JPH022347A - 生物学的に活性なシステム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、生物細胞及びその固体支持体を含む生物学的
に活性なシステムの製造方法、該方法により製造された
システム、並びにこのようなシステムの使用に係る。

本明細書中において「生物細胞」なる用語は広義に例え
ば細菌、菌類、それらに由来する胞子及び多３佃胞生物
に由来する細胞を表すために使用する。

生物及び／又は生物から由来する活性材料が通常は比較
的特異的反応である化学反応を促進又は実施するための
手段として機能するような生物学的に活性なシステムが
知られている。このような生物は生体触媒としても知ら
れている。従って、このような生物又はその誘導体は反
応の肝要な部分である。また、生物材料は通常特に該材
料が果たすべき特定の役割を選択されている。その選択
及びその後の精製は費用及び時間がかがる。従って、生
物材料は高価である。従って、生物材料はどのような反
応中でも効率的に使用され、しがち反応中又は反応後に
誤って失われることがないことが重要であり得る。

酵素の支持体は周知である。

ＵＳ−八−４６２９７４２は、リパーゼ酵素が吸着によ
り置孔質音成熱可塑性疎水性ポリマーに固定された生物
学的に活性なシステムを開示している。ポリマーは、気
孔（気泡）が孔により相互に連結された気Ｋｆ２Ｍ造を
有しており、典型的には商標Ａｃｃｕｒｅｌ（オランダ
国、Ｅｎｋａ社）で市販されている材料である。

Δｃｃｕｒｅｌはポリマー溶液を冷却することにより製
造される。固定化されたリパーゼは液体脂肪の加水分解
に使用される。同様の多孔性ポリマーがＵＳ八−４５３
９２９４の方法に使用されており、この方法では支持体
をまず最初に希釈長鎖カチオン性溶液に浸漬させた後に
タンパク質（例えば酵素）を固定化している。

ＵＳ−八−４５５１４８２も酵素を支持体に固定する方
法を開示している。この場合、支持体は気孔寸法の大き
い親水性ビートである。ポリエステルをスルポン１ヒ後
、ポリエチレンイミンをチャージする。酵素は担体にイ
オン結合すると記載されている。支持体は例えば水を外
部（連続）相としてスチレン及びジビニルベンゼンを懸
濁重合することにより形成され得る。多孔性を得るため
に気孔形成剤（例えばアルカン）が使用される。あるい
はブロック重合後に粉砕する。

酵素分担体に化学的に結合する例はＥＰ−八−１４７９
１４にら記載されており、ここでは担体は制御された気
孔を有するガラス又は紙である。

細胞をポリマーゲル内にトラップすることは周知である
。これらは存在する細胞で形成される。

予備成形された固体多孔性支持体材料に生物細胞を固定
１ヒすることはあまり十分に開示されていないと思われ
る。Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　５ｃ
ｉｅｎｃｅＶｏ１．４０．　Ｎｏ、　８．　ｐｐ　１３
２１−１３５４．１９８５．　Ｋａｒｅｌ他は予備成形
された多孔性マトリックスへの細胞の閉し込めを開示し
ている。与えられている７トリツクスの例は全無機才勿
買である。

菌類を閉じ込めるために２．５４ｍｍという大きい気孔
寸法を有する多孔性ポリウレタンフォームを使用するこ
とは例えばＴｊｉｒｋｅｒ及びＭａｖｉｔｕｎａによる
Ｅｎｚｙｍｅ　　Ｍｉｃｒｏｂ、Ｔｅｃｈｎｏｌ、　　
１９８７．　　ｖｏｌ、９．　　Ｄｅｃｅｍｂｅｒに記
載されている。ＷＯ３７１０２７０４は、細胞を粒子と
混合した後、剛性マトリックスを構成するために接触点
で結合された微細粒子間の空胴に細胞を保持する方法を
記載している。こうして細胞はマトリックスの気孔に機
械的にトラップされる。

本発明の目的は、使用中に所望の化学反応を効率的に生
起させることができ且つ反応の結果として、Ｊ胞の損失
を減少することが可能な、生物細胞とその支持体とを含
む生物学的に活性なシステムを製造するための方法を提
供することである。更に、システムは容易に形成するこ
とができるべきである。

本発明は、生才勿細胞及びその固体支持体を含む生物学
的に活性なシステムの製造方法を提供するものであって
、細胞が支持体に導入されており、少なくとも７５％の
総気孔容積を有しており且つ１〜１５０　ｐ　＋ｒｌの
範囲の平均直径を有する相互に連結された複数の気孔を
有する多孔性ポリマー材料を該支持体として作成し、多
孔性ポリマー材料の少なくとも気孔に生物細胞を導入し
、多孔性ポリマー材料は、モノマー及び／又はポリマー
材料のプレポリマーを含有するエマルジョンを調製し、
該モノマー及び／又はプレポリマーを重合して該多孔性
ポリマー材料を形成することにより形成されることを１
寺ｉ攻とする。

細胞は各種の物理的及び／又は化学的手段、例えば吸着
、取り込み、イオン結合、化学的共有結合により支持体
材料に保持され得る。細胞は実際に少なくとも材料の気
孔の内側に固定される。化合物の生成用にシステムを使
用する場合は、化合物の前駆物質を気孔に通して細胞と
接触させる。

従って、例えば連続又は半連続法では、前駆物質は固定
化した細胞を含む気孔を通ることにより多孔性材料を通
過し得る。

本発明で使用するのに適当な多孔性材料は例えばＥＰ−
八−００６０１３８４：記載されテオリ、　ＥＰ−八−
００６０１３８に記載されている高分散相エマルジョン
法を使用して製造することができる。ＥＰ−＾−００６
０１３８に記載されている多孔性材料はポリスチレンの
ようなポリビニル材料をベースとするポリマー材料であ
る。

本発明の細胞支持体を使用すると多数の利点が得られる
。例えば従来のポリスチレン支持体に比較して気孔率が
高いため、細胞を収容している気孔に反応物質を容易に
通過させることができる。

従って、細胞をより有効に使用することができる。

連続法の一部として使用すると、より高い処理量に達す
ることが可能である。充填ベツドを通る圧力降下も低く
することができる。

更に、本発明で使用される多孔性ポリマー材料の気孔の
寸法は、細胞で使用するのに特に適当である６また、高
い気孔率と小さい気孔寸法との組み合わせにより、細胞
支持体の単位容積当たり高い総表面積が得られ、従って
、支持体の単位容積当たり高い効率が得られる。本発明
の気孔寸法及び気孔率の要件は、２〜１００＋ｎ２／ｇ
程度の総表面積を実現することができる。

特に、ポリマー支持体材料を作成するためにＥＰ＾−６
０１３８に記載されている方法を使用すると、気孔及び
Ｓ−■孔の寸法を個々の要件に適合させることができる
。気孔及び細孔寸法を変えるためには、Ｗ１０エマルジ
ョン中の水相は少なくとも１０−４モルに選択されたイ
オン強度を有するとよく、イオン強度は１０−３〜５モ
ルの範囲にするとより適当である。イオン強度を変える
ための電解質は好ましくは可溶性ハロゲン化物及び硫酸
塩からｉＡ択される。

＆ｆＥって、電解質と（例えば撹拌により）エマルジョ
ンに加えられる剪断度とを組み合わせて使用することに
より、所定の気孔率の多孔性ポリマー材ｆＦ）を提供す
ることができる。より詳細な説明はヨーロッパ特許出願
第８８３０６４４７　、９号（１９８８年７月１５日付
は出願［ｌ５ＳＮ２１９２３１に対応）に記載されてお
り、その内容は参考資料として本願の一部に加える。

特定の用途に選択される実際の気孔寸法及び気孔率は適
宜選択され得る。もっとも、好適な気孔寸法は１〜１５
０１ｍの範囲の選択された寸法範囲であり、好適な気孔
率は９０〜９８％の範囲である。好適方法において、気
孔及び細孔寸法は導入すべき細胞の寸法及び型に従って
選択され得る。特に、気孔及び細孔寸法は多孔性ポリマ
ー材料に細胞を容易に浸透させ且つ細胞による気孔及び
細孔の閉塞を阻止できるように選択され得る。

生″ｊｌＡ、１（ｌＩ胞の平均最大寸法として細胞寸法
を規定するなら、本発明で使用されるポリマー材料の気
孔の平均寸法は細胞寸法の３〜１５倍、より好ましくは
６〜１２倍にすると好適である。同様に、気孔を相互に
連結する孔の平均寸法は好ましくは平均細胞寸法の１〜
８倍、より好ましくは３〜６倍である。

ポリマー中には閉じた気孔は存在せず、気孔は制御され
た寸法の孔により完全に相互連結されているので、生物
細胞は全気孔に容易に浸透することができ、従って、ポ
リマー支持体の高い充填率を得ることができ、ポリマー
への細胞の侵入は容易に得られる。実際に、例えば単に
細胞懸濁液中で粒状支持体を振蕩させるだけで細胞を支
持体に受動的に導入することが可能である。この点で、
本発明の方法で形成されるポリマー支持体は酵泰支持体
として上記材料へｃｃｕｒｅｌよりもすぐれていること
が判明した。

細胞の受動的導入の代わりに、支持体によりｔｊへ成さ
れる充填ベツドに細胞懸′？Ａ液を通すことに１り細胞
を支持体に導入することもできる。

本発明で支持体として使用されるポリマー材１−１の別
の利点は、架橋結りすると熱、例えばオートクレーブ処
理により滅菌できるという点にあり、これはΔｅｃｕｒ
ｅｌのような熱可塑性材料では不可能である。

本発明て使用される多孔性ポリマー支持体材１６［の相
互連結構造は、支持体材「１を通る流体流に対する抵抗
と低くし、低い圧力降下で良好な流１を可能にする。必
要に応じて、例えば油のような粘性液体をシステムに通
すことができる。本発明で使用される多孔性支持体材料
は更に、有益な放出特性を有することが判明した。この
ような特性は、反応の継続に表面領域を利用できるよう
にするためにシステムから逃がす生成物としてガスが放
出される反応で特に有利であり得る。気孔寸法及び気孔
の相互連結性により、システムから気体生成物を容易に
除去できることは明白である。

表面領域に容易に接近することがてき且つ気孔率がたか
いため、迅速な細胞反応動力学に特に好適であり、更に
、ゲル及び小さい気孔材料を使用する際に生じる物質移
動の制限をある程度回避することができる。

本発明で使用される多孔性材料は各種の形状で利用可能
である。形状は加工により又は製造中に与えられ、例え
ば成形又は注型により例えばブロック、シート、膜、管
又はより複雑な幾何学的形状に付形され得る。あるいは
、材料な粒状で提供し、所望の形状の反応器に充填する
こともできる。

もっとも、ブロック形状を使用すると多孔性材料の１以
上の完全なブロックを反応器に容易且つ迅速に装填する
ことができるので特に有利であり得る。ブロックに必要
な細胞を予め充填し、こうして、反応器内で同−又は異
なる細胞系を迅速に交換することができ、あるいは現場
でブロックに直接細胞を充填してもよい。いずれの場合
も、ブロックを使用すると反応器に粒子を充填する必要
のがなくなり、同時に粒子を充填した反応器に生じ得る
チャネリング（ｃｈａｎｎｅｌ　ｌ　ｉｎｇ）のような
周知の問題もなくなる。

多孔性材料の望ましい機械的特性は高い非圧縮性及び可
（ｎ性を含み得る。非圧縮性の比較的高い支持体材料は
工業的規模の生物学的に活性なシステム及び方法、例え
ば１〜５ｉ容量の範囲の反応器を構成することができる
ので、このような支持体材トＩを提供することが特に重
要である。実験質規模では十分に使用される多数の従来
の材料は、例えば天然に存在する有機ポリマーなとのよ
うに圧縮強さの欠如により大規模の使用には不適当であ
る。

本発明で使用するのに適当な多孔性材料の更に詳細な説
明は、上記ＥＰ−八−６０１３８に他に、ＥＰ−＾１０
５６３４、　ＥＰ−Δ−１５６５４１、ＥＰ−八−１５
７５０４、ＣＢ−Δ−２１５５４８１、Ｅｌ’−Ａ−２
００５２８及びＥｌ’−八−２２３５７４及び１系属中
の特許出願であるＥＰ−＾−２３９３６０、［ＥＰ−Δ
−２４０３４２、ＥＰ−Δ−２６４２６８、ＥＰ−八−
２８９２３８、ＩＥＰ−Ａｍ２８８３１０及び前出のヨ
ーロッパ特許出願第８８３０６４４７．９号に記載され
ている。これらの特許明細書は本発明の気孔率の要件に
合致する多孔性材料について開示している。いずれの場
合も材料は、Ｗ／Ｏエマルジョン、０７阿エマルジヨン
又は任意の２種の十分に不混和性の溶液の間で形成され
るエマルジョンのいずれかであり得る高分散相エマルジ
ョンの形態の出発物質を重合することにより製造され得
る。ここで「水」とは水性ベースを意味し、「油」は水
性系に不混和性であることとを意味する。各明細書に記
載されている材料はその出発物質及び／又は最終特性が
異なる。上記全特許明細書は参考資料として本願の一部
に加える。

本発明て使用される生物細胞は微生物、酵母、菌類、動
物細胞、植物細胞及びそれらの混合物から成る肝から選
択され得る。場合に・よっては細胞は多孔性材料の表面
に直接吸着することが認められており、また場合によっ
ては細胞と結合するために化学的結合を形成することが
必要である。このような場合、表面が化学的に修飾され
ている上記特許出願の多孔性材料は細胞に化学的結合部
位を提供するのに適していることが認められている。

どのような方法を使用して細胞を結合させるかに関ｆ系
なく、本発明の材料を使用すると相互に連結する気孔の
内側に細胞を固定することができ、上記利点の一部又は
全部を実現するので、本発明の材料の使用は特に適当で
あることが見出された。

特筆すべき利点として、細胞がポリマー支持体との強い
結合を形成するようにその形態を適応できるという事実
も認められた。即ち、初期には支持体との間に遊離した
相互作用しか生じない。この初期の相互作用はポリマー
表面における物理的吸着のプロセスであり得、即ち共有
結合及びイオン結合は存在しない。その後、細胞は細胞
自体の適応により化学的に結合され得る。

細胞は池の生物材料、特に酵素と共に本発明の支持体に
固定され得る。

本発明の範囲において細胞は現場でポリマー支持体中で
増殖し得る。細胞が増殖促進培地中にある間に細胞を支
持体に導入すると有利である。

本発明の生物学的に活性なシステムは、例えば飲食品、
医薬品及びファイケミカルを含む種々の産業で使用され
得る。本発明のシステムは水性及び非水性の両方の媒体
中で機能し得る。水性媒体中に固定された微生物の用途
の例としては、糖からアルコール及びブドウ濃縮液から
ワインの連続製造、生成物の流れからグルコースの除去
、及び香料物買の選択的還元が挙げられる。本発明のシ
ステムの使用方法には、成体触媒反応及び池の方法、例
えば細胞増殖、溶液からの金属抽出等がある。

以下、実施例に関して例示のみの目的で本発明を説明す
る。

実」「刀」− ＥＰ−Δ−００６０１３８に記載の手順に従って作成し
たポリマー多孔性支持体材料を使用して実験を行った。

即ち材料は多孔性ポリビニルをベースとする材料とした
。実験には、支持体材料に固定したＳ　ｕ　ｃ　ｃ　ｂ
ａｒｏｍｙｃｅｓ酵母を使用した。こうして得られたシ
ステムを充填ベツド反応器でアルコールの連続生成に使
用した処、好結果が得られた。反応器の容量効率は非常
に良好であった。

ポリマーの構造、特に気孔の寸法及び相互に連結する孔
の寸法は、使用される酵母の直径（遊雛培養中で約８ｐ
ｍの最大寸法に達するが、一般には５１℃程度である）
を考慮して選択した。多孔性材料を完全に浸透させ且つ
ポリマー壁への細胞の接着による気孔の閉塞を阻止する
ために、気孔及び孔寸法の適当な組み合わせは夫々的４
５ｐｍ及び１５μｍてあった。

支持体材料は次のように作成した。まず１０：１：２の
割合でスチレン、ジビニルベンゼン及び５ｐａｎ８０（
広く市販されている界面活性剤）を含有する１０容量％
の油相と、２．５ｇｌの濃度の過硫酸カリウム及び塩化
カルシウム（１０−’Ｍ）を含有する水相とから成る１
１の高分故相エマルジョンを形成しな。塩化カルシウム
は最終的な気孔及び細孔寸法の共調節剤として配合した
。エマルジョンに比教的均質な二次成形剪断を施し、次
に６０℃で１０時間維持して重合させた。形成されたポ
リマー材料を粒子に扮砕し、篩別して４２５１１ｍ〜１
４００　ｙ　ｍの寸法フラクションを集め、連続流高温
イソプロピルアルコール、次いて脱イオン水を使用して
洗浄し、界面活性剤及び塩を除去し、Ｒ後に乾燥した。

走査型電子顕微鏡によりす〉・プルを分析した処、気孔
及び孔寸法は必要な組み合わせ、即ち夫々４５μｍ及び
１５１ｍであることが判明した。総気孔容積は約９０％
てあった。

細胞固定化のために、ポリマーの一部をまずクォーター
リンゲル液内に置き、１２０°ＣでＩＭｂ／ｉｎ２の圧
力（１０５ｋＰａ）で２０分間オートクレーブ処理して
滅菌した。過剰のクォーターリンゲル液を傾瀉し、ポリ
マー材料を約１０倍の容量の５ａｂｏｕｒａｎｄｓデキ
ストロースブロスに再懸濁さぜな後、市販のワイン酸１
ｓａｃｃｌ＋ａｒｏ＋ｎ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅを接種した。接種したフラスコを振蕩下に約５日間室
温でインキュベートし、この間、１日おきに新しい培地
に交換した。インキュベーション後、全フラスコの内容
物を容ｉ２Ｉ／、の無菌フラスコにプールし、上清を捨
てた。約１ｐの無菌０．１％ペプトン水を２％Ｔｗｅｅ
ｎ８０（界面活性剤）と共にフラスコに加え、しっかり
と固定化した細胞を分疏しないようにしなから＊ｉ状邪
で接着している酵母を除去し易くするために内容物を激
しく転落した。１回おきに洗浄し、３０００ＲＰＭで２
０分間スラリーを遠心分離し、上清を捨てなから、この
手順を８回繰り返した。ｆ＆終遠心分雛後、粒子の充填
スラリー含無菌クォーターリンゲル液に再応濁させ、サ
ンプルを除去して走査型電子ｍ微鏡て分析した。ポリマ
ー材「１の風乾粒子はポリマー壁表面に結合した多数の
細胞を有していることが観察され、多くの場合、細胞外
材料を介して結合していることがｒｌｌ察された。

多孔性ポリマー材料に固定した細胞の活性を試験するた
めに、長さ４６５　ｍ　ｍ及び直径１３ｍｍのカラムに
スラリーをぎっしり充填して充填ベツド反応器を形成し
た後、ガス流出入システム、フィートタンク、ポンプ及
び圧力センサーを有するスルーフローシステムに組み込
んだ。細胞機能のために必須鉱物を含有する１５％スク
ロース溶液を糖−アルコール一方向変換用反応器にポン
プ注入した。

アルコール製造データを下記の表に要約する。

宍− 発酵型　　　　　　連続流、一方向 フィードストック　１５％スクロース＋鉱１勿１品度　
　　　　　　　　　　　　　　　２０°Ｃ酵母　　　　
　　　標準ワーイン酵母 （Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
）Ｊｕ柊アルコール濃度（り／Ｊｊり　　　　　６〜１
０．５反応器の容楢効率Ｋｇ　ＥＬＯＩＩ／ｍ’／ｈ　
　９〜１８．０反応器を２２日間連続的に運転させ、表
に示した数値はこの期間の最大及び最小をとった。糖変
換率は９８％を越えたが、糖全体がエタノールに変換し
た訳ではなかった。糖の一部は増殖及び再生のために細
胞により代謝されと予測される。しかしなから、標準ワ
イン酵母で２０℃の比較的低い温度で運転したシステム
の容積効率は優れていた。

重要な所見として、ガス移送特性が観察された。

発酵中に二酸化炭素が間断なく放出されたが、ポケット
及びベツド上昇が完全に不在なカラムの本体内ではガス
を現れず、ガス放出はベツドの頂部表面にしか観察され
なかった。このようなガス放出特性は、多孔性ポリマー
材料が隣接する粒子の気孔及び孔を通って優先的に放出
ガスを運搬するように機能することを示し、これは、ガ
ス放出又は流入を必要とするあらゆる充填ベツドシステ
ムに特に有利な特性である。

アルコール生成後、電子閉微鏡法によりポリマー粒子を
分析した処、粒子全体を通してポリマー材料の壁に濃密
な被覆が観察され、場合によっては気孔の内（ｌｌｌに
小さいフロック（δ囲胞凝集塊）が観察された。更にｍ
著な所見として、細胞は形態が変化しており、丸みが減
少しており、ポリマー表面をより濃密に覆っており、隣
接細胞は相互に結合しているように見えた。即ち、細胞
は有利な部位及び形態をとることが明白であり、本発明
の多孔性ポリマー材料が酵母細胞の固定に適しているこ
とが立証された。

あ艮 実施例１の手順とほぼ同１１にして、１５％スクロース
の代わりに一１ｎｅｃｒａｆｔ　Ｂｌｅｎｄ　Ｎｏ、　
４グレープジユース濃縮液（英国、ＷｉＨｔｏｎ、Ｌｅ
ｉｃｅｓＬｅｒ。

１１ｏｍｅ　Ｗｉｎｅｃｒａｆｔ）をカラムにポンプ導
入した。連続運転で５日間で１０％Ｉｌｌ／ｖのアルコ
ールを含有する５１の美味のワインを生成した。比較の
ために、従来の自家製手順により２８日かけてパンチサ
ンプルを調製した。ガスクロマトグラフィ及び他の方法
を使用してこのバッチ生成物及び本実施例の連続発酵生
成物を分析した。サンプルの組成はほぼ同一であったが
、バッチサンプルのアルコール含有量のほうがやや高か
った。このことから明らかなように、本発明のシステム
で固定１ヒされた酵ｅ綱胞は、池の方法ては望ましくな
い代謝分泌物をもたらす強制状況下で予想されるような
代謝変化又は異常を生じない。

火花上１ ハイプリドーマ細胞のような動ｔｂｓ胞はモノクローナ
ル杭木の製造に特に有利である。培養中の多くの真核細
胞型は「足場依存性（ａｎｃｌ＋ｏｒａｇｅｄｅｐｅｎ
ｄｅｎｔ）」であり、即ち容易に接近可能な栄養素の通
常要１′１−及び摩耗損傷からの保護に加えて、接着及
び増殖のための適当な支持体を必要とする。

これらの支持体は、細胞の樹立を可能にし、細胞挙動（
形態、移動度、増殖及び代謝）を調節する。

気孔寸法、孔直径及び表面化学的特徴の所望の組み合わ
せを備える本発明の粒状多孔性ポリマー材料を、足場依
存性ラット胚線維芽細胞（ＩｔＥＦ）の培養を含む一連
の実験で使用した処、好結果を納めた。使用した多孔性
ポリマー材料は平均気孔寸法９０ｉｌ　Ｉｌ＋及び平均
孔寸法３０１４＋ｎを有しており、細胞を気孔に浸透さ
せ且つ完全な「拡散（ｓｐｒｅａｄ）Ｊ形態を得るのに
適していた。

材料の調製にあたり、ます水相の塩化カルシウムを１．
ＯＭとした以外は実施例１と同様にして高分散相エマル
ジョンを形成しな。このイオン強度を約２分間の二次成
形剪断時間と組み合わせることにより、所望の気孔及び
孔寸法の組み合わせを有する材料が得られた。

重合、粉砕及び洗浄（実施例１と同様）後、乾燥した材
「１を９８％硫酸に３０分間浸漬させることにより処理
し、その後、ＩＮ水酸１ヒナトリウムで中和し、最後に
脱イオン水で洗浄してから乾燥して表面を親水性にし、
即ちこの場合は細胞接着に適するようにした。最初に細
胞結合はイオン性にしてもよい。

片■胞増殖試験のために、オートクレーブ処理したポリ
マーの３０〜４０個の粒子を、１０％ウシ胎児血清、１
．−グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシンを
補充したＤｕｌｂｅｃｃｏの修飾イーグル培地（ＤＭＥ
Ｍ）に懇濁したラット胚繊維芽細胞（ＲＥＦ）Ｌ〜２ｐ
ｌと混合した。培養物を５％Ｃ０２雰囲気下で３７℃で
６時間維持した。

１足来の方法を使用して走査型（ＳＥＭ）及び伝送型電
子顕ｉＭＨｊＬ（ＴＥＮ）の両方で、多孔性ポリマーへ
のＲＥＦ細胞の接着及びその内部における増殖を試験し
た。培養物中の健康な足場依存性細胞は通常良好な「拡
散」形態を示し、十分に広がった細胞骨格特徴を有する
。多孔性ポリマーの表面は「拡散」細胞で十分に覆われ
ていることが認められ、多くの場合、細胞は実際にポリ
マー網状構造の内側で気孔を嬌かけしており、更にＳ細
胞増殖及び接着のための材料の適合性を確立している。

細胞超微細構造のＴＥＮ分析によると、高度に特殊化し
た細胞膜／ポリマー結合点の存在、端部に集中性接着を
有するアクｌ−ミオシンフィラメントの束、１０　ｎ　
ｍフィラメント及び微細管システムのような正常細胞骨
格ｆ１η造を１１４成した。このように、（１１ＥＦ）
細胞の健康な形態及び超ｉａ細構造特徴は、本発明の多
孔性ポリマー材料の気孔及び孔寸法が足場依存性動物細
胞の培養に選択されると適当であることを示した。

火施準■ユ 実施例３に記載した手ｊ頃に従って、ＲＥＦ印胞の代わ
りに足場依存性小児ハムスター腎臓細胞（ＢＩＩＫ）を
１重用したシステムを作成した。ＤＩＩＫ細胞は良好な
「拡散」形態を示し、特殊（ヒした細胞支持体接着板を
形成し、正常な細胞骨格系を示した。培養における正常
細胞の機能に典型的なこれらの特徴は、本発明の多孔性
ポリマー材１−１が動物細胞の支持体材「［として有用
であることを立証している。

χ１Ｊ１１ 菌糸を浸透及び増殖させるために、生物に適当な気孔率
及び気孔寸法を有するポリビニルポリマー材料を作成し
た。

多孔性支持体は次のように１乍成した。まずスチレン、
ジビニルベンゼン及び５ｐａｎ８０（夫々４．４２．０
．４４及び０．８８＆ｇ）を含有する油相と、水、過硫
酸すトリウム及び塩化カルシウム（夫々４４．２５．０
．０９７及び９．０／１ｇ）を含有する水相とから成る
高分散相打０エマルジョンを形成した。エマルジョンに
８５ｒｐｍで３０分間二次成形剪断を施した。次に６０
℃で４０時間重音させた。形成されたポリマーのブロッ
クを厚さ０．５ｃｍのスライスに切断し、このスライス
から直径８５　＋ｎ　ｍのディスクを切り取った。次に
ポリマーを実施例１と同様に洗浄した。材料のｍ微鏡試
験によると、材ｒ１は９０％の気孔率、少なくとも３０
１．１１１１の気孔寸法、及び少なくとも１１０１Ｉの
相互連結孔寸法を有していることが確認された。

無菌条件下で、洗浄及びオー１−クレープ処理したポリ
マーディスクに５ａｂｏｕｒａｎｄｓデキトスロースブ
ロスを充填し、べ１・り皿に容れ、上表面を酊」見目ｄ
↓暉す−ｉ接種材料で覆った。接種したプレートを２８
℃でインキュベートシ、；ａ密な菌の増殖がＩ１１察さ
れたら、菌を固定したポリマーディスクを絶対エタノー
ルに浸漬させ、風乾した。ディスクの断面を走査型電子
顕微鏡により分析した。

その結果、多孔性ポリマー屑状構造に菌糸か濃密に浸透
ｉ−でおり、菌糸及びポリマー表面から多数の胞子が延
び、胞子含有量の高いディスクをｆｊ４成していること
が観察された。このように、本発明の多孔性ポリマー材
料は、脆い菌糸に良好な保護を与えなから菌の増殖及び
再生に適当な支持体及び栄養供給源を提供することが可
能であった。

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. （１）生物細胞及びその固体支持体を含む生物学的に活
   性なシステムを製造する方法であって、細胞が支持体に
   導入されており、少なくとも７５％の総気孔容積を有し
   ており且つ１〜１５０μｍの範囲の平均直径を有する相
   互に連結された複数の気孔を有する多孔性ポリマー材料
   を該支持体として作成し、多孔性ポリマー材料の少なく
   とも気孔に生物細胞を導入し、多孔性ポリマー材料は、
   モノマー及び／又はポリマー材料のプレポリマーを含有
   するエマルジョンを調製し、該モノマー及び／又はプレ
   ポリマーを重合して該多孔性ポリマー材料を形成するこ
   とにより形成されることを特徴とする前記方法。
2. （２）モノマー及び／又はプレポリマーがエマルジョン
   の連続相に存在しており、該気孔がエマルジョンの分散
   相により表されることを特徴とする請求項１に記載の方
   法。
3. （３）エマルジョンがＷ／Ｏエマルジョンであり、モノ
   マー及び／又はプレポリマーが油相であることを特徴と
   する請求項２に記載の方法。
4. （４）水相が少なくとも１０＾−＾４モル電解質のイオ
   ン強度を有していることを特徴とする請求項３に記載の
   方法。
5. （５）水相のイオン強度が１０＾−＾３〜５モル電解質
   の範囲であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
6. （６）電解質が可溶性ハロゲン化物及び硫酸塩から成る
   群から選択されることを特徴とする請求項４又は５に記
   載の方法。
7. （７）多孔性ポリマー材料がビニルをベースとするポリ
   マー材料であることを特徴とする請求項１から６のいず
   れかに記載の方法。
8. （８）細胞を導入する前に形成された多孔性ポリマー材
   料を洗浄する段階を含んでいることを特徴とする請求項
   １から７のいずれかに記載の方法。
9. （９）形成された多孔性ポリマー材料が少なくとも９０
   ％の総気孔容積を有していることを特徴とする請求項１
   から８のいずれかに記載の方法。
10. （１０）ポリマー材料が架橋結合ポリマーであることを
    特徴とする請求項１から９のいずれかに記載の方法。
11. （１１）支持体との初期接触時に細胞が共有結合せずに
    支持体内に局在することを特徴とする請求項１から１０
    のいずれかに記載の方法。
12. （１２）支持体との初期接触時に細胞が共有結合又はイ
    オン結合せずに支持体内に局在することを特徴とする請
    求項１から１１のいずれかに記載の方法。
13. （１３）細胞が材料に化学的に結合されることを特徴と
    する請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
14. （１４）細胞が増殖促進培地中にある間に支持体に導入
    されることを特徴とする請求項１から１３のいずれかに
    記載の方法。
15. （１５）細胞が微生物、酵母、菌類、動物細胞、植物細
    胞及びそれらの混合物から成る群から選択されることを
    特徴とする請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
16. （１６）多孔性ポリマー材料の該気孔の平均寸法が生物
    細胞の細胞寸法の３〜１５倍の範囲であることを特徴と
    する請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
17. （１７）多孔性ポリマー材料の該気孔の平均寸法が生物
    細胞の細胞寸法の６〜１２倍の範囲であることを特徴と
    する請求項１６に記載の方法。
18. （１８）多孔性ポリマー材料が該気孔の間で相互に連結
    する孔を有しており、孔の平均寸法が生物細胞の細胞寸
    法の１〜８倍の範囲であることを特徴とする請求項１か
    ら１７のいずれかに記載の方法。
19. （１９）孔の平均寸法が細胞寸法の３〜６倍の範囲であ
    ることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
20. （２０）請求項１から１９のいずれかに記載の方法によ
    り製造された生物学的に活性なシステム。
21. （２１）システムの細胞により行われる反応を介して１
    種以上の化合物を調製するための、請求項２０に記載の
    生物学的に活性なシステムの使用。
22. （２２）細胞が支持体の気孔内に配置されており、反応
    のための反応剤が材料の相互に連結する孔を通って該気
    孔に導入されることを特徴とする請求項２１に記載の使
    用。