JPS6262156B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は醗酵法によるＬ―トリプトフアンの製
造法に関し、特に、バチルス・ズブチリスの５―
フルオロトリプトフアン及び８―アザグアニンに
耐性を有し、Ｌ―トリプトフアン生産能を有する
変異株を用い、通常の栄養培地に前駆物質として
アントラニル酸を添加し好気的に培養することに
よりＬ―トリプトフアンを生成蓄積せしめ、これ
を採取することを特徴とする方法に関する。

細菌、放線菌、酵母、糸状菌など種々のＬ―ト
リプトフアン生産能を有する微生物を培地に培養
し、生成蓄積したＬ―トリプトフアンを採取する
方法については従来良く知られており、生産性の
高い微生物の発見や５―メチルトリプトフアン、
５―フルオロトリプトフアン、６―フルオロトリ
プトフアン等のようなトリプトフアンのアナログ
体に耐性を有する変異株の使用或いは通常の栄養
培地に前駆物質としてアントラニル酸やインドー
ルを添加する方法等種々の改良が試みられてい
る。しかし、従来公知の方法ではトリプトフアン
の培地中の蓄積速度が遅く、また消費された炭素
源（糖類）に対する収率も低い等の難点があり工
業的な製造法として満足すべきものとは言い難
い。

本発明者らは醗酵法によるＬ―トリプトフアン
の製造法に於いて上記の如き難点を克服し工業上
有利に実施し得る方法を開発すべく種々研究の結
果、バチルス・ズブチリスの５―フルオロトリプ
トフアン耐性変異株から更に８―アザグアニン耐
性を有する変異株を誘導採取し、この菌株をアン
トラニル酸を添加した培地中に培養したところ、
トリプトフアンの蓄積速度及び消費糖当りの収率
が大巾に向上することを見出し、本発明の方法を
完成するに至つた。

以下、本発明のトリプトフアンの製造法につい
て更に詳細に説明する。

この発明に於いて使用するバチルス・ズブチリ
スの５―フルオロトリプトフアン及び８―アザグ
アニンに耐性を有する変異株はバチルス・ズブチ
リスの既知の菌株、例えば、バチルス・ズブチリ
スIAM―1026に常法により紫外線又はＸ線の照
射、アクリジンオレンジ又はニトロソグアニジン
等の添加などの人工的突然変異誘発処理を行い、
これを５―フルオロトリプトフアンを最低阻止濃
度（MIC）以上含んだ培地で培養して生有した菌
（コロニー）を分離し、各菌株についてトリプト
フアン生産能を試験し、最も生産性の高い菌株を
選択し、再びこれを上記と同様の処理にかけ、こ
の操作を数回繰返して得たバチルス・ズブチリス
の５―フルオロトリプトフアン耐性変異株（バチ
ルス・ズブチリスSD―９、微工研菌寄第1483号
特開昭49−20391）に更に、上記と同様の人工的
突然変異誘発処理、８―アザグアニンをMIC以上
に含んだ培地での培養、生育した菌の分離、生産
能の高い菌の選択を数回繰返し、実質的に、５―
フルオロトリプトフアン及び８―アザグアニンに
対し、それぞれ5000PPm及び1000PPm以上の耐
性を付与したもので、バチルス・ズブチリスSD
―10と称する。（微工研微生物受託番号第5545
号）。

本発明の方法を実施するには前記したバチル
ス・ズブチリスSD―10を炭素源、窒素源、無機
塩等を含む培地でアントラニル酸を添加しつつ好
気的に培養することにより行われる。炭素源とし
てはブドウ糖、糖密、庶糖、デン粉、デン粉糖化
液、セルロース分解物などの糖類、酢酸などの有
機酸、エタノールなどのアルコール等菌が資化し
得るものであれば特に制限はなく、また、窒素源
としてはアンモニア、硫安、塩安、硝安、燐安な
どのアンモニウム塩や尿素、硝酸塩等が適宜用い
られる。無機塩としては燐酸、カリウム、マグネ
シウム、鉄、マンガン等の塩類例えば、燐酸アン
モニウム、燐酸カリ、硫酸カリ、苛性カリ、硫酸
マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン等の通
常の工業用薬品で良く、他に微量元素としてカル
シウム、ナトリウム、亜鉛、硼素、銅、コバル
ト、モリブデン等の塩類を加えても良い。また微
量有機栄養素としてビタミン、アミノ酸等は菌の
生育上は特別に必要とするものはないが、これら
を添加したり、コーンスチープリカー、肉エキ
ス、酵母エキス、ペプトン、等の有機物を加えて
も良い。アントラニル酸はソーダ塩、またはカリ
ウム塩の水溶液や、遊離酸のエチルアルコールま
たアセトン溶液として添加すれば良い。

培養は振とう培養、通気撹拌培養等の好気的条
件下で行なうが、培養温度は25〜45℃PHは5.0〜
9.0、好ましくは６〜８の範囲が至適である。ア
ントラニル酸の添加方法は培地中の濃度が阻害濃
度以上にならないよう、高くとも0.1％以下にな
るように、培養初期から間けつ的若しくは連続的
に添加するか何れでもよい。

ただ、培地中のアントラニル酸の濃度が高くな
ると余り高濃度の場合は別として菌の生育自体に
は余り影響はないが、トリプトフアンの合成が著
しく阻害されるため、その培地中での蓄積及び一
時的な濃度の増加を避けるため消費速度に合せて
連続的に添加する方法が好ましい。また、本発明
の前記耐性変異株の場合、アントラニル酸を添加
しない場合でも菌体は正常に増殖するがＬ―トリ
プトフアンの蓄積は実質的には殆ど認められな
い。

培養終了後の培養液からのトリプトフアンの単
離は常法によつて行えば良い。

以下に本発明の方法について代表的な例を示し
更に具体的に説明するが、これらは本発明の方法
についての理解を容易にするための単なる例示で
あり、本発明はこれらの例のみに限定されないこ
とは勿論のこと、これらによつて何ら制限されな
いことは言うまでもない。

実施例 １ 下記組成の液体培地２を５のジヤーフアー
メンターに入れ115℃15分間加熱滅菌した。あら
かじめ、ブイヨン培地に30℃で12時間振盪培養し
た、バチルス・ズブチリスSD―10（微工研微生
物受託番号第5545号）を上記培養槽に５％接種し
て、35℃で溶存酸素量を0.5ppm以上に保つよう
にしながら通気撹拌培養を行なう。５％のアント
ラニル酸ソーダ塩溶液を培養液中のアントラニル
酸の濃度が阻害濃度以下になるように連続的に添
加し、培養液のPHを7.0に保ちつつ30時間培養す
ることにより、Ｌ―トリプトフアンが14.6ｇ／
の濃度に生成蓄積した。この時のＬ―トリプトフ
アンの対消費糖収率は16.5％、対アントラニル酸
のモル収率は99％であつた。

培地組成 グルコース 10％ 硫安 0.3％ Na₂HPO₄・12H₂O 0.5％ KH₂PO₄ 0.2％ MgSO₄・7H₂O 0.1％ FeSO₄・7H₂O 0.5mg％ MnSO₄・４〜6H₂O 0.1mg％ これと並行して、アントラニル酸塩溶液を添加
しない試験区を設けて同様に培養を行なつたとこ
ろ30時間でトリプトフアンの蓄積量は250mg／
であつた。

実施例 ２ バチルス・ズブチリスSD―10を実施例１に示
した培地で５ジヤーフアーメンターにて20時間
培養したもの750mlを同じ培地を15含む30ジ
ヤーフアーメンターに接種し、35℃で溶存酸素を
0.5ppm以上に保ちながら通気撹拌培養を行な
う。10％アンスラニル酸ソーダ塩溶液を培養液中
のアントラニル酸の濃度が阻害濃度以下になるよ
うに連続的に添加し、培養液のPHを7.0に保ちつ
つ24時間培養することにより、Ｌ―トリプトフア
ンが15.6ｇ／の濃度に生成蓄積した。この時の
Ｌ―トリプトフアンの対消費糖収率は17.4％、対
アントラニル酸モル収率は99％であつた。

なお、これと並行して、バチルス・ズブチリス
SD―９（微工研菌寄第1483号特開昭49−20391）
を種菌株として実施例２と同じ培地を用いて同様
に30ジヤーフアーメンターで24時間培養した。
結果トリプトフアン蓄積濃度は4.8ｇ／トリプ
トフアンの対消費糖収率5.2％対アンスラニル酸
モル収率は92％であつた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ バチルス・ズブチリスの５―フルオロトリプ
   トフアン及び８―アザグアニンに耐性を有し、Ｌ
   ―トリプトフアン生産能を有する変異株をアント
   ラニル酸を添加した培地に培養し、Ｌ―トリプト
   フアンを培地中に生成蓄積せしめ、これを採取す
   ることを特徴とするＬ―トリプトフアンの製造
   法。