JPH02234698A - 細菌ルシフェラーゼ系によるｄｎａプローブの検出法 - Google Patents
細菌ルシフェラーゼ系によるｄｎａプローブの検出法Info
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- JPH02234698A JPH02234698A JP5390289A JP5390289A JPH02234698A JP H02234698 A JPH02234698 A JP H02234698A JP 5390289 A JP5390289 A JP 5390289A JP 5390289 A JP5390289 A JP 5390289A JP H02234698 A JPH02234698 A JP H02234698A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は核酸のハイプリダイゼーシジンを利用して、特
定の塩基配列を同定するＤＮＡプローブ法におけるＤＮ
Ａプローブの検出方法に関する。
定の塩基配列を同定するＤＮＡプローブ法におけるＤＮ
Ａプローブの検出方法に関する。
〔従来の技術および発明が解決しようとする課題〕酵素
を標識したＤＮＡプローブを核酸の特定配列の同定のた
めに用いることは、ラジオアイソトープを標識する方法
に代るＤＮＡプローブ検出法として近年広く検討されて
いる。とりわけ、酵素標識により対象物質を検出するこ
とは、免疫反応において酵素免疫測定法として広く実施
され、ラジオアイソトープと同等感度もしくはそれを上
まわる感度の検出系を実現している。酵素標識のうちで
もアルカリフォスファターゼを標識することは該酵素の
ターンオーバー数の大きさ（比活性の大きさが目安とな
る）により、高活性が期待され、事実標識に伴う酵素の
安定性も含めてアルカリフォスファターゼが、標識系に
選ばれることが多い。
を標識したＤＮＡプローブを核酸の特定配列の同定のた
めに用いることは、ラジオアイソトープを標識する方法
に代るＤＮＡプローブ検出法として近年広く検討されて
いる。とりわけ、酵素標識により対象物質を検出するこ
とは、免疫反応において酵素免疫測定法として広く実施
され、ラジオアイソトープと同等感度もしくはそれを上
まわる感度の検出系を実現している。酵素標識のうちで
もアルカリフォスファターゼを標識することは該酵素の
ターンオーバー数の大きさ（比活性の大きさが目安とな
る）により、高活性が期待され、事実標識に伴う酵素の
安定性も含めてアルカリフォスファターゼが、標識系に
選ばれることが多い。
また、その反応基質として、外部にリン酸基を有するも
のならアルカリフォスファターゼの基質になるため、吸
光法のみならず蛍光法による検出法にも適した酵素であ
る。しかし基質を選定する際、該酵素の至適反応条件に
近いｐＨで自然分解のない安定な基質を選定することが
、検出系のブランクを低下させ、検出を高感度化するた
めに必須な条件である。
のならアルカリフォスファターゼの基質になるため、吸
光法のみならず蛍光法による検出法にも適した酵素であ
る。しかし基質を選定する際、該酵素の至適反応条件に
近いｐＨで自然分解のない安定な基質を選定することが
、検出系のブランクを低下させ、検出を高感度化するた
めに必須な条件である。
更に検出系を高感度化するために発光法を用いることが
アルカリフォスファターゼ活性、ひいては該酵素標識物
の検出を高感度に行うため有利であることはいうまでも
ない。ここで、リン酸結合型発蛍光物質（例えばウンベ
リフェリルリン酸）から、リン酸が遊離され、生成する
蛍光物質をシュウ酸ジエステルと過酸化物（ＨｚＯ２）
と酸化触媒（ベルオキシダーゼなど）により化学発光さ
せ高感度系を実現できることは、原理的に可能である。
アルカリフォスファターゼ活性、ひいては該酵素標識物
の検出を高感度に行うため有利であることはいうまでも
ない。ここで、リン酸結合型発蛍光物質（例えばウンベ
リフェリルリン酸）から、リン酸が遊離され、生成する
蛍光物質をシュウ酸ジエステルと過酸化物（ＨｚＯ２）
と酸化触媒（ベルオキシダーゼなど）により化学発光さ
せ高感度系を実現できることは、原理的に可能である。
しかし、自然氷解を受けない安定なリン酸化発蛍光物質
により実施されなければならず、化学発光での検出感度
の向上は蛍光法と同程度もしくは１０倍程度の高感度化
が実現されるにすぎない。
により実施されなければならず、化学発光での検出感度
の向上は蛍光法と同程度もしくは１０倍程度の高感度化
が実現されるにすぎない。
そこで、本発明者らはアルカリフォスファターゼを標識
とするＤＮＡプローブの検出系において、より高感度な
発光法による検出法を開発すべく鋭意研究を行った。
とするＤＮＡプローブの検出系において、より高感度な
発光法による検出法を開発すべく鋭意研究を行った。
核酸のハイブリダイゼーションにおいては、非特異的な
吸着及びハイブリダイゼーションの正確性及び効率性の
ため、６０゜Ｃ付近の高温にて、標識酵素をとり扱い、
また、洗浄に苛酷な界面活性剤（例えばＳＤＳ）が用い
られる。そして、この核酸のハイブリダイゼーションに
おけるＤＮＡプローブの標識酵素としては、このような
ハイブリダイゼーション条件に耐える高活性なアルカリ
フォスファターゼが用いられる。本発明者らは、この高
活性のアルカリフォスファターゼの特性と、苛酷なハイ
ブリダイゼーション条件を考慮しつつ、該酵素の検出系
を高惑度な発光系と結合することにより高惑度な方法を
見出し、本発明を完成した。
吸着及びハイブリダイゼーションの正確性及び効率性の
ため、６０゜Ｃ付近の高温にて、標識酵素をとり扱い、
また、洗浄に苛酷な界面活性剤（例えばＳＤＳ）が用い
られる。そして、この核酸のハイブリダイゼーションに
おけるＤＮＡプローブの標識酵素としては、このような
ハイブリダイゼーション条件に耐える高活性なアルカリ
フォスファターゼが用いられる。本発明者らは、この高
活性のアルカリフォスファターゼの特性と、苛酷なハイ
ブリダイゼーション条件を考慮しつつ、該酵素の検出系
を高惑度な発光系と結合することにより高惑度な方法を
見出し、本発明を完成した。
本発明は、アルカリフォスファターゼを標識したＤＮＡ
ブローブにＮＡＤＰ”．を反応させ、生成するＮＡＤ”
にアルコールおよびアルコール脱水素酵素を反応させて
ＮＡＤＨに変換し、該ＮＡＤＨを細菌由来のフラビン還
元酵素およびルシフェラーゼを用いて、発光強度として
測定するこを特徴とする細菌ルシフェラーゼ系によるＤ
ＮＡブローブの測定法である。
ブローブにＮＡＤＰ”．を反応させ、生成するＮＡＤ”
にアルコールおよびアルコール脱水素酵素を反応させて
ＮＡＤＨに変換し、該ＮＡＤＨを細菌由来のフラビン還
元酵素およびルシフェラーゼを用いて、発光強度として
測定するこを特徴とする細菌ルシフェラーゼ系によるＤ
ＮＡブローブの測定法である。
すなわち、本発明は、ＤＮＡブローブの検出法において
、高感度化を実現するため、生物発光法による高感度検
出を実現する方法である。まず、アルカリフォスファタ
ーゼの基質であってその生成物が生物発光法、とくには
、発光細菌の発光系酵素の基質に転換しうるものであり
、かつ基質ブランクが発光検出においてきわめて小さい
ことが、発光検出の精度を維持する上で必要なため、ア
ルカリフォスファターゼが該基質に小さいｈ値を示し、
かつ基質の反応条件における自然氷解（脱リン酸）が小
さいものが基質として選ばれなければならない。上記条
件をみたす基質としてＮＡＤＰ”（ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドリン酸）を用いることが良いことを
、探索の結果見出した。
、高感度化を実現するため、生物発光法による高感度検
出を実現する方法である。まず、アルカリフォスファタ
ーゼの基質であってその生成物が生物発光法、とくには
、発光細菌の発光系酵素の基質に転換しうるものであり
、かつ基質ブランクが発光検出においてきわめて小さい
ことが、発光検出の精度を維持する上で必要なため、ア
ルカリフォスファターゼが該基質に小さいｈ値を示し、
かつ基質の反応条件における自然氷解（脱リン酸）が小
さいものが基質として選ばれなければならない。上記条
件をみたす基質としてＮＡＤＰ”（ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドリン酸）を用いることが良いことを
、探索の結果見出した。
ＮＡＩ）Ｐ”がアルカリフォスファターゼの基質であり
、氷解反応によりＮＡＩ）”（ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド）が生成することは文献（Ｌｅｏｎ Ａ
．Ｈｅｐｐｅｌら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｌｉ．Ｖｏｌ
． ２３７， ｐ８４１８４６， １９６ｉ）により示
されているが、アルカリフォスファターゼのＮＡＤＰ＋
に対するｂが、吸光法に用いられる好適な基質ｐ−ニト
ロフェニルリン酸より小さいことが検討した結果判明し
た。ｂ値の小さい基質を用いることは、アルカリフォス
ファターゼ反応に対し、少ない基質量で最大活性をうる
ことができ、少ない基質量を用いることで非酵素的反応
によるＮＡＤ”の生成量を少なくし、発光反応における
、基質によるブランクアップを最小限にすることが可能
となる。次に生成したＮＡＤ”を細菌発光系の基質であ
るＮＡＤＨに転換する時、ＮＡＤＰ″過剰存在下に選択
的に生成したＮＡＤ＋のみをＮＡＤＨに還元することの
できる酵素として、イースト由来のアルコール脱水素酵
素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．１） （例えばベーリンガー
・マンハイム社製の酵素）がＮＡＤ”に特異的に作用す
ることが知られている。しかもこのアルコール脱水素酵
素は基質であるエチルアルコールの存在下にアルカリ性
条件下で作用・し、エチルアルコールの必要濃度はアル
カリフォスファターゼ活性に何ら障害とならないため、
極めて有利な酵素であり、一一の反応系において、アル
カリフォスファタ−ゼにより生成するＮＡＤ”をアルコ
ール脱水素酵素との共役により逐次ＮＡＤＨに転換せし
めることが可能である。かつ、該アルコール脱水素酵素
は該酵素に含まれるフォスファターゼ及びＮＡＤ・分解
酵素（ＮＡＤａｓｅ）の混在量が極めて少ないため、非
特異反応の防止上有利である。かくして、生成し蓄積し
たＮＡＤＨ量をＦＭＮ （フラビンモノヌクレオチド）
、長鎖アルデヒド及び酸素の存在下、発光細菌より得ら
れるフラビンレダクターゼ及びルシフェラーゼにより、
反応させて、短時間で、例えば約７秒前後で迅速に発光
強度をピーク高さとして測定することにより、該アルカ
リフォスファターゼ存在量、酵素標識したＤＮＡプロー
ブ量ひいては該ＤＮＡプローブとハイブリッドした核酸
配列量を測定することができる。上記したアルコール脱
水素酵素はイースト由来のものと同等の性質を有するも
のであれば、イースト由来のものに限定されない。例え
ばウマ肝臓由来のアルコール脱水素酵素を用いることも
できる。なお、上記した発光細菌としては、ビブリオ・
ハーベアイ（Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ）やビブリ
オ・フィッシャライ （Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒ
ｉ） （ＡＴＣＣ ７７４４）が挙げられ、上 記発光
細菌の分類については、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．４， ｐ．１２７（１９８０）
に記載されている。
、氷解反応によりＮＡＩ）”（ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド）が生成することは文献（Ｌｅｏｎ Ａ
．Ｈｅｐｐｅｌら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｌｉ．Ｖｏｌ
． ２３７， ｐ８４１８４６， １９６ｉ）により示
されているが、アルカリフォスファターゼのＮＡＤＰ＋
に対するｂが、吸光法に用いられる好適な基質ｐ−ニト
ロフェニルリン酸より小さいことが検討した結果判明し
た。ｂ値の小さい基質を用いることは、アルカリフォス
ファターゼ反応に対し、少ない基質量で最大活性をうる
ことができ、少ない基質量を用いることで非酵素的反応
によるＮＡＤ”の生成量を少なくし、発光反応における
、基質によるブランクアップを最小限にすることが可能
となる。次に生成したＮＡＤ”を細菌発光系の基質であ
るＮＡＤＨに転換する時、ＮＡＤＰ″過剰存在下に選択
的に生成したＮＡＤ＋のみをＮＡＤＨに還元することの
できる酵素として、イースト由来のアルコール脱水素酵
素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．１） （例えばベーリンガー
・マンハイム社製の酵素）がＮＡＤ”に特異的に作用す
ることが知られている。しかもこのアルコール脱水素酵
素は基質であるエチルアルコールの存在下にアルカリ性
条件下で作用・し、エチルアルコールの必要濃度はアル
カリフォスファターゼ活性に何ら障害とならないため、
極めて有利な酵素であり、一一の反応系において、アル
カリフォスファタ−ゼにより生成するＮＡＤ”をアルコ
ール脱水素酵素との共役により逐次ＮＡＤＨに転換せし
めることが可能である。かつ、該アルコール脱水素酵素
は該酵素に含まれるフォスファターゼ及びＮＡＤ・分解
酵素（ＮＡＤａｓｅ）の混在量が極めて少ないため、非
特異反応の防止上有利である。かくして、生成し蓄積し
たＮＡＤＨ量をＦＭＮ （フラビンモノヌクレオチド）
、長鎖アルデヒド及び酸素の存在下、発光細菌より得ら
れるフラビンレダクターゼ及びルシフェラーゼにより、
反応させて、短時間で、例えば約７秒前後で迅速に発光
強度をピーク高さとして測定することにより、該アルカ
リフォスファターゼ存在量、酵素標識したＤＮＡプロー
ブ量ひいては該ＤＮＡプローブとハイブリッドした核酸
配列量を測定することができる。上記したアルコール脱
水素酵素はイースト由来のものと同等の性質を有するも
のであれば、イースト由来のものに限定されない。例え
ばウマ肝臓由来のアルコール脱水素酵素を用いることも
できる。なお、上記した発光細菌としては、ビブリオ・
ハーベアイ（Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ）やビブリ
オ・フィッシャライ （Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒ
ｉ） （ＡＴＣＣ ７７４４）が挙げられ、上 記発光
細菌の分類については、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．４， ｐ．１２７（１９８０）
に記載されている。
該発光細菌からフラビン還元酵素を得る方法は例えばＪ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ ｖｏｌ．２４７， ｐ．３９８−４０４（
１９７２）に記載されている。またフラビン還元酵素を
得る方法は例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＆Ｃｅｌｌｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｖｏ１．４４，ｐ．
１８１−１８７（１９８２）に記載されている。ここで
発光検出に用いるフラビンレダクターゼ及びルシフェラ
ーゼには、フォスファターゼ及びアルコール脱水素酵素
、更にはＮＡＤＨ分解反応を惹起する成分が含まれない
ため、ＮＡＤＨ量を発光量として正しく検出できたこと
はいうまでもない。更には共役反応に用いたアルコール
脱水素酵素、フラビンレダクターゼ、゛ルシフェラーゼ
試薬が残存する界面活性剤に影響されないことも本発明
の大きな利点である。
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ ｖｏｌ．２４７， ｐ．３９８−４０４（
１９７２）に記載されている。またフラビン還元酵素を
得る方法は例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＆Ｃｅｌｌｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｖｏ１．４４，ｐ．
１８１−１８７（１９８２）に記載されている。ここで
発光検出に用いるフラビンレダクターゼ及びルシフェラ
ーゼには、フォスファターゼ及びアルコール脱水素酵素
、更にはＮＡＤＨ分解反応を惹起する成分が含まれない
ため、ＮＡＤＨ量を発光量として正しく検出できたこと
はいうまでもない。更には共役反応に用いたアルコール
脱水素酵素、フラビンレダクターゼ、゛ルシフェラーゼ
試薬が残存する界面活性剤に影響されないことも本発明
の大きな利点である。
上記の反応は、以下の反応式にまとめることができる。
？ＭＮＩＩ■＋Ｃ−ＲＣＨＯ＋Ｏｚ
ＦＭＮ＋Ｃ−ＲＣＯＯ旧ｏｚｏ＋ｈ νここでｈ
νは光量を示す。（上記の式中、ＲＣＨＯは長鎖アルデ
ヒドを示し、例えばデカナールである。
ＦＭＮ＋Ｃ−ＲＣＯＯ旧ｏｚｏ＋ｈ νここでｈ
νは光量を示す。（上記の式中、ＲＣＨＯは長鎖アルデ
ヒドを示し、例えばデカナールである。
ＲＣＯＯＨは長鎖カルボン酸を示し、例えばデカン酸で
ある。
ある。
本発明の検出法ではナイロン膜上に標的ＤＮＡを変性さ
せ一本鎖として固定した上、アルカリフォスファターゼ
標識のＤＮＡプローブをハイブリダイズさせたものを試
料として用いる。そして、既知量の標的ＤＮＡをあらか
じめ固定しハイブリダイズさせることにより検量線を作
成し、未知試料中の標的ＤＮＡ量を知ることができる。
せ一本鎖として固定した上、アルカリフォスファターゼ
標識のＤＮＡプローブをハイブリダイズさせたものを試
料として用いる。そして、既知量の標的ＤＮＡをあらか
じめ固定しハイブリダイズさせることにより検量線を作
成し、未知試料中の標的ＤＮＡ量を知ることができる。
以下に実施例により本発明を詳しく説明する。
但し、本発明はこれら実施例に限定されるものでない。
〔実施例１〕
ＨＳＶ−ｇｅｎｅｒｉｃの特異配列を組込んだプラスミ
ドをコントロール・プラスミドとして用意し、蒸留水に
て希釈系列を作った。これらに等量の０．６ＮＮａＯＨ
を加え１５分間室温に放置した後、７５ｕ１をドット・
プロットした。ドット・プロットされたナイロン膜は２
０ＸＳＳＣ （１７５ｇ Ｎａｃｌ， ８８ｇクエン酸
ナトリウム／１）を４倍希釈した（５ Ｘ ＳＳＣ）バ
ッファーにて軽く洗浄し、８０゜Ｃ３０分間乾燥した。
ドをコントロール・プラスミドとして用意し、蒸留水に
て希釈系列を作った。これらに等量の０．６ＮＮａＯＨ
を加え１５分間室温に放置した後、７５ｕ１をドット・
プロットした。ドット・プロットされたナイロン膜は２
０ＸＳＳＣ （１７５ｇ Ｎａｃｌ， ８８ｇクエン酸
ナトリウム／１）を４倍希釈した（５ Ｘ ＳＳＣ）バ
ッファーにて軽く洗浄し、８０゜Ｃ３０分間乾燥した。
これをドットに従い、３ＩＩＩ［Ｉ１径に切り抜き、ハ
イブリダイゼーション・バｙ ７ ７ （２０ＸＳＳ
Ｃに５ｇＢＳＡ，５ｇポリビニルピロリドン、Ｌｏｇ
ＳＯＳを加える）を加え、６０゜Ｃ，１５分間加温し、
１ ｍｌｌハイブリダイゼーション・バッファーに対し
、５μ２のアルカリフォスファターゼ標識ＤＮＡプロー
ブ５μｌ （５０ｎｇＤＮＡ／ｍｆｆ）を加えて、更
に６０゜ｃ，１５分間加温した。
イブリダイゼーション・バｙ ７ ７ （２０ＸＳＳ
Ｃに５ｇＢＳＡ，５ｇポリビニルピロリドン、Ｌｏｇ
ＳＯＳを加える）を加え、６０゜Ｃ，１５分間加温し、
１ ｍｌｌハイブリダイゼーション・バッファーに対し
、５μ２のアルカリフォスファターゼ標識ＤＮＡプロー
ブ５μｌ （５０ｎｇＤＮＡ／ｍｆｆ）を加えて、更
に６０゜ｃ，１５分間加温した。
次に洗浄は室温にて１ ｘ ｓｓＣ（１／２０希釈）に
ｌ％ＳＤＳを加え、５分間２回振騰しておこなった。次
に１％トリトンＸ−１００をＩＸＳＳＣに加えた洗浄液
ｌ０ で６０″Ｃ， ５分間洗浄し、室温に戻して更に上記
バッファーで２回洗浄し、最後に１ｘｓｓｃにし室温５
分間２回洗浄した。試料量は１２．３ｎｇ （１．４
Ｘ １０９コピー）を希釈して用いた。
ｌ％ＳＤＳを加え、５分間２回振騰しておこなった。次
に１％トリトンＸ−１００をＩＸＳＳＣに加えた洗浄液
ｌ０ で６０″Ｃ， ５分間洗浄し、室温に戻して更に上記
バッファーで２回洗浄し、最後に１ｘｓｓｃにし室温５
分間２回洗浄した。試料量は１２．３ｎｇ （１．４
Ｘ １０９コピー）を希釈して用いた。
このようにして、試料ＤＮＡの希釈系列に従って作製し
た標識ＤＮＡプローブをパイプリダイズさせたｄ ｉｓ
ｃを円筒形の容器に納めた。次いで２５μｌの２ｕ／ｍ
アルコール脱水素酵素、２１ｍＭエチルアルコール及び
ｉｏｏμＭ ＮＡＤＰ“を加えた０．５ｍＭ ＭｇＣｌ
２を含む２０ｍＭトリスー塩酸バッフ７−ｐＨ８．５を
加え、２５”ＣＩ時間反応させた。反応後、２０μｌを
サンプルとして発光反応に供した。発光反応用試薬は０
．００６％デカナール、１０μＭ ＦＭＮ、０．６％Ｂ
ＳＡ，５０ｍν／Ｆｄフラビンレダクターゼ、２ Ｘ
１０−２ｍ ｕ ／ １ｄルシフェラーゼを０．１Ｍリ
ン酸バッファ一ｐＨ７．０に溶解した。２０μ２の試料
に対し、２００μｌの上記発光試薬を注射器で注入し、
そのピーク高さを測定する。発光測定はラボサイエンス
社製ＴＤ４０００ルミフォトメーターを用いた。
た標識ＤＮＡプローブをパイプリダイズさせたｄ ｉｓ
ｃを円筒形の容器に納めた。次いで２５μｌの２ｕ／ｍ
アルコール脱水素酵素、２１ｍＭエチルアルコール及び
ｉｏｏμＭ ＮＡＤＰ“を加えた０．５ｍＭ ＭｇＣｌ
２を含む２０ｍＭトリスー塩酸バッフ７−ｐＨ８．５を
加え、２５”ＣＩ時間反応させた。反応後、２０μｌを
サンプルとして発光反応に供した。発光反応用試薬は０
．００６％デカナール、１０μＭ ＦＭＮ、０．６％Ｂ
ＳＡ，５０ｍν／Ｆｄフラビンレダクターゼ、２ Ｘ
１０−２ｍ ｕ ／ １ｄルシフェラーゼを０．１Ｍリ
ン酸バッファ一ｐＨ７．０に溶解した。２０μ２の試料
に対し、２００μｌの上記発光試薬を注射器で注入し、
そのピーク高さを測定する。発光測定はラボサイエンス
社製ＴＤ４０００ルミフォトメーターを用いた。
測定の結果は表１に示すように、２． １３ Ｘ １０
’コピーが最少感度であり、０．１８８ ｐｇブラスミ
ドに相当した。なお、Ｓ／Ｎ比は、ブランクに対し１．
１８であり、有意差が認められた。また各測定点におけ
るＳ／Ｎ比は吸光法により検出可能な濃度域においても
極めて高く本法が優れた検出系であることが示された。
’コピーが最少感度であり、０．１８８ ｐｇブラスミ
ドに相当した。なお、Ｓ／Ｎ比は、ブランクに対し１．
１８であり、有意差が認められた。また各測定点におけ
るＳ／Ｎ比は吸光法により検出可能な濃度域においても
極めて高く本法が優れた検出系であることが示された。
〔比較例１〕
同一のＨＳＶ− ｇｅｎｅｒ ｉｃの特異配列を組込ん
だプラスミドをサンプルとし、同一の希釈系列を用意し
、ＭＢＩ社ＳＮＡＰキットを用いて測定した結果、本法
のフォルマザン発色法では、５．４６Ｘ１０’コピーが
検出された（表１）。Ｓ／Ｎ比は発光法に比べて小さか
った。なお、検出系の原理は５−ブロモー４−クロロー
３−インドリルフォスフェートを基質としてアルカリフ
ォスファターゼにより脱リン酸した生成物が非酵素的に
ニトロブルーテトラゾリウムを還元発色させ、このフォ
ルマザン色素が膜に沈着するので、その発色の色調を計
測する方法によった。
だプラスミドをサンプルとし、同一の希釈系列を用意し
、ＭＢＩ社ＳＮＡＰキットを用いて測定した結果、本法
のフォルマザン発色法では、５．４６Ｘ１０’コピーが
検出された（表１）。Ｓ／Ｎ比は発光法に比べて小さか
った。なお、検出系の原理は５−ブロモー４−クロロー
３−インドリルフォスフェートを基質としてアルカリフ
ォスファターゼにより脱リン酸した生成物が非酵素的に
ニトロブルーテトラゾリウムを還元発色させ、このフォ
ルマザン色素が膜に沈着するので、その発色の色調を計
測する方法によった。
〔比較例２〕
ＮＡＤＰ”を基質として、アルカリフォスファターゼ活
性を検出する別法としてＣ，Ｈ，ＳｅｌｆはＪｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ１ｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏ
ｔ３ｓ， ７６巻３８９３９３ページ（１９８５）にお
いて、生成するＮＡＤ”をアルコール脱水素酵素とジア
ホラーゼのサイクリング反応により、フォルマザン色素
を蓄積する方法でアルカリフォスファターゼを高感度に
検出する方法を報告している。発明者らは上記方法に従
い、２５μｌの１００μＭ ＮＡＤＰ“を加えて、ｄｉ
ｓｃ上のアルカリフォスファターゼと反応させ、１時間
後に、１０μ℃をサンプリングし０．９Ｍのサイクリン
グ用試薬を添加して１５分反応させ、０．３Ｎ ＨＣＩ
ＩＩｄを加えて反応を停止する。このときサイクリング
用試薬の組成は０．０１■／ ｍｌアルコール脱水素酵
素、５％エタノール、０．５％トリトンＸ〜１００、ジ
アホラーゼ０． １ ｔｎｇ ／ ｍｌｌ、ニトロブル
ーテトラゾリウム０． １ ｍｇ ／ ｍｌを５Ｏｎ＋
Ｍリン酸バッツ７ − ｐＨ７．５に溶解して用いた
。
性を検出する別法としてＣ，Ｈ，ＳｅｌｆはＪｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ１ｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏ
ｔ３ｓ， ７６巻３８９３９３ページ（１９８５）にお
いて、生成するＮＡＤ”をアルコール脱水素酵素とジア
ホラーゼのサイクリング反応により、フォルマザン色素
を蓄積する方法でアルカリフォスファターゼを高感度に
検出する方法を報告している。発明者らは上記方法に従
い、２５μｌの１００μＭ ＮＡＤＰ“を加えて、ｄｉ
ｓｃ上のアルカリフォスファターゼと反応させ、１時間
後に、１０μ℃をサンプリングし０．９Ｍのサイクリン
グ用試薬を添加して１５分反応させ、０．３Ｎ ＨＣＩ
ＩＩｄを加えて反応を停止する。このときサイクリング
用試薬の組成は０．０１■／ ｍｌアルコール脱水素酵
素、５％エタノール、０．５％トリトンＸ〜１００、ジ
アホラーゼ０． １ ｔｎｇ ／ ｍｌｌ、ニトロブル
ーテトラゾリウム０． １ ｍｇ ／ ｍｌを５Ｏｎ＋
Ｍリン酸バッツ７ − ｐＨ７．５に溶解して用いた
。
サイクリング条件については至適組成濃度を検討して用
いたがブランク吸光度が高く、高感度に生成したＮＡＤ
＋を測定できなかった（表１に測定結果を示す）。
いたがブランク吸光度が高く、高感度に生成したＮＡＤ
＋を測定できなかった（表１に測定結果を示す）。
（本頁以下余白）
〔発明の効果〕
本発明のＤＮＡプローブ検出法は、アルカリフォスファ
ターゼで標識したＤＮＡプローブを発光系と結合するこ
とにより、吸光法よりも高感度でかつ安定性の高い優れ
たものである。
ターゼで標識したＤＮＡプローブを発光系と結合するこ
とにより、吸光法よりも高感度でかつ安定性の高い優れ
たものである。
そして、アルカリフォスファターゼの基質としてＮＡＤ
Ｐ”を用いることにより、少ない基質量で最大の活性を
得ることができ、しかも発光検出の精度が高くなり、ま
たＮＡＤ＋をＮＡＤＨに還元する手段として、アルコー
ル脱水素酵素を用いることにより、アルカリフォスファ
ターゼ活性に悪影響を及ぼすことなく、さらに発光検出
手段として、フラビン還元酵素及びルシフェラーゼを用
いることにより、迅速にまた他の酵素・反応に影響する
ことがないので正確にＮＡＤＨ量を発光量として検出す
ることができる。
Ｐ”を用いることにより、少ない基質量で最大の活性を
得ることができ、しかも発光検出の精度が高くなり、ま
たＮＡＤ＋をＮＡＤＨに還元する手段として、アルコー
ル脱水素酵素を用いることにより、アルカリフォスファ
ターゼ活性に悪影響を及ぼすことなく、さらに発光検出
手段として、フラビン還元酵素及びルシフェラーゼを用
いることにより、迅速にまた他の酵素・反応に影響する
ことがないので正確にＮＡＤＨ量を発光量として検出す
ることができる。
そして、核酸のハイブリダイゼーションにおいて使用す
る界面活性剤にもこの反応系は影響をうけることがない
という優れた効果をも奏する。
る界面活性剤にもこの反応系は影響をうけることがない
という優れた効果をも奏する。
Claims (1)
- アルカリフォスファターゼを標識したＤＮＡプローブに
ＮＡＤＰ＾＋を反応させ、生成するＮＡＤ＾＋にアルコ
ールおよびアルコール脱水素酵素を反応させてＮＡＤＨ
に変換し、該ＮＡＤＨを細菌由来のフラビン還元酵素お
よびルシフェラーゼを用いて、発光強度として測定する
ことを特徴とする細菌ルシフェラーゼ系によるＤＮＡプ
ローブの測定法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5390289A JPH02234698A (ja) | 1989-03-08 | 1989-03-08 | 細菌ルシフェラーゼ系によるｄｎａプローブの検出法 |
| EP19900104249 EP0386691A3 (en) | 1989-03-08 | 1990-03-06 | Dna probe detection method with bacterial luciferase system |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5390289A JPH02234698A (ja) | 1989-03-08 | 1989-03-08 | 細菌ルシフェラーゼ系によるｄｎａプローブの検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02234698A true JPH02234698A (ja) | 1990-09-17 |
Family
ID=12955650
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5390289A Pending JPH02234698A (ja) | 1989-03-08 | 1989-03-08 | 細菌ルシフェラーゼ系によるｄｎａプローブの検出法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0386691A3 (ja) |
| JP (1) | JPH02234698A (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06153991A (ja) * | 1992-11-18 | 1994-06-03 | Unitika Ltd | ホスファターゼ測定試薬 |
| US6247995B1 (en) | 1996-02-06 | 2001-06-19 | Bruce Bryan | Bioluminescent novelty items |
| US5876995A (en) | 1996-02-06 | 1999-03-02 | Bryan; Bruce | Bioluminescent novelty items |
| US6416960B1 (en) | 1996-08-08 | 2002-07-09 | Prolume, Ltd. | Detection and visualization of neoplastic tissues and other tissues |
| US6458547B1 (en) | 1996-12-12 | 2002-10-01 | Prolume, Ltd. | Apparatus and method for detecting and identifying infectious agents |
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