JPS5988086A - 乳酸桿菌属の細菌のプロトプラスト調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、乳酸桿菌域の細菌のプロトプラストを調製す
る方法に関する。さらに詳しくは、乳酸桿菌域の細菌に
ストレプトマイセス・グロピスボラス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ　）が生産するエ
ンド−Ｎ−アセチルムラミダーゼを蔗糖（シー−クロー
ス）、乳糖（ラクトース）などの三糖類の存在下で作用
させることを特徴とする乳酸桿菌域の細菌のプロトプラ
ストを調製する方法に係わるものである。

従来、細菌のプロトプラストの調製には、卵白リゾチー
ムが使用されてきた。しかしながら、乳酸桿菌域の細菌
の細胞壁は、卵白リゾチームに対しては感受性が弱いの
で、未だ卵白リゾチームを用いてのプロトプラストの調
製には成功していない。ヘンダーソン（Ｈｅｎｄｅｒｓ
ｏｎ　）らは、−ＢＥす）、以下ラクトバチルスはり、
と略称する）ＡＴＣＣ７４６９に卵白リゾチームを３０
’Ｃにて１６時間作用させることにより、Ｌ、カゼイ（
（Ｌ、　ｃａｓｅｉ　）のプロトプラストを得たと報告
している（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ　）、　　２５２．
　３７６０−３７６５．１９７７）が、この実験を上記
報前の条件下で追試して、光学顕微鏡および電子顕微鏡
にて細菌の形態を観察した結果によれば、プロトプラス
トの形成はほとんど観察されなかった。加えて、乳酸桿
菌属の細菌に対する卵白リゾチーム処理には、長大な処
理時間を要するので、かかる長時間の酵素処理は細菌の
生理活性を著しく阻害するものであった。

本発明者らは、乳酸桿菌属の細菌のプロトプラストの調
製における卵白リゾチームに対する低感受性と長大な処
理時間等の問題点に鑑み、鋭意研究の結果、ストレプト
マイセス・グロビスボラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
　ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ　）より単離精製されたエン
ド−Ｎ−アセチルムラミダーゼ（ｅｎｄ　−Ｎ−ａｃｅ
ｔｙｌｍｕｒａｍｉｄａｓｅ　）を三糖類の存在下で乳
酸桿菌属の細菌に作用させることｋより、短時間にかつ
高率にプロトプラストが得られることを見い出して本発
明を完成するに至った。

より詳細に述べるならば、（１）エンド−Ｎ−アセチル
ムラミダーゼによる単独処理では、プロトプラストの形
成は観察されず、溶菌作用のみが観察されるが、かかる
エンド−Ｎ−アセチルムラミダーゼによる処理な三糖類
の存在下で行うことによって初めてプロトプラストの形
成が達成されること、換言すれば、三糖類が浸透圧調節
物質として効果的に作用し、プロトプラストの調製過程
における浸透圧差による菌細胞の破壊の抑制に有効であ
るので、プロトプラスト形成のためには、これらの三糖
類の存在が不可欠の条件であること、（２）一般に、プ
ロトプラストが形成されても、その生理活性の存否が問
題となるが、上記三糖類の存在下で調製したプロトプラ
ストはよく、その生理活性を保持していること、等の知
見に基づいて、本発明が完成されたものである。

そして、本発明の一つの構成要素であるエンド−Ｎ−ア
セチルムラミダーゼは、ストレプトマイセス・グロビス
ボラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏ−ｂｉｓｐ
ｏｒｕｓ　）の培養上清から分取されたものであり、後
に詳述する実験例および実施例では、ス（３） トレプトマイセス・グロビスボラス（５ｔｒｅｐｔｏ−
、ｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ　）　１８２９
の培養上清より単離精製されたもの（大日本製薬社製で
生化学工業社より市販されているもの。以下、Ｍ−１酵
素という）が採用されている。

本発明の他の一つの構成要素である乳酸桿菌属の細菌に
は、全ての種のものが含まれるが、例をあげると、Ｌ、
カゼイ（Ｌ、　ｃａｓｅｉ　）、Ｌ、アンドフィラス（
Ｌ、　ａｃｉｄｏｐｈｉｌ、ｕｓ　）、Ｌ、ブルガリカ
ス（Ｌ、ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　）、Ｌ、ラクティス（
Ｌ、　１ａｃｔｉｓ　）、ｐｌａｎｔａｒｕｍ　）　、
Ｌ、ファーメンタム（Ｌ、　ｆｅｒｍｅｎ−り（Ｌ、　
ｂｕｃｈｎｅｒ　ｉ　）、Ｌ、プレビス（Ｌ、　ｂｒｅ
ｖｉｓ　）などがある。

これらの乳酸桿菌属の細菌の培養には、通常的な培地お
よび通常的な培養条件を採用すればよい。

（４） 更に、本発明の残りの一つの構成要素である浸透圧調製
物質としての三糖類には、蔗糖（シェークロース）、乳
糖（ラクトース）のほか、マルトース、トレハロースな
どが含まれる。

続いて、実験例を示して、本発明を更に詳細に説明すれ
ば以下の通りである。なお、実験例１〜５においては、
供試菌株としてり、カゼイ（Ｌ、ｃａｓｅｉ　）ＡＴＣ
Ｃ７４６９を使用した。

実施例 この実験は、Ｍ−１酵素処理の基礎条件（ｐＨ条件、緩
衝液の種類、温度条件、振盪条件、細菌懸濁液濃度など
）に関するものである。

乳酸桿菌属の細菌に対するＭ−１酵素の酵素作用を調べ
るために、まず、Ｌ、カゼイ（Ｌ、ｃａ−ａｅｉ　）を
下記組成の培地を用いて、下記の培養条件下にて培養し
た。即ち、培地１１中に、ニュトリエントプロス（ティ
フコ社ｌｌり　　　１２ｇ酵母エキス（ディフコ社製）
５Ｉ ツイーン　８０　　　　　　　　　　罰に２ＨＰＯ＜　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　３１ＫＨｚＰＯ
４１，５ｇ グルコース　　　　　　　　　　０．４９Ｍ　ｇ　Ｓ　
０４・７Ｈ２００，１ｇ Ｍｎ　ＳＯ４”　４Ｈ２００，０２５、ｊ９を含み、最
終声が６．８に調整されたものである。

上記組成のうち、グルコース、　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０
゜ＭｎＳＯ４・４Ｈ６０に関しては、おのおの別個に高
圧滅菌後、これらを上記の終末濃度になるように添加し
た。培養は、３７℃、静置条件下にて行ない、菌の増殖
は波長６５０　ｎｍにおける吸光度の変化により測定し
た。

Ｍ−１酵素処理に際しては、３７℃にて一夜培養した菌
を、４，０００Ｘｐで５分間の遠心分離により集菌し、
２０１ｒＬＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）で２
回洗浄した後、上記緩衝液に０．５〜５．０■湿重量／
ｄとなるように前記集菌した菌を懸濁した。

該懸濁液を２０ｍ／容量の丁字上ノー管に入れ、３７℃
にて５分間ブレインキュベーションした後、Ｍ−１酵素
を添加することにより、酵素処理を開始した。酵素処理
の温度条件に関しては、２５℃〜４０℃の範囲内で酵素
活性を調べた。

菌懸濁液の振盪に関しては、モノー型振盪機によってθ
〜３０サイクル／分の微弱振盪条件下にて行なった。酵
素作用の度合いに関しては、６５０　ｎｍの吸光度の減
少をもって目安とした。

更に、プロトプラストの調製に関しては、上記酵素処理
を二糖類の存在下にて行なう点を除いて、上記酵素処理
と全く同様の処理条件で行なった。そして、その際、プ
ロトプラスト形成の程度に関しては、光学顕微鏡下で円
形化した細胞の形成を観察することにより、これを判定
した。

実験結果を以下に示す。

乳酸桿菌属の細菌に対するＭ−１酵素作用は、ｐＨ６，
０〜７．５の範囲において観察された。そして、緩衝液
の種類は該酵素作用とは無関係であることが確認された
。

酵素処理の温度条件に関しては、２５℃〜４Ｏ℃の範囲
内で高温はど強い酵素活性が観測された。しかし、形成
されたプロトプラストの生理活性保持のためには、３７
℃前後（３０℃〜４０℃）が好適であった。

酵素処理の振盪条件に関しては、３０サイクル／分以下
、好適には、５〜８サイクル／分の微弱振盪条件下で良
好にプロトプラストを形成した。

酵素処理のための細菌懸濁液の濃度に関しては、０．５
〜５■湿重量／ｄが好ましく、特に、１〜３■湿重量／
ｄが最も好ましかった。

実施例 この実験は、Ｍ−１酵素作用に及ぼす細胞増殖期の影響
に関するものである。

第１図（Ａ）は実験例１のための培地と同じ培地におけ
るり、カゼイ（Ｌ、　Ｃａ５ｅｉ　）の増殖曲線を示す
。

第１図（Ｂ）は各増殖期の細胞のＭ−１酵素による濁度
の減少を示すものであり、各増殖期の菌を集菌し、洗浄
した後、２０　ｍＭ　リン酸緩衝液に２．５■湿重量／
１ｎｌになるように懸濁して、おのおのに１．５μ９／
ＩＩＬＩのＭ−１酵素を添加して処理し、その溶菌過程
を濁度の減少で追った結果を表わしている。実験方法は
、実験例１の場合と同様である。

この実験結果から、培養時間の長い菌はどＭ−１酵素処
理に対する感受性が高いことが判明した。しかし、生理
活性の高いプロトプラストを得るためには、長時間の培
養は好ましくなく、対数増殖後期から定常期（第１図（
Ａ）中３〜６で表わされる培養期間）の細胞を使用する
ことが望ましい。

実施例 この実験はＭ−１酵素作用に及ぼす酵素量の影響に関す
るものである。

第２図に、３．０■湿重量／Ｔｎｌの細胞懸濁液に対し
て濃度を変化させてＭ−１酵素を作用させた場合の濁度
の変化傾向を示す。実験方法は実験例１の場合と同様で
ある。

Ｍ−１酵素０．３８〜９．０μｆｌ／ｍｌの添加により
添加酵素量に比例して濁度の減少が認められた。

しかしながら、プロトプラストの調製に際しては、酵素
量を増大させて、濁度の減少を大きくすると、プロトゲ
ラストの収量が悪くなり、一方、濁度の減少を抑えるべ
く酵素量を減少させると、プロトプラストの形成までに
長時間を要する傾向が認められる。

したがって、プロトプラストの調製のためには、細胞懸
濁液濃度を３■湿重量／−Ｉ！程ｉって、０．７５〜７
６５μｇ／ＩＩＬＩのＭ−１酵素を添加して５〜３０分
間の処理を行うことが望ましい。

実施例 この実験はプロトゲラストの形成に及ぼす各種浸透圧調
節物質の影響に関するものである。

細胞懸濁液にＭ−１酵素を添加してもプロトプラストは
形成されず、溶菌作用のみが観察されるところから、プ
ロトプラストの形成のためには、ある種の浸透圧調節物
質を添加することが有効であることを見い出した。そこ
で、プロトプラストの調製に適した浸透圧調節物質を探
査すべく、Ｎａｃｌ、塩化コリン、グリセリン、グルコ
ース、蔗糖および分子量が異なる二種類のポリエチレン
グリコールを選び、各浸透圧調節物質がＭ−１酵素作用
に及ぼす影響を調べた。

実験方法は、各種浸透圧調節物質を存在させる点を除い
て、実験例１の場合と同様とし、細胞懸濁液濃度を２．
５１ｖ／ｍｌに選定したものである。

その実験結果を第３図に示す。

同図から明らかなように、二種類の電解質（Ｎａｃｌお
よび塩化コリン）の添加は酵素活性を阻害することが判
明した。更に、グリコース、グリセリンおよび二種類の
ポリエチレングリコールの添加はＭ−１酵素のみを添加
した場合と同程度の濁度の減少しか伴わなかった。

そして、上記の浸透調整物質のうち、０．９Ｍのグルコ
ースを添加したときにのみ３〜４％のプロトプラスト形
成が観察された。一方、０．９Ｍの蔗糖を添加したとき
には（第３図中９）、Ｍ−１酵素の添加（１，５μｇ／
ｍｌ　）と同時に急激な濁度の減少が観測され、酵素処
理５〜１０分後には、９５％以上の細胞がプロトプラス
ト化していることが確認された。

これらの事実から、蔗糖は、プロトプラスト形成過程に
おける浸透圧差による細胞破壊を効果的に抑制する作用
を有するばかりか、Ｍ−１酵素の細胞壁溶解作用を増強
する作用をも有することが判明した。

プロトプラスト形成過程における浸透圧差に起因する細
胞破壊作用に対する抑制作用は、ラクトース、トレハロ
ース、マルトースなどの蔗糖以外の三糖類に関しても同
様に認められた。

しかしながら、一方、酵素処理が長時間におよぶと、形
成されたプロトプラストが破壊されるので、細胞懸濁液
の濁度の減少が観測された。

なお、上記実験中、プロトプラスト形成の判定は、位相
差顕微鏡にて検鏡することにより行なった。

実施例 この実験は各種糖類によるＭ−１酵素の溶解作用に対す
る増強作用に関するものである。

蔗糖存在下でＭ−１酵素を作用させると、Ｌ。

カゼイ（Ｌ、Ｃａ５ｅｉ　）の細胞壁に対する溶解作用
が増進することが見い出されたが、かかるＭ−１酵素作
用に対する増強作用が他の糖類に関しても期待できるか
否かを調べるべく各種糖類によるＭ−１酵素作用に対す
る増強作用の有無を調べた。

実験方法は各種糖類の存在下にて酵素処理する点を除い
て、実験例１の場合と同様である。

その実験結果を第４図に示す。

四種類の単糖類（キシロース、ガラクトース、フルクト
ース、イノシトール）の存在下では、Ｍ−１酵素を添加
した後も濁度の変化はほとんど観測されなかった。

三糖類のラフィノース存在下でもＭ−１酵素作用に対す
る増強作用はほとんど観測されなかった。

これに対して、四種類の三糖類、すなわち、マルトース
、トレハロースＪ糖（シュークロース）、乳糖（ラクト
ース）の存在下では、いずれもＭ−１酵素作用に対する
増強作用が観測され、特に、蔗糖と乳糖の存在下では、
増強作用の程度が極めて強いものであった。

これらの事実から、三糖類はプロトプラストの浸透圧差
による破壊作用を抑制するための浸透圧調節物質として
有効であるばかりか、Ｍ−１酵素の乳酸桿菌属の細菌に
対する細胞壁溶解作用の増強作用をも有することが判明
した。

なお、乳酸桿菌属の細菌の種類に応じて、上記酵素作用
に対する増強作用には差異が存在する。

例えば、Ｌ、ヘルベティカス（Ｌ、　ｈｅｌｖｅｔ　１
ｃｕｓ　）、Ｌ、サリバリウス（Ｌ、　ｓａｌ　１ｖａ
ｒｉｕｓ　）、Ｌ、プランタラム（ＴＪ、　ｐｌａｎｔ
ａｒｕｍ　）、Ｌ、ファーメンタム（Ｌ。

ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ　）、その他多くの乳酸桿菌属の細
菌に関しては、同様のＭ−１酵素作用に対する増強作用
が認められるが、Ｌ、アシドフィラス（Ｌ。

ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ　）、Ｌ、ブルガリカス（Ｌ、
ｂｕｌｇａｒｉ−ｃｕｓ　）に関しては、上記Ｍ−１酵
素作用に対する増強作用は認められなかった。（後述の
実験例６の第１表参照のこと。） 実施例 の実験は細菌の種類によるＭ−１酵素作用の差異に関す
るものである。

各種乳酸桿菌属の細菌におけるＭ−１酵素に対する感受
性とプロトプラストの形成状況とを実験例１および実験
例４に準じて観察した。

Ｍ−１酵素に対する細胞の感受性に関しては、緩衝液中
に、０．８５Ｍの蔗糖を存在させた場合と蔗糖無添加の
場合の濁度低下の度合を、更に、プロトプラストの形成
率に関しては、０．８５Ｍの蔗糖を存在させた場合の位
相差顕微鏡による検鏡観察結果を整理して第１表に示す
。

第１表から明らかなように、Ｌ、アシドフィラス（Ｌ、
　ａｃｉｄｏｐｈｉ　Ｉｕｓ　）、Ｌ、ヘルベティカス
（Ｌ。

ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ　）、Ｌ、サリバリウス（Ｌ、　
ｓａｌ　１ｖａｒｉｕｓ　）、Ｌ、プランタラム（Ｌ、
　ｐｌａｎｔａｒｕｍ　）、Ｌ、カゼイ（Ｌ、ｃａｓｅ
ｉ　）、Ｌ、ファーメンタム（Ｌ、　ｆｅｒｍｅｎｔｕ
ｍ　）、Ｌ、ブルガリカス（Ｌ、　ｂｕｌｇａｒｉｃｕ
ｓ　）などを含むほとんどすべての乳酸桿菌属の細菌に
関して高率のプロトプラスト形成が確認された。

第１表　各種乳酸桿菌属の細菌におけるプロトゲラスト
の形成性１　）　　　Ｓｕｅは蔗糖の不存在を、十Ｓ　
ｕ　ｃは蔗糖の存在を示す。

注２）　　士、十、丑、柑は、Ｍ−１酵素の各種乳酸菌
に対する細胞壁溶解作用の強さく８分間の反応の結果濁
度がどの位減少するかという度合い）を観察者の感応評
価により表示したもので、左から右に向って増大傾向を
持つ。

なお、Ｌ、アシドフィラス、Ｌ、ブルガリカスに関して
は、Ｍ−１酵素に対する感受性の、蔗糖の存否による影
響は認められなかった。

実施例１ 供試菌株として、Ｌ、カゼイ（Ｌ、　Ｃａ５ｅｉ　）　
Ａ　ＴＣＣ７４６９を使用し、培地ｌｌ中にニュトリエ
ントブロス（ディフコ社製）　１２１！、酵母エキス（
ティフコ￥ｒＪｎ　　５Ｊｉ’、ツイーン８０１　ｍ１
％に！ＨＰＯ４３１１、ＫＨ２ＰＯ４１，５＆、グルコ
ース−０゜４１１％Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈｔ０．０．１９、
ＭｎＳＯ４−４ＨｔＯｏ、　０２５　ｇを含み、最終）
ｐ）Ｉが６．８に調整された培地にて上記供試菌を培養
した。

上記培地組成のうち、グルコース、ＭｇＳＯ４・７Ｈｔ
Ｏ１ＭｒＬ８０４　”　４ＨｔＯに関しては、各々別個
に高圧滅菌後、上記終末濃度になるように、添加した。

培養は、３７℃、静置条件下にて行なった。

−夜装置培養した菌は、４．０ＯＯＸ、９５分間の遠心
分離により集菌し、２０ＴｒＬＭリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ７，０）で２回洗浄した後、上記緩衝液に２．５
り温室／Ｗｔｌとなるように懸濁した。

酵素処理は、菌懸濁液１０ｍＡ’を２０−容量の丁字上
ノー管に入れ、３７℃にて５分間プレインキュベージ冒
ンした後、Ｍ−１酵素３μＩ／ｄを添加することにより
、開始した。

かかる酵素処理を１．０Ｍの蔗糖の存在下で、かつ、５
サイクル／分の微弱振盪条件下にて、３０分分間性した
。

実験例４の場合と同様の方法によりプロトプラスト形成
率を判定したところ、その値は９５％であった。

実施例２ 供試菌株として、Ｌ、ヘルベティカス（Ｌ、ｈｅ＋−ｖ
ｅｔｉｃｕｓ　）を使用し、実施例１と同様の培地にて
同様の培地条件下で培養した菌を集菌して、これを３Ｔ
ｖ湿重量／　ｍｌになるように、懸濁させ、その菌懸濁
液を、１．０Ｍの乳糖の存在下で、３７℃にて１５分間
、８サイクル／分の微弱振盪条件下で１Ｍｇ／ｄのＭ−
１酵素にて処理することにより、プロトプラストの調製
を行なった。

実験例４の場合と同様の検鏡観察によりプロトゲラスト
形成率を判定したところ、その値は９５％であった。

実施例３ （１９） 供試菌株として、Ｌ、カゼイ（Ｌ、　ｃａｓｅｉ　）　
Ａ　ＴＣＣ７４６９を使用して、実施例２の場合と同様
に処理したところ、９０％のプロトプラスト形成率が確
認された。

【図面の簡単な説明】

第１図（Ａ）は、Ｌ、カゼイ（Ｌ、　ｃａｓｅｉ　）の
増殖段階を表わす濁度曲線、第１図（Ｂ）は、各増殖期
における細胞のＭ−１酵素に対する感受性を表わす濁度
曲線。 第２図は、Ｌ、カゼイ（Ｌ、　ｃａｓｅｉ　）の溶菌作
用に及ぼすＭ−１酵素量の影響を表わす濁度曲線、第３
図は、Ｍ−１酵素による溶菌作用に及ぼす各種浸透圧調
節物質の影響を表わす濁度曲線、第４図は、Ｍ−１酵素
作用に及ぼす浸透圧調節物質としての各種糖類の影響を
表わす濁度曲線である。 第１図において、第１図（８）中に付された各数字にて
特定される各曲線は、第１図（Ａ）中に付された同一の
数字にて特定される各増殖段階（２０） の細菌に関するものである。 第２図において、１・・・酵素無添加、２・・・０，３
８μＩ／−添加、３・・・０．７５μｇ／プ添加、４・
・・１，５μｍ１／Ｉｔ添加、５・・・３．０μＩ／ゴ
添加、６・・・４．５４／ｄ添加、７・・・６．０μｌ
／ｍｌ添加、８・・・７，５μＥ／ｍｌ添加、９・・・
９．０μｍ１／ｍｌ添加第３図において、１・・・２０
　ｍＭ　！Ｊン酸緩衝液に酵素無添加、２・・・２０　
ｍＭ　！Ｊン酸緩衝液に１．５μｇ／ｄＭ−１酵素添加
、３〜９・・・２０　ｍＭ　リン酸緩衝液に下記の各種
物質を加え、酵素を添加したもの、即ち、３　・・・０
．４５　Ｍ　Ｎａｃｌ、４−０．４５　Ｍ塩化コリン、
５・・・０．９　Ｍグリセリン、６・・・０．９Ｍグル
コース、７・・・０．５　Ｍポリエチレングリコール（
平均分子量３００）、８・・・０．５Ｍポリエチレング
リコール（平均分子量１０００）、９・・・０．９Ｍ蔗
糖 第４図において、１・・・対照（糖類およびＭ−１酵素
無添加）、２・・・対照（糖類無添加、１．５μ９／ｄ
Ｍ−１酵素添加）、３・・・キシロース添加、４・・・
ガラクトース添加、５・・・フルクトース添加、６・・
・イノシトール添加、７・・・ラフィノース添加、８・
・・マルトース添加、９・・・トレハロース添加、１０
・・・ラクトース添加、１１・・・蔗糖添加。 （各添加量は０．５　Ｍ　） 特許出願人　　株式会社ヤクルト本社 （２３） 第１図（Ａ） ＠　朋　　　（ｈ「） 第１図（Ｂ） 晒　間　（ｍｉｎ） 第２図 蒔　朋　　（而ｎ） 第３図 層間（ｍｊｎ） 第４図 跨　Ｍ　　（ｍｉｎ） 第１頁の続き ０発　明　者　金政泰弘 岡山市鹿田町２丁目５番１号岡 両大学医学部内 ■出　願　人　大日本製薬株式会社 大阪市東区道修町３丁目２５番地

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　ストレプトマイセス・グロビスボラス（Ｓｔ
   −ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ　）
   が生産するエンド−Ｎ−アセチルムラミダーゼを浸透圧
   調節物質の存在下にて乳酸桿菌域の細菌に作用させて、
   上記細菌のプロトプラストを調製する方法において、前
   記浸透圧調節物質が三糖類であることを特徴とする乳酸
   桿菌域の細菌のプロトプラスト調製方法。
2. （２）前記浸透圧調節物質としての三糖類が蔗糖（シー
   −クロース）あるいは乳糖（ラクトース）である特許請
   求の範囲第１項記載の乳酸桿菌域の細菌のプロトプラス
   ト調製方法。