JPH02234692A - ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有する蛋白質の精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、白血球減少等の治療薬として有用なヒト類粒
球コロニー刺激因子（（，ＣＳＦ）活性を有する蛋白質
の精製法に関する。

従来の技術 Ｇ−ＣＳＦは骨髄幹細胞から白血球の一種である顧粒球
コロニーを形成させる蛋白質である。生体の造血系を制
御する生理活性物質として重要な役割を担っている。

最近のＤＮΔ組換え技術の進歩により天然のＧＣＳＦの
みならず（，−ＣＳＦ活性をもつ誘導体も報告されてい
る。

ガン細胞由来の培養細胞株から生産されるＧ−ＣＳＦの
精製方法については、ブロシーデインダス・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ，Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ）　８２　．　　１５２６−
１５３０（１９８５）及びヨーロピアン・モレキュラー
・バイオロジー・オーガニゼイション・ジャーナル（［
！ＭＢＯＪ）５　．　８７１−８７６（１９８６）に記
載があるが、いずれも動物細飽株からの（，−ＣＳＦの
精製法であり、また精製に有機溶媒を用い、精製の過程
で高速液体クロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ）を使用して
いる。

組換えＤＮＡ技術によって大腸菌で生産させたＧＣＳＦ
の精製法については、特開昭６２−１２９２９８，Ｗ０
８６／０４６０５及び１１１０８７／０１１３２に記載
がある。特開昭６２−１２９２９８及びＷ０８６／０４
６０５には溶媒としてロープ口パノールを用い、大腸菌
中で顆粒となったＧ−ＣＳＦの可溶化に８Ｍ塩酸グアニ
ジンを用い、逆相ＨＰＬＣとゲルＰ過ＨＰＬＣを組み合
わせて精製する方法が開示されている。ＷＯ８７／０１
１３２には溶媒としてアセトン及びｎ−プロバノールを
用い、顆粒となったＧ−ＣＳＦを界面活性剤を用いて可
溶化し、疎水性ＨＰＬＣあるいはゲルＰ過とＣＭセルロ
ースクロマトグラフィーを用いて精製する方法が開示さ
れている。しかし、いずれの場合においても有機溶媒を
用いている。有機溶媒は蛋白質を変性させるため精製効
率を低下させ、また使用した後に回収しなければならず
、大量蛋白質精製に用いる場合には適していない。

ＨＰＬＣは、目的蛋白質を高純度に精製することができ
る有力な手段であるが、工業的な規模で大量に精製する
場合には適していない。

一方、Ｇ−ＣＳＦなどの分子内にジスルフィド結合（以
下ＳＳ結合と略記す．る）を有する蛋白質を組換えＤＮ
Ａ技術を用いて微生物で生産させた場合、該蛋白質は菌
体内に失活した状態で類粒として蓄積するため、ポリベ
プチド鎮が無秩序に折りたたまれ、分子間でｓｓ結合を
形成している場合も多い。従って、このような蛋白質を
精製する場合、システイン残基を酸化する過程、すなわ
ち、ＳＳ結合を形成させ、天然型と同じ構造の蛋白質に
する過程が必要である。１１１０８７／０１１３２では
硫酸銅を用いて酸化を行っているが、硫酸銅を用いる酸
化は天然型と同じ位置にＳＳ結合を形成する割合が少な
く、効率的な方法ではない。一般的に、この酸化過程に
用いる酸化剤としては還元型グルタチオン（以下ＧＳＨ
と略記する）及び酸化型グルタチオン（以下ＧＳＳＧと
略記する）の混合物又は、システインとシスチンの混合
物などが知られているが、効率よく酸化を行うために必
要な酸化剤は精製する蛋白質の種類によって異なり、Ｇ
ＣＳＦ活性を有する蛋白質について効率的に酸化するこ
とが可能な酸化剤は知られていない。

また、非経口の医薬品においては、発熱性物質の除去は
必須である。発熱性物質は、生産菌である微生物由来の
もの、または、使用する水または空気から混入する微生
物由来のものなどがある。

この発熱性物質を除去する方法はいくつか知られている
が、従来のＧ−Ｃ　Ｓ　Ｆの精製方法において、発熱性
物質の除去の工程を積極的に組み入れた例はない。

発明が解決しようとする課題 組換えＤＮＡ技術を用いて微生物で生産させた（，−Ｃ
ＳＦ活性を有する蛋白質を、天然型と同じ構造を有する
蛋白質として、高収率かつ高純度に精製する方法の開発
が求められている。

課題を解決するための手段 本発明者らは、組換えＤＮＡ技術を用いて微生物で生産
させたＧ−Ｃ　Ｓ　Ｆ活性を有する蛋白質を、有機溶媒
及びＨＰＬＣを用いずに効率的に精製する方法を見い出
し本発明を完成させた。

本発明は、組換えＤＮＡ技術を用いて微生物で生産させ
たＧ−ＣＳＦ活性を有する蛋白質を含む非水溶性の穎粒
に、変性剤及び還元剤を加えて還元変性状態で可溶化し
、変性剤を除去した後に酸化型グルタチオンまたはシス
チンを加えて酸化して天然型のＧ−Ｃ　Ｓ　Ｆのジスル
フィド結合に相当する位置にジスルフィド結合を形成さ
せ、得られる混合物より発熱性物質を除去し、非変性の
酸化型単量体となったＧ−Ｃ　Ｓ　Ｆ活性を有する蛋白
質を単離、精製することを特徴とするＧ−ＣＳＦ活性を
有する蛋白質の精製法に関する。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明で用いられるＧ−Ｃ　Ｓ　Ｆ活性を有する蛋白質
は組換えＤＮＡ技術を用いて微生物で生産させたＧ−Ｃ
ＳＦ活性を有する蛋白質であればいずれでも対象となる
。微生物の代わりに真核生物を用いて生産させたＧ−Ｃ
ＳＦ活性を有する蛋白質でもよい。

具体的には、第１表に示されるアミノ酸配列を有するも
の［Ｇ−Ｃ　Ｓ　Ｆ誘導体（Ａ＞］　　（ＥＰ−ＡＩ−
０２７２７０３）または第２表に代表されるような、第
１表のアミノ酸配列中で少なくとも一個のアミノ酸が他
のアミノ酸に置換されたポリベブチドまたはＮ末端アミ
ノ酸が１〜１１欠失したポリペプチドでＧ−Ｃ　Ｓ　Ｆ
活性を有するものが例示される。さらに特開昭６　３−
２　２　９、特公表６３−５００６３６に記載のヒト顆
粒球コロニ刺激因子誘導体も用いることができる。第１
表中、Ｘは水素原子まｔこはメチオニン残基を示す。

坂下余白 ク　　　　ー　　　　−　　　　Φ　　　　コ　　　　
ｅ　　　　把　　　　一一　　　ｈ　　一　　　一　　
　■　　　一　　　一　　　ロ■　　ヒ　　く　　＝　
　一　　ロ　　く　　φ第 表 一一　一響　一一一Ｎ＋＋　マー　り＝Ｘ　号乙　；コ
　りλ　■の　一ロ　ー１ｊ　　−０−　　一一＊は第
１表と同じであることを示す。

組換えＤＮＡ技術を用いて微生物で生産させたＧ−Ｃ　
Ｓ　Ｆ活性を有する蛋白質を含む非水溶性の顆粒の分離
、精製法は以下に示す方法に従って行菌体 （工程工） 固体（精製類粒） 次に各工程について詳述する。

〈工程Ｉ冫 蛋白質の顆粒を菌体内に蓄積している微生物菌体を破砕
後、遠心分離して沈殿画分（沈殿画分Ａとする）をとる
。

菌体破砕は中性付近の緩衝液（例えばｐＨ７のリン酸緩
衝液）に菌体を懸濁し、ついで常法により超音波処理、
リゾチーム処理、ホモゲナイザー処理、凍結乾燥を繰り
返すことによる破砕、機械的圧力による破砕等により行
うことができる。特に機械的圧力による破砕が好ましく
、例えばフレンチ・プレス、マントンーガウリンホモゲ
ナイザ等によって破砕が行われる。破砕条件は各機器の
適切な使用範囲で十分である。

次に破砕液を遠心分離して沈殿画分Ａを得るが、この沈
殿画分には蛋白質順粒及び菌体残渣が含まれる。遠心分
離は通常の遠心分離機によって行えばよいが、連続遠心
、シャープレスによってもよい。通常の遠心分離機を使
用する場合の遠心条件は通常２０００〜１５０００ｒｐ
ｍ，　　１　０〜１２０分間とするが、きくに４０００
　〜１２００Ｏｒｐｍ，　　３　０　〜９　０分間が好
ましい。

く工程２〉 沈殿画分Ａをアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の
鉱酸塩、ペントース、ヘキソース、２糖類、３糖類、デ
オキシ糖、糖アルコール、デヰストランもしくはデキス
トリン又はフイコールの水溶液、又はパーコールの水懸
濁液に懸濁して遠心分離して沈殿画分（沈殿画分Ｂとす
る》をとる。

この遠心分離によっ・て細胞残渣は上清として除去され
、蛋白質順粒を含む沈殿が得られる。

従来、密度の異なる細胞内成分の分離には、しばしばシ
ヨ糖密度勾配超遠心法、シヨ糖密度勾配平衡超遠心法な
どが用いられている。又、ラット肝臓をシヨ糖溶液を用
いてホモゲナイズした後、遠心分離して沈殿部に細胞核
を含む両分を得る分画遠心法などが知られている〔大岳
　望ら著、「物質の単離と精製」、東大出版会発行、１
４５１５５ページ（昭和５１年発行）〕。

上記において、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属
の鉱酸塩としてはナトリウム、カリウム、カルシウム、
セシウム等の塩酸塩、硫酸塩、臭化水素酸塩等があげら
れる。具体的には塩化セシウム、硫酸カルシウム、塩化
ナトリウム、臭化ナトリウム等があげられる。

ペントースとしてはＬ−アラビノース、Ｄ−キシロース
、Ｄ−リボース等、ヘキソースとしてはＤ−グルコース
、Ｄ−マンノース、Ｄ−４”ラクトース、Ｌ−ガラクト
ース、Ｄ−フルクトース、Ｌソルボース等、２糖類、３
糖類としてはシヨ糖、マルトース、ラクトース、トレハ
ロース、セロビオース、ラフィノース等、デオヰシ糖と
してはＬラムノース、２−デオキシーＤ−リボース等、
糖アルコールとしてはグリセロール、エリトリット、ア
ラビット、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニット等があげ
られる。

フイコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、パーコール（Ｐｅｒｃｏ
ｌｌ）はファルマシア社製の商品の商品名であり、フイ
コールはシヨ糖とエピクロルヒドリンとからなる水に易
溶の合成高分子であり、パーコールはシリヵのビーズを
合成樹脂でコーティングし、粒をそろえたものである。

水溶液、水懸濁液は中性付近の緩衝液であることが好ま
しい。

水溶液中の固形成分の濃度としては、アルカリ金属もし
くはアルカリ土類金属の鉱酸塩の場合は５〜５０％（ｗ
／ｗ）　、グリセリンの場合は１０〜８０％（ｗ／ｗＬ
デキストラン、デヰストリンの場合は５〜５０％（ｗ／
ｗ）　、シヨ糖をはじめその他のＦｉ頚の場合は０．２
５〜４Ｍ，特に０．５〜２Ｍが適当である。

上記水溶液、水懸濁液の沈殿画分八に対する使用割合と
しては工程１に入る前の発酵ブロスの容量に対して１７
２０〜２０倍量（ｖ／ｖ）が適当である。

上記条件で調製した沈殿画分八の懸濁液は直ちに遠心分
離することにより沈殿画分Ｂを得てもよいが、沈殿画分
Ｂの分離効率を高めるために懸濁液は十分攪拌したのち
遠心分離することが好ましＧ）。

遠心分離は通常の遠心分離機によって行えばよいが連続
遠心、シャープレスによってもよい。

通常の遠心分離機による場合、通常２０００〜１５００
０ｒｐｍ１０〜１２０分間、好ましくは４００（１−　
１２０００ｒｐｍ，３０〜９０分間の条件で行う。

〈工程３〉 沈殿画分Ｂを比較的弱い変性剤を含む緩衝液と混合し、
ついで固液分離する。この操作により、沈殿画分Ｂに混
在するＧ−ＣＳＦ活性を有する蛋白質以外の蛋白質が溶
解除去され、Ｇ−Ｃ　Ｓ　Ｆ活性を有する蛋白質を含む
顆粒が精製される。

変性剤としては、尿素又は塩酸グアニジン等が用いられ
る。変性剤の濃度は用いる変性剤の種類によって異なり
、例えば、尿素の場合１〜６Ｍ，好ましくは３〜５Ｍで
あり、塩酸グアニジンの場合１〜３Ｍ，好ましくは１〜
２Ｍである。

上記条件で調製した沈殿画分Ｂの混合液は直ちに固液分
離してもよいが、分離効率を高めるべく十分攪拌したの
ち固液分離するのが好ましい。

固液分離は遠心分離、ｐ過等により行うことができる。

遠心分離は固液分離を可能にする方法・条件であればい
ずれの方法・条件であってもよい。

例えば、工程１、工程２に述べた方法・条件によればよ
い。

以上の方法で分離、精製したＧ−Ｃ　Ｓ　Ｆ活性を有す
る蛋白質を含む頴粒は、強い変性剤及び還元剤を含む緩
衝液中で還元変性状態で可溶化される。

変性剤としては、尿素、塩酸グアニジンまたはアルカリ
を単独又は複合して用いる。変性剤の濃度は用いる変性
剤の種類によって異なり、例えば、尿素の場合６〜８Ｍ
，好ましくは７〜８Ｍであり、塩酸グアニジンの場合３
〜６Ｍ，好ましくは５〜６Ｍである。還元剤としては、
２−メルカブトエタノール又はジチオスレイトール（Ｄ
ＴＴ）等が上げられ、変性剤を含む緩衝液に添加して用
いる。

濃度は用いる還元剤の種類によって異なり、例えば２−
メルカプトエタノールの場合は０．０１〜１％（ｖ／ｖ
）、ＤＴＴの場合は０．１　〜５ｍＭである。緩衝液の
ｐＨは２〜ｌ２、好ましくは５〜１１である。可溶化は
温度Ｏ〜４０℃、好ましくは５〜１５℃で攪拌しながら
行い、５時間で終了する。可溶化した蛋白質は分子内で
天然型とは違った位置にＳＳ結合を形成しているか、あ
るいは分子間でＳＳ結合を形成しているため、変性剤を
加える際に同時に還元剤を加えることによりＳＳ結合を
開裂させ、蛋白質の還元型単量体を増加させ、会合体を
減少又は消失させることができる。

変性剤を除去する手段は、希釈、透析、限外戸過、ゲル
ｐ過、等電点沈殿、吸脱着を含むクロマトグラフィーお
よびバッチ摸作などがあり、特に限定されないが希釈が
好ましい。例えば、還元変性状態で可溶化した蛋白質を
変性剤を含まない緩衝液に希釈することにより変性剤を
除去することができる。緩衝液としてはトリス／塩酸！
ｌ衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、モルホリノプ
口パンスルホン酸緩衝液等が０．Ｏｌ〜ＩＭの濃度で用
いられる。緩衝液のｐＨは５〜１０、好ましくは７〜８
である。希釈の倍率は５〜１００倍、好ましくは１０〜
３０倍である。

希釈液はそのまま放置すると、溶存酸素によりチオール
基が酸化されてＳＳ結合が形成されるが、０．０１　〜
１ｍＭ　　ＧＳＳＧまたは、０．０１〜１ｍＭシスチン
を加えて酸化することにより効率的に天然型の（，−Ｃ
ＳＦのＳＳ結合に相当する位置にＳＳ結合を形成させる
ことができる。ＧＳＨあるいはシステインの添加は阻害
的に作用する。反応は温度０〜４０℃、好ましくは５〜
１５℃で行い、２〜４８時間で終了する。

反応混合物より発熱性物質を除去し、非変性の酸化型単
量体となったＧ−ＣＳＦ活性を有する蛋白質を単離、精
製することにより医薬用として適するＧ−ＣＳＦ活性を
有する蛋白質を得ることができる。単離、精製の手段は
特に限定されないが、酸化剤を除去した後に陰イオンク
ロマトグラフィー及び／又は疎水性担体クロマトグラフ
ィーを用いることが好ましい。

酸化剤の除去は、希釈、透析、限外Ｐ過、ゲルｐ過、吸
脱着を含むクロマトグラフィーおよびバッチ摸作などが
あり特に限定され７いが、限外戸過が好ましい。限外Ｐ
過膜としては、分画分子量１０００〜３００００のもの
が使用される。膜材質はボリスルホン系又はポリオレフ
ィン系が好ましい。初期容量の５〜６倍量の交換溶媒を
Ｐ過流量と注入流量が等しくなるようにして流し、溶媒
交換を行う。この溶媒交換により初期溶媒は百分の一以
下となり、酸化剤を除去することができる。

陰イオン交換クロマトグラフィーに用いる担体としては
、例えばＤＥＡＥを交換基とする担体があげられる。溶
出は０．１〜０．５Ｍ塩化ナｌウムを含む緩衝液で行い
、必要に応じて段階的に塩化ナトリウム濃度を上げて溶
出を行ってもよいし、濃度勾配をつけて溶出を行っても
よい。

疎水性担体クロマトグラフィーに用いる担体としては、
例えばブチル基、フエニル基又はオクチル基等の疎水性
基を結合させた担体や、担体自体に疎水性を有するもの
が使用される。担体は、高濃度の塩を含むｐＨ７〜９の
緩衝液で平衡化して用いる。塩としては硫安または塩化
ナトリウム等が用いられ、担体に吸着させるために、蛋
白質溶液にも添加することが好ましい。硫安の濃度は０
．２〜０．　５　Ｍであり、好ましくは０．２〜０．３
Ｍである。塩化ナトリウムの濃度は０．５〜１．５Ｍで
あり、好ましくは０．５〜１．０Ｍである。担体に蛋白
質溶液を接触させ、蛋白質を吸着させた後、塩を含まな
い緩衝液で溶出する。

発熱性物質の除去の方法は特に限定されないが、シリカ
ゲルクロマトグラフィーによる除去が好ましい。シリカ
ゲルクロマトグラフィーに用いるシリカゲルは、ｐＨ５
〜７の低塩濃度緩衝液に平衡化して用いる。シリカゲル
の代わりに多孔性ガラスを用いてもよい。溶出は１５〜
６０％エチレングリコール又は３〜５Ｍ尿素を含むｐＨ
７〜８の緩衝液で行う。溶出を行う前に、Ω〜１５％エ
チレングリコールを含む緩衝液で洗浄することが好まし
い。

以上の方法によりＧ−ＣＳＦ活性を有する蛋白質を単離
、精製することができるが、さらに該蛋白質を低分子の
塩と分離するには脱塩処理を行う。

脱塩処理の方法としては、ゲル一過、限外Ｐ過、透析な
どがあげられ特に限定されないが、ゲル枦過が好ましい
。ゲルＰ過に用いる担体としては、蛋白質の脱塩に適し
たものであれば、いずれでも用いられる。例えばトヨパ
ールＨＷ−４０（東ソー社製）、セファデックスＧ−２
５（ファルマシア製）等があげられる。担体はｐＨ６〜
８の低塩濃度緩衝液で平衡化した後に、蛋白質溶液と接
触させる。溶出はｐＨ７〜８のリン酸緩衝液で行う。

蛋白質の定量は、ローリーらの方法〔ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリ−（Ｊ．ロｉｏ１，Ｃｈ
ｅｍ．）２￥３　　，　２６５　（１９５１）　：ｌに
従って行う。標準蛋白質としては牛血清アルブミンを用
いる。

溶液中で蛋白質の２次構造がどの程度復元しているかは
円偏光二色性スペルトルを測定することにより調べる。

円偏光二色性スペクトルの測定は、円偏光二色性分散計
Ｊ−５００Ａ　（日本分光工業社製）を使用する。セル
の厚さは０．　１　４　ｍｍである。測定は室温で行い
、積算は４回行う。

蛋白質の非変性の酸化型単量性の定量に用いる逆相ＨＰ
ＬＣは下記条件下で行う。

カラム：ＯＤＳ−１　２　０Ｔ　（東ソー社製）溶　出
二〇．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル４０
〜９０％の直線濃度勾配 流速：１ｍｌ／分 カラム温度＝４０℃ 検　出：２２０ｎｍでの吸光度 微生物由来の蛋白質の定量は、宿主である微生物の蛋白
質をウサギに免疫して得られるポリクローナル抗体を用
いる酵素免疫測定法（Ｂｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓ
ａｙ＞で行う。二次抗体としては、抗ウサギＩｇＧ抗体
にベルオキシダーゼを結合したものを用い、４−クロロ
ー１ナフトールの発色で定量する。

エンドトキシンの定量は、生化学工業社製のパイロディ
ック（商品名）を用いる。

（，−ＣＳＦ活性の測定は、才カベらの方法〔キャンサ
ー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）　４
４４５０３−４５０６（１９８６＞　１に準じて、骨髄
造血幹細胞コロニー形成能を測定することにより行う。

エチレングリコールの定量は、ガスクロマトグラムＧ−
８０（ヤナコ社ＩＮ）を用いる。充填剤はＣｈｒｏｍｏ
ｓｏｒｂｌ０１　，　６０／８０　　（ガスクロ工業社
製）を用いる。カラム温度及び注入口温度は２００℃、
カラム長はｌｍ、キャリアーはヘリウムガスを用い、流
速は１５ｍｌ／分とする。

蛋白質の純度は、レムリの方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕ
ｒｅ）　２２７　．　６８０　（１９７０）　］により
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で蛋白質を分離
し、クマシーブリリアントブルーで染色した後、クロマ
トスキャナー（ＣＳ−９３０、島津製作所製）を用いて
測定する。

以下、実施例をあげて本発明を具体的に説明する。

実施例１． 参考例１で得られた菌体５ｋｇを２０ｍＭ’Ｊン酸緩衝
液（ｐＨ７．２＞３０ｊ！に懸濁し、５℃でホモゲナイ
ザー（型式１　５Ｍ−８ＴＡ　；マントンーガウリン　
マニファクチュアリング社製）に３回通して菌体を破砕
した。破砕液は９０００ｒｐｍ，　３　０分間遠心分離
し、得られた沈殿物を０．８Ｍシヨ糖を含む２０ｍＭ　
　リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に懸濁し、９００（ｌｒ
ｐｍ，　３　０分間遠心分離した。得られた沈殿物を５
Ｍ尿素、１％　２−メルカプトエタノールを含む２０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ｛７．２）に懸濁し、１時間攪拌
した後、連続遠心して顆粒を集めた。

順粒３０ｇを８Ｍ尿素及び３ｍＭ　　ＤＴＴを含む５０
ｍＭ｝リス緩衝液（ｐＨ８）１．８＊に溶解した。この
ときの蛋白質濃度は５．　２　ｍｇ／ｍｌであった。こ
れを５℃で５時間攪拌した後、尿素及びＤＴＴを含まな
い！ｌ＋ＯｍＭ｝リス緩衝液（ｐＨ８）５０Ａに希釈し
た。希釈液中の円偏光二色性スペクトルを測定し、希釈
液中の蛋白質の２次構造の状態を調べた。希釈液中の蛋
白質は第１図に示したように２次構造が復元していた。

希釈液は４時間放置した後、０．１ｍＭ　　ＧＳＳＧを
添加した。添加直後から、２０時間後までの酸化型単量
体の形成の状態を逆相ＨＰＬＣで調べた。第２図に、Ｈ
ＰＬＣのクロマトダラムのパターンを示した。第２図に
示したように２０時間後に蛋白質はほぼ完全に酸化され
た。酸化型単量体は、会合体を含むＧ−ＣＳＦ活性を有
する蛋白質全量の約６６％であった。

酸化後、蛋白質を含む溶液５０１は限外ρ過膜（ＰＭＩ
Ｏ：φ１２５　Ｘ１０９２ｍｍ、ロミコン社製）に通し
、１５０ＩｌのＧＳＳＧを含まないトリス緩衡液（ｐＨ
８）を注入して溶媒交換を行った。

膜にかかる圧力は０．　５　ｋｇ／　ｃＩＩｌ，　ｐ過
流速は２０１７時とした。溶媒交換後のＧＳＳＧの濃度
は交換前の百分の一にまで減少した。さらに、蛋白質溶
液は交換用の緩衝液を注入せずに限外戸過を続け１３Ｊ
まで濃縮した。このときの蛋白質濃度は０．３ｍｇ／ｍ
ｌ＋であった。蛋白質の回収率は６５％であった。

蛋白質溶液は、あらかじめ１０ｍＭ｝！Ｊス緩衝液（ｐ
Ｈ８）で平衡化しておいたＤＥ八Ｅトヨパール（東ソー
社製）カラムＩＯＡに流速５ｌ／時で通塔し、トリス緩
衝液（ｐＨ８）　　１０１を通液して未吸着物質を除去
した後、０〜０．２Ｍの塩化ナトリウムの濃度直線勾配
溶出を行った。蛋白質濃度が高い溶出画分１．９１！を
集めたところ、蛋白質が１．９ｇ含まれていた。回収率
は４９％であった。このクロマ゛トグラフィーにより、
大腸菌由来の蛋白質は全蛋白質量の０．　３　６　７％
から０．０１５％に減少した。溶出液は、硫安を０．２
５Ｍになるように添加した後、あらかじめ０．２５Ｍ硫
安を含んだ５０ｍ．Ｍ｝．！Ｊス緩衝液（ｐｉ｛８）で
平衡化したプチルトヨパール（東ソー社製）カラム０．
６　Ｉｌに流速１７／時で通塔した。カラムを平衡化し
たものと同じ緩衝液で洗浄して未吸着物質を除去し、硫
安を含まないトリス緩衝液で溶出した。蛋白質を含む溶
出液１．２ｌを集約だところ、Ｇ−ＣＳＦ活性を有する
蛋白質が１．０ｇ含まれていた。回収率は５３％であっ
た。大腸菌由来の蛋白質の濃度は全蛋白質量の０．　０
　０　１％に減少した。

溶出液１．２１はｐＨを７に調整し、あらかじめ１０ｍ
Ｍ｝！Ｊス緩衡液（ｐＨ７）で平衡化したマイクロビー
ズシリカゲル力ラム（３０−６０メッシ．　；　ＦＩＪ
ＪＩ−ＤＡＶＩＳＯＮ　ＣＨＨＭＩＣＡＬ社製）０．４
βに流速０．８Ｉｌ／時で通搭した。カラムを１５％エ
チレングリコールを含む１０ｍＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ
７）で洗浄し発熱性物質を除去した後、６０％エチレン
グリコールを含むリン酸緩衝液（ｐＨ８）で溶出した。

Ｇ−ＣＳＦ活性を有する溶出液０．５５１を集めたとこ
ろ、溶出液中にＧ−ＣＳＦ活性を有する蛋白質が１．０
ｇ含まれていた。この蛋白質の比活性は６．　２　Ｘ　
１　０　８Ｕ／ｍｇ，エンドトキシンは０、４５ｎｇ／
ｍｇ蛋白質含まれており、純度は９９％以上であった（
回収率１１％）。

溶出液（蛋白質濃度３．　３　ｍｇ／　ｍｃ）　０．　
５　５　Ｉｔは、あらかじめ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（フ
ァルマシア社製）２、５ｌに流速２、５１／時で通塔し
た。

リン酸緩衝液（ｐＨ７）で溶出を行い、Ｇ−Ｃ　ＳＦ活
性を有する溶出液０．　５　９　Ａを集めたところ、溶
出液中にＧ−Ｃ　Ｓ　Ｆ活性を有する蛋白質が１．０ｇ
含まれていた。溶出液中にエチレングリコールが含まれ
ていないことをガスクロマトグラフィで確ε忍した。

実施例２． 参考例２で得られた菌体４．　５　ｋｇをＧＳＳＧの代
わりに０．０５ｍＭシスチンを用いる以外は実施例１と
同様に行い、Ｇ−ＣＳＦ活性を有する蛋白質溶液０．　
８　０　Ｉｔを得た。この溶液中にはＧ−ＣＳＦ活性を
有する蛋白質が１．　５　２　ｇ含まれていた（回収率
２２％）。この蛋白質の比活性は１．　７　Ｘ　Ｉ　０
　８Ｕ　／　ｍｇｓ　エンドトキシンは０．　６　１　
ｎｇ／ｍｇ蛋白質含まれており、純度は９９％以上であ
った。溶液中にエチレングリコールが含まれていないこ
とをガスクロマトグラフィーで確認した。

参考例１． 第１表に示したアミノ酸配列をコードしたＤＮＡを含む
プラスミドｐＣｆＢＤ２８を保有する大腸菌Ｗ３　　１
　　１　　０　　　ｓｔｒ八（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
　　ｃｏｌｉ　　ＢＣＦＢＤ２８ＦＢＲＭ　ＢＰ−１４
７９＞をＬＧ培地（バクトトリブトン５０ｇ、酵母エキ
ス２５ｇ１塩化ナトリウム２５ｇ、グルコース５ｇを水
５ｌに溶かし水酸化ナトリウムにてｐＨを７とする。）
で３７℃、１８時間培養し、この培養液５１を２５Ｊ１
ｇ／ｍｌのトリプトファンと５０■／ｍｌのアンピシリ
ンを含むＭＣＧ培地〔リン酸二ナトリウム０．６％、リ
ン酸一カリウム０．３％、塩化ナトリウム０．５％、カ
ザミノ酸０．５％、硫酸マグネシウム１ｍＭ，ビタミン
Ｂ４μｇ／ｍｌ、ｐＨ７．２］　　１　０　０　Ｉｔに
接種し、３０℃で４〜８時間培養後、トリプトファンの
誘導物質である３β−インドールアクリル酸を１０μｇ
／ｍｌ加え、さらに２〜１２時間培養を続けた。培養液
を８００Ｏｒｐｍ　，　１　０分間遠心して集菌し、湿
重量５ｋｇの菌体を得た。

参考例２， 第２表のＮに示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含
むプラスミドｐｃｆＴＡ１を保有する大腸菌Ｗ３１１０
　　ｓｔｒＡを用い、参考例１と同様にして天然型Ｇ−
ＣＳＦを取得した。

発明の効果 本発明によれば、組換えＤＮＡ技術を用いて微生物で生
産させたＧ−ＣＳＦ活性を有する蛋白質を効率よく精製
することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はＧ−ＣＳＦ誘導体（Ａ）の円偏光二色性スペク
トルを示す。（ａ）は希釈前の溶液のスペクトル、（６
）はトリス緩衝液で２５倍に希釈した溶液のスペクトル
をそれぞれ示す。 第２図ＩＦ逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムのパターンを
示す。（ａ）はＧ−Ｃ　Ｓ　Ｆ誘導体（Ａ）のトリス緩
衝液で２５倍に希釈した直後、（ｂ）はＧＳＳＧを添加
後１時間、（Ｃ）はＧＳＳＧを添加後５時間、（６）は
ＧＳＳＧ添加後２０時間経過後のクロマトグラムのパタ
ーンをそれぞれ示す。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）組換えＤＮＡ技術を用いて生産させたＧ−ＣＳＦ
   活性を有する蛋白質を含む非水溶性の顆粒に、変性剤及
   び還元剤を加えて還元変性状態で可溶化し、変性剤を除
   去した後に酸化型グルタチオンまたはシスチンを加えて
   酸化して天然型のＧ−ＣＳＦのジスルフィド結合に相当
   する位置にジスルフィド結合を形成させ、得られる混合
   物より発熱性物質を除去し、非変性の酸化型単量体とな
   ったＧ−ＣＳＦ活性を有する蛋白質を単離、精製するこ
   とを特徴とするＧ−ＣＳＦ活性を有する蛋白質の精製法
   。
2. （２）変性剤が６〜８Ｍ尿素または３〜６Ｍ塩酸グアニ
   ジンであることを特徴とする請求項１記載の方法。
3. （３）変性剤の除去が希釈による除去であることを特徴
   とする請求項１記載の方法。
4. （４）発熱性物質の除去がシリカゲルカラムクロマトグ
   ラフィーによることを特徴とする請求項１記載の方法。
5. （５）非変性の酸化型単量体となったＧ−ＣＳＦ活性を
   有する蛋白質の単離、精製の手段が限外ろ過及び陰イオ
   ンクロマトグラフィー及び／又は疎水性担体クロマトグ
   ラフィーによることを特徴とする請求項１記載の方法。