JPH0223155B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、乳酸桿菌属の細菌のプロトプラスト
を調製する方法に関する。さらに詳しくは、乳酸
桿菌属の細菌にストレプトマイセス・グロビスポ
ラス（Streptomyces globisporus）が生産する
エンド−Ｎ−アセチルムラミダーゼを蔗糖（シユ
ークロース）、乳糖（ラクトース）などの二糖類
の存在下で作用させることを特徴とする乳酸桿菌
属の細菌のプロトプラストを調製する方法に係わ
るものである。 従来、細菌のプロトプラストの調製には、卵白
リゾチームが使用されてきた。しかしながら、乳
酸桿菌属の細菌の細胞壁は、卵白リゾチームに対
しては感受性が弱いので、未だ卵白リゾチームを
用いてのプロトプラストの調製には成功していな
い。ヘンダーソン（Henderson）らは、ラクトバ
チルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、以下ラ
クトバチルスはL.と略称する）ATCC7469に卵白
リゾチームを30℃にて16時間作用させることによ
り、L.カゼイ（L.casei）のプロトプラストを得
たと報告している（ジヤーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem），252，
3760−3765，1977）が、この実験を上記報告の条
件下で追試して、光学顕微鏡および電子顕微鏡に
て細菌の形態を観察した結果によれば、プロトプ
ラストの形成はほとんど観察されなかつた。加え
て、乳酸桿菌属の細菌に対する卵白リゾチーム処
理には、長大な処理時間を要するので、かかる長
時間の酵素処理は細菌の生理活性を著しく阻害す
るものであつた。 本発明者らは、乳酸桿菌属の細菌のプロトプラ
ストの調製における卵白リゾチームに対する低感
受性と長大な処理時間等の問題点に鑑み、鋭意研
究の結果、ストレプトマイセス・グロビスポラス
（Streptomyces globisporus）より単離精製され
たエンド−Ｎ−アセチルムラミダーゼ（endo−
Ｎ−acetylmuramidase）を二糖類の存在下で乳
酸桿菌属の細菌に作用させることにより、短時間
にかつ高率にプロトプラストが得られることを見
い出して本発明を完成するに至つた。 より詳細に述べるならば、(1)エンド−Ｎ−アセ
チルムラミダーゼによる単独処理では、プロトプ
ラストの形成は観察されず、溶菌作用のみが観察
されるが、かかるエンド−Ｎ−アセチルムラミダ
ーゼによる処理を二糖類の存在下で行うことによ
つて初めてプロトプラストの形成が達成されるこ
と、換言すれば、二糖類が浸透圧調節物質として
効果的に作用し、プロトプラストの調製過程にお
ける浸透圧差による菌細胞の破壊の抑制に有効で
あるので、プロトプラスト形成のためには、これ
らの二糖類の存在が不可欠の条件であること、(2)
一般に、プロトプラストが形成されても、その生
理活性の存否が問題となるが、上記二糖類の存在
下で調製したプロトプラストはよく、その生理活
性を保持していること、等の知見に基づいて、本
発明が完成されたものである。 そして、本発明の一つの構成要素であるエンド
−Ｎ−アセチルムラミダーゼは、ストレプトマイ
セス・グロビスポラス（Streptomyces
globisporus）の培養上清から分取されたもので
あり、後に詳述する実験例および実施例では、ス
トレプトマイセス・グロビスポラス
（Streptomyces globisporus）1829の培養上清よ
り単離精製されたもの（大日本製薬社製で生化学
工業社より市販されているもの。以下、Ｍ−１酵
素という）が採用されている。 本発明の他の一つの構成要素である乳酸桿菌属
の細菌には、全ての種のものが含まれるが、例を
あげると、L.カゼイ（L.casei）、L.アシドフイラ
ス（L.acidophilus）、L.ブルガリカス（L.
bulgaricus）、L.ラクテイス（L.lactis）、L.ヘル
ベテイカス（L.helveticus）、L.サリバリウス（L.
salivarius）、L.プランタルム（L.plantarum）、
L.フアーメンタム（L.fermentum）、L.セロビオ
ーサス（L.cellobiosus）、L.デルブレツキ（L.
delbrueckii）、L.ブヒネリ（L.buchneri）、L.ブ
レビス（L.brevis）などがある。 これらの乳酸桿菌属の細菌の培養には、通常的
な培地および通常的な培養条件を採用すればよ
い。 更に、本発明の残りの一つの構成要素である浸
透圧調製物質としての二糖類には、蔗糖（シユー
クロース）、乳糖（ラクトース）のほか、マルト
ース、トレハロースなどが含まれる。 続いて、実験例を示して、本発明を更に詳細に
説明すれば以下の通りである。なお、実験例１〜
５においては、供試菌株としてL.カゼイ（L.
casei）ATCC7469を使用した。 実験例 １ この実験は、Ｍ−１酵素処理の基礎条件（PH条
件、緩衝液の種類、温度条件、振盪条件、細菌懸
濁液濃度など）に関するものである。 乳酸桿菌属の細菌に対するＭ−１酵素の酵素作
用を調べるために、まず、L.カゼイ（L.casei）
を下記組成の培地を用いて、下記の培養条件下に
て培養した。即ち、培地１中に、 ニユトリエントブロス（デイフコ社製） 12ｇ 酵母エキス（デイフコ社製） ５ｇ ツイーン80 １ml K₂HPO₄ ３ｇ KH₂PO₄ 1.5ｇ グルコース 0.4ｇ MgSO₄・7H₂O 0.1ｇ MnSO₄・4H₂O 0.025ｇ を含み、最終PHが6.8に調整されたものである。 上記組成のうち、グルコース、MgSO₄・
7H₂O，MnSO₄・4H₂Oに関しては、おのおの別
個に高圧減菌後、これらを上記の終末濃度になる
ように添加した。培養は、37℃、静置条件下にて
行ない、菌の増殖は波長650nｍにおける吸光度
の変化により測定した。 Ｍ−１酵素処理に際しては、37℃にて一夜培養
した菌を、4000×ｇで５分間の遠心分離により集
菌し、20mMリン酸カリウム緩衝液（PH7.0）で
２回洗浄した後、上記緩衝液に0.5〜5.0mg湿重
量／mlとなるように前記集菌した菌を懸濁した。 該懸濁液を20ml容量の丁字モノー管に入れ、37
℃にて５分間プレインキユベーシヨンした後、Ｍ
−１酵素を添加することにより、酵素処理を開始
した。酵素処理の温度条件に関しては、25℃〜40
℃の範囲内で酵素活性を調べた。菌懸濁液の振盪
に関しては、モノー型振盪機によつて０〜30サイ
クル／分の微弱振盪条件下にて行なつた。酵素作
用の度合いに関しては、650nｍの吸光度の減少
をもつて目安とした。更に、プロトプラストの調
製に関しては、上記酵素処理を二糖類の存在下に
て行なう点を除いて、上記酵素処理と全く同様の
処理条件で行なつた。そして、その際、プロトプ
ラスト形成の程度に関しては、光学顕微鏡下で円
形化した細胞の形成を観察することにより、これ
を判定した。 実験結果を以下に示す。 乳酸桿菌属の細菌に対するＭ−１酵素作用は、
PH6.0〜7.5の範囲において観察された。そして、
緩衝液の種類は該酵素作用とは無関係であること
が確認された。 酵素処理の温度条件に関しては、25℃〜40℃の
範囲内で高温ほど強い酵素活性が観測された。し
かし、形成されたプロトプラストの生理活性保持
のためには、37℃前後（30℃〜40℃）が好適であ
つた。 酵素処理の振盪条件に関しては、30サイクル／
分以下、好適には、５〜８サイクル／分の微弱振
盪条件下で良好にプロトプラストを形成した。 酵素処理のための細菌懸濁液の濃度に関して
は、0.5〜５mg湿重量／mlが好ましく、特に、１
〜３mg湿重量／mlが最も好ましかつた。 実験例 ２ この実験は、Ｍ−１酵素作用に及ぼす細胞増殖
期の影響に関するものである。 第１図Ａは実験例１のための培地と同じ培地に
おけるL.カゼイ（L.casei）の増殖曲線を示す。 第１図Ｂは各増殖期の細胞のＭ−１酵素による
濁度の減少を示すものであり、各増殖期の菌を集
菌し、洗浄した後、20mMリン酸緩衝液に2.5mg
湿重量／mlになるように懸濁して、おのおのに
1.5μｇ／mlのＭ−１酵素を添加して処理し、その
溶菌過程を濁度の減少で追つた結果を表わしてい
る。実験方法は、実験例１の場合と同様である。 この実験結果から、培養時間の長い菌ほどＭ−
１酵素処理に対する感受性が高いことが判明し
た。しかし、生理活性の高いプロトプラストを得
るためには、長時間の培養は好ましくなく、対数
増殖後期から定常期（第１図Ａ中３〜６で表わさ
れる培養期間）の細胞を使用することが望まし
い。 実験例 ３ この実験はＭ−１酵素作用に及ぼす酵素量の影
響に関するものである。 第２図に、3.0mg湿重量／mlの細胞懸濁液に対
して濃度を変化させてＭ−１酵素を作用させた場
合の濁度の変化傾向を示す。実験方法は実験例１
の場合と同様である。 Ｍ−１酵素0.38〜9.0μｇ／mlの添加により添加
酵素量に比例して濁度の減少が認められた。しか
しながら、プロトプラストの調製に際しては、酵
素量を増大させて、濁度の減少を大きくすると、
プロトプラストの収量が悪くなり、一方、濁度の
減少を抑えるべく酵素量を減少させると、プロト
プラストの形成までに長時間を要する傾向が認め
られる。 したがつて、プロトプラストの調製のために
は、細胞懸濁液濃度を３mg湿重量／ml程度に保つ
て、0.75〜7.5μｇ／mlのＭ−１酵素を添加して５
〜30分間の処理を行うことが望ましい。 実験例 ４ この実験はプロトプラストの形成に及ぼす各種
浸透圧調節物質の影響に関するものである。 細胞懸濁液にＭ−１酵素を添加してもプロトプ
ラストは形成されず、溶菌作用のみが観察される
ところから、プロトプラストの形成のためには、
ある種の浸透圧調節物質を添加することが有効で
あることを見い出した。そこで、プロトプラスト
の調製に適した浸透圧調節物質を探査すべく、
NaCl、塩化コリン、グリセリン、グルコース、
蔗糖および分子量が異なる二種類のポリエチレン
グリコールを選び、各浸透圧調節物質がＭ−１酵
素作用に及ぼす影響を調べた。 実験方法は、各種浸透圧調節物質を存在させる
点を除いて、実験例１の場合と同様にし、細胞懸
濁液濃度を2.5mg／mlに選定したものである。 その実験結果を第３図に示す。 同図から明らかなように、二種類の電解質
（NaClおよび塩化コリン）の添加は酵素活性を阻
害することが判明した。更に、グルコース、グリ
セリンおよび二種類のポリエチレングリコールの
添加はＭ−１酵素のみを添加した場合と同程度の
濁度の減少しか伴わなかつた。 そして、上記の浸透調整物質のうち、0.9Mの
グルコースを添加したときにのみ３〜４％のプロ
トプラスト形成が観察された。一方、0.9Mの蔗
糖を添加したときには（第３図中９）、Ｍ−１酵
素の添加（1.5μｇ／ml）と同時に急激な濁度の減
少が観測され、酵素処理５〜10分後には、95％以
上の細胞がプロトプラスト化していることが確認
された。 これらの事実から、蔗糖は、プロトプラスト形
成過程における浸透圧差による細胞破壊を効果的
に抑制する作用を有するばかりか、Ｍ−１酵素の
細胞壁溶解作用を増強する作用をも有すことが判
明した。 プロトプラスト形成過程における浸透圧差に起
因する細胞破壊作用に対する抑制作用は、ラクト
ース、トレハロース、マルトースなどの蔗糖以外
の二糖類に関しても同様に認められた。 しかしながら、一方、酵素処理が長時間におよ
ぶと、形成されたプロトプラストが破壊されるの
で、細胞懸濁液の濁度の減少が観測された。 なお、上記実験中、プロトプラスト形成の判定
は、位相差顕微鏡にて検鏡することにより行なつ
た。 実験例 ５ この実験は各種糖類によるＭ−１酵素の溶解作
用に対する増強作用に関するものである。 蔗糖存在下でＭ−１酵素を作用させると、L.カ
ゼイ（L.casei）の細胞壁に対する溶解作用が増
進することが見い出されたが、かかるＭ−１酵素
作用に対する増強作用が他の糖類に関しても期待
できるか否かを調べるべく各種糖類によるＭ−１
酵素作用に対する増強作用の有無を調べた。 実験方法は各種糖類の存在下にて酵素処理する
点を除いて、実験例１の場合と同様である。その
実験結果を第４図に示す。 四種類の単糖類（キシロース、ガラクトース、
フルクトース、イノシトール）の存在下では、Ｍ
−１酵素を添加した後も濁度の変化はほとんど観
測されなかつた。 三糖類のラフイノース存在下でもＭ−１酵素作
用に対する増強作用はほとんど観測されなかつ
た。 これに対して、四種類の二糖類、すなわち、マ
ルトース、トレハロース、蔗糖（シユークロー
ス）、乳糖（ラクトース）の存在下では、いずれ
もＭ−１酵素作用に対する増強作用が観測され、
特に、蔗糖と乳糖の存在下では、増強作用の程度
が極めて強いものであつた。 これらの事実から、二糖類はプロトプラストの
浸透圧差による破壊作用を抑制するための浸透圧
調節物質として有効であるばかりか、Ｍ−１酵素
の乳酸桿菌属の細菌に対する細胞壁溶解作用の増
強作用をも有することが判明した。 なお、乳酸桿菌属の細菌の種類に応じて、上記
酵素作用に対する増強作用には差異が存在する。 例えば、L.ヘルベテイカス（L.helveticus）、L.
サリバリウス（L.salivarius）、L.プランタルム
（L.plantarum）、L.フアーメンタム（L.
fermentum）、その他多くの乳酸桿菌属の細菌に
関しては、同様のＭ−１酵素作用に対する増強作
用が認められるが、L.アシドフイラス（L.
acidophilus）、L.ブルガリカス（L.bulgaricus）
に関しては、上記Ｍ−１酵素作用に対する増強作
用は認められなかつた。（後述の実験例６の第１
表参照のこと。） 実験例 ６ この実験は細菌の種類によるＭ−１酵素作用の
差異に関するものである。 各種乳酸桿菌属の細菌におけるＭ−１酵素に対
する感受性とプロトプラストの形成状況とを実験
例１および実験例４に準じて観察した。 Ｍ−１酵素に対する細胞の感受性に関しては、
緩衝液中に0.85Mの蔗糖を存在させた場合と蔗糖
無添加の場合の濁度低下の度合を、更に、プロト
プラストの形成率に関しては、0.85Mの蔗糖を存
在させた場合の位相差顕微鏡による検鏡観察結果
を整理して第１表に示す。 第１表から明らかなように、L.アシドフイラス
（L.acidophilus）、L.ヘルベテイカス（L.
helveticus）、L.サリバリウス（L.salivarius）、L.
プランタラム（L.plantarum）、L.カゼイ（L.
casei）、L.フアーメンタム（L.fermentum）、L.
ブルガリカス（L.bulgaricus）などを含むほとん
どすべての乳酸桿菌属の細菌に関して高率のプロ
トプラスト形成が確認された。

【表】 続いて、以下に本発明の実施例を示す。 実施例 １ 供試菌株として、L.カゼイ（L.casei）
ATCC7469を使用し、培地１中にニユトリエン
トブロス（デイフコ社製）12ｇ、酵母エキス（デ
イフコ社製）５ｇ、ツイーン801ml、K₂HPO₄3
ｇ、KH₂PO₄1.5ｇ、グルコース0.4ｇ、MgSO₄・
7H₂O0.1ｇ、MnSO₄・4H₂O0.025ｇを含み、最終
のPHが6.8に調整された培地にて上記供試菌を培
養した。 上記培地組成のうち、グルコース．MgSO₄・
7H₂O、MnSO₄・4H₂Oに関しては、各々別個に
高圧減菌後、上記終末濃度になるように、添加し
た。 培養は、37℃、静置条件下にて行なつた。一夜
静置培養した菌は、4000×ｇ５分間の遠心分離に
より集菌し、20mMリン酸カリウム緩衝液（PH
7.0）で２回洗浄した後、上記緩衝液に2.5mg湿
重／mlとなるように懸濁した。 酵素処理は、菌懸濁液10mlを20ml容量の丁字モ
ノー管に入れ、37℃にて５分間プレインキユベー
シヨンした後、Ｍ−１酵素3μｇ／mlを添加する
ことにより、開始した。 かかる酵素処理を1.0Mの蔗糖の存在下で、か
つ、５サイクル／分の微弱振盪条件下にて、30分
間続行した。 実験例４の場合と同様の方法によりプロトプラ
スト形成率を判定したところ、その値は95％であ
つた。 実施例 ２ 供試菌株として、L.ヘルベテイカス（L.
helveticus）を使用し、実施例１と同様の培地に
て同様の培地条件下で培養した菌を集菌して、こ
れを３mg湿重量／mlになるように、懸濁させ、そ
の菌懸濁液を、1.0Mの乳糖の存在下で、37℃に
て15分間、８サイクル／分の微弱振盪条件下で
1μｇ／mlのＭ−１酵素にて処理することにより、
プロトプラストの調製を行なつた。 実験例４の場合と同様の検鏡観察によりプロト
プラスト形成率を判定したところ、その値は95％
であつた。 実施例 ３ 供試菌株として、L.カゼイ（L.casei）
ATCC7469を使用して、実施例２の場合と同様に
処理したところ、90％のプロトプラスト形成率が
確認された。

【図面の簡単な説明】

第１図Ａは、L.カゼイ（L.casei）の増殖段階
を表わす濁度曲線、第１図Ｂは、各増殖期におけ
る細胞のＭ−１酵素に対する感受性を表わす濁度
曲線。第２図は、L.カゼイ（L.casei）の溶菌作
用に及ぼすＭ−１酵素量の影響を表わす濁度曲
線、第３図は、Ｍ−１酵素による溶菌作用に及ぼ
す各種浸透圧調節物質の影響を表わす濁度曲線、
第４図は、Ｍ−１酵素作用に及ぼす浸透圧調節物
質としての各種糖類の影響を表わす濁度曲線であ
る。第１図において、第１図Ｂ中に付された各数
字にて特定される各曲線は、第１図Ａ中に付され
た同一の数字にて特定される各増殖段階の細菌に
関するものである。 第２図において、１……酵素無添加、２……
0.38μｇ／ml添加、３……0.75μｇ／ml添加、４…
…1.5μｇ／ml添加、５……3.0μｇ／ml添加、６…
…4.5μｇ／ml添加、７……6.0μｇ／ml添加、８…
…7.5μｇ／ml添加、９……9.0μｇ／ml添加、第３
図において、１……20mMリン酸緩衝液に酵素無
添加、２……20mMリン酸緩衝液に1.5μｇ／mlＭ
−１酵素添加、３〜９……20mMリン酸緩衝液に
下記の各種物質を加え、酵素を添加したもの、即
ち、３……0.45M Nacl、４……0.45M塩化コリ
ン、５……0.9Mグリセリン、６……0.9Mグルコ
ース、７……0.5Mポリエチレングリコール（平
均分子量300）、８……0.5Mポリエチレングリコ
ール（平均分子量1000）、９……0.9M蔗糖、第４
図において、１……対照（糖類およびＭ−１酵素
無添加）、２……対照（糖類無添加、1.5μｇ／ml
Ｍ−１酵素添加）、３……キシロース添加、４…
…ガラクトース添加、５……フルクトース添加、
６……イノシトール添加、７……ラフイノース添
加、８……マルトース添加、９……トレハロース
添加、１０……ラクトース添加、１１……蔗糖添
加。（各添加量は0.5M）。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ストレプトマイセス・グロビスポラス
   （Streptomyces globisporus）が生産するエンド
   −Ｎ−アセチルムラミダーゼを浸透圧調節物質の
   存在下にて乳酸桿菌属の細菌に作用させて、上記
   細菌のプロトプラストを調製する方法において、
   前記浸透圧調節物質が二糖類であることを特徴と
   する乳酸桿菌属の細菌のプロトプラスト調製方
   法。 ２ 前記浸透圧調節物質としての二糖類が蔗糖
   （シユークロース）あるいは乳糖（ラクトース）
   である特許請求の範囲第１項記載の乳酸桿菌属の
   細菌のプロトプラスト調製方法。