JPH02234670A - 細胞培養用基材 - Google Patents
細胞培養用基材Info
- Publication number
- JPH02234670A JPH02234670A JP1055225A JP5522589A JPH02234670A JP H02234670 A JPH02234670 A JP H02234670A JP 1055225 A JP1055225 A JP 1055225A JP 5522589 A JP5522589 A JP 5522589A JP H02234670 A JPH02234670 A JP H02234670A
- Authority
- JP
- Japan
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- eggshell
- membrane
- eggshell membrane
- cell culture
- microcarrier
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- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、細胞培養用基材に関する。
有機合成や微生物醗酵では生産が困難な、例えば、イン
ターフェロンやプラスミノーダンアクチベーター等の有
用な生埋活性物質は、線維芽細胞等の接着性細胞の培養
によって生産が可能であシ、最近、その培養技術の開発
が盛んになってきた。
ターフェロンやプラスミノーダンアクチベーター等の有
用な生埋活性物質は、線維芽細胞等の接着性細胞の培養
によって生産が可能であシ、最近、その培養技術の開発
が盛んになってきた。
接着性細胞の培養は、小規模の場合には、ガラスやプラ
スチック製のフラスコ シャーレ等ヲ用いて平面的に行
なう方法が採られ、寸た、上記有用物質を生産させる場
合には、生産効率を向上させるために、マイクロキャリ
アや中空糸等を用いて立体的に行なわれている。
スチック製のフラスコ シャーレ等ヲ用いて平面的に行
なう方法が採られ、寸た、上記有用物質を生産させる場
合には、生産効率を向上させるために、マイクロキャリ
アや中空糸等を用いて立体的に行なわれている。
そして、いずれの場合にも、培養中において細胞の接着
性と堆殖性をいかにして高めるかが技術上のポイントで
あり、従来よシ種々の工夫がなされている。
性と堆殖性をいかにして高めるかが技術上のポイントで
あり、従来よシ種々の工夫がなされている。
その中で、特開昭５８−７１８８／Ｉ号公報には、平面
状、球状、中空糸状等に成型したガラスやプラスチック
の表面をコラーケ゛ン、ゼラチン等の接着性蛋白質で被
覆する方法が提案され、また、特開昭６１−２７４号公
報には、コラーケゝン、ゼラチン等の接着性蛋白質自体
を膜状、球状、中空糸状等に成型し、得られた成型物を
そのま捷培養用基材とする方法が提案されている。
状、球状、中空糸状等に成型したガラスやプラスチック
の表面をコラーケ゛ン、ゼラチン等の接着性蛋白質で被
覆する方法が提案され、また、特開昭６１−２７４号公
報には、コラーケゝン、ゼラチン等の接着性蛋白質自体
を膜状、球状、中空糸状等に成型し、得られた成型物を
そのま捷培養用基材とする方法が提案されている。
４西７
しかし、上記接着性蛋白質は、天然の高ｔ！−蛋白質原
料を用い↓、複雑な精製工程を経て得られる純度の高い
ものであるため、非常に高価であるのが現状である。
料を用い↓、複雑な精製工程を経て得られる純度の高い
ものであるため、非常に高価であるのが現状である。
また、上記接着性蛋白質は、γ線照射すると低分子化し
て接着性を損なうので、この接着性蛋白質を用いた細胞
培養用基材は、γ線滅菌ができないという欠点がある。
て接着性を損なうので、この接着性蛋白質を用いた細胞
培養用基材は、γ線滅菌ができないという欠点がある。
このような状況下において、本発明は、安価に、かつγ
線滅菌をはじめ各種滅菌操作が可能な動物細胞培養用担
体を提供することを目的としてなされたものである。
線滅菌をはじめ各種滅菌操作が可能な動物細胞培養用担
体を提供することを目的としてなされたものである。
本発明者等は、卵殻膜の主成分が清水に不溶な蛋白質で
あり、また、卵殻膜の表面には動物細胞がよく接着する
ことに着目し、鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成し
たものである。
あり、また、卵殻膜の表面には動物細胞がよく接着する
ことに着目し、鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成し
たものである。
本発明は、細胞培養用基材に関し、卵殻膜を担体として
なることを特徴とするものである。
なることを特徴とするものである。
本発明において卵殻膜とは、鳥卵等の爬虫類の卵の卵殻
の内側に付着している膜のことをいう。
の内側に付着している膜のことをいう。
また、担体とは、線維芽細胞、ハイブリドーマ等の接着
性動物細胞を培養する場合、細胞が担持されて発育する
部材のことをいう。
性動物細胞を培養する場合、細胞が担持されて発育する
部材のことをいう。
さらに、細胞培養用基材とは、細胞を培養するための容
器、マイクロキャリア、フィルム、中空糸等をいう。
器、マイクロキャリア、フィルム、中空糸等をいう。
本発明の細胞培養用基材を得るには、まず、卵殻に付着
している卵殻膜を人手により又は機械的に分離する。卵
殻膜に卵殻が付着していると、担体に加工しにくいので
、得られた卵殻膜を酸処理して卵殻を除去することが望
捷しい。
している卵殻膜を人手により又は機械的に分離する。卵
殻膜に卵殻が付着していると、担体に加工しにくいので
、得られた卵殻膜を酸処理して卵殻を除去することが望
捷しい。
次にこのようにして得られた卵殻膜を担体にするには種
々の方法があるが、一例を示すと、この卵殻膜を乾燥後
粉砕し、望ましくは粒径が１００μｍ〜４００μｍの粉
末に仕上げると、そのままマイクロキャリア（担体の一
種）として用いることができる。また卵殻膜を微粉末（
粒径１〜１０μｍ）とし、この微粉末をポリスチレン等
のプラスチックからなる小球体の表面に公知の方法にて
担持させれば、表面が卵殻膜を被覆されたマイクロキャ
リアを得ることができる。
々の方法があるが、一例を示すと、この卵殻膜を乾燥後
粉砕し、望ましくは粒径が１００μｍ〜４００μｍの粉
末に仕上げると、そのままマイクロキャリア（担体の一
種）として用いることができる。また卵殻膜を微粉末（
粒径１〜１０μｍ）とし、この微粉末をポリスチレン等
のプラスチックからなる小球体の表面に公知の方法にて
担持させれば、表面が卵殻膜を被覆されたマイクロキャ
リアを得ることができる。
また、他の一例を示すと、卵殻膜を酸、アルカリ、有機
溶媒、酸化剤、還元剤等で処理して得られた可溶性卵殻
膜の水溶液をフラスコやベトリ皿等の容器に塗布し、風
乾すれば、卵殻膜で被覆された細胞培養用容器を得るこ
とができる。まだ、上記可溶性卵殻膜の水溶液中にガラ
ス、プラスチック等からなる小球体やフイルムを浸漬し
た後、風乾すれば卵殻膜で被覆ζれたマイクロキャリア
やフィルムを得ることができる。
溶媒、酸化剤、還元剤等で処理して得られた可溶性卵殻
膜の水溶液をフラスコやベトリ皿等の容器に塗布し、風
乾すれば、卵殻膜で被覆された細胞培養用容器を得るこ
とができる。まだ、上記可溶性卵殻膜の水溶液中にガラ
ス、プラスチック等からなる小球体やフイルムを浸漬し
た後、風乾すれば卵殻膜で被覆ζれたマイクロキャリア
やフィルムを得ることができる。
さらに、他の一例を示すと、卵殻膜をβ−メルカゾトエ
タノール・チオグリコール酸にて還元、溶解して可溶性
卵殻膜の水溶液とし、この水溶液をガラス板に塗布し、
加熱乾燥した後、ガラス板から剥離すれば水不溶性のフ
ィルムを得ることができる。
タノール・チオグリコール酸にて還元、溶解して可溶性
卵殻膜の水溶液とし、この水溶液をガラス板に塗布し、
加熱乾燥した後、ガラス板から剥離すれば水不溶性のフ
ィルムを得ることができる。
する従来の細胞培養用基材と同等の細胞棲接着性と増殖
効果を示す。
効果を示す。
その原理については深く追求したわけではないが、卵殻
膜は接着性細胞に対し、強い親和性を有するからではな
いかと推察される。
膜は接着性細胞に対し、強い親和性を有するからではな
いかと推察される。
実施例１．
殻付鶏卵を割卵して卵液を除いた後、得られた卵殻膜付
の卵殻を清水中に入れ、人手により卵殻を除去し卵殻膜
を得た。
の卵殻を清水中に入れ、人手により卵殻を除去し卵殻膜
を得た。
次に、得られた卵殻膜を１係塩酸水溶液中に１時間浸漬
して卵殻膜に付着した微小な卵殻を溶解した後、８０℃
の熱水中に３時間浸漬し、而る後水洗した。
して卵殻膜に付着した微小な卵殻を溶解した後、８０℃
の熱水中に３時間浸漬し、而る後水洗した。
次に、この卵殻膜を天日乾燥した後、スクリーンミルに
て粉砕し、而る後、粉砕物をふるいにかけて、平均粒径
２００μｍめ卵殻膜の粉末を得た。
て粉砕し、而る後、粉砕物をふるいにかけて、平均粒径
２００μｍめ卵殻膜の粉末を得た。
そして、得られた卵殻膜の粉末をそのまま細胞培養用基
材とした。
材とした。
実施例２．
殻付鶏卵を割卵して卵液を除いた後、得られた卵殻膜付
の卵殻を清水中に入れ、人手により卵殻を完全に除去し
、卵殻膜を得た。
の卵殻を清水中に入れ、人手により卵殻を完全に除去し
、卵殻膜を得た。
次に、得られた卵殻膜を０． １ ％苛性ソーダ水溶液
中に２時間浸漬した後、水洗した。
中に２時間浸漬した後、水洗した。
次に、この卵殻膜を天日乾燥した後、・・ンマーミルに
て粉砕して、平均粒径３００μｍの卵殻膜の粉末を得た
。
て粉砕して、平均粒径３００μｍの卵殻膜の粉末を得た
。
そして、得られた卵殻膜の粉末をその１才細胞培養用基
材とした。
材とした。
実施例３
殻何鶏卵を割卵して卯液を除ｂた後、得られた卵殻膜伺
の卵殻を粉砕した。
の卵殻を粉砕した。
次に、粉砕した卵殻膜例の卵殻を清水中に入れて攪拌し
、卵殻から分離して浮上してきた卵殻膜を採取した。
、卵殻から分離して浮上してきた卵殻膜を採取した。
次に、得られた卵殻膜を１係塩酸水溶液中に１時間浸漬
した後、水洗し、而る後、天日乾燥した。
した後、水洗し、而る後、天日乾燥した。
次に、この卵殻膜を・・ンマーミルにて粗粉砕した後、
ジェノ１・ミル（■セイノン企業製、商品名ｒ Ｃｏ−
ＪＥＴ ｓｙｓＴＥＭｏ！ＪＪ ） Ｋテ微粉砕シ、
平均粒径１２μｍの卵殻膜の微粉末を得た。
ジェノ１・ミル（■セイノン企業製、商品名ｒ Ｃｏ−
ＪＥＴ ｓｙｓＴＥＭｏ！ＪＪ ） Ｋテ微粉砕シ、
平均粒径１２μｍの卵殻膜の微粉末を得た。
次に、この卵殻膜の微粉末と別に用意した粒径２００μ
ｍのポリスチレンからなる球体とを混合し、オーダード
ミクスチャ状態を形成させた後、高速気流中衝撃法によ
る処理をしたところ、ポリスチレンの小球体の表面が卵
殻膜にて安定に担持されたマイクロキャリアが得られた
。
ｍのポリスチレンからなる球体とを混合し、オーダード
ミクスチャ状態を形成させた後、高速気流中衝撃法によ
る処理をしたところ、ポリスチレンの小球体の表面が卵
殻膜にて安定に担持されたマイクロキャリアが得られた
。
実施例４。
実施例３と同じ方法で得られた乾燥卵殻膜］． ０ ０
ｇに２Ｎの苛性ソーダ水溶液１− ２ ０ ０ｍ．ｌと
無水エタノール８ ０ ０ ｍｌ．を加え、攪拌しなが
ら４０℃で５時間処理して卵殻膜を可溶化した。
ｇに２Ｎの苛性ソーダ水溶液１− ２ ０ ０ｍ．ｌと
無水エタノール８ ０ ０ ｍｌ．を加え、攪拌しなが
ら４０℃で５時間処理して卵殻膜を可溶化した。
次に、この液を布製フィルターにてＦ別しだ後、Ｆ液を
脱塩し、而る後、凍結乾燥して可溶性卵殻膜の粉末５３
ｇを得だ。そして、得られた可溶性卵殻膜の粉末９０μ
ｇを２ ｍｌの清水に溶解した後、１２１℃で１５分間
加熱して滅菌した。
脱塩し、而る後、凍結乾燥して可溶性卵殻膜の粉末５３
ｇを得だ。そして、得られた可溶性卵殻膜の粉末９０μ
ｇを２ ｍｌの清水に溶解した後、１２１℃で１５分間
加熱して滅菌した。
次に、この水溶液を別に用意したポリスチレン製ペトリ
皿（直径３５朋）に加え、無菌的に風乾したところ、表
面が１０／１ｇ／Ｃｒ／Ｌ２の卵殻膜で被覆された細胞
培養用ペトリ皿が得られた。
皿（直径３５朋）に加え、無菌的に風乾したところ、表
面が１０／１ｇ／Ｃｒ／Ｌ２の卵殻膜で被覆された細胞
培養用ペトリ皿が得られた。
実施例５，
実施例３と同じ方法で得られた乾燥卵殻膜１００ｇに、
１Ｍ２−メルカプトエタノール水溶液５００ｍｌを加え
、ＰＨを９．５に調整した後、６０℃で４時間処理して
卵殻膜を可溶化した。
１Ｍ２−メルカプトエタノール水溶液５００ｍｌを加え
、ＰＨを９．５に調整した後、６０℃で４時間処理して
卵殻膜を可溶化した。
次に、この溶液を遠心分離（ ６０００ ｒ．ｐ．ｍ．
２ ０分間）して不溶物を除いた後、透析を行ない蛋
白質含量８係の溶液を得た。
２ ０分間）して不溶物を除いた後、透析を行ない蛋
白質含量８係の溶液を得た。
次に、別に用意したポリエチレンシ一ト（表面をプラズ
マ処理したもの）に、上記方法で得られた溶液を塗布し
、風乾したところ、表面に５μＩ／ｃｒｎ２の卵殻膜が
強く被覆された細胞培養用のシートが得られた。
マ処理したもの）に、上記方法で得られた溶液を塗布し
、風乾したところ、表面に５μＩ／ｃｒｎ２の卵殻膜が
強く被覆された細胞培養用のシートが得られた。
試験例１
実施例１で得られた卵殻膜の粉末２ｇを１６０℃で２時
間乾熱滅菌をした後、スビーナーフラスコに入れ、さら
に、このフラスコにダルベソコ変法イーグル培地（１０
係牛胎児血清含有）５０ｍｌを加え、３０分間攪拌して
卵殻膜粉末を膨潤させた。
間乾熱滅菌をした後、スビーナーフラスコに入れ、さら
に、このフラスコにダルベソコ変法イーグル培地（１０
係牛胎児血清含有）５０ｍｌを加え、３０分間攪拌して
卵殻膜粉末を膨潤させた。
次に、上記フラスコにヒト真皮由来線維芽細胞を４Ｘ１
０／ｍｌ分散させた培地（上記ダルベソコ変法イーグル
培地と同じ組成） ５ ０ ｍｌを加え、５０ｒ，ｐ．
ｍで２分間攪拌した後１時間静置した。その後、１時間
ごとに５ ０ ｒ．ｐ．ｍで２分間の攪拌操作を６回繰
り返し、而る後、５ ０ ｒ．ｐ．ｍで連続攪拌して、
３７商品名ｒ ＫＯＫＥＮ ＣＥＬＬＧＥＮ １ −
ｐｃＪ ）を用い、常法によって作成したマイクロキャ
リア（粒径２００μｍ）２Ｊを用い、テスト区と同じ試
験を行なった（対照区）。
０／ｍｌ分散させた培地（上記ダルベソコ変法イーグル
培地と同じ組成） ５ ０ ｍｌを加え、５０ｒ，ｐ．
ｍで２分間攪拌した後１時間静置した。その後、１時間
ごとに５ ０ ｒ．ｐ．ｍで２分間の攪拌操作を６回繰
り返し、而る後、５ ０ ｒ．ｐ．ｍで連続攪拌して、
３７商品名ｒ ＫＯＫＥＮ ＣＥＬＬＧＥＮ １ −
ｐｃＪ ）を用い、常法によって作成したマイクロキャ
リア（粒径２００μｍ）２Ｊを用い、テスト区と同じ試
験を行なった（対照区）。
そして、２日後、４日後、６日後の生細胞の数として用
いた場合、従来のマイクロキャリアと比べて遜色のない
細胞の増殖効果を有する。
いた場合、従来のマイクロキャリアと比べて遜色のない
細胞の増殖効果を有する。
表−１
尚、表中の数値は、培養液１ｍｌ当りの生細胞の数を示
す。
す。
試験例２．
実施例４で得られたベトリ皿にヒト真皮由来線維芽細胞
５．ＯＸ１０４／ｍｌを分離させたダルペッコ変法イー
グル培地４０係牛胎児血清含有）２ｍｌを加え、３７℃
で７日間培養した（テスト区）。
５．ＯＸ１０４／ｍｌを分離させたダルペッコ変法イー
グル培地４０係牛胎児血清含有）２ｍｌを加え、３７℃
で７日間培養した（テスト区）。
対照として、表面が未処理のポリスチレン製ベトリ皿（
対照区１）と、市販の精製コラーダン（■高研製、商品
名「ＫＯＫＥＮ ＣＥＬＬＧＥＮ １−ＰＣＪ ）を用
い、実施例４に準じて作成したコラーケ゛ン４ｆ＃−θ
（１０μ＃／ｃｍ２）ペトリ皿（対照区２）を用い上記
と同じテストをした。
対照区１）と、市販の精製コラーダン（■高研製、商品
名「ＫＯＫＥＮ ＣＥＬＬＧＥＮ １−ＰＣＪ ）を用
い、実施例４に準じて作成したコラーケ゛ン４ｆ＃−θ
（１０μ＃／ｃｍ２）ペトリ皿（対照区２）を用い上記
と同じテストをした。
そして、２日後、４日後、７日後の培養皿内全体の生細
胞の数を測定したところ、表−２の結果が得られた。
胞の数を測定したところ、表−２の結果が得られた。
表−２から明らかなように、卵殻膜を被覆したベトリ皿
は、従来のコラーグンを被覆したべトリ皿と比べて、遜
色のない細胞の増殖効果を有する。
は、従来のコラーグンを被覆したべトリ皿と比べて、遜
色のない細胞の増殖効果を有する。
表
試験例３，
災施例３で得られたマイクロキャリア２ｇをγ線で滅菌
した後、スピンナーフラスコに入れた。
した後、スピンナーフラスコに入れた。
次に、このフラスコにヒト真皮由来線維芽細胞２Ｘ１０
’／ｄを分散させたダルベソコ変法イーグル培地（１０
係牛胎児血清添加）１００ｍｌを加え、３ ０ ｒ．ｐ
．ｍを攪拌しながら、３５℃で６日間培養した。
’／ｄを分散させたダルベソコ変法イーグル培地（１０
係牛胎児血清添加）１００ｍｌを加え、３ ０ ｒ．ｐ
．ｍを攪拌しながら、３５℃で６日間培養した。
そして、２日後、４日後、６日後のフラスコ内全体の生
細胞の数を測定したところ表−３の結果が得られた。
細胞の数を測定したところ表−３の結果が得られた。
表−３から明らかなように、卵殻膜を担持させたマイク
ロキャリアは、γ線照射をしても細胞の接着性や増殖性
が低下せず、良好な増殖効果を有する。
ロキャリアは、γ線照射をしても細胞の接着性や増殖性
が低下せず、良好な増殖効果を有する。
表
尚、表中の数値は培地１ｍｌ当りの生細胞の数を示す。
以上述べたように、本発明の細胞培養用基材は、卵殻膜
を担体として成るので、特別な精製等の処尚、本発明の
細胞培養用基材は、円筒状に加工し、その内面に血管内
皮細胞を培養すればハイブリッド型人工血管に応用でき
、まだ、臓器状に加工しその内面で肝実質細胞を培養す
ればハイブリッド型人工肝臓に応用できる等、人工臓器
にも応用可能である。
を担体として成るので、特別な精製等の処尚、本発明の
細胞培養用基材は、円筒状に加工し、その内面に血管内
皮細胞を培養すればハイブリッド型人工血管に応用でき
、まだ、臓器状に加工しその内面で肝実質細胞を培養す
ればハイブリッド型人工肝臓に応用できる等、人工臓器
にも応用可能である。
ｔ＆、シリコーンやポリビニールアルコールのシートに
卵殻膜を担持させたものは、創傷被覆剤として応用可能
である。
卵殻膜を担持させたものは、創傷被覆剤として応用可能
である。
胞培養用基材と遜色のない培養効果を示す。
また、γ線殺菌をしても、卵殻膜は分解しないので、基
材を数時間で確実に滅菌させることができる。
材を数時間で確実に滅菌させることができる。
Claims (1)
- 卵殻膜を担体としてなることを特徴とする細胞培養用基
材。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1055225A JP2628536B2 (ja) | 1989-03-09 | 1989-03-09 | 細胞培養用基材 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1055225A JP2628536B2 (ja) | 1989-03-09 | 1989-03-09 | 細胞培養用基材 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5336796A Division JPH06254149A (ja) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | シート材 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02234670A true JPH02234670A (ja) | 1990-09-17 |
| JP2628536B2 JP2628536B2 (ja) | 1997-07-09 |
Family
ID=12992664
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1055225A Expired - Lifetime JP2628536B2 (ja) | 1989-03-09 | 1989-03-09 | 細胞培養用基材 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2628536B2 (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07246234A (ja) * | 1994-03-08 | 1995-09-26 | Q P Corp | シート材 |
| US20140294961A1 (en) * | 2013-03-27 | 2014-10-02 | ALMADO Inc. | Hepatic protection agent containing eggshell membrane and pharmaceutical composition, food additive and food using the same |
| US20140356450A1 (en) * | 2013-05-28 | 2014-12-04 | ALMADO Inc. | Agent for activating sirtuin gene containing egg shell membrane ingredient and composition using the same |
| US20140363519A1 (en) * | 2013-06-11 | 2014-12-11 | The University Of Tokyo | Activator of gene expression of molecular chaperone gene comprising eggshell membrane component and composition thereof |
| US20150150916A1 (en) * | 2013-11-29 | 2015-06-04 | The University Of Tokyo | Insulin resistance-improving agent containing eggshell membrane component, and composition using the same |
| CN107890581A (zh) * | 2017-01-01 | 2018-04-10 | 史英 | 人体伤口治疗膜 |
| CN115595288A (zh) * | 2022-11-28 | 2023-01-13 | 深圳市脉唐生物科技有限公司（Cn） | 一种用于细胞培养的微载体及其制备方法 |
-
1989
- 1989-03-09 JP JP1055225A patent/JP2628536B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| EXPERIENTIA=1983 * |
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| CN115595288A (zh) * | 2022-11-28 | 2023-01-13 | 深圳市脉唐生物科技有限公司（Cn） | 一种用于细胞培养的微载体及其制备方法 |
| CN115595288B (zh) * | 2022-11-28 | 2023-03-31 | 深圳市脉唐生物科技有限公司 | 一种用于细胞培养的微载体及其制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2628536B2 (ja) | 1997-07-09 |
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