JPH02233619A - ウィルス感染防御剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 皮来上夙■■公！ 本発明は、鉄結合性蛋白質を有効成分とするウィルス感
染防御割に関する． 鴛ｍ避 ウィルス性疾患は、現在、医療分野に残された最大の課
題の一つである．これまでに多数の抗ウィルス剤につい
ての研究が行われてきたが、ウィルスが細胞の増殖機能
に依って増殖するため、薬剤による治療は困難であった
．これまでに、ウィルス性疾患に治療効果を示す薬剤と
して認められているものは、インフルエンザＡｔ型に対
するアマンタジン、単純ヘルペスウィルスによる脳炎、
帯状発疹に対するアシクロビル及びビダラビンがあるだ
けである．この内アマンタジンは、我国においては抗ウ
ィルス剤としての使用は認められていない． 又、最近では、ＨＩＶによる感染症、いわゆるＡＩＤＳ
が問題となり、多数の化合物がスクリーニングにかけら
れ、その結果、アジドチミジン（ＡＺＴ）がＡＩＤＳ感
染者に対して延命効果を示すことが確認され、ＨＩＶ感
染者の治療に使用されている．しかし、これらの薬剤は
高価であり、又副作用も強く、その治療スペクトルも限
定されており、抗ウィルス剤としては、まだ問題をかか
えている． 一方、抗ウィルス剤として最近注目を集めているものに
インターフェロンがある．インターフェロンは、１９５
７年に発見された物質であり、ウィルスの細胞への惑染
を防御する物質として研究が進められた．インターフェ
ロンは、白血球や、線維芽細胞を培養することにより得
られるが、最近では遺伝子組換による大量生産も可能と
なった．インターフェロンを抗ウィルス剤として使用す
る方法としては、経鼻投与により、呼吸系の感染、例え
ば、インフルエンザの治療に応用する報告などが見られ
るが、体内の代謝や動態が不明であり、臨床上の有効性
を確認するまでに至っていない．又、遺伝子組換による
大量生産が可能になったとはいえ、インターフェロンの
生産コストは高価であり、インフルエンザ等の一般的な
ウィルス疾患の治療や感染防御の用途に供するには、ま
だ高価である。

現在のところ、ウィルス性疾患に対する対策としては感
染を予防するワクチンの投与が最も普及している．これ
には各ウィルスをなんらかの方法で弱毒化した生ワクチ
ンやウィルスのホルマリン処理により作成した不活性化
ワクチン、ウィルスの抗原部分のみを精製したコンポー
ネントワクチンがある．これらのワクチンにより大部分
の疾患については予防が可能となっている。しかし、最
も代表的なウィルス性疾患であるインフルエンザを例に
とった場合、ワクチンによる惑染予防は困難である．イ
ンフルエンザウィルスは、ウィルス表面のエンベロープ
と呼ぶ部分に抗原が存在し、この抗原をワクチンとして
使用しているが、この抗原部分はしばしば変異し、変異
型のウィルスに対しては、旧型のワクチン投与では、何
ら効果を示さないことが明らかとなっている．又、Ｈ　
Ｉ　Ｖのように、ワクチンとしての抗原が不明なウィル
スや、臓器移植後の免疫抑制剤投与による免疫機能低下
時にしばしば発症するサイトメガロウィルス感染症など
に対してはワクチンによる感染防御は困難である． 近年、ウィルス学の研究が進み、ウィルスの感染におい
ては、細胞表面に存在するウィルスレセプターにウィル
スが結合し、この部分から細胞内へウィルスが侵入する
ことが明らかとなった．例えば、ＨＩＶはＴ４リンパ球
の表面に存在するＣＤ４レセプターに結合する．このた
めＣＤ４を大量に血中に投与することにより、ＡＩＤＳ
の発病を防止することが可能となると言われている．こ
のようにウィルスとウィルスレセプターの研究は新しい
ウィルス治療剤の開発の可能性を示している．インフル
エンザウィルスは、ウィルス表面にヘマグルチニンと呼
ばれる赤血球を凝集させる酵素蛋白を持っている．この
ヘマグルチニンがウィルス抗原を決定すろ重要な因子で
ある．このヘマグルチニンは一般には、ＨいＨ富、Ｈｓ
と３つのタイプが知られているが、しばしばこの型か変
異する．このためワクチンの効果が低下するのである．
ヘマグルチニンはインフルエンザが細胞に感染する際に
、細胞膜表面に存在するシアル酸結合型糖鎖を認識して
結合し細胞への侵入を開始するが、この細胞への結合性
を赤血球の凝集反応を指標として評価することができる
．したがって、赤血球凝集阻止を示すような糖鎖構造を
有するものであれば、インフルエンザウィルスの細胞へ
の結合を阻害し、感染を防止し、さらに惑染後の他の細
胞への伝播を防御できる． 既に、本発明者らは特開昭６３−２８４　１３３号公報
に開示したように、インフルエンザウィルスの感染を防
御する物質を得て特許出願を行った．又、山川らは、ヒ
ト血球より、インフルエンザウィルスの示す赤血球凝集
を阻害する物質を単離し、これがシアル酸を構成糖に持
つＩ！董白質であることを明らかにしている（山川他、
「生化学」３１巻４１６〜４２１頁ｌ９５９年）．シか
し、ウィルスのレセプター結合阻害と糖蛋白質との規則
性は未だ明らかになっていない． が”゜　しようとする赤 上述したように、ウィルスの感染を防御するにあたって
の重要な因子としては、ウィルスの結合する細胞表面の
レセブターと、これに拮抗する物質が挙げられる．イン
フルエンザウィルスを例にとると種々のレセブターが確
認されている．「蛋白質・核酸・酵素ｖｏｌ．３２．　
１１７真〜１３５頁、１９８８年」には、ヘマグルチニ
ンとレセプターについて開示されている．これらによれ
ば、必ずしも糖蛋白質、糖脂質の糖鎖構造とレセプター
の役割については一定の法則性を見出し得ない．本発明
者らは、ウィルスの感染防御について鋭意研究を進めた
結果、シアル酸及びマンノースをＩ！鎖構造中に持つ鉄
結合性蛋白質が各種ウィルスのレセプターと拮抗し、ウ
ィルス感染を防止することを見出した． したがって、本発明は鉄結合性蛋白質を有効成分とする
ウィルス感染防御剤の提供を課題とする．゜するための 本発明の特徴は、ウィルス感染防御剤としてシアル酸及
びマンノースをＩ！鎖構造中に持つ鉄結合性蛋白質を用
いることにある． シアル酸及びマンノースをＷ鎖構造中に持つ鉄結合性蛋
白質としては、ラクトフェリン、オボトランスフェリン
等が例示できる．又、これらの蛋白質を部分的に酵素加
水分解したものを用いることもできる． ラクトフェリンは、一般には、噛乳動物の乳汁から分離
される鉄結合性蛋白質であるが、本発明の実施において
は、どのような種、由来のものでも差し支えない．又、
必要に応じて、遺伝子組換により生産した糖蛋白質を使
用することもできる．現在、最も安価でかつ容易に入手
できるものとしては牛乳より分離したものである．牛乳
より分離する場合は、特開昭６１−１４５２００号公報
に開示された抗ラクトフェリン抗体を使用する方法等が
採用し得る． オボトランスフェリンは、ニワトリ卵白中に含まれる分
子量約７７．０００〜８７．０００の糖蛋白質でラクト
フェリンに良く似た鉄結合性の蛋白質である．オボトラ
ンスフェリンを得るためには、公知のクロマトグラフィ
ー等の分離精製が可能である．例えば、カルボキシメチ
ルセルロースによる方法（ギャリアン他「ジャーナル・
オブ・フードサイエンス」４５巻、４６０頁、１９８０
年）、金属固定化親和クロマトグラフィーを用いる方法
（アルーマシキ他「アグリ力ルチャル・バイオロジカル
ケミストリーＪ５１巻、２８８１〜２８８７頁、１９８
７年）等の方法を採用し得る。

上述のようにして得られたラクトフェリン並びにオボト
ランスフェリン等の鉄結合性蛋白質をプロテアーゼによ
り部分加水分解したものも本発明においては使用し得る
．ラクトフェリン並びにオボトランスフェリンを酵素加
水分解する場合には、ウィルス感染防御能を維持しかつ
、酵素分解による効果を奏するためには、分解率を６０
％以下に止めることが好ましい． 上述した鉄結合性蛋白質、あるいはその部分酵素加水分
解物は、ウィ”ルス感染防御剤として、単独あるいは混
合して使用することができる．ウィルス感染防御剤とし
ての使用は、経口、経皮、注射剤等の投与が可能であり
、それぞれの投与経路に応じた製剤化が可能である． 本発明をサイトメガロウィルス（Ｃ　Ｖ　Ｍ）の感染予
防或は治療の目的に使用する場合には、有効成分である
鉄結合性蛋白質が投与組成物１ｇ当り０，１μｇ以上の
量が存在していることが効果上必要である． 又、鉄結合性蛋白質をｗｉ菌する場合には、０，４５μ
餉以下のメンプランフィルターによる濾過ｗｉ国をする
ことができる． 本発明に係る鉄結合性蛋白質であるラクトフ占リン並び
にオボトランスフェリンは、それぞれ牛乳、卵白中に含
まれており、その安全性もｉ’ａ認されている． 次に、本発明のウィルス惑染防御効果を、インフルエン
ザウィルスによる赤血球凝集を阻止する反応（ＩＩ）を
例にした試験例について説明する．試験例ｌ インフルエンザウィルスとして以下のウィルスを対象と
した． デンカ生研より入手した不活化インフルエンザウィルス
、Ａ／山形／１２０／８６（Ｈ，Ｎ，）、Ａ／新潟／１
０２／８１（Ｈ３Ｎ冨）、Ａ／四川／α／　８７／　（
　Ｈ　ｓ　Ｎ　＊）、Ａ／福岡／Ｃ２９／８５（ＨツＮ
茸）、Ｂ／長崎／　１　／８７、Ｂ／シンガポール／２
２２／７９、及び静岡薬科大学より譲渡された不活化さ
れていないインフルエンザウィルスＡ／ＰＲ／８／３４
（ＨＩＮ＋）、及びＡ／愛知／２／６Ｂ（ＨｓＮｇ）． これらのウィルスのヒヨコ安定化赤血球《武田薬品工業
製）に対する凝集反応阻止（ＨＩ）活性を測定した，Ｈ
ｌ活性は、上述した山川らの方法（「生化学」３１＠、
４１６頁〜４２１頁）に準じて測定した． 測定に供したサンプルは、牛ラクトフェリン（ｂ　Ｌ　
ｆ）、ヒトラクトフェリン（ｈＬｆ）、山羊ラクトフェ
リン（ｇ　Ｌ　ｆ）、オボトランスフェリン（ＯＴｆ）
並びにこれらをトリブシンにより２０％、４０％、６０
％の分解率で酵素分解したものである．結果は表１に示
す通りであった． 表１に示した通り、いずれのサンプルも強いＨ璽活性を
示した．又、Ａ／山形／１２０／８６はヒヨコ赤血球を
凝集させなかった．　尚、表１の（Ａ）はヒヨコ安定化
赤血球を対象とし、（Ｂ６）はヒト０型赤血球を対象と
したものである． 試験例２ 試験例１で使用した各サンプルを生理食塩水に溶解し、
０．５％（ｗ／ｖ）の濃度に調製した．この溶液に、試
験例１で調製したヒト０型赤血球、又はヒヨコ安定化赤
血球を加え、赤血球濃度が１％（Ｖ／Ｖ）、又は１０％
となるように懸濁させた，これを時々攪拌しながら１時
間室温で放置した後、１５００ｒｐｍでｌＯ分間遠心し
、その上清について、試験例１と同様の手順によりＨｌ
活性を測定した． 結果は表２に示す通り、このような処理を行っても各サ
ンプルの示すＨｌ活性に変化は認められなかった． 試験例ｌ及び２の結果から、鉄結、合性蛋白質、及びそ
の酵素分解物は、ウィルスによる赤血球の凝集を阻害し
、又、その効果は赤血球への非特異的な吸着によって起
るものではなく、ウィルスのへマグルチニンと各有効成
分が特異的に親和することにより起るものと堆定された
．更に、鉄結合性蛋白質とウィルスの親和性は、ウィル
ス抗原の変異に影響されないことが確認された．尚、表
中の（Ａ）はヒヨコ安定化赤血球を対象とし、（Ｂ）は
ヒト０型赤血球を対象としたものである．以下に実施例
を示し、さらに本発明を具体的に説明する． 実施例ｌ 堕」」以匡盟： ウシラクトフェリン（ｂ　Ｌ　ｆ）は、「ジャーナル・
オブ・ディリイ・サイエンス」２０巻、７５２〜７５９
頁（１９８７年）に開示された抗ウシラクトフェリンモ
ノクローナル抗体アフィニティーカラムを用い牛乳より
調製した． 脱脂乳を抗ウシラクトフェリンモノクローナル抗体アフ
ィニティー力ラムに負荷し、ウシラクトフェリン（ｂ　
Ｌ　ｆ）を吸着させ、次いで、ｐＨ　７．３のリン酸緩
衝生理食塩水（ＰＢＳ）で十分洗浄した。

その後、０．５Ｍ食塩を含むｐＨ　７．３のリン酸緩衝
液で洗浄し、さらに、０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（
　ｐｕ　３．７、０．１５Ｍ食塩を含む）でカラムに吸
着したｂＬｆを溶出した．溶出後ｐｉを中性付近に調整
し、脱イオン水に対し３日間透析した後、凍結乾燥し、
ｂＬｆを得た．得られたｂＬｆは電気泳動により純度を
確認したが単一のバンドを示した．実施例２ ｈＬｆの調製： ヒトラクトフェリン（ｈＬｆ）は、ヘパリンーセファロ
ースＣＬ−６Ｂカラムを用い大乳より調製した．脱脂人
乳をヘバリンーセファロースＣＬ−６Ｂカラムに負荷し
、脱脂人乳中のｈＬｆをカラム内に吸着させ、その後ｐ
Ｈ７．３の０．ＯＩＭリン酸緩衝液で洗浄した。次いで
、１．０Ｍ食塩を含むｐＨ　７．３の０．ＯＩＭリン酸
緩衝液でカラム内に吸着したｈＬｒを溶出した．さらに
、溶出液を脱イオン水に対し３日間透析した後、凍結乾
燥しｈｌＪを得た．得られたｈＬｆは、電気泳動により
純度を確認したが、９８％以上の純度を示した。

実施例３ ０７ｆの調製： 卵白に硫安を２．５Ｍとなるように加えて蛋白質を沈澱
させた．遠心により沈澱を集め、ｐＨ　６．０の０．Ｏ
ＩＭリン酸緩衝液に再溶解させ、ジエチルアミノエチル
セルロースカラムに負荷した。卵白中のＯＴｆをカラム
に吸着させた後、ｐｌ１　６．０の０．ＯＩＭリン酸緩
衝液で洗浄し、次いで、０．１Ｍの食塩を含むｐｎ　６
．０のリン酸緩衝液でＯＴｆを溶出した．溶出液を集め
、脱イオン水に対して３日間透析し、その後凍結乾燥に
よりＯＴｆを得た．得られたＯＴｆを電気泳動により純
度を確認したが、９５％以上の純度を示した． 実施例４ インフルエンザウィルスの惑染防？ＩＩＩ：試験例ｌに
使用した不活化されていないインフルエンザウィルスＡ
　／　Ｐ　Ｒ　／８／３４及びＡ／愛知／２／６Ｂを段
階的に希釈し、５個のニワトリ　１０日卵に０．１−ず
つ尿液腔内に接種し、３日後、個々の卵の尿液５０μＥ
をとり、これを０．５％ヒａコ安定化赤血球と混合、攪
拌し、赤血球の凝集によって感染率を決定した．１００
％の怒染率を示した希釈倍率のウィルス希釈液の０．１
−に実施例１２及び３で得たｂｌＪ，ｈＬｆ，ＯＴｆ、
をそれぞれ２．０ｍｇ％１．０一ｇ、０．５ｓｇづつを
溶解し、室温で３０分間インキエベートした後、ニワト
リ１０日卵に０．１一ずつ尿液腔内に接種した．３日後
、個々の卵の尿液５０μｌをとり、赤血球凝集反応によ
り感染率を決定した．１群５個の卵を使用し各群の感染
率を得た． 又、各蛋白質の酵素分解物についても同様にして感染防
御効果を測定した． 結果は表３に示す通りであり、各サンプルとも有意にイ
ンフルエンザウィルスに対して強い感染防御効果を示し
た． 表３ 実施例５ ｂＬｆによるサイトメガロウィルス感染阻止効果：実施
例ｌで得たｂＬｆのサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）の
感染阻止効果を確認した．ｂｔｒを２％血清添加ＭＥＭ
培地に５ｍｇ／一となるように溶解し、０．４５μ霧の
フィルターで濾過滅菌しストック溶液とした．このスト
ック溶液を必要に応じ、２％血清添加ＭＥＭ培地により
希釈して用いた． ヒトＣ　Ｍ　Ｖ　（Ｔｏｎｎｅ株）を各濃度のｂｌＪ含
有培養液で１時間インキエベート後、ヒト胎児繊維芽細
胞（ＨＥＬ細胞）に感染させた． ２４時間培養後、ヒ｝ＣＭＶ陽性血清で蛍光染色し細胞
へのヒトＣＭＶの吸着能力を測定した．その結果、表４
に示すとおり、ＣＭＶがｌｍｇ／一のｂＬｆと１時間イ
ンキエベーシッンすることによって、完全にヒ｝ＣＭＶ
吸着侵入能力を失うこと確認された． 表４ 実施例６ ｈＬｆによるＣＭＶ増殖阻止試験： 実施例５と同様に溶解、希釈したｈＬｆとヒトＣＭＶを
１時間インキエベートした後、ＨＥＬ細胞にＣＭＶを感
染させた． 次いで、上記感染ＨＥＬ細胞をそれぞれｈＬｆ希釈液と
同じ濃度に調整したｈＬｆ含有軟寒天培地（０．８％ソ
フトアガー、ディフコ社製）で培養し、９日目に出現し
たプラークを数え比較した．軟寒天墳地は３日毎に重層
した． 一方、軟寒天培地中にｈＬｆを含まない条件でも同様に
試験を行い、生成するプラークを数えた．表５ ほぼ完全にＣＭＶの増殖を抑制した． 表６ ０ＴｆのヒトＣＭＶ増殖抑制効果 表５に示す通り、ｌｓｇ／ｄの濃度のｈＬｆ含有培地で
ＣＭＶを処理した後、同濃度のｈｌＪ軟寒天培地で培養
した場合強いＣＭＶの増殖抑制が認められた． 実施例７ ０ＴｆによるＣＭＶ増殖抑制効果： 実施例３で得たＯＴｆを実施例６に記載したと同様に処
理し、ＯＴｆ含有軟寒天培地中で生成したブラークを数
えた． 表６に示すように、０．５一ｇｏｄの濃度のＯＴｆで実
施例８ ｂＬｆによるヒ｝ＣＭＶ力値への影響：９６大のプラス
チックプレート　（ファルコン社製）にＨＥＬ細胞を培
養し、これにヒ｝ＣＭＶを１０−１〜１０−’までのｌ
Ｏ倍希釈系列のウィルス液を加え、感染させ、力価を測
定した． 実施例５と伺様に、各希釈系列のウィルス液を各濃度系
列のｂＬｆ培養液により１時間インキュベート処理し、
その後９６大のプラスチックプレートに生育したＨＥＬ
細胞にウィルス液を加え感染させ、惑染の成立したウエ
ルを数えた．その結果、５Ｘ１０’の力価を持つＣＭＶ
は０．１霧ｇｏｄ（７）ｂＬｆで力価７．５Ｘ１０’　
ニ、０．５ｍｇ／ａｄ（ＤｂＬｆで力価が２．５Ｘ１０
”に、１．０ｍｇ／一のｂＬｆで力価が５０に顕著に低
下することが明らかとなった（表７）． 実施例９ 動物におけるＣＭＶ感染予防治療効果：本実施例におい
ては、動物のＣＭＶ感染予防及び感染動物の治療効果に
ついて確認した例を示す．実施例ｌで得たｂｌＪを生理
食塩溶液１一当り、１０００μｇの濃度になるように溶
解し、溶解後０．２２μ一のフィルターで濾過滅蘭した
． 一方、胸腺を摘除したマウス（　Ｃ　５７　Ｂ　１６Ｊ
）　２０匹を２群にわけ、１群には上記のｂＬｆ溶液を
７日間、静脈より１一連日投与し、１群には同様にして
生理食塩水を投与した．その後マウスＣＭＶをグランデ
ィーらの方法（トランスプランテーション、３７巻、４
８４〜４９０頁、１９８４年）に従って感染させた．す
なわち、マウスＣＭＶのスミス種の唾液腺ウィルスの腹
腔内投与により感染させた．さらに１ケ月間飼育した後
、エンザイム・リンクド・イムノアッセイ法で尿中のマ
ウスＣＭＶＩを測定した． 生理食塩溶液のみを投与したマウズは全て尿中のマウス
ＣＭＶ陽性であったのに対し、ｂＬｆ投与群では１０匹
中２匹が陽性であった．又、この生理食塩溶液のみを投
与したｌＯ匹を２群にわけ、上記ｂＬｆ溶液を１５日間
、静脈よりＩＩｄ連日投与し、一群には生理食塩溶液の
みを同様に投与した．１５日後に、両群とも麻酔後解剖
し、臓器の状態を観察した． 表８ 表８に示した通り、マウスＣＭＶ感染によって認められ
るのみで、他の３匹は明らかに回復している． １１ＩＢ裏果 以上述べた通り、本発明に係る鉄結合性蛋白質は明らか
にウィルスの感染を防御し、かつ治療効果も示すことか
ら、本発明はウィルス感染防御剤として有効に利用でき
る．また、特に本発明に係る鉄結合性蛋白質はインフル
エンザウィルスの抗原変化に影響されないことが明らか
であり、広範な予防効果も期待できる．さらに、本発明
に係る上記物質は食品中に含まれている成分であり、安
全でかつ低コストで供給可能である． したがって、本発明の実施により、安全でかつ広範なウ
ィルスに対して惑染防御効果を有するウィルス感染防御
剤が安定にかつ安価に供給される． 手続補正書 平成１年６月５日 ｌ．事件の表示　平成１年特許願第５３６７９号２．発
明の名称　ウィルス感染防御剤 ３．補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称 （６６９）雪印乳業株式会社 （ほか１名） ４．代理人 住　所　東京都千代田区麹町５丁目４番クロスサイド麹
町ビル７階

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）鉄結合性蛋白質を有効成分とするウィルス感染防
   御剤。
2. （２）鉄結合性蛋白質が、ラクトフェリン、もしくはオ
   ボトランスフェリンである請求項（１）記載のウィルス
   感染防御剤。
3. （３）鉄結合性蛋白質がラクトフェリンもしくはオボト
   ランスフェリンの部分酵素加水分解物である請求項（１
   ）に記載のウィルス感染防御剤。
4. （４）ウィルスがインフルエンザウィルスもしくはサイ
   トメガロウィルスである請求項（１）、（２）、（３）
   のいずれかに記載のウィルス感染防御剤