JPH02234697A - 生体試料の測定法 - Google Patents
生体試料の測定法Info
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- JPH02234697A JPH02234697A JP5379689A JP5379689A JPH02234697A JP H02234697 A JPH02234697 A JP H02234697A JP 5379689 A JP5379689 A JP 5379689A JP 5379689 A JP5379689 A JP 5379689A JP H02234697 A JPH02234697 A JP H02234697A
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- dehydrogenase
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、生体試料のIII定法に関し、さらに詳しく
は、生体試料中の脱水素酵素および脱水素酵素の基質の
含有率の測定法に係わる。
は、生体試料中の脱水素酵素および脱水素酵素の基質の
含有率の測定法に係わる。
生化学的検査や病理学的研究において血清や尿などの生
体試料中の脱水素酵素および脱水素酵素の基質のそれぞ
れの含有率の測定を行う際に、脱水素酵素の作用により
生成された還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ト(以下N A D Hと記す)または還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドりん酸(以下NADPH
と記す)の量を測定することによる生体試料中の脱水素
酵素および脱水素酵素の基質のそれぞれの含有率の測定
が広く行われている。
体試料中の脱水素酵素および脱水素酵素の基質のそれぞ
れの含有率の測定を行う際に、脱水素酵素の作用により
生成された還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ト(以下N A D Hと記す)または還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドりん酸(以下NADPH
と記す)の量を測定することによる生体試料中の脱水素
酵素および脱水素酵素の基質のそれぞれの含有率の測定
が広く行われている。
NADHまたはNAI)PH (以下両者のうちの一方
をNAD (P)Hと記す)の定量法としては、5−メ
チルフエナジニウムメチルサルフェ−1・(以下PMS
と記す)または1−メトキシ−5メチルフェナジニウム
メチルサルフエ−1−(以下l−メトキシPMSと記す
)を、電子伝達体として作用させる方法が広く利用され
ている。
をNAD (P)Hと記す)の定量法としては、5−メ
チルフエナジニウムメチルサルフェ−1・(以下PMS
と記す)または1−メトキシ−5メチルフェナジニウム
メチルサルフエ−1−(以下l−メトキシPMSと記す
)を、電子伝達体として作用させる方法が広く利用され
ている。
すなわち、NAD (P)HにPMSまたは1メトキシ
PMSを作用させ、酸化還元指示薬の呈色反応により測
定する方法、あるいは、NAD (P)HにPMSまた
は1〜メトキシPMSを作用させて、生成された過酸化
水素を測定する方法などがある。しかし、これらの方法
で電子伝達体として用いられるPMSまたは1−メトキ
シPMSにはそれぞれ大きな問題がある。
PMSを作用させ、酸化還元指示薬の呈色反応により測
定する方法、あるいは、NAD (P)HにPMSまた
は1〜メトキシPMSを作用させて、生成された過酸化
水素を測定する方法などがある。しかし、これらの方法
で電子伝達体として用いられるPMSまたは1−メトキ
シPMSにはそれぞれ大きな問題がある。
PMSは散乱光およびアルカリ性溶液中において極めて
不安定であり、水溶液を長期保存することはできない。
不安定であり、水溶液を長期保存することはできない。
したがって使用時毎に反応液を調製しなければならない
。一方、1−メトキシPMSは、散乱光には安定である
がアルカリ性溶液中においては、依然として極めて不安
定である。
。一方、1−メトキシPMSは、散乱光には安定である
がアルカリ性溶液中においては、依然として極めて不安
定である。
一般に、脱水素酵素の脱水素反応においては、その至適
pHがアルカリ性側に偏っている場合が多く、さらに、
NAD (P)Hがアルカリ性側で安定であるにもかか
わらず、PMSまたは1−メトヰシPMSのアルカリ性
溶液中における極度の不安定性が測定操作上の制限とな
っている。
pHがアルカリ性側に偏っている場合が多く、さらに、
NAD (P)Hがアルカリ性側で安定であるにもかか
わらず、PMSまたは1−メトヰシPMSのアルカリ性
溶液中における極度の不安定性が測定操作上の制限とな
っている。
本発明は、前記の従来の電子伝達体のもつ問題点を解決
するものであり、散乱光に対し安定でありアルカリ性に
おいては勿論のこと酸性または中性においてさえも安定
である電子伝達体を使用することにより脱水素酵素およ
び脱水素酵素の基質のそれぞれの含有率を知る方法を提
供することにある。
するものであり、散乱光に対し安定でありアルカリ性に
おいては勿論のこと酸性または中性においてさえも安定
である電子伝達体を使用することにより脱水素酵素およ
び脱水素酵素の基質のそれぞれの含有率を知る方法を提
供することにある。
C問題点を解決するための手段、作用〕本発明者らは、
前記の問題点を解決するために種々検討したところ、構
造式 で示される1−メトキシ−5−エチルフエナジニウムエ
チルサルフェート(以下1−メトキシPESと記す)が
優れた電子伝達体であることを見出し本発明に到達した
。
前記の問題点を解決するために種々検討したところ、構
造式 で示される1−メトキシ−5−エチルフエナジニウムエ
チルサルフェート(以下1−メトキシPESと記す)が
優れた電子伝達体であることを見出し本発明に到達した
。
すなわち、本発明は、生体試料中の脱水素酵素および脱
水素酵素の基質のそれぞれの含有率の測定に際して、脱
水素反応により生成された還元型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドまたは還元型ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドりん酸に1−メトキシ〜5−エチルフエ
ナジニウムエチルサルフェートを電子伝達体として作用
させることにより、生体試料中の脱水素酵素および脱水
素酵素の基質のそれぞれの含有率を知ることを特徴とす
る生体試料の測定法である。
水素酵素の基質のそれぞれの含有率の測定に際して、脱
水素反応により生成された還元型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドまたは還元型ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドりん酸に1−メトキシ〜5−エチルフエ
ナジニウムエチルサルフェートを電子伝達体として作用
させることにより、生体試料中の脱水素酵素および脱水
素酵素の基質のそれぞれの含有率を知ることを特徴とす
る生体試料の測定法である。
本発明において使用される生体試料としては、動物、植
物あるいは微生物などに由来する試料などがあり、代表
例として、血清および尿など、並びに各生物体の抽出物
、微生物及び細胞の培養液などがある。
物あるいは微生物などに由来する試料などがあり、代表
例として、血清および尿など、並びに各生物体の抽出物
、微生物及び細胞の培養液などがある。
本発明に用いられる脱水素酵素はNAD (P)Hを生
成させる反応を触媒する酵素であれば良い。
成させる反応を触媒する酵素であれば良い。
代表例として第1表に示す脱水素酵素およびその基質が
挙げられる。
挙げられる。
第1表
(第1表続き)
添加されるこれらの酵素、基質および酸化型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド(以下NAD゛と記す)ま
たは酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドりん
酸(以下NADP” と記す)は、その由来、製法など
に特に制限はない。これらの酵素、基質およびNAD“
またはNADP”として市販品を使用することができる
。
ミドアデニンジヌクレオチド(以下NAD゛と記す)ま
たは酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドりん
酸(以下NADP” と記す)は、その由来、製法など
に特に制限はない。これらの酵素、基質およびNAD“
またはNADP”として市販品を使用することができる
。
本発明において利用される1−メトキシPESは、1−
メトキシフェナジンをジエチル硫酸により5位をエチル
化することにより得た。1−メトキシPESは、赤紫色
の粉体であり、通常の使用濃度における水溶液は、中性
付近では、淡いピンク色から淡い赤紫色である。pH7
の水溶液中では277nm, 3 8 5nm、508
r++n付近に吸収の極大値があり、278nmにおけ
る分子吸光係数は44mM−’cm−’テアル。
メトキシフェナジンをジエチル硫酸により5位をエチル
化することにより得た。1−メトキシPESは、赤紫色
の粉体であり、通常の使用濃度における水溶液は、中性
付近では、淡いピンク色から淡い赤紫色である。pH7
の水溶液中では277nm, 3 8 5nm、508
r++n付近に吸収の極大値があり、278nmにおけ
る分子吸光係数は44mM−’cm−’テアル。
また1−メトキシPESは散乱光およびアルカリ性溶液
中において安定となった電子伝達体である。■一メトキ
シPESは、その安定性が比較的大きく、たとえば0.
2M酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.0)中において室
温で1月間散乱光を照射しても電子伝達の活性およびス
ペクトルは全く変化しない。また、1−メトキシPES
を28μHの濃度で、pH4から9までの緩衝溶液中、
30゛C、3日間保存しても全く失活せず、また、pH
10においては、PMSまたは1−メトキシPMSが完
全に失活するのに対して、80%もの残存活性があり、
pH4から10の範囲で使用できる。
中において安定となった電子伝達体である。■一メトキ
シPESは、その安定性が比較的大きく、たとえば0.
2M酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.0)中において室
温で1月間散乱光を照射しても電子伝達の活性およびス
ペクトルは全く変化しない。また、1−メトキシPES
を28μHの濃度で、pH4から9までの緩衝溶液中、
30゛C、3日間保存しても全く失活せず、また、pH
10においては、PMSまたは1−メトキシPMSが完
全に失活するのに対して、80%もの残存活性があり、
pH4から10の範囲で使用できる。
本発明の生体試料中の脱水素酵素および脱水素酵素の基
質のそれぞれの含有率の測定に際して、基質の脱水素反
応により、添加したNAD”またはNADP”よりNA
D (P)Hが生成される。
質のそれぞれの含有率の測定に際して、基質の脱水素反
応により、添加したNAD”またはNADP”よりNA
D (P)Hが生成される。
生成されるNAD (P)Hの定量法としては、前記の
方法の何れも利用することができる。
方法の何れも利用することができる。
すなわち、NAD(P)Hに1−メトキシPESを作用
させ、酸化還元指示薬の呈色反応により測定する方法、
あるいは、NAD(P)Hに1メトキシPESを作用さ
せて、生成された過酸化水素を測定する方法などである
。測定に用いられる酸化還元指示薬は特に制限はないが
、テトラゾリウム類が通常用いられる。例えば、テトラ
ゾリウム類としてニトロブルーテトラゾリウムを用いた
場合は、ニトロブルーテトラゾリウムからホルマザンを
生成させ、ホルマザンの吸収帯である570nm付近の
吸光度の増加を測定することにより定量ができる。過酸
化水素の定量法も、特に制限はないが、実用上、代表的
な方法としては電極法、発色法、発光法などがある。電
極法としては、過酸化水素電極を用いる方法がある。発
色法としては、ベルオキシダーゼを作用させて、フェノ
ールなどのフェノール類や0′−フエニレンジアミンな
どの芳香族アミン類による発色を測定する方法、あるい
はベルオキシダーゼを作用させて、4アミノアンチピリ
ン(以下1−AAと記す)とアニリン頻の酸化縮合によ
る発色を測定する方法、あるいはカタラーゼを作用さセ
る方法がよく用いられる。発光法としては、ルミノール
と錯体類とを作用させて、発生する化学発光を検出する
方法があり、高感度測定が可能である。
させ、酸化還元指示薬の呈色反応により測定する方法、
あるいは、NAD(P)Hに1メトキシPESを作用さ
せて、生成された過酸化水素を測定する方法などである
。測定に用いられる酸化還元指示薬は特に制限はないが
、テトラゾリウム類が通常用いられる。例えば、テトラ
ゾリウム類としてニトロブルーテトラゾリウムを用いた
場合は、ニトロブルーテトラゾリウムからホルマザンを
生成させ、ホルマザンの吸収帯である570nm付近の
吸光度の増加を測定することにより定量ができる。過酸
化水素の定量法も、特に制限はないが、実用上、代表的
な方法としては電極法、発色法、発光法などがある。電
極法としては、過酸化水素電極を用いる方法がある。発
色法としては、ベルオキシダーゼを作用させて、フェノ
ールなどのフェノール類や0′−フエニレンジアミンな
どの芳香族アミン類による発色を測定する方法、あるい
はベルオキシダーゼを作用させて、4アミノアンチピリ
ン(以下1−AAと記す)とアニリン頻の酸化縮合によ
る発色を測定する方法、あるいはカタラーゼを作用さセ
る方法がよく用いられる。発光法としては、ルミノール
と錯体類とを作用させて、発生する化学発光を検出する
方法があり、高感度測定が可能である。
1−メトキシPESとNAD(P)Hとの反応は、通常
、りん酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などの緩衝液中で行
われ、pHは4がら10の広い範囲とされる。従って、
生体試料中の脱水素酵素および脱水素酵素の基質のそれ
ぞれの含有率を測定する際に、脱水素反応の至適P H
であるアルカリ性においても効率よ<NAD (P)H
を生成させることができる。反応液中における1−メト
キシPESの濃度範囲は、特に制限されず、試料の種類
、反応条件や測定時間によって適宜設定され、通常は0
.01〜10+nMの濃度範囲が好ましい。
、りん酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などの緩衝液中で行
われ、pHは4がら10の広い範囲とされる。従って、
生体試料中の脱水素酵素および脱水素酵素の基質のそれ
ぞれの含有率を測定する際に、脱水素反応の至適P H
であるアルカリ性においても効率よ<NAD (P)H
を生成させることができる。反応液中における1−メト
キシPESの濃度範囲は、特に制限されず、試料の種類
、反応条件や測定時間によって適宜設定され、通常は0
.01〜10+nMの濃度範囲が好ましい。
NAD+またはNADP”の濃度範囲も特に制限されず
、通常は0.01〜10mMの濃度範囲で使用される。
、通常は0.01〜10mMの濃度範囲で使用される。
反応温度も特に制限はないが、通常は20〜40゜Cの
範囲で行われ、この範囲にある限りにおいて加熱、冷却
する必要はないが、加熱、冷却することを妨げない。
範囲で行われ、この範囲にある限りにおいて加熱、冷却
する必要はないが、加熱、冷却することを妨げない。
以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明する
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない
。
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない
。
実施例 I
NAD (P)Hと1−メトギシPESとの反応により
生成された過酸化水素を測定することによりNAD (
P)Hの定量を行った。
生成された過酸化水素を測定することによりNAD (
P)Hの定量を行った。
第1液
0.5mM 1−メトヰンP E S
O.13ml!20mM グリシン・NaOH!
l衝冫13j (pll9.0 ) 0.87mI!.
蒸留純水 1.00mj
22.OOmj! 第2211{ 10mM4−AA0.2ml. 10mM N一エチルーN一(2−ハイドロキン−3
スルホプ口ピル)−m一トルイジン(以下TOOSと記
す) 0.2mffi1
0011/m Q ベルオキシダーゼ 0
.2+ni!.IM Tris − 11cI緩衝液
(pH7.5 ) 0.4 mj21.On/! 反応は37゜Cの恒温装置中で行った。第1液を37“
Cにて予備加熱した。20mMグリシン・NaOll緩
衝液(pH9.0)に溶解したNAD (P)H(0
〜2mM)を0.05mI!.添加し5分間反応させた
。これに第2液を添加し、添加1分後の550nmにお
ける吸光度を測定した。
O.13ml!20mM グリシン・NaOH!
l衝冫13j (pll9.0 ) 0.87mI!.
蒸留純水 1.00mj
22.OOmj! 第2211{ 10mM4−AA0.2ml. 10mM N一エチルーN一(2−ハイドロキン−3
スルホプ口ピル)−m一トルイジン(以下TOOSと記
す) 0.2mffi1
0011/m Q ベルオキシダーゼ 0
.2+ni!.IM Tris − 11cI緩衝液
(pH7.5 ) 0.4 mj21.On/! 反応は37゜Cの恒温装置中で行った。第1液を37“
Cにて予備加熱した。20mMグリシン・NaOll緩
衝液(pH9.0)に溶解したNAD (P)H(0
〜2mM)を0.05mI!.添加し5分間反応させた
。これに第2液を添加し、添加1分後の550nmにお
ける吸光度を測定した。
その結果を第1図に示す。
第1図は添加されたNAD (P)Hの濃度と吸光度と
の関係が直線関係でありNAD (P)Hを精度よく定
量できることを示している。この方法によりNAD (
P)Hの濃度は15mMまで定量が可能である。
の関係が直線関係でありNAD (P)Hを精度よく定
量できることを示している。この方法によりNAD (
P)Hの濃度は15mMまで定量が可能である。
実施例 2
LDHの脱水素反応の基質である乳酸の定量性について
調べた。
調べた。
第1液
50 U/mj2 LDH O.1
++12.2mM NAD’ 0.
2 mIV.0.5mM 1−メl−ニトシPES
0.1mj2蒸留純水
0.6mff20mMグリシン・NaOHM衝
液(pl+9.0) 1.0 ti42.0mj! 第2液 10mM 4 −AA 0.2 m
j!10mM TOOS 0.2
mj!1000/m j2 ベルオキシダーゼ
0.2mj2IM Tris − HCI緩衝液 (
pH7.5 ) 0.4 ml1.0 ml 反応は37゜Cの恒温装置中で行った。第1液を37゜
Cにて予備加熱した。DL一乳酸リチウム水溶液(0〜
50mM)を0.05ml.添加し5分間反応させた。
++12.2mM NAD’ 0.
2 mIV.0.5mM 1−メl−ニトシPES
0.1mj2蒸留純水
0.6mff20mMグリシン・NaOHM衝
液(pl+9.0) 1.0 ti42.0mj! 第2液 10mM 4 −AA 0.2 m
j!10mM TOOS 0.2
mj!1000/m j2 ベルオキシダーゼ
0.2mj2IM Tris − HCI緩衝液 (
pH7.5 ) 0.4 ml1.0 ml 反応は37゜Cの恒温装置中で行った。第1液を37゜
Cにて予備加熱した。DL一乳酸リチウム水溶液(0〜
50mM)を0.05ml.添加し5分間反応させた。
これに第2液を添加し、添加1分後の55Qnmにおけ
る吸光度を測定した。
る吸光度を測定した。
その結果を第2図に示す。
第2図は添加したDL一乳酸リチウムの濃度を550n
mにおける吸光度により定量できることを示している。
mにおける吸光度により定量できることを示している。
この方法によりDL一乳酸リチウムの濃度は50mMま
で定量が可能である。
で定量が可能である。
このように、本発明によれば、生体試料中の脱水素酵素
の含有率または、脱水素酵素の基質の含有率を従来より
も安定に、かつ、再現性よく測定できるので、各種の臨
床検査に利用することができる。
の含有率または、脱水素酵素の基質の含有率を従来より
も安定に、かつ、再現性よく測定できるので、各種の臨
床検査に利用することができる。
第1図は添加したNAD (P).Hの濃度と吸光度と
の関係を示している。第2図は添加したDL乳酸リチウ
ムの濃度と吸光度との関係を示している。 l4 述 3(}μ’Xh9tVt:+”’OCrS手続補正書 平成1年乎月7日
の関係を示している。第2図は添加したDL乳酸リチウ
ムの濃度と吸光度との関係を示している。 l4 述 3(}μ’Xh9tVt:+”’OCrS手続補正書 平成1年乎月7日
Claims (1)
- 生体試料中の脱水素酵素および脱水素酵素の基質のそれ
ぞれの含有率の測定に際して、脱水素反応により生成さ
れた還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまた
は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドりん酸
に1−メトキシ−5−エチルフェナジニウムエチルサル
フェートを電子伝達体として作用させることにより、生
体試料中の脱水素酵素および脱水素酵素の基質のそれぞ
れの含有率を知ることを特徴とする生体試料の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5379689A JPH02234697A (ja) | 1989-03-08 | 1989-03-08 | 生体試料の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5379689A JPH02234697A (ja) | 1989-03-08 | 1989-03-08 | 生体試料の測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02234697A true JPH02234697A (ja) | 1990-09-17 |
Family
ID=12952782
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5379689A Pending JPH02234697A (ja) | 1989-03-08 | 1989-03-08 | 生体試料の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02234697A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018054555A (ja) * | 2016-09-30 | 2018-04-05 | アークレイ株式会社 | バイオセンサ、その製造方法、グルコース又はラクテートの濃度測定方法及び濃度測定システム |
-
1989
- 1989-03-08 JP JP5379689A patent/JPH02234697A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018054555A (ja) * | 2016-09-30 | 2018-04-05 | アークレイ株式会社 | バイオセンサ、その製造方法、グルコース又はラクテートの濃度測定方法及び濃度測定システム |
| US10697922B2 (en) | 2016-09-30 | 2020-06-30 | Arkray, Inc. | Biosensor, production method thereof, and method and system for measuring glucose or lactate |
| EP3301183B1 (en) * | 2016-09-30 | 2024-05-08 | ARKRAY, Inc. | Biosensor, production method thereof, and method and system for measuring glucose or lactate |
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