JPH069508B2

JPH069508B2 - 筋細胞の培養の方法

Info

Publication number: JPH069508B2
Application number: JP59170326A
Authority: JP
Inventors: グラハムマレツトウイリアム; ジヨセフキグレイ，ジユニアハーバート
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1983-08-15
Filing date: 1984-08-15
Publication date: 1994-02-09
Anticipated expiration: 2009-02-09
Also published as: JPS6062979A; MX7531E; GB2145114A; US4605623A; GB2145114B; CA1215013A; GB8411880D0

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、細胞培養若しくは組織培養において、成長発
育を変え、かつ、微生物による汚染を抑制しうる方法に
関する。

（本発明の背景）本発明は、１９８２年１１月８日出願の米国特許出願番
号440,039号の一部改良に係るものである。この先願に
おいては、線維増殖の抑制方法、並びに組織の成長及び
創傷組織の分化を促進する方法に関して開示している。

この先願を行なってから、本出願人は、キトーサンが、
線維増殖の抑制に使用でき、かつ、組織の成長、および
組織培養における分化を促進するべく使用できることを
発見した。

細胞培養若しくは組織培養は、未分化新生物の成長パタ
ーンを研究するため、また、細胞代謝における基礎研究
に、長年用いられてきた。最近、製薬材料をつくるため
に、大規模な細胞培養技術が使われている。このような
細胞培養の成長または分化を刺激するべく用いられてい
る方法は、これら生物学的生産物の収率とか組成に悪い
影響を与える。

大部分の組織培養は、２次元構造の容器の底部若しくは
側部において、単一層で成長するか、培地中で、個々に
懸濁して成長している細胞として成長する。３次元的組
織培養は、コラーゲン（蛋白質）ゲルの形で報告されて
いる。複合細胞を３次元的に増殖することは、移植に対
する組織を成長させる可能性を高める。

微生物、特にバクテリア及びマイコプラズマ(mycoplasm
a)は、細胞培養倍地の中で増殖できる。培養の汚染を予
防的に抑制するため、通常、高濃度の抗生物質が用いら
れている。この抗生物質は、調査の対象となっている組
織の成長発育を妨害する。

多くの場合、ひどく汚染された細胞培養は、排除しなけ
ればならず、そのため、大変な時間と材料が無駄にな
る。

本発明の第１の目的は、特定の細胞の成長および分化を
高め、かつ選択的に低下させ、また場合によっては変え
るべく、組織培養若しくは細胞培養を処理する方法を提
供することにある。

本発明の第２の目的は、培養容器若しくは培地を処理
し、非蛋白性をマトリックスにおける組織の３次元的成
長を維持するための方法を提供することにある。

本発明の第３の目的は、微生物によって細胞培養の汚染
を抑制しうる方法を提供することにある。

以上に述べた目的、およびそれ以外の目的は、以下の説
明により当業者であれば理解できることと思う。

（本発明の要約）組織培養の成長及び発育を変えるための方法は、(1)組
織の３次元的成長に対して、非蛋白性マトリックスを供
給する段階と、(2)キトーサン若しくはその誘導体を細
胞培養に接触させることによって、微生物の汚染を防止
若しくは抑制する段階とから成っている。

本発明に用いられるキトーサンは、10,000乃至2,055,00
0の分子量を有する約４５％乃至１００％脱アセチル化
物である。キトーサンは、溶液状若しくは固体状にあり
得る。

（好適実施例）キトーサンに関する研究において、止血時や生体内組織
の成長分化時に、脈管移植片周囲のキトーサン層の中の
にできた未分化細胞が、急速に成長することを観察し
た。驚いたことに、細胞は、予期に反し、コラーゲン繊
維組織よりは、むしろ平滑筋の中へ発育していた。そこ
で、組織培養における細胞の成長及び分化に関するキト
ーサンの効果について調べることにした。

心臓の筋肉細胞を成長させるため、ヤッフェ(Yaffe)の
方法〔ヤッフェ・デイー(Yaffe,D.)、「ラットの骨格筋
細胞」−Tissue Culture，Methods and Application，1
973版、発行者：クルーズ及びパターソン（Kruse and P
atterson)、発行所：Academic Press,p. 106〜114〕に
よって、機能的で、かつ基準的な細胞培養標本を作成し
た。この組織培養標本と、米国特許第4,394,373号明細
書、並びに本発明に関連を有する米国特許出願第440,03
9明細書に記載されている方法によって調製された無菌
のキトーサン止血溶液とを用いて、実験を行なった。

実験Ｉ新生児のスプレイグ・ドーリー(Neonatal Sprague Dawl
ey)・ラットを使用した。頭部を滅菌鋏で切除し、体部
を７０％エタノールに浸けた。滅菌鋏を用いて、心臓を
取り出し、次にそれを、９０．８mlの遊離性カルシウム
及びマグネシウムの入ったリン酸緩衝セーライン（以
下、ＰＢＳ−ＣＭＦと略す）、５mlをの胎児の牛の血清
（以下、ＦＢＳと略す）、１ml当り10,000単位のペニシ
リンと10,000μｇのストレプトマイシンを含有する２ml
の溶液（以下、ＰＳと略す）、１ml当り２５０μｇを含
有する２mlのアンホテリシンＢ（以下、ＡＢと略す）、
並びに１０mg／mlのゲンタマイシンを含有する２mlの溶
液（以下、ＧＮＴと略す）が入った試験管に移した。

新生児の心臓を、室温になっている抗生物質溶液に入れ
て、動物室から組織培養実験室へ運んだ。３０分以内
に、その心臓を、ＰＢＳ−ＣＭＦの入った１０ml滅菌ペ
トリ皿へ移し、清浄な溶液で２回洗浄した。心臓部を、
心房によって支え、心室を小片に分割し、次に、滅菌刃
を用いて細かく切断した。

１０mlの細分された心室筋肉を、５mlの2.5%トリプシン
溶液を加えた４５mlのＰＢＳ−ＣＭＦが入ったコニカル
チューブに移した。この懸濁液を、毎分１００回転する
回転ミキサーで、３７℃に保ち２時間かけて培養した。
各試験管に、１６mlのダルベッコの改良型イーグル培地
〔Dulbcco's Modified Eagle Medium〕（以下、ＤＭＥ
Ｍと略す）と４mlのＦＢＳを加えた。

懸濁液を完全に混合し、試験管を真直ぐに立てて置い
た。５mlのＦＢＳを、試験管の底部で層になるよう注意
深く加え、１０分間残渣物を沈澱させた。残渣物層の上
方にある細胞懸濁液を注意深く取り分け、１５００rpm
で１０分間遠心分離した。

細胞ペレットを８７．８％のＤＭＥＭ、１０％のＦＥ
Ｓ、１％のＰＳ、１％のＡＢ、および０．２％のＧＮＴ
が入ったものの中へ再懸濁させ、１０mlの培養皿で２時
間平板培養した。懸濁液中に、筋肉細胞を残して、殆ん
ど不要な繊維芽細胞は、この第１の培養平板にしっかり
付着した。

次に、細胞の濃度を測定し、３５mm培養皿につき、１０
０万の細胞が含まれた懸濁液を平板培養した。５％の二
酸化炭素に富んだ空気を充たし、温度を３７℃にして平
板を培養した。

古い培地を流し去り、２日目に新鮮な培地を加えた後、
平板培養し、その後２日ごとにそれを繰り返した。

調整のため加えられる培地は、８７．８mlのＤＭＥＭ、
１０mlのＦＢＳ、１mlのＰＳ、１mlのＡＢおよび０．２
mlのＧＮＴが含まれた混合物とした。

実験室におけるこの方法ではラットの心臓筋肉の成長発
育について、他の実験も含め１００以上の平板培養に関
し測定した。

殆んどの筋肉細胞は、２４時間乃至４８時間のあいだに
倒潰し、それから平板培養される。４日乃至５日のうち
に、筋肉管（myotubes）が平板の縁部周辺にでき始め
る。７日乃至１０日の間に、収縮中央部が形成される。
平板は、１４日間の成長によって被覆される。１５日目
には、平板の全面にわたって均一な収縮ができ始める。

キトーサンによる最初の実験では、通常の方法で、筋肉
細胞を平板培養した。栄養溶液は、前述の栄養溶液９０
mlに、好適なキトーサン止血溶液（０．０２６Ｎ酢酸中
に、２ｍｇ／mlのキトーサン薄片、若しくはその粉末を
含んだ）１０mlを加えて調製した。

３５mm平板には、各栄養補給に、新鮮な溶液約５mlを必
要とした。１日後、平板の底部で筋肉細胞を覆っている
キトーサン層が、はっきり現われた。

キトーサンは、平板及び筋肉細胞に付着、そのため、栄
養溶液の取り替えによって、古いキトーサンを完全に注
ぎ出せなかった。平板上のキトーサン濃度は、各溶液の
取り替えとともに増大している。

キトーサンによって処理された２０個の平板を観察する
と、筋肉管は、２日乃至３日で形成された。収縮中央部
は、４日乃至５日で形成された。平板は、９日間の成長
によって覆われた。表面の単一な収縮は、１０日目に始
まった。

個々の筋肉細胞が、ガラスとの接触による分裂細胞か
ら、キトーサン層の中へ上げられ、かつ、成長と分裂を
続けていることが、際立って観測された。１４日目まで
に、平板上の病巣には、一定の３次元的成長パターンを
もっているものがあった。

層状細胞は、機能的かつ３次元的な心臓組織のように、
下方の細胞と一致した摶動を打っている。対照平板に
は、近接成長によって接触面から掻き取られている個体
細胞が良く見られた。

それらは、栄養溶液中の球形をしており、しかも、表面
接触がないと成長もしない作用もしない。培地中のキト
ーサン繊維は、筋肉細胞に成長を続けさせ、かつ作用を
続けさせるべく、十分な「表面」接触を明確に提供して
いた。

このようなキトーサン表面は、容器中での表面接触成長
層を増大させるため、底部及び側部につけられるか、溶
液中に懸濁しているビーズ状物につけられる。

実験II 同一の細胞懸濁液の分割試料を用い、対照培養とキトー
サン処理培養の調製を繰り返し行ない、成長速度および
発育において観察された差異が、対照平板とキトーサン
平板とにおける細胞の違いによって生じた結果でないと
いうことを確証した。

これまでの観測によると、ラットの心臓筋肉細胞は、細
胞密度が高いとより速く成長した。２０個の平板に対す
る対照実験は、それぞれ同じ結果を生み、キトーサン処
理培養の成長発育がより早いことを確認した。真性「組
織」の３次元的成長を再び見ることができた。

実験III 濃度を変え実験を行なった。５０％のキトーサン止血溶
液に、５０％の通常の栄養溶液（１００mlの栄養溶液当
り、１００mgのキトーサンを含む）を加えた栄養溶液の
添加によって、厚いキトーサン・ゲル層の下における通
常の成長発育より遅い結果が得られた。

３次元的成長が、３０日間維持された平板に見られた。
繊維芽細胞は、この濃度では成長しなかった。それぞ
れ、１００ml当りキトーサンを１０mg含んだ栄養溶液
と、５mg含んだ栄養溶液は、電子顕微鏡によって調べた
筋肉細胞表面に付着しているキトーサン繊維により、大
きな成長発育速度を示した。しかし、３次元的成長は、
あまり顕著でなかった。

実験IV ８個の培養において、４５％の脱アセチル化キトーサン
溶液は、栄養溶液と混合した際に、厚くて、しかもはっ
きりしたゲル層を生じた。しかし、細胞成長は、対照に
比較して遅れていた。

平均的に低分子量（低粘度）の１００％脱アセチル化ポ
リグルコサミンは、２０mg／mlの濃度で筋肉細胞に付着
したが、大部分は、キトーサン粒子として、液体中に懸
濁状になっており、明確なゲル層を形成しなかった。成
長発育速度は、ポリグルコサミンによって高まったが、
３次元的成長は、７個の培養において、顕著でなかっ
た。

実験Ｖ人の繊維芽細胞の純粋培養を行なった。１００mlの栄養
溶液当り２０mgのキトーサンが含まれる濃度を有するキ
トーサン止血溶液を添加することよって、通常の栄養溶
液より速い成長が得られた。互いい垂直に交錯した繊維
芽細胞を有する３次元的成長が現われ、繊維芽細胞の編
み目状マットを生じた。栄養溶液中のキトーサン濃度が
高いと、繊維芽細胞の成長が抑制された。

ラットの繊維芽細胞と筋肉細胞の混合培養によって分か
ったことは、栄養溶液１００ml当たり３０mgのキトーサ
ンが含まれる濃度で、筋肉細胞の成長は続行可能である
一方、繊維芽細胞を抑制していた。最終的に、平板、９
５％の筋肉細胞と５％の繊維芽細胞で覆われた。

実験VI １００ml当り２０mgのキトーサンを含んだ栄養溶液５ml
を用いて、８個の平板を前処理し、平板の表面を覆うゲ
ル層を作った。

このキトーサン・ゲルに加えられた筋肉細胞は、倒潰の
仕方が可成りゆっくりであったが、細胞分裂と細胞増殖
速度は非常に大きかった。

平板を前処理したものに、更に、好適なキトーサンアセ
テート溶液５mlを加えて実験を続け、デシケーター中
で、それを蒸発乾燥させた。平板の底部及び側部には、
乾燥キトーサンアセテートの薄い透明膜が被覆されてい
るのが見られた。キトーサンを含まない標準細胞懸濁液
状の筋肉細胞を、これらの平板上、および対照平板上に
置いた。１６時間で、対照筋肉細胞の２５％は、倒潰
し、それらの形状が変化し始め、いつもの通り、その約
１０％が分裂中であった。

キトーサン被覆平板上では、細胞の１０％だけが倒潰し
てしまっていたが、これら筋肉細胞の９０％が分裂中で
あった。第３日目に、細胞分裂の早いものは、キトーサ
ンと栄養溶液の境界部分に筋肉細胞の堆積層を生じてい
た。幅の３倍程度に伸びた細胞のうちいくらかは鼓動を
開始した。

栄養溶液を２回取り変えてから、第６日目に、大部分の
膜は、洗い落されていたが、堆積し、かつ鼓動を打って
いる筋肉細胞の島が、平板にへばりついていたキトーサ
ンの病巣部に残っていた。

５０％のラット筋肉細胞と、５０％のラット繊維芽細胞
の混合培養を、キトーサン被覆平板に付けて分かったこ
とは、１０％の筋肉細胞が１６時間に積層したが、繊維
芽細胞は全く積層していなかったことである。これは、
繊維芽細胞が、筋肉細胞より相当に早く積層してい、筋
肉細胞が表面に達することを阻止している対照混合細胞
培養と大幅に異なることである。６日目まで、鼓動を打
っている筋肉細胞の島は、平板上に残った。

繊維芽細胞は、死んでしまっていたか、または、取り変
えられた栄養溶液によって、平板から洗い落とされてし
まっていたかである。

実験VII 凍結乾燥されたキトーサンアセテート繊維によって覆わ
れた平板は、細胞の平板培養を受容でき、かつ急速成長
を刺激しうる同じ能力を示した。栄養溶液により予め湿
すことによって、細胞懸濁液を固形キトーサン繊維に直
接注いで得られたものより、積層が早く生じ、存在細胞
が多かった。

平板を被覆する前に、いろいろ取り変えられる栄養溶液
に対してキトーサンを透析すると、平板培養された懸濁
液から得られる生存細胞数を高めることができた。

実験VIII 間隔は一定しないが、通常、春には、ラットの子供の組
織の培養は、標準培地において、ペニシリン、ストレプ
トマイシン、アンホテリシンＢおよびゲンタマイシンの
存在下で繁殖しうるマイコプラズマ（mycolasma）によ
って新たに汚染される。このような組織培養は、普通捨
てられる。

数匹の雌の飼育ラットは、子孫にまで広まる慢性マイコ
プラズマ感染により死んでしまった。

実験IIを行なっている際に、いくつかの平板は、平板培
養後２日経ち（第１回の栄養溶液を取り変える直前）、
マイコプラズマによる全体的汚染によって、顕微鏡の下
で培地が激しい運動をしているのが分かった。

微生物の存在に拘わらず、流体の上澄みを注ぎ、キトー
サンを含有する栄養溶液を、汚染された平板に加えた。
顕微鏡によって観察すると、キトーサンを加えた平板で
は全ての動きが止まっていた。

筋肉の細胞は、予期した通り、次の３０日にわたって、
検出しうるマイコプラズマ侵入の再発もなく成長発育し
た。汚染された胎児組織を用い慎重に平板培養された２
４個の平板は、２日でマイコプラズマによる全体汚染を
確認し、引き続いて平板培養した。

半分に対して、１００ml当り２０mgのキトーサンを含有
する栄養溶液を加えた。４倍量の標準抗生物質溶液を加
えられた汚染平板は、筋肉細胞の死亡を死し、一方、キ
トーサンが加えられた平板は、汚染されておらず、しか
もキトーサンで処理された組織培養と同じ位成長発育し
た。

実験IX ８個の一連の平板は、平板培養後２日でマイコプラズマ
およびバクテリアで汚染されていた。４個の平板を、１
００ml当り２０mgのキトーサンが含まれた溶液で処理す
ることで、通常の成長発育を可能にした。４個の未処理
平板上の筋肉細胞は、混濁培地中で死んだ。

実験Ｘ他の研究所の研究者から、汚染された２つのマイコプラ
ズマを分けてもらった。一方は、汚染された新生児の牛
の組織で、他方は、汚染された新生児の犬の組織であっ
た。

犬のマイコプラズマは、本出願人による標準的栄養溶液
中でよく成長したが、対照培養では破壊された。牛のマ
イコプラズマは、標準的栄養溶液が加えられた本出願人
による対照培養中で抑制されながら、ゆっくり増殖して
いった。

いずれも、栄養溶液にキトーサンを加えることによっ
て、マイコプラズマを消失させ、かつ、組織培養の通常
の成長発育を可能にした。

標準的な臨床微生物実験室において、ピー・ピー・エル
・オー（ＰＰＬＯ）培地でマイコプラズマを成長させる
ことができ、しかも、微生物が、エム・ホミニス（Ｍ．
hominis）でも、また、エム・ニューモニアエ(M.pneumo
niae)でもなく、しかも、ユー・ユーリアリティキュム
(U.urealyticum)でもないことを決定できた。従って、
それらを、ラット、犬または牛に起源を発するマイコプ
ラズマ種と呼ぶことにした。

以上行なった実験Ｉ乃至Ｘを通して結論をまとめると、
本発明によるキトーサンは、細胞培養の成長発育を変
え、組織の３次元的成長に対して、非蛋白性マトリック
スを提供でき、しかも、組織細胞における微生物による
汚染を抑制できる。

本発明による方法によれば、前に述べた目的のすべてを
達成することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ハーバートジヨセフキグレイ，ジユニアアメリカ合衆国ネブラスカ州オマハモツキングバードドライブ9511

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ミオサイト（筋細胞）の３次元成長を可能
にするに十分な量の、そして、繊維芽細胞、腫瘍細胞、
マイコプラズマ及びバクテリアを含有する培養媒体中
で、特定の望ましくない細胞を抑制するに十分な量の水
性キトーサン溶液を含有する培養媒体中で、筋細胞を生
長せしめ、そのキトーサン源は、ポリグルコサミン或い
は室温で本質的に水溶性のキトーサン塩から選択したキ
トーサン誘導体であることを特徴とする懸濁液中での筋
細胞の培養の方法。
【請求項２】前記のキトーサン誘導体は、該媒体中に溶
解せしめ、該液体媒体の成分であることを特徴とする特
許請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】前記キトーサン誘導体は、固体形である特
許請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項４】前記キトーサン誘導体は、該媒体又は細胞
を、培養容器に適用する前に、培養溶液に、適用される
ことを特徴とする特許請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項５】前記キトーサン誘導体は、フィルムである
特許請求の範囲第４項記載の方法。
【請求項６】前記キトーサン誘導体は、シートである特
許請求の範囲第４項記載の方法。
【請求項７】前記キトーサン誘導体は、繊維形である特
許請求の範囲第４項記載の方法。
【請求項８】前記キトーサン誘導体は、粉末である特許
請求の範囲第４項記載の方法。
【請求項９】前記シート誘導体は、マットに形成された
ものである特許請求の範囲第６項記載の方法。
【請求項１０】前記キトーサン誘導体は、供給溶液中に
入れられ、古い媒体がデカント或いは吸引される毎に、
添加されることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
の方法。
【請求項１１】前記キトーサン誘導体は、分子量１０，
０００〜２，０５５，０００を有する脱アセチル化キチ
ンである特許請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項１２】前記キトーサン誘導体は、４５％〜１０
０％脱アセチル化されたものである特許請求の範囲第１
１項記載の方法。