JPH02234687A - 発酵法によるｎ―アセチル―ｌ―トリプトファンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は発酵法によるＮ−アセチル−Ｌ−｝！Ｊプトフ
ァン（以下、アセチルトリプトファンと称す）の製造法
に関する。

アセチルトリプトファンは飼料添加物、輸液用等として
有用である。

従来の技術 アセチルトリプトファンはトリプトファンをアセチル化
する方法〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　　１４４　　，１９３（１９４
２）　〕、ａ一力ルボキシ−ＤＬ−アセチルトリプトフ
ァンを脱炭酸する方法、アセトアミドーＴ−ホルミル醋
酸をフェニルヒドラジンと反応させる方法（特開昭４８
−１４６６１号公報）等で得られたＮ−アセチル−ＤＬ
−トリプトファンをラセミ分割することにより得られる
。

従来の方法は合成法であり、発酵法でアセチルトリプト
ファンを得る方法は知られていない。

発明が解決しようとする課題 アセチルトリプトファンを発酵法で安価に収率よく得る
方法が求められている。

課題を解決するための手段 本発明はミクロコッカス属に属し、アセチルトリプトフ
ァン生産能を有する微生物を培地に培養し、培養物中に
アセチルトリブトファンを生成蓄積させ、該培養物より
アセチルトリプトファンを採取することを特徴とする発
酵法によるアセチルトリプトファンの製造法を提供する
。

本発明に用いる微生物止しては、ミクロコッカス属に属
し、アセチルトリブトファン生産能を有する微生物であ
ればいずれもよい。好ましくはトリプトファンアナログ
耐性微生物が用いられる。

具体例としミクロコッカス・バリアンス（　Ｍｉｃｒｏ
ｃｏｃｃｕｓ　　ｖａｒｉａｎｓ　）＾ＴＣＣ　３９９
　、好ましくはミクロコッカス・バリアンス８０−１７
１−９５　（５　−メチルトリプトファン耐性）（Ｆ［
！ＲＭ　ＢＰ−２２５５）　（以下、ＦＢＲＭ　ＢＰ−
２２５５と称す）等が挙げられる。

次に、ＦＯＲＭ　ＢＰ−２２５５を得る具体例を説明す
る。

ミクロコッカス・バリアンスＡＴＣＣ　３９９の細胞を
トリスーマレート緩衝液（ｐＨ６．０）に１０１１個／
ｍｌになるよう懸濁した後、該懸濁液にＮ−メチルーＮ
′一ニトローＮ−ニトロングアニヂンを最終濃度で２ｍ
ｇ／ｍＩ！になるように添加し、室温で２０分間、処理
した。

処理した菌体を生理食塩水で３回洗浄し、再び生理食塩
水で懸濁後、懸濁液または生理食塩水で希釈した液を０
．　１　ｍｌ２づつ、５−メチルトリブトファンを１ｍ
ｇ／一含む最少培地（グルコース１０ｇ／Ｉ！，ガザミ
ノ酸５ｇ／β、リン酸アンモニウム１ｇ／１、塩化カリ
ウム０．２ｇ／Ｒ，硫酸マグネシウム０．２ｇ／Ｉｔ，
ピオチン５　０　ｒ／Ｉｌ，ビタミンＢ＋１０ｍｇ／１
、微量金属液１ｒｄｌ／１、寒天２０ｇ／１、ｐ　Ｈ　
７．　０　）に塗抹した。

３０℃で４日間培養後、出現してきたコロニを５−メチ
ルトリブトファン耐性株として取得し、発酵培地（グル
コース１００ｇ／ｊ！、リン酸一カリウム１ｇｌｌｌ，
　リン酸二カリウムＩｇ／ｊ！，硫酸マグネシウム・７
水塩０．５ｇ／ｊ’，硫酸アンモニウム２０ｇ／ｊ！，
コーンスチーブリ力−３０ｇ／Ｃｐ　Ｈ　７．　Ｏ　）
で試験管培養及びジャー培養で親株よリアセチルトリプ
トファン生産能が向上した変異株を８０−１７１−９５
として選択した。この菌株は平成元年１月２４日付で工
業技術院微生物工業技術研究所にＦＯＲＭ　ＯＰ−２２
５５として寄託されている。

本発明に用いる培地としては、炭素源、窒素源、無機塩
、生育因子等を程よく含有する培地ならば、合成培地又
は天然培地のいずれでもよい。

炭素源としては、グルコース、マルトース、シークロー
ス、廃糖蜜、デンブン、セルロースの分解物等の炭水化
物、酢酸、フマール酸、リンゴ酸等の有機酸、ｎ−パラ
フィン等が用いられる。

窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、硝酸
アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム
、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸
、コーンスチーブリ力等が用いられる。

無機塩としては、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム
、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄
、硫酸マンガン、塩化ナトリウム等が用いられる。

生育因子としては、ビタミン（例えば、ビオチン、チア
ミン、ニコチン酸、パントテン酸）等が用いられる。

さらに、培地にインドールを添加することによリアセチ
ルトリブトファンの生成量を著しく向上させることがで
きる。添加するインドールの量は培養液中に１％以下が
望ましい。

培養は振盪培養、通気攪拌培養等の好気的条件下で行う
。培養温度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃で
ある。培地のｐＨは５〜９、好ましくは中性付近に保持
する。培地のｐＨｌｆｉｌ整は炭酸カルシウム、無機ま
たは有機の酸、アルカリ溶液、アンモニア、ｐＨ緩衝剤
等によって行う。

培養期間は通常２４〜１５０時間で、培養物中にアセチ
ルトリブトファンが生成蓄積する。

培養液中に生成したアセチルトリプトファンの単離は、
培養終了後、培養液から菌体等の沈殿物を遠心分離等で
除去した後、イオン交換、濃縮、吸着、抽出等の方法を
用いることにより、上清液からアセチルトリプトファン
を回収することができる。

以下に実施例を示す。実施例中、アセチルトリブトファ
ンの定量は高速液体クロマトグラフィーにより行った。

実施例１ グルコース３０ｇ／Ｉｌ，ペプトン１０ｇ／Ｃ酵母エキ
ス５ｇ／Ｉｌ及び塩化ナトリウム２．５ｇ／ｊ！の組成
から成る液体培地（ｐＨ７．０）　３　０　０ｍｉ！を
含む２ｌフラスコにＦＢＲＭ　ＢＰ−２２５５を接種し
、３０℃で１６時間振盪培養した。その後、培養液全量
を後記組成の発酵培地２．　７　Ａを含む５ｌジャーフ
アーメンターに入れ、ｌｖ，ｖ，ｍ　，　　６　０　０
ｒ，ｐ，ｍで通気攪拌培養した。培養温度は３０℃に、
ｐＨは１４％アンモニア水で調整した。

発酵培地組成 グルコース　　　　　　　　　１００ｇ／Ｊ！リン酸一
カリウム−　　　　　　　　１８／１リン酸二カリウム
　　　　　　　　　１ｇ／１硫酸マグネシウム・７水塩
　　　０．５ｇ／Ｉｔ硫酸アンモニウム　　　　　　　
２０ｇ／βコーンスチーブリ力−　　　　　３０ｇ／Ｉ
！ｐ　Ｈ　　　　　　　　　　　　　　７．　０培養開
始５０時間以降、グルコースが消費された時点で培養液
中１０〜３０ｇ／１の範囲になるようにグルコースを逐
次添加し、１２２時間培養した後の培養液中のアセチル
｝　ＩＪブトファン濃度は１．７ｇ／Ａであった。

実施例２ 実施例１と同様な方法で得た種培養液を実施例１と同じ
発酵培地組成を含む５βジャーフアーメンターに入れた
。培養開始２８時間以降培養液中のインドール濃度が０
，１％以内になるようにインドールの５０％エタノール
溶液を逐次添加しながら１２２時間培養した。培養終了
後、培養液中のアセチル｝　ＩＪブトファン濃度は４、
３　ｇ／ｊｌ！であった。

培養液を遠心分離して菌体を除いた上演を液量３分の１
に濃縮し、疎水性吸着樹脂〔ダイヤイオンＳＰ２０７、
三菱化成■製〕を充填したカラムに通液し、３０％メタ
ノールで溶出した。溶出液を陽イオン交換樹脂〔ダウエ
ックス５０Ｗ、三菱化成＠製〕に通液し、アセチルトリ
プトファンに相当する両分を採取した後濃縮し、アセチ
ル｝　Ｕブトファンの結晶１　１．　５　ｇを得た。

発明の効果 本発明方法によりアセチルトリブトファンを安価に収率
よく得ることができる。

特許出願人　（１０２）協和醗酵工業株式会社代表者　
　加　藤　幹　夫

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ミクロコッカス属に属し、Ｎ−アセチル−Ｌ−トリプト
   ファン生産能を有する微生物を培地に培養し、培養物中
   にＮ−アセチル−Ｌ−トリプトファンを生成蓄積させ、
   該培養物よりＮ−アセチル−Ｌ−トリプトファンを採取
   することを特徴とする発酵法によるＮ−アセチル−Ｌ−
   トリプトファンの製造法。