＭ　１０９株を形質転換する。形質転換
体より、アルカリ法によりプラスミドを分離後、制限酵
素解析により、目的とするＥｃｏＲＩ　／ＨｉｎｃｌＩ
　ＤＮＡ断片を組込んだプラスミドを保持する組換え体
を選択する。

このようにして得た組換え体を、適当な培地（たとえば
、１００＋ａＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピ
ラノシドを含むＬ培地）中で培養することにより、当該
ポリペプチドを発現生産することができる。発現される
ポリペプチドは、Ｎ末端にメチオニンが付加されている
。ただし、大腸菌内にあるＮ末端のメチオニンを分解す
る酵素により除去されたものも含まれる。

（ロ）１〜８６番目のアミノ酸迄を含む蛋白質を発現さ
せる場合 大腸菌を用いる場合にはｐＧＥＭ　３５２−３をＡｖａ
ｌｌを用いて切除後、式（Ｉ［［） ％式％ （［） で示される＾νａＩＩ切断部位をリン酸化した合成りＮ
Ａを、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて結合する。続いて
、Ｐｓｔ　Ｉを用いて切断後、式（ＩＩ）で示されるＰ
ｓｔｌ切断部位をリン酸化した合成［ＩＮＡを、Ｔ４　
ＤＮＡ　リガーゼを用いて結合する。このようにして、
合成りＮＡを結合したＤＮＡ断片（Ｅｃｏ　Ｒ１／旧ｎ
ｄｌ［ｒ断片）は、アガロース・ゲル電気泳動により分
離精製する。

このようにして調製したＥｃｏ　Ｒ１／Ｈ５ｎｄｍ　Ｄ
ＮＡ断片と、Ｅｃｏ　Ｒ１および）ｌｆｎｄＩｌｌを用
いて切断したｐＫＫ　２２３−３とを結合後、先述の方
法と全く同様にして、１〜８６番目のアミノ酸迄のポリ
ペプチドを発現する組換え大腸菌を得ることができる。

つぎに、ＣＩＯ細胞を用いて発現させる場合は、大ｕＩ
菌を宿主として発現する場合と同様に、ｐＧＥＭ３５２
−３をＡｖａｌｌ切断後、式（ＩＩＩ）で示される合成
りＮＡを結合する。続いて、Ｓａｃ　Ｉを用いて切断後
、アガロース・ゲル電気泳動により、約３７５塩基対の
ＤＮＡ断片を分離精製する。このＤＮＡ断片を、マング
・ビーン・ヌクレアーゼ処理することにより、平滑末端
とする。このＤＮＡ断片を、ＢｇＺＩＩ切断後、同切断
部位を平滑末端としたｐＶＹ　１に組み込むことにより
、発現プラスミドを作製する。この発現プラスミドを、
ＣＨＯ細胞に遺伝子導入することにより、１〜８６番目
のアくノ酸迄のポリペプチドを発現生産するＣＩＯ細胞
を得ることができる。

（ハ）１〜７７番目のアミノ酸迄および１〜７０番目の
アミノ酸迄を含む蛋白質を発現させる場合 １〜７７番目のア旦ノ酸迄お、よび１〜７０番目のア旦
ノ酸迄をコードする遺伝子を大腸菌およびＣＨＯ細胞を
宿主として発現させる場合も、上述の方法と同様にして
行なう。ただし、調製上具なる点は、ｐＧＥ？＋　３５
２−３をＡｖａ　ＩＩ切断後に結合する合成ＤＮＡが、
１〜７７番目のアミノ酸迄のポリペプチドを発現させる
場合は、式（ｒＶ） （ＩＶ） で示される合成ＤＮＡであり、また１〜７０番目のアミ
ノ酸迄のポリペプチドを発現させる場合は、式（Ｖ） ＧＡＣＡＣＡＴＴＧＡＣＴＴＣＧ八 （Ｖ） で示される合成ＤＮＡであることである。

これ以降は、上述（ロ）の方法と全く同様に行なって、
対応する遺伝子およびそれを発現する組換え体ベクター
を得ることができる。

形見（猿 かくして得られるヒトＭＡＣＩＦ　ｃＤＮＡ又はヒトＭ
ＡＣＩＦ改変蛋白ｃＤＮＡの発現ベクターの、所望の宿
主細胞への導入及びこれによる形質転換の方法としては
、一般に用いられている方法が採用できる。

該発現ベクター・プラスミドは、遺伝子構築に用いた宿
主（例えば大腸菌８８１０１株等）中より、アルカリ溶
菌法等の一般的方法により調製される。

調製したベクター・プラスミドを用いて宿主を形質転換
する方法としては、細菌を宿主とする場合はハナハン法
［Ｈａｎａｈａｎ、　Ｄ、、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、　１６６　、５５７
　５８０　（１９８３））等が、哺乳動物細胞を宿主と
する場合はリン酸カルシウム法（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ
、　Ａ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎ　Ｅｎｚｙ−ｍｏｌｏｇｙ、　６５．８２６−８３９
（１９８０）、　Ａｃａｄｅｓ＋ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、）
等が例示出来る。

蛋豆反ブ田製 上記で得られる形質転換体は、常法に従い培養すること
が出来、該培養により生物活性を有するヒトＭＭＣＩＦ
又はヒトＭＡＣＩＦ改変蛋白が生産、蓄積される。該培
養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じ
て慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば上記Ｃ
ＨＯ細胞であればＭＥＭ−α培地に必要に応じ牛胎児血
清（ＦＣＳ）等の血液成分を添加したものを使用できる
。

該形質転換体細胞で生産される組換えヒ）Ｍ＾ＣＩＦ、
又は組換えヒトＭＡＣＩＦ改変蛋白の発現部位は、選択
されたｃＤＮＡでコードされるアミノ酸配列、使用する
ベクターの種類、宿主細胞の種類、及びそれらの組合せ
によって異なり、細胞膜上、細胞内、又は細胞培養上清
に生産されうる。形質転換細胞より生産されるヒトＭへ
ＣＩＦ又はその改変蛋白は、その物理的性質、化学的性
質を利用した各種の分離操作〔例えば、日本生化学全編
　生化学データブック■、１１７５頁、第１版、第１刷
、１９８０年、株式会社東京化学同人、等〕により、そ
れらより分離精製する事が出来る。

該方法としては、具体的には例えば通常の蛋白沈澱剤に
よる処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（
ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン変換クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体
クロマトグラフィ、透析法、これらの組合せ等を例示出
来るがより具体的には該組換え蛋白の発現部位により異
なる。

培養上清に生産される組換え蛋白は、以下の方法による
。

まず培養上清より予め目的とする物質を部分精製する。

この部分精製は、例えば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリ
ウム、リン酸ナトリウム等の塩析剤を用いる処理及び／
又は透析膜、平板膜、中空繊維膜等を用いる限外濾過処
理等により行われる。

これらの各処理の操作及び条件は、通常この種の方法で
とられるものと同様のものとすればよい。

次いで上記で得られた粗精製物を、吸着クロマトグラフ
ィー、アフィニティークロマトグラフィーゲル濾過、イ
オン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー
、等に付すことにより、又これら各操作の組合せにより
、ヒ）　ＭＭＣＩＦの活性が認められる両分を取得し、
かくして目的物質を均等な物質として単離することが出
来る。

細胞股上に産生される組換え蛋白は、ＰＩアンカーを有
し、該アンカーを介して細胞膜と結合している場合もあ
る。該膜結合組換え蛋白は適切な界面活性剤〔例、ＮＰ
−４０，）ライドンＸ−１００，オクチルグリコシド〕
処理により細胞膜を破砕した後、上記と同様に精製する
事が出来る。また、別法として、ＰＩアンカーを介して
細胞膜に結合した組換え蛋白はＰＩアンカー切断操作を
施すことにより、可溶化することが出来る。該切断操作
としては、フォスファチジル・イノシトール特異的フオ
スフオリバーゼＣによる切断、もしくはフォスファチジ
ル・イノシトール特異的フォスフォリパーゼＤによる切
断が例示できる。上記方法で処理することにより可溶性
となった組換え蛋白は細胞培養上清に放出されるので、
上記と同様に精製することが出来る。

細胞内に生産される組換え蛋白は、上記膜結合組換え蛋
白の場合と同様、適切な界面活性剤処理により細胞膜を
破砕して組換え蛋白を溶液中に放出させた後、上記と同
様に精製する事が出来る。

上記方法により精製された組換えヒｌ−ＭＡＣＩＦ、可
溶性組換えヒｌ−ＭＭＣＩＦ　、又は改変体組換えヒト
ＭＡＣＩＦの活性は、リアクティブリシス【丁ｈｏｍｐ
ｓｏｎＲ，Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
　Ｅｘｐｅｒｉｖｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ。

１３１　、６２９−６４１　（１９７０）及びＬａｃｈ
ｍａｎｎ、　Ｐ、　Ｊ、　ｅｔａｌ、　Ｊｏｕｒｎａｌ
　ｏｆ　ＥｘｐｅｒｉＩＩｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎ
ｅ、　１３１゜６４３−６５７　（１９７０））阻害活
性の測定等の方法により確認する事が出来る。

（発明の効果） 以上、本発明の遺伝子、遺伝子を発現する為のベクター
、及び遺伝子を発現しうる形質転換微生物、及び形質転
換細胞並びにそれらの調製法について説明した。本発明
により、ヒｌ−ＭＭＣＩＦの遺伝子ＤＮＡ配列が初めて
明らかにされたと同時に、医薬として実用上有用なヒト
ＭＭＣＩＦの改変蛋白をコードする遺伝子も明らかにさ
れ、これにより遺伝子組換えの手法により純粋で均質な
ヒトＭＭＣＩＦまたはその改変蛋白の量産化が達成され
る。

ヒトＭＭＣＩＦまたはその改変蛋白は、ヒト由来である
ことから、ヒトに対する抗原性がなく、低毒性であり、
補体活性化反応の最終段階であるＭＡＣ形成を介する自
己細胞・組織の損傷を防止する作用を有するので、補体
制御成分が欠失あるいは低下している疾患、■型および
■型アレルギーとして分類されるすべての疾患、さらに
これらに限定されない種々の疾患の治療剤として有用に
用いることが出来る。

また、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）に代表されるが
如き補体制御成分の欠失あるいは低下している疾患にお
いてのみでなく、自己細胞・組織の損傷を伴う種々の炎
症疾患・自己免疫疾患において、ヒトＭＭＣＩＦは量的
にもしくは質的に正常とは異なる性状を示す可能性があ
る。従って、ヒｌ−ＭＡＣＩＦまたはその改変蛋白その
もの、ヒｌ−ＭＡＣＩＦまたはその改変蛋白に特異的な
モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、さらに
ヒトＭＭＣＩＦ又はその改変蛋白遺伝子ＤＮＡおよびヒ
トＭＭＣＩＦ又はその改変蛋白遺伝子に相補的なりＮＡ
は上記疾患の特異的な診断に利用し得る。

ヒｌ−ＭＭＣＩＦまたはその改変蛋白の投与形態は、疾
患の種類、症状、患者の状態により異なるが、全身投与
経路として通常注射剤、経鼻剤、生薬、埋め込み形製剤
などの非経口投与が用いられる。

また、局所投与経路として、関節腔内投与、患部埋め込
み形製剤等が用いられる。

これらの製剤の調製は、夫々剤形に適した組成物が配合
される。注射剤として製剤するには、ヒトＭＡＣＩＦま
たはその改変蛋白をたとえばリン酸緩衝生理食塩水やデ
キストロース水溶液に溶解し、必要に応して安定化剤、
分散剤等を加え、注射用アンプルに充填するか、あるい
はバイアルびん中で凍結乾燥し、投与時に注射用蒸留水
あるいは生理食塩水に溶解して用いることができる。

ＭＭＣＩＦ及びその改変蛋白の投与量は、通常成人１日
あたり、ｌＯμｇ〜５．０００韻ｇ、好ましくはｌｌｌ
１ｇ〜５００　ｍｇであり、これを１日１回乃至数回に
分けて投与する。

製剤調製例； ＭＡＣＩＦ及びその改変蛋白５ｇを生理食塩水１００Ｉ
Ｉ１１！、にとかした溶液を無菌濾過したのち、Ｚ　ｒ
ｓｌづつバイアルびんに分注する。次いで、凍結乾燥し
て１バイアル中ＭＭＣＩＦ及びその改変蛋白を１００ｍ
ｇ含有する注射用製剤を得る。

実施例 （１）　　ヒｌ−？’１ＡＣＩＦ精製標品のＮ末端およ
びＣ末端アミノ酸配列決定 １）Ｎ末端アミノ酸配列の決定 １８キロダルトンの天然型ヒトＭＡＣＩＦ精製標品を、
常法により８Ｍ尿素存在下に２−メルカプトエタノール
で還元し、ヨード酢酸によりアルキル化を行い、Ｓ−カ
ルボキシメチル化を行った後、気相プロテインシークエ
ンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｌｏ−５ｙｓ　Ｌｅｔａｓ
社製４７０Ａ、米国）を用いてＮ末端アミノ酸配列を分
析したところ、以下の結果が得られた。

１　　２　　３　　４　　５　　６　　７　　８　　９
　　１ＯＮＨ２−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ａ
ｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ２）Ｃ
末端アミノ酸配列決定 天然型ヒｌ−ＭＡＣＩＦ精製標品０．６ｍｇを、常法に
より６Ｍグアニジン塩酸存在下にジチオスレイトールで
還元し、ヨード酢酸によりアルキル化を行い、Ｓ−カル
ボキシメチル化を行った。反応液を蒸留水に対して、４
℃、−晩透析した後、透析内液を遠心型減圧濃縮器を用
いて０．５ｍｊ！にまで濃縮した。上記で得たカルボキ
シメチル化しトＭＭＣＩＦ溶液全量にＩＭ）リス塩酸緩
衝液（ｐＨ８，０）を加えて緩衝化し、次いで５０ｍＭ
）リス塩酸緩衝液２０ｐｉに溶解したＰｒｏｎａｓｅ　
（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）１００μｇを加え、３７
℃、２２時間反応した。

反応終了後、クロロホルム・メタノール（１：Ｉ）混和
液を０．５ｍｌ！加え、よく振とうした後、遠心分離し
た所、透明な上層、白濁した中層、透明な下層に分かれ
た。各層の一部を採取し、６規定塩酸で加水分解した後
ピコタグ・ワークステーション装置（ウォーターズ社製
、米国）を用いて常法により分析した所、中層にエタノ
ールアミンが認められたので、ＰＩアンカーがＣ末に付
加されたＰｒｏｎａｓｅ消化断片は中層に存在する事が
明らかとなった。上記Ｐ■アンカー付加Ｃ未断片を含む
中層６００μｌを凍結乾燥し、これに水・ｎ−ブタノー
ル・１規定塩酸（６００：６００：３　）混和液１．２
ａ＋Ｉｌを加えてよく振とうした後、遠心した。上記と
同様に６規定塩酸で加水分解後、ピコタグ・ワークステ
ーション装置を用いて分析した所、ブタノール層（上層
）にエタノールアミンが検出された。

得られた上層に等量のｎ−ブタノール飽和−５ｍＭ塩酸
を加え、振とう、遠心後、上層を得た。上記の酸性ブタ
ノールでの抽出を計２回繰り返した。

最後のｎ−ブタノール層の半量に就いて、プロテインシ
ークエンサー（前出）を用いてアミノ酸配列を決定した
。

その結果、第２図記載の配列中７２番目より７６番目に
相当する以下の配列が得られ、７７番目のＧｌｕ以降に
対応するアミノ酸は検出されなかった。

以上の事実は、赤血球由来天然型ヒトＭＡＣＩＦに於い
て、Ｎ〜末より数えて７６番目のＧｌｕにＰＩアンカー
が付加している事を示すものである。

を用い、ホスホア≧ダイト法により化学合成した。

３２ｐで５′末端をラベルした１５　ｍｅｒ混合プロー
ブ（以下、Ｍ１プローブと記載）は、示されるヌクレオ
チド配列を、また１７ＩＩＩｅｒ混合プローブ（以下、
Ｍ４プローブと記載）は、（２）　　ヒトＭＡＣＩＦを
コードするｃＤＮＡクローンを検出するためのオリゴヌ
クレオチドプローブの調製 （１）項で得られたアミノ酸配列に基づいて、アミノ酸
番号＋１〜＋５、および＋４〜＋９のアミノ酸配列をコ
ードするｍＲＮＡの領域に相補的な配列である、それぞ
れ１５　ｔａｅｒおよび１７　ｍｅｒのン昆合オリゴデ
オキシリボヌクレオチドプローブを、３８０Ａ型ＤＮＡ
合或機（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）
（３）　　ヒト単球ｃＤＮＡライブラリーの作製免疫複
合体で刺激したヒト末梢血単球由来のｍＲＮＡを材料と
して、市販されているインビトロ転写用プラス確ドベク
ターｐＧＥＭ　４　（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ　）社
製）を用い、オカヤマ・バーブ法〔前出〕に従って組換
えプラスミドを構築した。

なお、構築された組換えプラスミドは、ｐＧＥＭ　４に
存在するＳＰ　６プロモーター領域とＴ７プロモーター
領域にはさまれて位置するマルチクローニング部位の、
制限酵素Ｋｐｎｌ切断部位と制限酵素Ｓａｃ■切断部位
の間にｃＤＮＡが組込まれた格好になっており、ｃＤＮ
Ａの方向はＫｐｎｌ側（Ｔ７プロモーター側）がａＲＮ
Ａの３′側であり、Ｓａｃ　　Ｉ側（ＳＰ６プロモータ
ー側）がａＲＮＡの５′側である。

その組換えプラスミドを用いて、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＢ
１０１コンピテントセル（宝酒造社製）を形質転換し、
約４００，０００株の形質転換体から成るｃＤＮＡライ
ブラリーを得た。

（４）　　ヒトＭＡＣＩＦ　ｃＤＮＡのクローニング（
３）項で得られたヒト単球ｃＤＮＡライブラリーについ
て、ヒトＭＭＣＩＦをコードするｃＤＮＡを含むプラス
ミドを持つ形質転換体を得る目的で、（２）項で得られ
た台底オリゴヌクレオチドプローブを用いてコロニーハ
イブリダイゼーションを行ない、Ｍｌおよび旧プローブ
の両者とハイブリダイズするクローンを検出し、そのう
ち最長のｃＤＮＡ　（約２，０００ｂｐ）を含むクロー
ンのプラスミドｐＧＥＭ　３５２−３について、ｃＤＮ
＾部分の部分塩基配列を決定した。方法は、プラスミド
ベクターを用いるジデオキシ法（前出〕および？−ＤＥ
ＡＺＡ法〔前出〕により行ない、ｐＧＥＭ　４のＳＰ　
６プロモーター側（ａＲＮＡの５′側）から約５００　
ｂｐのｃＤＮＡ配列を決定した。その結果を第１図に示
す。

その結果、決定されたｐＧＥＭ　３５２−３クローンの
ｃＤＮＡ配列中には、（１）項で記した精製ヒトＭＭＣ
ＩＦのＮ末端の１０アミノ酸をコードする配列が存在す
るとともに、その上流−２５番目のアミノ酸に相当する
位置には翻訳開始コドンＡＴＧが、また下流＋１０４番
目のアミノ酸に相当する位置には翻訳終止コドンＴＡ＾
が存在していたが、それらによって形成されるオーブン
・リーディング・フレーム（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ
　ｆｒａｗ＋ｅ　）　は１２８アξノ酸から戒るタンパ
ク質をコードしていた。なお、−２５〜−１に相当する
領域のアミノ酸配列は、極めて疎水性に冨む、いわゆる
分泌シグナル配列であることを強く示唆するものであっ
た。

（５）　　ヒトＭＡＣＩＰ　ｃＤＮＡの卵母細胞に於け
る発現及び生物活性の確認 前述のｐＧＥＭ　３５２−３クローンについて、そのｃ
ＤＮＡ部分をその上流にあるＳＰ　６プロモーターを用
い、ＳＰ６　ＲＮ＾ポリメラーゼにより、ｉｎ　ｖｉｔ
ｒｏでｍＲＮＡに転写した。同時にヒトＩＬ−１αのｃ
ＤＮＡを含むクローンのプラスミドについてもｉｎ　ｖ
ｉｔｒｏでｍＲＮＡに転写した。それらのｓ＋ＲＮＡお
よびそれらの溶媒である緩衝液ＴＥ　　（１０ＭＭ　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｊ２．　ｐＨ８，０，１ｍＭＥＤＴＡ）を
アフリカッメガエルの卵母細胞に微量注入し、改変Ｂａ
ｒｔｈ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ　　（Ｇｕｒｄｏｎ、　Ｊ、
　Ｂ、。

Ｔｈｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅ
ｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ａｎｉａ＋ａｌＤｅｖｅｌｏｐｍｅ
ｎｔ、　０ｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅ
ｓｓ、　（１９７４））（免疫沈降に用いる場合は”５
−Ｃｙｓを０．１μＣｉ／μｌ加える）中で２０℃、４
８時間培養し、ｉｎνｉ　ｔｒｏで翻訳した。その後、
卵母細胞を０．０１％Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ　４０　（Ｎ
Ｐ　４０　）（シグマ（Ｓｉｇ＠ａ　）社製、米国）を
含む溶液中で超音波破砕し、遠心分離後、中間の水層（
以下、翻訳産物と記す）を免疫沈降、活性測定に用いた
。

■）翻訳産物の抗体反応性（免疫沈降）各翻訳産物と抗
ヒトＭＭＣＩＦウサギポリクローナル抗体、抗ヒトＴＮ
　Ｆウサギポリクローナル抗体を反応させた後、パンソ
ルビン（ＰＡＮＳＯＲＢＩＮＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ｃｅｌｌｓ、ヘキスト（Ｈｏｅｃ
ｈｓ　ｔ）社、西ドイツ）に抗体を結合させ、遠心した
沈殿物を結合緩衝液（アフィゲル　プロティンＡ　ＭＡ
ＰＳ−■キット、バイオラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　）社、
米国）で３回洗い、０．１７　Ｍグリシン塩酸水（ｐＨ
３，０）により遠心上清に現われた”５−Ｃｙｓを液体
シンチレーションカウンター（ＴＲＩ−ＣＡＲＢ　４６
０型、パラカード（Ｐａｃｋａｒｄ）社製、米国）によ
り計測した。

その結果、表１に示されるように　ｐＧＥＭ　３５２−
３をｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写翻訳系にかけたときに生じる
翻訳産物のみが特異的に抗ヒト門＾ＣｒＦウサギポリク
ローナル抗体と反応することが示された。

表 １ ２１８　　　　　　　４１０ ２）翻訳産物の生物活性 ２−１）抗ヒトＭＡＣＩＦ抗体カラムによる部分精製 常法により、活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア社
製、スウェーデン）と精製したマウスモノクローナル抗
ヒｌ−ＭＡＣＩＦ抗体を結合させて調製した抗体カラム
に上記の翻訳産物を吸着させた後、０、１％ＮＰ　４０
を含むリン酸緩衝化食塩液（ＰＢＳ）とＯ９１％ＮＰ　
４０を含む２Ｍ食塩水にて十分洗浄した。

抗体カラムに吸着した翻訳産物は０．１％ＮＰ　４０を
含む３Ｍチオシアン酸ナトリウム水にて溶出した後、０
．０１％ＮＰ　４０を含む５ＧＶＢ”　緩衝液とバッフ
ァー交換して活性の測定に用いた。なお、上記の５ＧＶ
Ｂ”緩衝液は、０．１％ゼラチン、５ｍＭバルビッール
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，４）　、８．５６％シー
ＪＲ１０，１５５Ｍ塩化カルシウム、１　ｍＭ塩化マグ
ネシウムからなる組成を持つ緩衝液である。

２−２）翻訳産物の活性測定 Ｄｅｓｓａｕｅｒ等の方法ＣＤｅｓｓａｕｅｒ、　Ａ、
　ｅｔ　ａｌ、、ＡｃＬａＰａｔｈｏｌｏｇｉｃａ　Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ　５ｃａｎｄｉｎａｖｉａ
　５ｅｃ−ｔｉｏｎ　　Ｃ５ｕｐｐｌｅｓ＋ｅｎｔ　　
２Ｂ４．　９２．　７５−８０１９８４））　　により
ヒトＣ５とＣＧからヒトｃ５〜０６複合体（凍結保存後
融解：　　Ｃ５，６ｆ）を調製し、モルモット赤血球（
１０７細胞／ｓｏ浮遊液と混合して３３℃で５分間イン
キュベートした。次にＣ７を添加し更に１５分間インキ
ュベートし、モルモット赤血球−ヒト補体ｃ５−７複合
体（以下、ＥＣ５−７中間体と記す）を調製した。この
ＥＣ５−７中間体浮遊液（１，５Ｘ　１０＠／ａｘｌり
とＣＢ、　Ｃ９及び標品溶液を加えて、全量１ｍｊ！と
しく１．５ｘ１０’／１ＩＩ４り、３７℃で１時間イン
キュベートした。この時、標品溶液を加えていないもの
を同時にインキュベートしてコントロールとした。反応
後２０００Ｘｇ、５分間遠心分離し、その上清の吸光度
（４１４ｒｖ　）を測定して溶血率を求めた。活性単位
の表示は、Ｈａｍｍａｒ等の方法（Ｈａｍｍｅｒ、　Ｃ
，Ｆｌ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５６゜３９９５−４
００５　（１９８１）　）に準じて赤血球細胞当りのサ
イト数（Ｚ）を算出した。コントロールのＺ値に対する
百分率をもって活性の指標とした。

コントロールとして用いたＴＥやＩＬ−１αの場合には
、全く活性が認められないが、ヒトＭＡＣＩＦの場合に
は有意な溶血阻害活性が認められた（第５図）。これら
の活性は用量依存的に認められ、しかも、ヒトＭＡＣｒ
Ｆに対するマウス・モノクローナル抗体にて完全に中和
された（第６図）。

従って、（４）で得たｐＧＥＭ　３５２−３クローンの
ｃＤＮＡはヒトＭＡＣＩＦをコードしている事が明らか
である。

（６）　　発現ベクターｐｖｙ　１の構築発現ヘクター
ｐＶＹ　１の構築は、第７図に示すごとく行った。

ｌ）先ず、ベクターｐＡｄＤ２６ＳＶ　（Ａ）　Ｎａ３
　（東京大学半田宏博士より入手；　　Ｋａｕｆｍａｎ
、　Ｒ，Ｊ、　ａｎｄＳｈａｒｐ＋　Ｐ、　Ａ、、　Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ。

茎、　１３０４〜１３１９　（１９８２）の論文で公知
である〕ＤＮＡを、Ｂｇｌ　ＩＩで切断し、フェノール
・クロロホルム抽出、エタノール沈澱後、滅菌蒸留水に
溶解した０次に、Ｋｌｅｎｏ−酵素（ベーリンガー・マ
ンハイム社製）を用いて常法により平滑末端とし、フェ
ノール・クロロホルム抽出、エタノール沈澱後、滅菌蒸
留水に溶解した。更に、ＤＮＡライゲーションキット（
宝酒造社製）を用いて自己結合させた後、大腸菌ＨＢ　
１０１コンピテントセルを形質転換した。テトラサイク
リン耐性を示す形質転換体よりプラスミドＤＮＡを得た
。これらのＤＮＡの一部をＢｇｌ　　ＩＩで処理後、０
．７％アガロースゲルで電気泳動を行い、Ｂｇｌ　　Ｉ
Ｉ部位を消失したクローンｐＡｄＤ２６ＳＶ（Ａ）　Ｎ
ａ　３　（Ｎ　）を得た。

次に、このプラスミドＤＮＡをＥｃｏ　Ｒ１消化後、フ
ェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈澱後、滅菌
蒸留水に溶解し、マング・ビーン・ヌクレアーゼ（ファ
ルマシア社製）を用いてＥｃｏ　Ｒ１切断部位を平滑末
端とし、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈
澱後、滅菌蒸留水に溶解した。

２　）　ｐＫｓＶｌｏ　（７７／Ｉ／７　シフ社Ｗ）　
ＤＮＡ　ヲ常法ニより制限酵素Ｋｐｎ　ＩおよびＢａａ
　ＨＩで切断した後、Ｔ４ＤＮＡ、ｔｃリメラーゼ（宝
酒造社製）およびにｌｅｎｏｗ酵素により平滑末端とし
た。次に、０．７％アガロースゲルで電気泳動を行い、
約２．９Ｋｂｐの断片を分離後、電気溶出法によりＤＮ
Ａを回収した。

３）１）項で得たＤＮＡ断片と２）項で得た１）ＮＡ断
片を、ＤＮＡライゲーションキットを用いて、結合させ
た後、大腸菌）ＩＢ　１０１コンピテントセルを形質転
換した。

テトラサイタリン耐性を示す形質転換体の中がら常法に
よりプラスミドＤＮＡを調製した。これらのプラスミド
ＤＮＡの一部をＰｓｔｌにより消化し、１、０％アガロ
ースゲル電気泳動を行い、約３．６Ｋｂｐ、約３．２５
Ｋｂρ、約１．５Ｋｂｐバンドを示すプラスミドｐＶＹ
　１を得た。

（７）　　ヒトＭＡＣＩＦ　ｃＤＮＡのＣＨＯ細胞にお
ける発現ｌ）ヒトＭＡ（ＪＦ　ｃＤＮＡ発現ベクターの
構築プラスミドｐＧＥＭ　３５２−３を制限酵素Ｓａｃ
　Ｉ及びＨｉｎｃＩＩを用いて切断後、アガロース・ゲ
ル電気泳動により、約４２５塩基対のＳａｃ　Ｉ　／　
Ｈｉｎｃ　ＩＩ　ＤＮＡ断片を分離精製した。このＤＮ
Ａ断片をマング・ビーン・ヌクレアーゼ処理することに
より、平滑末端とした。

一方、Ｃ）１０細胞用発現ベクターとしては、（６）で
得たｐＶＹ　１を用いた。ｐＶＹ　ｉを８ｇ１ｆｆを用
いて切断後、マング・ビーン・ヌクレアーゼ処理するこ
とにより、ＢｇｌＩ［切断末端を平滑末端としたものと
、先述の平滑末端にしたＳａｃ　Ｉ　／旧ｎｃｌｌ　Ｄ
ＮＡ断片とを、Ｔ４ＤＮ＾リガーゼを用いて結合後、大
腸菌ＨＢ　１０１株を形質転換することにより、テトラ
サイタリン耐性を示す形質転換体を得た。これより、プ
ラスミドをアルカリ溶菌法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、　Ｈ。

Ｃ，ａｎｄ　Ｄｏｌｌｙ、　Ｊ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　７　。

１５１３〜１５２３　（１９７９））により調製し、Ｐ
ｓｔｌ等を用いた制限酵素解析により、当該遺伝子を発
現するプラスミドを選択した。

２）ヒトＭＡＣＩＦ遺伝子のＣＨＯ細胞における発現の
［認 上述のように作製した発現プラスミドを、ＤＨＦＲ欠損
ＣＯＯ細胞（Ｕｒｌａｒｂ、　Ｇ、　ａｎｄ　Ｃｈａｓ
ｉｎ、　Ｌ、＾、。

Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎ
ａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎ−ｃｅｓ　ｏ
ｆ　ｔｈｅ　Ｕ、Ｓ、Ａ、＋″７７　、４２１６〜４２
２０　（１９８０）　）にリン酸カルシウム法（前出〉
によりトランスフェクトし、選択培地（ＭＥＭ　ａｌｐ
ｈａ（−）　、（ギブコ社製）〕にて生育する形質転換
体を得た。

形質転換したＣＨＯ細胞を選択培地で培養後、５×１０
Ｓ個につき、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄
後、ヒトＭＭＣＩＦに対するモノクローナル抗体（Ｉｇ
Ｇ　１　）を産生ずるハイプリドーマ細胞培養上清５０
０μｌで懸濁し、氷中１時間反応させた。

また、同時にコントロールとしてヒトプロティンＳに対
するモノクローナル抗体（ＩｇＧ　ｌ　）を産生ずるハ
イブリドーマ細胞培養上清を用い同様の処理を行った。

反応後、２％ウシ胎児血清、０．１％窒化ナトリウムを
含むＰＢＳ　（以下洗浄液と称す）で３回洗浄後同洗浄
液で５０倍希釈したＦＩＴＣ（Ｆｌｕ。

ｒｅｓｃｅｉｎ　１ｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）標識
抗マウスイムノグロブリン（アマジャム・ジャパン社製
）ト１ｘ１０”／ｒａｔの濃度で氷中３０分間反応させ
た。反応後洗浄液にて３回洗浄後、フローサイトメータ
ー　（ＥＰＩＣ５ＰＲＯＦＩＬＥ　　コールタ−社、米
国）にて解析を行った。その結果第８図ａ、ｂに見られ
るごとく、抗ヒトＭ＾Ｃ［Ｆ抗体を用いた場合螢光強度
が高い方ヘシフトし、抗ヒトＭＡＣＩＦ抗体の細胞への
結合が認められた。従って、この形質転換したＣ）１０
細胞はヒトＭＭＣＩＦを発現していることが確認された
。

また、この形質転換ＣＩＯ細胞をＰＢＳで洗浄後Ｐｈｏ
ｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−ｓｐｅｃｉｆｉ
ｃ　ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅＣ（ＰＩ−ＰＬＣ，フ
ナコシ、サラポロビール製）にて３７°Ｃ１３０分間反
応後、洗浄液にて３回洗浄を行い、同様に抗ヒトＭＭＣ
ＩＦモノクローナル抗体並びにＦＩＴＣ抗標識マウスイ
ムノグロブリンにて螢光染色を行った。その結果第８図
Ｃに見られるごとく、ＰＩ−ＰＬＣ処理により螢光強度
がコントロールまで下がり、この形質転換ＣＨＯ細胞で
発現されていたヒトＭＡＣＩＦはＰＩ−ＰＬＣ処理によ
り膜から遊離することが示された。従って、この形質転
換ＣＨＯ細胞上に発現されたヒトＭＡＣＩＦはＰＩ−Ｐ
ＬＣで切断を受ける様なＰＩアンカー型蛋白としてその
膜上に発現されていることがｔｉ認された。

３）ヒトＭＡＣＩＦ　ｃＤＮ＾形質転換ＣＩ（０細胞に
おける発　現蛋白の生物活性 上述の形質転換ＣＨＯ細胞上に発現されたヒトＭＭＣＩ
Ｆの生物活性を［認する目的で、大量に培養した形質転
換ＣＨＯ細胞をＰＢＳにて洗浄後、種々のタンパク質分
解酵素阻害剤（１ｍＭ　Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ。

２ｍＭ　Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ　
ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、　２１ＭＭＥｔｈｙｌ
ｅｎｅｄｉａ　　ｌ１ｉｎｅ　　Ｌｅｔ　　ｒａａｃｅ
ｔｉｃ　　ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）。

２ｍＭＥ　ｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−ｂｉｓ（β−
ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ　ｅｔｈｅｒ）Ｎ、Ｎ、　Ｎ’　
、Ｎ’　−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ　（ＥＧ
ＴＡ）、いずれもシグマ社製）と２％ＮＰ　４０を含む
ＰＢＳにて４°Ｃ５−晩反応することにより細胞を可溶
化した。

１２、０００回転、３０分の遠心分離にて得た上滑を、
＋５１−．２−１）項で既述した方法により抗ヒ）　Ｍ
ＭＣＩＦモノクローナル抗体カラムを用いて部分精製し
生物活性測定に用いた。

形質転換ＣＨＯ細胞より部分精製したヒｌ−ＭＡＣＩＦ
の阿＾Ｃ形成阻害活性（リアクティブリシス阻害活性〉
は、（５）−２−２）項に既述した方法により測定した
。第９図に示すように、ＣＨＯ細胞に発現されたヒトＭ
ＭＣＩＦは、用量依存的なＭＡＣ形戒形成活性を示した
。また、これらの阻害活性は、赤血球由来のヒトＭＡＣ
ＩＦに対するマウスモノクロナール抗体により中和され
た。

以上の結果より、ＣＨＯ細胞により発現されたし）ＭＡ
ＣｒＦは、ヒト赤血球由来のＭＭＣＩＦと同一の活性を
有していることが明らかとなった。

（８）　　ヒ）　ＭＡＣＩＦ改変蛋白をコードする遺伝
子の大腸菌における発現 ｌ）ヒｌ−ＭＭＣＩＦ改変蛋白発現ベクターの構築と大
腸菌における発現 １−１）大腸菌発現用ベクターの調製 大腸菌発現用ベクターｐＹｌｌｉＪＯＯ１（ファルマシ
ア社製（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）第１０図〉は、制限酵
素旧ｎｄ■を用いて切断後、アガロース・ゲル電気泳動
により、複製起点及び当該遺伝子発現用プロモーターを
含むベクター本体を分離精製後、アルカリホスファター
ゼを用いて処理することにより、末端のリン酸基を除去
した。

本ベクターに挿入するＳ０配列、ヒトＭＭＣＩＦ改変蛋
白遺伝子及び転写ターミネータ−を含むＤＮＡ断片は以
下のようにして作製した。

１−２）１０３番目のアミノ酸迄のペプチド配列を含む
ヒトＭＭＣＩＦ改変蛋白（Ｅ１０３）発現用の挿入ＤＮ
Ａ断片の調製 ｐＧＥＭ　３５２−３を制限酵素Ｐｓｔ　Ｉ　、旧ｎｃ
Ｉ［及びＢａｇ旧を用いて切断後、アガロースゲル電気
泳動により、約３１０塩基対のＤＮＡ断片を分離精製し
た。

方、式（Ｖｌ） ＳＤ　　ＲＯＸ ＴＲＰ　　Ａ　　ＴＥＲＭ （Ｖｌ） に示した合［ＤＮへのＢ及びＣをポリヌクレオチド・キ
ナーゼを用いて末端をリン酸化した。リン酸化したＢ及
びＡ、リン酸化したＣ及びＤを、９０℃から１６℃まで
徐冷することにより、それぞれをアニーリングした。ア
ニーリングした２種のＤＮＡと、先に調製した約３１０
塩基対のＤＮＡとを、Ｔ４　ＯＮＡリガーゼを用いて結
合後、アガロース・ゲル電気泳動により、ヒトＭＡＣＩ
Ｆ改変体（Ｅ　１０３）をコードする領域を含む約３７
５塩基対のＤＮＡ断片を分離精製した。

１−３）８６番目のアミノ酸迄のペプチド配列を含むし
）　ＭＡＣＩＦ改変蛋白（Ｅ８６）発現用の挿入ＤＮＡ
断片の調製 先に調製した約３１０塩基対のＤＮＡ断片を制限酵素Ｍ
ｂｏ　ＩＩを用いて切断後、アガロースゲル電気泳動に
より、約２５０塩基対のＤＮＡ断片を分離精製した。

一方、式（■） ＳＤ　　ＢＯＸ Ｈｉｎｄ　ｍ ｓｔ　　Ｉ ＴＲＰ　　Ａ　　ＴＥＲＭ ｂｏ　　Ｕ Ｈｉｎｄ　　ｍ （■） に示した合成りＮＡのＢ及びＣをポリヌクレオチド・キ
ナーゼを用いて末端をリン酸化した。リン酸化したＢ及
びＡ、リン酸化したＣ及びＤを、９０℃から１６℃まで
徐冷することにより、それぞれをアニーリングした。ア
ニーリングした２種のＤＮＡ　と、先に調製した約２５
０塩基対のＤＮＡとを、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて
結合後、アガロース・ゲル電気泳動により、ＭＭＣＩＦ
改変蛋白（Ｅ８６）をコードする領域を含む約３２５塩
基対のＤＮＡ断片を分離精製した。

１−４）ヒ）　ＭＭＣＩＦ改変体の大腸菌用発現ベクタ
ーの調製と形質転換 このように調製した２種類のＤＮＡ断片は、ポリヌクレ
オチド・キナーゼを用いて末端をリン酸化後、先に作製
したベクター本体と、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて反応
した。この反応物を用いて、大腸菌に１２℃Ｍ１０９株
を形質転換した。得られた形質転換体より、アルカリ法
（前出）により、プラスミドを調製後、制限酵素解析（
例えばＰｓｔｌ切断による）により、当該遺伝子を発現
する方向で組み込んだプラス５ドを選択した。

ｌ−５〉発現と培養 当該遺伝子を発現する組換え大腸菌の前培養液１１５０
容を、１００μｇ７’ａｌアンピシリン含有２　ｘＹＴ
培地（バタトトリプトン１６ｇ、イースト・エキストラ
フ１１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ／■）に植菌後、３７
℃にて振とう培養し、当該組換え大腸菌が、５ｘ　１０
　’　／　ｖａｌ程度の細胞密度にまで生育した時点で
、イソプロピル・チオガラクトピラノシドを２．５ｍＭ
となるように添加し、１６時間の培養後集菌した。

集菌した菌体は、２ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　２ｍＭ　ＥＧ
ＴＡ　、　１１１Ｍベンザミジン、２１１Ｍフェニルメ
チルスルホニル・フルオリド（ＰＭＳＦ）　（いずれも
シグマ（ＳＩＧＭＡ）社製）を含有するＰＢＳに懸濁後
、マントン・ガラリンを用いて、菌体破砕液を調製した
。

２）ヒ）　ＭＭＣＩＦ改変蛋白遺伝子の大腸菌における
発現蛋白の精製及び生物活性の測定 ２−１）精製 上述のように調製した大腸菌破砕物から１２．０００回
転、３０分遠心して得た沈澱物を６Ｍ塩酸グアニジン存
在下で４℃、−晩攪拌して可溶化した。

同一条件で遠心して不溶物を除いた後、その上清に含ま
れる発現蛋白（Ｅ１０３又はＥ８６）を、Ｗｉｎｋｌｅ
ｒと旧ａｂｅｒの方法（Ｗｉｎｋｌｅｒ、　Ｍ、　Ｅ、
　ａｎｄＢｌａｂｅｒ、　Ｍ、＋　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ＋　２５６．４０４１　４０４５（１９８６）　
）に準じて、酸化型と還元型グルタチオン（シグマ　（
Ｓｉｇｍａ）社製）存在下で反応することにより再構築
した。

次に、１０−トリス緩衝液（ｐＨ８，０）に対して十分
透析した後、同一緩衝液にて予め平衡化したＱ−Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ　　（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
）社製）にアプライし精製した。

２−２）ヒト旧ＣＩＦ改変蛋白（ＥＩ０３）の活性第１
１図に示したように、（５）−２−２＞項に記述した方
法により測定したりアクティブリンス阻害活性は、二峰
性に認められたが二番目の活性ピーク（Ｆｒａｃｔｉｏ
ｎ　２５前後）のみ抗ヒトＭＡＣＩＦモノクローナル抗
体で部分的に中和された。

第１２図に示したように、ドデシル硫酸ナトリウム存在
下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＯＳ−ＰＡ
ＧＥ）による分析から、二番目の活性ピークに一致して
主要なバンドが認められた。それ故、この活性画分を抗
ヒトＭＡＣＩＦ抗体カラムにより更に精製し、同様にし
てリアクティブリシス阻害活性を測定した。第１３図に
示したように、精製した発現蛋白（Ｂ１０３）は用量依
存的な溶血阻害活性を示し、かつ、その阻害活性は抗ヒ
トＭＡＣＩＦモノクローナル抗体により完全に中和され
た。

２−３）ヒト門ＡＣＩＦ改変蛋白（Ｂ８６）の活性Ｅ１
０３の場合と異なり、抗体で中和される主要な活性のピ
ークは認められなかったが（第１４図）、第１５図に示
したように、５ＯＳ−ＰＡＧＥによる解析から、主要な
バンドを含む画分（２６−３０）を抗ヒトＭＭＣＩＦ抗
体カラムにて精製後、リアクティプリシス阻害活性を測
定した。第１６図に示したように、精製した発現蛋白（
−Ｂ８６）は用量依存的に溶血阻害活性を示した。更に
、その阻害活性は抗体により完全に中和された。

以上の結果より、大腸菌において発現されたヒトＭＡＣ
ＴＦ改変蛋白は、ヒト赤血球由来のＭＡＣＩＦと同一の
活性を示し、かつ、ヒ）　ＭＡＣＩＦは、糖鎖やＰＩ　
アンカーがなくてもリアクティブリシス阻害活性を発揮
することが明らかとなった。

ＣＩＯ細胞における発現と生物活性の確認１）ヒトＭＭ
ＣＩＦ改変蛋白（Ｃ８６）のＣＨＯ細胞における発現 １−１　）　ＣＨＯ細胞における発現用の組換えプラス
ミドの構築 Ｃ）１０細胞用発現ベクターとしては、（６）で得たｐ
ＶＹ　１を用いた。ｐＶＹ　１をＢｇｌｌｌを用いて切
断し、以下の組換えプラスごドの構築に供した。

ｐＧＥＭ　３５２−３をＥｃｏ０１０９１および５ｔｙ
Ｉを用いて切断後、式（■）で示される５ｔｙｔ切断部
位をリン酸化した合成りＮＡ断片および式（ＩＸ）で示
されるｆｉｃｏｏ１０９１切断部位をリン酸化した合成
ＤＮＡ断片を、Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼを用いて結合し
た。

（■） （９）　　ヒ）ＭへＣＩＦ改変蛋白をコードする遺伝子
の（ＩＸ） 続いて、アガロース・ゲル電気泳動により３４１塩基対
のＤＮＡ断片を分離精製した。このＤＮＡ断片を、Ｂｇ
ｌ　　ＩＩ切断したｐＶＹ　１とＴ４　　［ＩＮＡリガ
ーゼを用いて結合後、大腸菌ｔＩＢＩＯＩ株を形質転換
することにより、テトラサイクリン耐性を示す形質転換
体を得た。これからアルカリ溶菌法により、プラスミ。

ドを調製し、Ｐｓｔｌ等を用いた制限酵素解析により、
当該遺伝子を発現する組換えプラスミドを選択した。

１−２）Ｃ）１０細胞における発現の確認上述のように
作製した発現プラスミドを、ＤＨＰＲ欠損ＣＨＯ細胞（
前出）にリン酸カルシウム法によりトランスフェクショ
ンし、メソトレキセート存在下で、選択培地（ＭＥＭ　
ａｌｐｈａ　（）　、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）　］にて生
育する形質転換体を得、以後の研究に充てた。

上記方法で形質転換したＣＨＯ細胞１０１１個を培養し
、その培養上清に就いて抗ＭＡＣＩＦモノクローナル抗
体を結合した抗体カラムを用いて（５１−２−１）に記
載の方法でアフィニティー・クロマトグラフィーを行っ
た。この抗体カラムに結合した両分を３Ｍチオシアン酸
ナトリウム水で溶出し、溶出画分についてＰＤ−１０カ
ラム（ファルマシア社製）にまり脱塩を行った後、抗ヒ
トＭＡＣＩＦウサギ抗体を用いた競合型ＥＬＩＳＡを用
いて抗原の有無を測定した。その結果、アフィニティー
・クロマトグラフィーに於ける結合画分にヒｌ−ＭＭＣ
ＩＦ抗原の存在が確認された。

この結果は、本法によりＣＨＯ細胞内で、１番目から８
６番目迄のペプチドから成るヒトＭＭＣＩＦ改変蛋白を
発現することに成功したことを示す。

２）ヒトＭＭＣＩＦ改変蛋白（ＣＢ２）のＣＨＯ細胞に
おける発現 ２−１　）　ＣＩＯ細胞における発現用の組換えプラス
ミドの構築 発現用プラスミドの構築の際に、式（Ｘ）で示されるＥ
ｃｏ０１０９　１部位をリン酸化したＤＮＡ断片を用い
る以外は、（９）　１　）と同様の操作を行った。

（■） （Ｘ） ２−２　）ＣＨＯ細胞における発現の確認（９１１）と
同様の方法により、上記組換えベクター形質転換細胞培
養上清よりヒトＭＡＣＩＦ抗原を検出した。この結果は
、本性によりＣＨＯ細胞内で、１番目から８２番目迄の
ペプチドから威るヒトＭＭＣＩＦ改変蛋白を発現するこ
とに成功したことを示す。

３）ヒトＭＭＣＩＦ改変蛋白（Ｃ７？）のＣＨＯ細胞に
於ける発現と生物活性の確認 ３−１　）　ＣＨＯ細胞における発現用の組換えプラス
ミドの構築 ＣＨＯ細胞用発現ベクターとしては、（６）ご得たｐｖ
ｖ　１を用いた。ｐＶＹｌをＢｇｌＩＩを用イテ切断し
、以下の組換えプラスミドの構築に供した。

ｐＧＥＭ　３５２−３をＥｃｏ０１０９１およびｓｔｙ
＋を用いて切断後、式（■）で示されるｓｔｙ　Ｉ切断
部位をリン酸化した合成りＮＡ断片および式（ＸＩ）で
示されるＥｃｏＯ１０９１切断部位をリン酸化した合成
りＮＡ断片を、Ｔ４　ＤＮＡ　リガーゼを用いて結合し
た。

（■→ （ＸＩ） 続いて、アガロース・ゲル電気泳動により３１４塩基対
のＤＮＡ断片を分離精製した。このＤＮＡ断片を８ｇｌ
Ｉｒ切断したｐＶＹ　１とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて
結合後、大腸菌ＨＢ　１０１株を形質転換することによ
り、テトラサイクリン耐性を示す形質転換体を得た。こ
れよりアルカリ溶菌法により、プラスミドを調製しＰｓ
ｔｌ等を用いた制限酵素解析により、当該遺伝子を発現
する組換えプラスミドを選択した。

３−２）Ｃ）１０細胞における発現の確認上述のように
作製した発現プラスミドを、ＤＨＦＲ欠損ＣＩＯ細胞（
前出）にリン酸カルシウム法によりトランスフェクショ
ンし、メソトレキセート存在下で、選択培地（ＭＥＭ　
ａｌｐｈａ　（）　、ギプコ（Ｇｉｂｃｏ　）　）にて
生育する形質転換体を得、以後の研究に充てた。

上記方法で形質転換したＣＨＯ細胞１０”個を培養し、
その培養上清について抗ＭＭＣＩＦモノクローナル抗体
を結合した抗体カラムを用いて（５１２−１）に記載の
方法でアフィニティー・クロマトグラフィーを行った。

この抗体カラムに結合した両分を３Ｍチオシアン酸ナト
リウム水で溶出し、溶出画分についてＰＤ−１０カラム
（ファルマシア社製）にまり脱塩を行った後、抗ヒトＭ
ＭＣＩＦウサギ抗体を用いた競合型ＥＬＩＳＡを用いて
抗原の有無を測定した。その結果、アフィニティー・ク
ロマトグラフィーに於ける結合画分にＭＭＣＩＦ抗原の
存在が確認された。

この結果は、本性によりＣＨＯ細胞内で、１番目から７
７番目迄のペプチドから威るヒトＭＡＣＩＦ改変蛋白を
発現することに成功したことを示す。

３−３）生物活性の確認 大量に培養した形質転換ＣＨＯ細胞の培養上清より（９
）　３−２　）項に記載した方法で部分精製した組換え
ヒトＭＡＣＩＦ改変蛋白（Ｃ７７）標品を５ＧＶＢ”緩
衝液とバッファー交換し、ＭＡＣ形威形成活性を（５）
２−２）項に既述した方法により測定した。第１７図に
示すように、ＣＨＯ細胞により発現されたヒトＭＡＣＩ
Ｆ改変蛋白（Ｃ７７）は、用量依存的にＭＭＣ形成阻害
活性を示した。また、これらの阻害活性は、赤血球由来
の天然型ヒＩ−ＭＭＣＩＦに対するマウスモノクローナ
ル抗体により中和された。

以上の結果より、ＣＨＯ細胞により発現され培地中に分
泌されたヒトＭＡＣＩＦ改変蛋白（Ｃ７？）は、ヒト赤
血球由来の天然型ＭＡＣＩＦと同一の活性を有している
ことが明らかとなった。

４）ヒトＭＭＣＩＦ改変蛋白（Ｃ７６）　（７）ＣＩＯ
細胞における発現と生物活性の確認 ４−１　）　ＣＨＯ細胞における発現用の紐換えプラス
ミドの構築 発現用プラスごドの構築の際に、式（Ｘ［ｒ）で示され
るＥｃｏ０１０９　１部位をリン酸化したＤＮＡ断片を
用いる以外は、＋９）　１　’）と同様の操作を行った
。

（■） （ＸＩり ４−２）Ｃ）１０細胞における発現の確認（９１１）と
同様の方法により、上記組換えベクター形質転換細胞培
養上清よりヒトＭＭＣＩＦ抗原を検出した。この結果は
、本性によりＣＩＯ細胞内で、１番目から７６番目迄の
ペプチドから戒るヒトＭＡＣＩＦ改変蛋白を発現するこ
とに成功したことを示す。

４−３）生物活性の確認 大量に培養した形質転換ＣＨＯ細胞の培養上清を用い、
（９１−３−３）と同様の方法により、ＣＨＯ細胞によ
り発現されたヒトＭＭＣ４Ｆ改変蛋白（Ｃ７６）のＭＭ
Ｃ形成阻害活性を測定したところ、第１８図に示すよう
に、Ｃ７６は用量依存的に活性を示した。

以上の結果より、ＣＩ（Ｏ細胞により発現され培地中に
分泌されたヒトＭＭＣＩＦ改変蛋白（Ｃ７６）は、ヒト
赤血球由来の天然型ＭＭＣＩＦと同一の活性を有してい
ることが明らかとなった。

５）ヒトＭＭＣＩＦ改変蛋白（Ｃ７５）のＣＩＯ細胞に
おける発現 ５−１　）　ＣＨＯ細胞における発現用の組換えプラス
ミドの構築 発現用プラスミドの構築の際に、式（ＸＩ［Ｉ）で示さ
れるＥｃｏ０１０９１部位をリン酸化したＤＮＡ断片を
用いる以外は、（９１１）と同様の操作を行った。

（■） （■） （ＸＩ） ５−２）ＣＨＯ細胞における発現の確認＋９１１　）と
同様の方法により、上記組換えベクター形質転換細胞培
養上清まりヒＩ−ＭＭＣＩＦ抗原を検出した。この結果
は、本性によりＣＨＯ細胞内で、１番目から７５番目迄
のペプチドから戒るヒトＭＡＣＩＦ改変蛋白を発現する
ことに成功したことを示す。

６）ヒトＭＡＣＩＦ改変蛋白（Ｃ７０）のＣＨＯ細胞に
おける発現と生物活性の確認 ６−１）ＣＨＯ細胞における発現用の組換えプラスミド
の構築 発現用プラスミドの構築の際に、式（ＸＩＶ）で示され
るＥｃｏ０１０９１部位をリン酸化したＤＮＡ断片を用
いる以外は、（９）　１　）と同様の操作を行った。

（Ｘ　ＩＶ） ６−２）ＣＨＯ細胞における発現の＆ｆ！認（９）　１
　）と同様の方法により、上記組換えベクター形質転換
細胞培養上清よりヒｌ−ＭＭＣＩＦ抗原を一検出した。

この結果は、本性によりＣＨＯ細胞内で、１番目から７
０番目迄のペプチドから威るヒトＭＡＣＩＦ改変蛋白を
発現することに成功したことを示す。

６−３）生物活性の確認 大量に培養した形質転換ＣＨＯ細胞の培養上清を用い、
（９１−３−３”）と同様の方法により、ＣＨＯ細胞に
より発現されたヒトＭＭＣＩＦ改変蛋白（Ｃ７０）のＭ
ＭＣ形成阻害活性を測定したところ、第１９図に示すよ
うに、Ｃ７０は用量依存的に活性を示した。

以上の結果より、ＣＩＯ細胞により発現され培地中に分
泌されたヒトーＡＣＩＦ改変蛋白（Ｃ７０）は、ヒト赤
血球由来の天然型ＭＡＣＩＦと同一の活性を有している
ことが明らかとなった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒト白血球から得られた天然型ヒトＭＡＣＩ
Ｆを含むアミノ酸配列をコードする遺伝子である。 第２図は、第１図で示される遺伝子配列に基づく、推定
アミノ酸配列である。 第３図は、大腸菌用発現ベクターｐＫＫ２２３−３の全
体構造である。 第４図は、ＣＨＯ細胞用発現ベクターｐｖｙ　１の全体
構造である。 第５図は、翻訳産物のモルモット赤血球溶血阻害活性の
結果である。 第６図は、翻訳産物のモルモット赤血球溶血阻害活性に
おける用量依存性及び抗ヒ）Ｍ＾ＣＩＦ抗体による中和
能を示した結果である。 第７図は、発現ベクターｐｖ’ｖ　１の構築方法を示し
たものである。 第８図は、形質転換ＣＨＯ細胞上でのヒｌ−Ｍ＾ＣＩＦ
の発現をフローサイトメーターにより示したものである
。 第９図は、形質転換ＣＨＯ細胞により発現されたヒトＭ
ＭＣＩＦのモルモット赤血球溶血阻害活性における用量
依存性及び抗ヒトＭＡＣＩＦ抗体による中和能を示した
結果である。 第１０図は、大腸菌発現用ベクターｐＹＥＪＯＯ１の全
体構造を示したものである。 第１１図は、大腸菌により発現されたヒトＭＭＣＩＦ改
変蛋白（Ｃ１０３）のロー５ｅｐｈａｒｏｓｅを用いた
精製の結果である。 第１２図は、大腸菌により発現されたヒトＭＭＣＩＦ改
変蛋白（Ｃ１０３）をＱ−５ｅｐｈａｒｏｓｅを用いて
精製した際の各両分（Ｆｒａｃｔｉｏｎ）について、５
Ｏ５−ＰＡ（：Ｅにより分析した結果である。 第１３図は、大腸菌により発現されたヒトＭＡＣＩＦ改
変蛋白（Ｃ１０３）のモルモット赤血球溶血阻害活性に
おける用量依存性及び抗ヒ）　ＭＡＣＩＦ抗体による中
和能を示した結果である。 第１４図は、大腸菌により発現されたヒトＭＭＣＩＦ改
変蛋白（Ｃ８６）のＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いた精
製の結果である。 第１５図は、大腸菌により発現されたし）　ＭＭＣＩＦ
改変蛋白（Ｃ８６）をＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて
精製した際の各両分について、５ＯＳ−ＰＡＧＥにより
分析した結果である。 第１６図は、大腸菌により発現されたヒｌ−ＭＭＣＩＦ
改変蛋白（Ｃ８６）のモルモット赤血球溶血阻害活性に
おける用量依存性及び抗ヒｌ−ＭＭＣＩＦ抗体による中
和能を示した結果である。 第１７図は、形質転換ＣＩＯ細胞により発現されたヒト
ＭＡＣＩＦ改変蛋白（Ｃ７７）のモルモット赤血球溶血
阻害活性における用量依存性およびヒｌ−ＭＭＣＩＦ抗
体による中和能を示した結果である。 第１８図は、形質転換ＣＨＯ細胞により発現されたヒト
ＭＭＣＩＦ改変蛋白（Ｃ７６）のモルモット赤血球溶血
阻害活性における用量依存性を示した結果である。 第１９図は、形質転換ＣＨＯ細胞により発現されたヒト
ＭＡＣＩＦ改変蛋白（Ｃ７０）のモルモット赤血球溶血
阻害活性における用量依存性を示した結果である。 第 １ 図（そのｌ） 第 図 ｌａ ｌａ 八１ａ ｒｐ ｅｔ ｅｕ １ｓ Ｐｒ。 第 図 （その２） ＣＣＡ八ＡへＴＣＣＣＣＧＴＴＣＣＴＧＣＧＴＡＧＴＣ
ＣＧＣＴＴＴＣＴＣＴＴＧＣＴＧＣＣ八ＣへＴへＣＴＡ
八ＡへＧＣＴＴＧＡＴ八ＴへＴＴＣＣＡＡＡＴＧＧＡＴ
ＣＣＴＧＴＴＧＧＧＡＡＡ・・・３′第 図 翻訳産物 第６図 ０ ２０　　３０　　４０　　５０ 翻訳度？１！添加鳳（μｍ） 第８図 相対蛍光強度 す 相対蛍光強度 相対蛍光強度 第 図 第９ 図 発現産物の部分精製標品添加ｆｉｔ（、ＬＩｆ）第１０ 図 第１２ 図 第１１ 図 フラクション 第１３図 ５０　　　　１００　　　　　　　　　　２００発現産
物の部分精製標品添加量（、ＬＬｌ）第１４図 フラクシヨン 第１６ 図 発現産物の部分精製標品添加量 （〃Ｉ） 第１５ 図 第１７図 ００ ００ ００ ００ 発現産物の部分精製標品添加量 （、Ｌｌ）） 第１８ 図 発現産物の部分精製標品添加量 （、ＪＪＩｔ） 第１９ 図 ００ ００ ００ ００ 発現産物の部分精製標品添加量 （μｌ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトＭＡＣＩＦ活性を示すペプチドをコードする遺
   伝子 ２、下記アミノ酸配列で示されるペプチドをコードする
   遺伝子 【遺伝子配列があります】 （式中、ＸおよびＹは、つぎの意味を示す Ｘ：Ｈ、 Ｍｅｔ又は 【アミノ酸配列があります】からなるアミノ酸配列Ｙ：
   ＯＨ、 【アミノ酸配列があります】 からなるアミノ酸配列、またはこのアミノ酸配列のＣ末
   端側から１乃至３２個のアミノ酸を欠失したアミノ酸配
   列） ３、Ｙが、 【アミノ酸配列があります】 【遺伝子配列があります】 を意味する請求項２で示されるペプチドをコードする遺
   伝子 ４、Ｙが、 【遺伝子配列があります】 を意味する請求項２で示されるペプチドをコードする遺
   伝子 ５、Ｙが、 【遺伝子配列があります】 を意味する請求項２で示されるペプチドをコードする遺
   伝子 ６、Ｙが、 【遺伝子配列があります】 を意味する請求項２で示されるペプチドをコードする遺
   伝子 ７、Ｙが、 【遺伝子配列があります】 を意味する請求項２で示されるペプチドをコードする遺
   伝子 ８、Ｙが、 【遺伝子配列があります】 を意味する請求項２で示されるペプチドをコードする遺
   伝子 ９、ＹがＯＨを意味する請求項２で示されるペプチドを
   コードする遺伝子 １０、請求項１から９のいずれか１項に記載の遺伝子が
   、請求項１から９のいずれか１項に記載のポリペプチド
   を発現させうる調節遺伝子ＤＮＡに有効に結合している
   組換え発現ベクター １１、請求項３に記載の遺伝子が、請求項３に記載のポ
   リペプチドを発現させうる調節遺伝子ＤＮＡに有効に結
   合している組換え発現ベクター １２、請求項４に記載の遺伝子が、請求項４に記載のポ
   リペプチドを発現させうる調節遺伝子ＤＮＡに有効に結
   合している組換え発現ベクター １３、請求項５に記載の遺伝子が、請求項５に記載のポ
   リペプチドを発現させうる調節遺伝子ＤＮＡに有効に結
   合している組換え発現ベクター １４、請求項６に記載の遺伝子が、請求項６に記載のポ
   リペプチドを発現させうる調節遺伝子ＤＮＡに有効に結
   合している組換え発現ベクター １５、請求項７に記載の遺伝子が、請求項７に記載のポ
   リペプチドを発現させうる調節遺伝子ＤＮＡに有効に結
   合している組換え発現ベクター １６、請求項８に記載の遺伝子が、請求項８に記載のポ
   リペプチドを発現させうる調節遺伝子ＤＮＡに有効に結
   合している組換え発現ベクター １７、請求項９に記載の遺伝子が、請求項９に記載のポ
   リペプチドを発現させうる調節遺伝子ＤＮＡに有効に結
   合している組換え発現ベクター １８、ＰＩアンカー（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏ
   ｓｉｔｏｌａｎｃｈｏｒ）をポリペプチドのＣ末端に付
   加することの出来る宿主細胞内で複製・維持されうる発
   現ベクターである請求項１０に記載の組換え発現ベクタ
   ー １９、請求項１０に記載の組換え発現ベクターで形質転
   換された細胞 ２０、請求項１１に記載の組換え発現ベクターで形質転
   換された細胞 ２１、請求項１２に記載の組換え発現ベクターで形質転
   換された細胞 ２２、請求項１３に記載の組換え発現ベクターで形質転
   換された細胞 ２３、請求項１４に記載の組換え発現ベクターで形質転
   換された細胞 ２４、請求項１５に記載の組換え発現ベクターで形質転
   換された細胞 ２５、請求項１６に記載の組換え発現ベクターで形質転
   換された細胞 ２６、請求項１７に記載の組換え発現ベクターで形質転
   換された細胞 ２７、下記アミノ酸配列で示されるペプチド【アミノ酸
   配列があります】 （式中、ＸおよびＹは、つぎの意味を示す。 Ｘ：ＨまたはＭｅｔ Ｙ：ＯＨまたは 【アミノ酸配列があります】 からなるアミノ酸配列、またはこのアミノ酸配列のＣ末
   端側から１乃至３２個のアミノ酸を欠失したアミノ酸配
   列） ２８、下記アミノ酸配列で示されるペプチド【アミノ酸
   配列があります】 （式中、Ｘは、つぎの意味を示す。 Ｘ：Ｈ、またはＭｅｔ） ２９、下記アミノ酸配列で示されるペプチド【アミノ酸
   配列があります】 （式中、Ｘは、つぎの意味を示す。 Ｘ：Ｈ、またはＭｅｔ） ３０、下記アミノ酸配列で示されるペプチド【アミノ酸
   配列があります】 【アミノ酸配列があります】 （式中、Ｘは、つぎの意味を示す。 Ｘ：Ｈ、またはＭｅｔ） ３１、下記アミノ酸配列で示されるペプチド【アミノ酸
   配列があります】 【アミノ酸配列があります】 （式中、Ｘは、つぎの意味を示す。 Ｘ：Ｈ、またはＭｅｔ） ３２、下記アミノ酸配列で示されるペプチド【アミノ酸
   配列があります】 【アミノ酸配列があります】 （式中、Ｘは、つぎの意味を示す。 Ｘ：Ｈ、またはＭｅｔ） ３３、下記アミノ酸配列で示されるペプチド【アミノ酸
   配列があります】 （式中、Ｘは、つぎの意味を示す。 Ｘ：Ｈ、またはＭｅｔ） ３４、下記アミノ酸配列で示されるペプチド【アミノ酸
   配列があります】 （式中、Ｘは、つぎの意味を示す。 Ｘ：Ｈ、またはＭｅｔ） ３５、下記アミノ酸配列で示されるペプチドのＣ末端に
   ＰＩアンカーが付加した蛋白質 【アミノ酸配列があります】 【アミノ酸配列があります】 （式中、Ｘは、つぎの意味を示す。 Ｘ：Ｈ、またはＭｅｔ）