JPH01257499A - Ｎａｄ（ｐ）ｈオキシダーゼを用いたｎａｄ（ｐ）ｈの定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド（ＮＡＤＨ）および／または還元型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰＨ）の酵
素的定量法に関する。

（従来の技術） 各種生物学的研究、臨床検査などにおいて、生体由来物
質や自然界に存在する数多くの物質が測定されている。

被測定物質のなかには１機器を用いて直接測定しにくい
物質もあり、このような被測定物質を測定する場合には
１例えば、該被測定物質が関与する酵素反応を利用し、
この酵素反応により生成する物質や、該酵素反応に関与
する補酵素を測定する方法が有効に利用され得る。特に
。

多くの酵素反応に関与する補酵素であるニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（醇化型はＮＡＤで。

還元型はＮＡＤＨで示される）またはニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドホスフェート（酸化型はＮＡＤＰ
で、還元型はＮＡＤＰＨで示される）を測定する方法が
広く行われている。例えば、アルコール脱水素酵素反応
によるアルコールの酸化によって生じるＮＡＤＨを測定
することにより該アルコールの測定がなされ得る。ＮＡ
ＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨ（以下、　ＮＡＤ（Ｐ）
Ｈとして示す〕は比較的感度よく定量し得るので、微量
物質の定量にも利用されている。

ＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈの定量方法としては、以下の（１）
〜（５）の方法が知られている： （１）　ＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈの紫外領域の特定波長（例
えば、　ＮＡＤ（Ｐ）ＩＩの極大吸収波長である３４０
ｎｍ）における吸収を直接測定する方法； （２）　ＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈに１反応により変化して螢
光を生じ得る物質の存在下でジアホラーゼ（または化学
的電子受容体）を作用させて螢光物質を生成させ、該螢
光物質から生じる螢光を測定する方法；（３）　ＮＡＤ
　（Ｐ）　ＩＩにテトラヅリウム塩存在下でジアホラー
ゼを作用させてジホルマザンを生成させ、該ジホルマザ
ンを比色定量する方法； （４）　ＮＡＤ　（Ｐ）　ＨにＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈオキ
シダーゼを作用させ。

水素受容体である溶存酸素の消費量を測定する方法；お
よび （５）　ＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈに、酸素の存在下でＮＡＤ
　（Ｐ）　Ｈオキシダーゼを作用させて過酸化水素を生
成させ、該過酸化水素によりフェリシアン化カリウム存
在下（アルカリ領域）でルミノールを酸化することによ
って生しる化学発光を測定する方法。

しかし、上記（１）〜（５）の方法には次のような問題
がある＝（１）の方法においては、　ＮＡＤ（Ｐ）ＩＩ
は紫外領域で測定されるため、特に血液や生体組織など
の生体試料を分析する場合には、該生体試料に含有され
る干渉物質の影響を受けやずい；（２）の方法は螢光測
定法であるので、高価な機器を必要とし、かつ操作が煩
雑である；（３）の方法においては、生成したジホルマ
ザン色素が水に難溶であるため、比色計のセルに吸着さ
れやすい；（４）の方法においては、溶存酸素は１例え
ば、ポーラログラフ式の酸素電極を用いて測定されるが
、該装置は高価であるうえ多数の検体を同時に測定でき
ない；そして、（５）のＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈオキシダー
ゼを用いる方法において、使用される該オキシダーゼは
、中性〜酸性領域における活性が高いため２例えば２弱
アルカリ性が至適反応条件である酵素反応と組みあわせ
て目的とする基質を測定する（例えば、脱水素酵素反応
と組みあわせて胆汁酸を測定する）ことが難しい；さら
に、化学発光を測定するため、比色により測定を行う汎
用の自動分析機には適応されに＜＜１日常検査ではほと
んど利用され得ない。

干渉物質の影響を受けにり＜、高価な機器を必要とせず
、操作が簡便であり、かつ自動化が可能であって多数の
検体を同時に測定できるようなＮＡＤ（Ｐ）＋１定量法
の開発が望まれる。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は上記従来の課題を解決するものであり。

その目的とするところは、試料中に存在するか。

もしくは酵素反応によって生成するＮＡＤＨおよび／ま
たはＮＡＤＰＩ＋を精度良く、簡便かつ安価に定量する
方法を提供することにある。本発明の他の目的は、自動
分析装置への適用が可能であるＮ　Ａ　Ｄ　ＩＩおよび
／またはＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　ＩＩの定量法を提供すること
にある。

（課題を解決するための手段） 発明者らは、　ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを効果的に定量し得る方
法について研究を重ねた結果、　ＮＡＤ（Ｐ）Ｈに特異
的に作用して過酸化水素を生成する性質を有するＮＡＤ
（Ｐ）＋１オキシダーゼを利用する方法が有利であるこ
とを見い出し１本発明を完成するに至った。

本発明は、試料中に存在するか、もしくは酵素反応によ
って生成するＮ　Ａ　Ｄ　Ｉｔおよび／またはＮ　Ａ　
Ｄ　Ｐ　ＩＩを定量する方法であって、（Ａ）該試料お
よび酸素を含有する反応系に、　ＮＡＤＨおよび／また
はＮＡＤＰＨの酸化を特異的に触媒する酵素を添加し、
ｐＨ７〜１１の範囲で反応を行って、　ＮＡＤおよび／
またはＮＡＤＰと過酸化水素とを生成させる工程、およ
び（Ｂ）該生成した過酸化水素を定量する工程、を包含
し。

そのことによって上記目的が達成される。

本発明方法に用いられるＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈの酸化を特
異的に触媒する酵素としては、該酵素が触媒する反応に
より過酸化水素（Ｈ２Ｏ。）を発生するようなＮＡＤ　
（Ｐ）　Ｈオキシダーゼが用いられる。このようなＮＡ
Ｄ（Ｐ）１１オキシダーゼとしては、バチルス属に属す
る微生物から単離したＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼが好
適に用いられる。このような微生物としては、バチルス
リケニホルミス、バチルス　ズブティリス、バチルス　
プミルス、バチルス　アノイリノリティヤス、へチルス
　スフエリカス、バチルス　アミロリクエファシェンス
、バチルス　セレウス、バチルス　チューリンギエンシ
スなどが挙げられ、これらはいずれも微工研などの公的
機関から容易に入手可能である。これらの微生物から得
られるＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼのうち、バチルス　
チューリンギエンシス由来の酵素を例に挙げ、その性質
を次に示す。

（１）作用および基質特異性：　ＮＡＤＨおよび／また
はＮＡＤＰＨの酸化を特異的に触媒し、　ＮＡＤおよび
／またはＮＡＤＰと過酸化水素とを生成させる。ＦＡＤ
を添加することにより、　ＮＡＤＨに対する活性は３５
倍に。

そしてＮＡＤＰＨに対する活性は５倍に高められる。

（２）至適ｐＨ：　ｐＨ６，５〜８．０において高い活
性を示す。

（３）ｐ　１１安定性：３０°Ｃにて２４時間保持する
と、ｐＨ７〜９において９０％以上の活性が残存する。

（４）Ｋｍ値：３．２ＸＩＯ−’Ｍ　　（ＮＡＤＨに対
して）（５）分子量および構造二分子量約５万のサブユ
ニット２個から構成される。１個のサブユニットあたり
１分子のＦＡＤを含む。

本発明方法の原理は次式（１）で示される。

ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび０２を含む測定系に上記ＮＡＤ（
Ｐ）ＩＩオキシダーゼを作用させることにより、　ＮＡ
Ｄ（Ｐ）ＩＩはＮＡＤ　（Ｐ）に酸化され、０．はＨ２
０□に還元される。この１１□０□を適当な方法を用い
て測定することにより。

系内に存在するＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈが測定される。本発
明において用いられるＮＡＤ（Ｐ）＋１オキシダーゼと
しては。

上記のように、バチルス属由来のものが好適である。こ
のようなＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈオキシダーゼの至適ｐＨは
。

例えば、上記バチルス　チューリンギエンシス由来のオ
キシダーゼにおいては６．５〜８．０であり。

一般に６〜１１程度の広いｐｎ領域において作用し得る
。これまで、このような酵素反応に使用し得るＮＡＤ　
（Ｐ）　Ｈオキシダーゼとしては酸性〜中性で活性を有
するＮＡＤ　（Ｐ）　Ｉ（オキシダーゼのみが使用され
ていたのに対して、上記オキシダーゼを用いることによ
り中性〜アルカリ領域における酵素反応も可能となった
。本発明方法においては、特にｐＨ７〜１１の範囲にお
ける測定が有利に行われる。上記酵素は、上記のように
、　ＦＡＤの存在下でＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈに対する活性
が高められる。そのため反応系にＦＡＤを共存させるこ
とが有利である。

上記生成する過酸化水素を測定する方法は特に限定され
ないが１反応系に色原体およびパーオキシダーゼ（ＰＯ
Ｄ）を添加して、該色原体を酸化して発色物質を生成さ
せ、これを測定する次式（ＩＩ）の方法が好適である。

このような色原体としては、４−アミノアンチピリンと
、フェノール系化合物、ナフトール系化合物またはアニ
リン系化合物との組合せ；３−ベンゾチアゾリノンヒド
ラゾン（ＭＢＴＨ）とアニリン系化合物との組合せ；ロ
イコメチレンブルー；などが用いられる。特に４−アミ
ノアンチピリンとジメチルアニリンとの組合せが好適で
ある。上記パーオキシダーゼの種類は特に限定されず、
西洋ワサビのパーオキシダーゼなどが好適に用いられる
。

上記方法においては９反応系のｐＨは、パーオキシダー
ゼの至適ｐＨｊＪ［域である５〜８．５とするのが好適
である。

本発明方法を用いてＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈを定量すること
により９間接的にＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈを生じる酵素反応
における基質量を測定することができる。例えば、脱水
素酵素反応を受ける基質にＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈを加えて
おき。

これに脱水素酵素を作用させるとＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈが
生じる。このＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈを測定することにより
上記基質量が算出される。このような系で測定され得る
基質としては、乳酸、グルコース−６−リン酸、アルコ
ース、コレステロール、グルコース、グルタミン酸、イ
ソクエン酸、胆汁酸などが挙げられる。

使用される脱水素酵素としては、乳酸脱水素酵素。

グルコース−６−リン酸脱水素酵素、アルコール脱水素
酵素、コレステロール脱水素酵素、グリセロール脱水素
酵素、グルコース脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素
、イソクエン酸脱水素酵素。

３α−ヒドロキシステロイド脱水素酵素などが挙げられ
る。

ＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈを定量することにより酵素活性を測
定することも可能であり２例えば、タレアチンホスホキ
ナーゼやアミラーゼが容易に測定され得る。

本発明方法によりＮＡＤ（Ｐ）Ｈを定量するには１例え
ば、上記式（Ｉ）および（Ｕ）の順序に従って。

ＮＡＤ　（Ｐ）　Ｉ（と酸素を含む系にＮＡＤ（Ｐ）Ｆ
ｌオキシダーゼを加えて反応させて）１．０．を生成さ
せた後２色原体とパーオキシダーゼとを系内に加えるこ
とにより；あるいは、　ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ、
色原体およびパーオキシダーゼを同時に系内に加えて反
応させることにより、なされる。生成した発色物質は比
色計により測定される。

本発明方法は２通常、上記のようにＮＡＤ（Ｐ）Ｈを定
量することにより、　ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生じる酵素反応
を触媒する酵素活性、または該反応における基質を間接
的に測定するのに用いられる。そのため。

例えば１次のような試薬（ａ）、　（ｂ）および（Ｃ）
をあらかじめ調製しておき、これらを用いて酵素活性ま
たは基質量を簡便に測定することができる：（ａ）脱水
素酵素、　ＮＡＤ（Ｐ）およびＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈオキ
シダーゼ。

（ｂ）ＮＡＤ（Ｐ）およびＮＡＤ（Ｐ）１１オキシダー
ゼ。

（Ｃ）　（、Ｉ　）式により生じる１１□０□を測定す
るための試薬２例えばパーオキシダーゼ、および色原体
（例えば、４−アミノアンチピリンおよびアニリン系化
合物）。

例えば、（ａ）および（Ｃ）を組みあわせることにより
。

胆汁酸、グルコース、コレステロールなどの基質を測定
することができる。そして、（ｂ）および（Ｃ）を組み
あわせることにより、３α−ヒドロキシステロイド脱水
素酵素、グルコース脱水素酵素、コレステロール脱水素
酵素などの酵素活性を測定することができる。上記試薬
（ａ）〜（Ｃ）の形態は、特定されず２例えば、液状の
試薬として、もしくは凍結乾燥品として供給される。液
状の試薬には、そのまま使用し得る濃度で各成分が含有
されていても。

あるいは希釈して使用しうるように高濃度で各成分が含
有されていてもよい。そのまま使用し得る濃度である場
合には２例えばＮＡＤ（Ｐ）ＩＩオキシダーゼの濃度は
、　ｏ、ｏｉ〜１００単位Ｃｕ）７ｍｌであることが望
ましい。ここでＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈオキシダーゼの１単
位は、　ｐＨ７，０，３０°Ｃにおいて１分間にＮＡＤ
Ｈ１μモルを酸化するのに必要とされる酵素量である。

上記試薬にはＰＡＤが同時に配合されることが好ましい
。

本発明方法による定量は個々のサンプルについて行って
もよく、あるいは、上記適当な試薬を適宜利用して多数
のサンプルを自動分析により連続的に処理して測定を行
うことも可能である。

（作用） 本発明によれば、このように、　ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシ
ダーゼを用い、　ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを定量的にＮＡＤ（Ｐ
）と）１２０□に変換し、このＨ２０□を測定すること
によりＮＡＤ（Ｐ）Ｈの高精度の定量がなされ得る。Ｈ
２Ｏ２の定量方法としては、上記のように、パーオキシ
ダーゼと色原体とを用いて、■２０□により色素を生成
させ、該色素を測定する方法が有利である。このように
して生成された色素は、可視領域に吸収を有するため。

生体試料中の物質の干渉を受けることなく、この領域に
おいて測定がなされる。さらに、上記色素は水溶性であ
るという利点を有する。つまり、従来の技術の項で述べ
たホルマザン色素のように。

水に不溶であるために測定器具に付着してこれを汚染す
る。という問題がない。色原体の種類を適宜選択するこ
とにより、測定波長を変えることが可能であ吟、そのた
め、より高感度で測定することが可能となる。

ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを定量することにより、　ＮＡＤ（Ｐ）
Ｈを生じるような酵素活性や基質量の測定が有利になさ
れ得る。特にＮＡＤ（Ｐ）と脱水素酵素を作用させてＮ
ＡＤ（Ｐ）Ｈを生じるような基質や該脱水素酵素の活性
の定量に利用される。例えば、コレステロール、胆汁酸
などのステロイド類、乳酸、グルコースなどの定量が行
われる。本発明で使用するＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ
は、広いｐＨ範囲において安定であるため。

広範囲のｐＨにおいて測定が可能である。

ところで、　ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼとしては、こ
れまでに次の種類が知られている。

■５ｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｆａｅｃａｌｉｓ由
来（Ｄｏｌｉｎ、　Ａｒｃｈ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙ、　＋　４６＋　４８３
＋　（１９５３））　；■Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
　　蛙憇圏匹しＮｏ、１１由来（福井ら、　Ａｇｒ、Ｂ
ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５，８７６、（１９６１））　
　；■Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏ
ｉｄｅｓ由来（小泡ら、Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、９７，１２７９．（１９８５）　）
　　；■Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　肌組圏社即　　由来（サ
エキら、Ｊ、Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ、９８，１４３３．　（
１９８５））　；■Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｔ照皿帥肛
艶餅旦旦由来（特開昭６０−５８０９号）。

これらのうち■〜■および■の酵素は、　ＮＡＤ（Ｐ）
Ｈを酸化するが、過酸化水素を生成する反応を触媒しな
い。■の酵素は１本発明方法と同様式の反応を触媒する
ため、これを使用することも可能ではある。しかし、こ
の酵素はｐＨ安定性、熱安定性などに劣り、さらに微生
物からの該酵素の生産性が低いため、実用的ではない。

従って２本発明方法においては、上記バチルス属由来の
ＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈオキシダーゼが最適である。このよ
うなＮＡＤ（Ｐ）Ｉ＋オキシダーゼを用いて２例えば、
ｐＨを７〜１１の弱アルカリ領域に設定すると、該ｐＨ
領域において高い活性を示す脱水素酵素が作用する基質
の測定が有利になされる。例えば、胆汁酸、コレステロ
ールなどのステロイド系化合物の測定が好適に行われる
。

本発明方法の測定系を利用して生体試料中の各種基質や
酵素を測定することができる。

（実施例） 本発明を以下の実施例および参考例につき説明する。

嚢考Ａ （バチルス　チューリンギエンシスからのＮＡＤ　（Ｐ
）　Ｈオキシダーゼの調製） １％グルコース、１％ペプトン、０．２％酵母エキス、
　０．１％クエン酸ナトリウム、０．２％（ＮＨ４）ｔ
ｓＯ４゜０．６％ＫＨ２ＰＯ４，１，４％に、ＨＰＯ，
、および０．０２％Ｍｇ５Ｏ＜４ＨｚＯを含有するｐＨ
７，０の培地を調製し、該培地を試験管に５ｄずつ分注
した。この試験管に綿栓をし。

１２０″Ｃにて１５分間オートクレーブによる滅菌を行
った。

上記の試験管培地にバチルス　チューリンギエンシスを
１白菌耳接種し、３０°Ｃにて約２０時間振盪培養して
種培養物を得た。５０！容のジャーファーメンタ−に上
記の組成の培地３０１を入れ、１２０°Ｃにて２０分間
蒸気滅菌し、これに上記種培養物３００ｔｎｆｌを植菌
した。回転数３０Ｏｒｐｍおよび通気１３０１７分で、
３０°Ｃにて６時間培養することにより、バチルス　チ
ューリンギエンシスの培養物を得た。この培養物を遠心
分離して菌体を回収し、該菌体を３０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７，２）　　３．２１に懸濁し、菌体破砕機ダイ
ノミルＫＤＬにより菌体破砕した。

得られた菌体破砕液を１２．００Ｏｒｐｍにて連続的に
遠心分離し、上清３．２１を得た。この上清に硫安粉末
を添加して硫安分画を行った。３５％飽和硫安では沈澱
せず、　６０％飽和の硫安で沈澱した両分を集め、　３
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）に溶解した後。

同様のリン酸緩衝液に対して透析を行った。この透析液
を、　３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）で平衡化し
たＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂファルマシア社）
カラム（ｉｆ容量）に吸着させ、　０．２Ｍ　ＮａＣｌ
にて溶出した。ＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈオキシダーゼ活性の
ある溶出画分を集め、　１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７，２）で平衡化したウルトロゲルＡＣＡ３４にてゲル
濾過を行った。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ活性のある
溶出画分を限外濾過して濃縮し、　５０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７，２）に対して透析した。この透析液を、　
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐｉｆ７．２）で平衡化した５
’−ＡＭＰ−セファロース４ＢＣ（ファルマシア社）カ
ラムに吸着させ、非吸着画分を洗浄除去した後、　０．
５Ｍ　ＮａＣ１を含有する５０＋ｓＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，２）で溶出した。ＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈオキシダー
ゼ活性画分を、　１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，２
）で平衡化したセファクリルＳ−２００（ファルマシア
社）にてゲル濾過し、　ＮＡＤ（Ｐ）ＩＩオキシダーゼ
活性のある両分を集めて限外濾過することにより濃縮し
た。この濃縮液を精製ＮＡＤ（Ｐ）ｌオキシダーゼ酵素
溶液とした。

この精製ＮＡＤ（Ｐ））ｌオキシダーゼ酵素溶液をＳＯ
３−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけると、単一
のバンドが示された。上記精製ＮＡＤ（Ｐ）ｌオキシダ
ーゼ酵素溶液の力価は、比活性として表すと６０ｕ／１
ｍｇタンパクであった。ＮＡＤ　（Ｐ）　＋（オキシダ
ーゼの力価測定法は次のとおりである。

ＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈオキシダーゼ力価測定法：　２５０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐｉ４７．０）２．５１ｄに、　２
ｍＭ　ＮＡＤＨ溶液０．３ｍｌおよび１ｍＭＦＡＤ溶液
０　、１　ｍｌを添加し、これを反応液１とする。この
反応液１を３０°Ｃで予備加温し、　ＮＡＤ（Ｐ）Ｉｔ
オキシダーゼ溶液０．１ｄを添加して３０°Ｃで酵素反
応を開始させる。同温度でインキュベートすることによ
り反応時間あたりに消費されるＮＡＤＨＯ量を、　３４
０ｎ…における吸光度の変化として測定する。上記反応
条件において。

１分間に１μモルのＮＡＤＨを酸化するのに必要とされ
る酵素量を１単位（ｕ）とする。

バチルス　チューリンギエンシス以外のバチルス属に属
するＮＡＤ　（Ｐ）　１１オキシダーゼ生産菌（例えば
。

前述のバチルス　リケニホルミス、バチルスズブティリ
スなど）からも、上記調製法によりＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキ
シダーゼを調製することが可能であった。

以下の実施例および比較例においては、上記参考例の方
法で調製した精製ＮＡＤ（Ｐ）ｌオキシダーゼ酵素溶液
を、　１００ｍＭリン酸緩衝液で希釈して０．１ｕ／ｍ
ｌとし、これをＮＡＤ（Ｐ）ｌオキシダーゼ酵素溶液と
して種々の測定に使用した。

尤Ｕ硼上 （ＮＡＤ（Ｐ））ＩオキシダーゼによるＮＡＤＨ（７）
消費および！１□０２の生成の確認） ＮＡＤ　（Ｐ）　ＨオキシダーゼによりＮＡＤＩＩが消
費され。

それと同時に１１□０ｚが生成されることを確認するた
めに、以下の組成を有する試薬Ａおよび試薬Ｂを調製し
て用いた。

（以下余白） 試且人＝ ２ｍＭ　　ＮＡＤＨ溶液　　　　　　　　　　　　０．
３ｄ１ｍＭ　　ＦＡＤ　　　　　　　　　　　　　　　
　　０．ｌｌｌ１１２５０ｗＭリン酸緩衝液、　ｐｔ１
７．０　　　　　　２．５ｍｌ！μ”ｓｙ： ０．３％　４−アミノアンチピリン水溶液　０．１ｍ０
６２％Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリンｏ、２Ｉｄ（０，０１
Ｎ塩酸溶液） パーオキシダーゼ溶液　　　　　　　　０．ＩＪ１１！
（５０ｕ／３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０））２５
０ｍＭ’Ｊ　ン酸緩衝液、　ｐＨ７，００，２ＩＩｄｌ
試薬Ａを３０’Ｃで予備加温した後、（ｉ）バチルス　
チューリンギエンシス由来のＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈオキシ
ダーゼ溶液０．１ｄを添加し、　３０″Ｃで１２分間反
応させた。この反応液（これを反応系（ｉ）とする）の
３４０ｒ＋＋＋＋における吸光度を経時的に測定するこ
とにより、　ＮＡＤＨＩを直接測定した。別に、　ＮＡ
Ｄ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ溶液の代わりに精製水を添加し
た系を調製しくこれを反応系（ｉｉ）とする）同様の測
定を行った。その結果を第１図に示す。精製水を添加し
た（ＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈオキシダーゼ無添加の）反応系
（ｉｉ　）の吸光度は変化がなかったが、　ＮＡＤ（Ｐ
）Ｈオキシダーゼを添加した反応系（ｉ）の吸光度は１
゜分取内に０．０となり、　ＮＡＤＩＩがＮＡＤ（Ｐ）
　Ｈオキシダーゼにより消費されたことが示された。

次いで、上記（ｉ）および（ｉｉ）の反応系０．２５戚
および精製水０．１５＃！１！を上記試薬Ｂ　Ｏ，６ｍ
に添加し、室温にて１０分間反応させた。これに、脱イ
オン水２緘を添加して全量を３　ａｌｌとし、　　５４
０ｎｍにおける吸光度を測定した。上記試薬Ａの代わり
に既知濃度のＨｚＯ□溶液０．２５ｍｊ！を用いて、上
記と同様に試薬Ｂと反応させ、Ｈ２０□の検量線を作成
した。この検量線により１１□０□量を算出した。この
ように。

（ｉｉ　）の反応系にはｎｚｏ□が生成されていること
が確認された。

実施ｆｌ （ＮＡＤＨの定量） 以下の組成を有する試薬Ｉおよび試薬■を調製した。た
だし、試薬ｌに含有されるＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈオキシダ
ーゼとしては、バチルス　リケンスホルミス由来の酵素
を用いた。

ＭＪＬＬ： （終濃度） ＮＡＤ（Ｐ）＋１オキシダーゼ溶液　　　　　０．１ｕ
／１ｆｆｉＦＡＤ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１　ｍＭリン酸緩衝液、　ｐＨ７，０５０ｍＭ 拭Ｊ↓： （終濃度） パーオキシダーゼ　　　　　　　　　　１０ｕ／ｍｎ４
−アミノアンチピリン　　　　　　　　０．００５％ジ
スルホブチル−ｍ−トルイジン（ＤＳＢｍＴ）　０．０
２％リン酸緩衝液、　ｐＨ７，０５０ｍＭ ＮＡＤＨをそれぞれ５０．　１００および２００μＨの
濃度となるようにそれぞれ０．２Ｍ　）リス塩酸緩衝液
（ｐ１１８．０）に溶解し、標準溶液とした。この標準
溶液を０．３ｍｌずつ採り、試薬Ｉを２．４ｍｌ添加し
て３７°Ｃの恒温槽内で５分間インキュベートした。こ
の溶液に試薬■を０　、６　ｍｌ添加し、３７°Ｃで５
分間インキュベートした後、　　５５５ｎｍにおける吸
光度を測定した。

この測定においては、　ＮＡｏ＋＋［度をＯμ門とした
試薬盲検を対照とした。このＮＡＤＩ＋検量線を第２図
に示す。

実新ｌ肘 （血清中の遊離コレステロールの定量）血清中の遊離コ
レステロールを定量するために。

以下の組成を有する試薬Ｉおよび試薬■を調製して用い
た。ただし、試薬Ｉに含有されるＮＡＤ（Ｐ）＋１オキ
シダーゼ溶液はバチルス　ズブティリス由来の酵素を用
いた。

戚粂土： （終濃度） コレステロール脱水素酵素　　　　　０．５ｕ／滅ＮＡ
Ｄ　　’　　　　　　　　　　　　　　　　　　２ｍＭ
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ溶液　　　　　０．１ｕ／
ｍＲＦＡＤ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１ｍＭジスル
ホブチル−ｍ−トルイジン（ＤＳＢｍＴ）　　０．０２
％トリトンＸ−１０００，０５％ リン酸緩衝液、　ｐＨ７，０５０ｍＭ ＭＪＬＬ： （終濃度） パーオキシダーゼ　　　　　　　　　　１０ｕ／ｍｆ４
−アミノアンチピリン　　　　　　　　ｏ、ｏｏｓ％リ
ン酸緩衝液、　ｐＨ７，０５０＋＋＋Ｍ血清２５μ２を
採取し、試薬Ｉを２．４ｔｎｌ添加して３７°Ｃにて５
分間インキュベートした。この溶液に試薬■を０　、６
　ｍｌ添加し、３７°Ｃにて５分間インキュベートした
後、　　５５５ｒｖ＋における吸光度を測定した。

この測定は、血清の代わりに上記リン酸緩衝液を用いた
試薬盲検を対照として行った。別に、コレステロール標
準液（０〜１００　ｍｇ／　ａ　）を調製し。

上記血清の場合と同様に操作して吸光度を測定し。

検量線を作成した。このコレステロールの検量線を第３
図に示す。この検量線から血清中のコレステロール濃度
を算出した。この方法で測定した血清中遊離コレステロ
ール値は、以下の比較例に示す従来法を用いた測定値と
良好な相関を示し、従来法と同様に日常検査に使用し得
ることがわがつた。本実施例および比較例の方法の相関
図を第４回に示す。

比較例 （コレステロールオキシダーゼを用いた血清中の遊離コ
レステロールの定量） ＮＡＤ（Ｐ）ＩＩオキシダーゼを含まない反応系を用い
て血清中の遊離コレステロールの定量を行い、実施例３
の測定値との比較を行った。

次の組成を有する発色試薬の調製を行った。

発負拭果： （終濃度） コレステロールオキシダーゼ　　　　５ｕ／ｄ１パーオ
キシダーゼ　　　　　　　　　１５ｕ／ｄ１４−アミノ
アンチピリン　　　　　　　０．０２５％ジスルホブチ
ル−ｍ−）ルイジン（ＤＳＢｍＴ）０．０３％ トリトンＸ−１０００，１５％ グツド緩衝液、　ｐＨ６，。

実施例３で使用したのと同一の血清を５０μｌ準備し、
これに、上記発色試薬３　ｍｆｌを添加し、３７°Ｃに
て１０分間インキュベートした。この溶液の６００ｎｍ
における吸光度を、血清の代わりにグツド緩衝液（ｐＨ
６，０）５０μｌを用いた試薬盲検を対照として測定し
た。別に、実施例３と同濃度のコレステロール標準液を
用いて検量線を作成し、血清中のコレステロール濃度を
算出した。

１！１ｌ− （血清中の総胆汁酸の定量） 血清中の総胆汁酸を定量するために、以下の組成を有す
る試薬Ｉおよび試薬■を調製した。試薬Ｉに含有される
ＮＡＤ（Ｐ）１１オキシダーゼとしては。

バチルス　セレウス由来の酵素を用いた。

（以下余白） 拭果士： （終濃度） ３α−ヒドロキシステロイド脱水素酵素０．２ｕ／ｍｌ
１ ＮＡＤ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　２　ｍＭＮＡＤＨオキシ
ダーゼ溶液　　　　　　０．１ｕ／ｍＮＦＡＤ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　１　ｍＭトリドア　Ｘ−
１０００，１％ リン酸緩衝液、　ｐＨ７，０５０ｍＭ 拭１１： （終濃度） パーオキシダーゼ　　　　　　　　　　１０ｕ／ｍＲ４
−アミノアンチピリン　　　　　　　　ｏ、ｏｉ％ジス
ルホブチ）Ｌｔ−ｍ、　）　ルイジ７　（ＤＳＢｍＴ）
　　０．０２％リン酸緩衝液、　ｐＨ７，０５０ｍＭ 血清１００μ！を採取し、試薬Ｉを２　ｍｌ添加して３
７゛Ｃにて５分間インキュベートした。この溶液に試薬
■をＩ　Ｉｎｌ添加し、３７°Ｃにて５分間インキュベ
ートした後、　　５５５ｎｍにおける吸光度を測定した
。

この測定は、血清の代わりに上記リン酸緩衝液を用いた
試薬盲検を対照として行った。別に、グリコールＭ’Ｊ
Ａ準液（２５，５０，７５，１００ｕＭ）ヲｇＪｌ製り
。

上記血清の場合と同様に操作して吸光度を測定し。

検量線を作成した。この検量線を第５図に示す。

この検量線から血清中の総胆汁酸濃度を算出した。

尖施開工 （血中のグルコースの定量） 血中のグルコースを定量するために、以下の組成を有す
る試薬■および試薬■を調製した。試薬Ｉに含有される
ＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈオキシダーゼとしては。

バチルス　プミルス由来の酵素を用いた。

（以下余白） ＬＴＬＬ＝ （終濃度） へキソキナーゼ　　　　　　　　　　３ｕ／ｄｌｌ八Ｔ
Ｐ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　１　ｍＭＧ−６−ＰＤＨ１０ｕ／
ｄ１ ＮＡＤＰ　　　　　　　　　　　　　　　　　　１　ｍ
ＭＦＡＤ　　　’　　　　　　　　　　　　　　　　１
ｍＭＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈオキシダーゼ溶液　　　　０．
１ｕ／ｍＡＭｇＣｈ　　　　　　　　　　　　　　　　
Ｏ，０１Ｍトリエタノールアミン−ＨＣｌ −Ｎａ０ｆ（緩衝液＋ｐｌ（７，５０，１Ｍパゑ工： （終濃度） パーオキシダーゼ　　　　　　　　　１０ｕ／Ｉｄロイ
コメチレンブルー　　　　　　　　２ｍＭトリエタノー
ルアミン−ＨＣｌ −ＮａＯＨ緩衝液、　ｐＨ７，５０，１Ｍ溶血させた血
液５μ！を準備し、試薬■を２．４ｍｌ添加して３７°
Ｃにて１０分間インキュベートした。

この溶液に試薬■を０．６滅添加し、３７°Ｃにて５分
間インキュベートした後、　　６００ｎｍにおける吸光
度を測定した。この測定は、血液の代わりに上記緩衝液
を用いた試薬盲検を対照として行った。別に。

グルコース標準液（０〜１．０００　ｍｇ／ｄ１）を調
製し。

上記血液の場合と同様に操作して吸光度を測定し。

検量線を作成した。この検量線を第６図に示す。

この検量線から血中のグルコース濃度を算出した。

（発明の効果） 本発明によれば、このように、　ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの定量
が精度良く簡単な操作で行われる。末法を用いると広い
ｐ）ｌ範囲における測定が可能であるため、酵素反応に
よりＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈを生成する基質や酵素の測定が
有利に行われ得る。特に９本法において生成する過酸化
水素をパーオキシダーゼの存在下で色原体に作用させ１
色素として測定する方法が好適である。この方法では比
色定量により測定がなされるため、汎用の比色計を用い
た本発明方法により２例えば、生体由来試料中の各種基
質や酵素が効果的に測定される。

４、パ　の　単な９′Ｈ 第１図は実施例１で得られたＮＡＤＨの消費曲線を表す
グラフ；第２図は実施例２で得られたＮＡＤＨの検量線
を表すグラフ；第３図は実施例３で得られたコレステロ
ールの検量線を表すグラフ；第４図は実施例３および比
較例の方法で得られた結果の相関を示すグラフ；第５図
は実施例４において血清中の総胆汁酸を定量するために
作成された検量線を表すグラフ；第６図は実施例５にお
いて血中のグルコースを定量するために作成された検量
線を表すグラフである。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、試料中に存在するか、もしくは酵素反応によって生
   成する還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（
   ＮＡＤＨ）および／または還元型ニコチンアミドアデニ
   ンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰＨ）を定量す
   る方法であって、 （Ａ）該試料および酸素を含有する反応系に、ＮＡＤＨ
   および／またはＮＡＤＰＨの酸化を特異的に触媒する酵
   素を添加し、ｐＨ７〜１１の範囲で反応を行って、ＮＡ
   Ｄおよび／またはＮＡＤＰと過酸化水素とを生成させる
   工程；および （Ｂ）該生成した過酸化水素を測定する工程、を包含す
   るＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの定量法。 ２、さらに、 （Ｃ）前記過酸化水素が生成した反応系に色原体および
   パーオキシダーゼを添加し、該色原体を酸化し発色物質
   を生成させる工程；および （Ｄ）該発色物質を測定する工程、 を包含する特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、前記ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの酸化を特
   異的に触媒する酵素がバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属
   菌に由来する、特許請求の範囲第１項に記載の方法。