JPH022358A - 百日咳菌の新規な線毛性サブユニットをコード付ける遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 線毛（ｐｉｌｉ）の新規なタンパク質性サブユニソトを
コード付ける遺伝子のクローニング及び配列決定（シー
フェンス）に係る。

本発明は、遺伝子又はそのフラグメントを包含する組換
えプラスミド、及びこの組換えプラスミドによって形質
転換させた宿主微生物にも係る。

さらに、本発明は、上記タンパク質サブユニット又はそ
の領域と同じアミノ酸配列を有する免疫学的に活性な合
成ペプチドに係る。

百日咳は、百日咳菌によって起る呼吸器系の病気であり
、カタル期又は発作期に、患者から罹患し易い健康者に
伝染する。

百日咳は痙宰、大脳障害を生ずることがあり、時には、
特に幼児及び母性の抗百日咳抗体が欠けた新生児では死
亡する場合がある。従って、このような病気に対して有
効なワクチンが望まれている。

現在では、マーシオレートで殺菌し、５６℃で処理した
ビルレント細菌でなる抗百日咳細胞性ワクチンが使用さ
れているが、この場合、たとえ永久防御を与えることが
できるとしても、望ましくない副作用がある。このため
、上述の欠点を持たない新規な抗百日咳無細胞ワクチン
の開発が要求されている。

百日咳の発病における必須の段階は、上部気道の上皮細
胞への細菌の付着であり、これにより、微生物が宿主の
防御系をくぐり抜けることが可能になる。

この過程において細菌の細胞表面のいかなる成分が関与
するかは完全には明白にされていないが、かかる付着は
、細菌の表面上に存在する重合化サブユニット［繊毛（
ｆｉｍｂｒｉａｅ）又は線毛として知られている］でな
る細胞外タンパク質によって起るものとみられる。

Ａｓｈｗｏｒｔｈらは、百日咳菌の繊毛が血清形−特異
的凝集原、すなわち細菌細胞を凝集させる抗体の生産を
促進する表在性抗原であることを示唆している［ｒｌｎ
ｆｅｃｔ、１ｍ＋＋＋ｕｎ、Ｊ　３７．１２７ｇ−１２
８１（Ｉ９８２）］。

Ｉｒｏｎｓ及び共同実験者らは、血清形２及び３凝集原
として分類される百日咳菌の繊毛を単離、精製している
［ｒＤｅｖ、Ｂｉｏ、５Ｌａｎｄ、Ｊ　６１．１５３−
１６３（Ｉ９８５）コ。この繊毛が分子量２１，０００
．２２，０００及び２４．０００ドルトンを有するサブ
ユニットでなることが明らかにされている。

上記凝集原と共に、血清形１．４．５及び６の繊毛も単
離、精製されている。百日咳に対して防御的に働く無細
胞ワクチンの開発における繊毛又はそのサブユニットの
使用に鑑み、上皮細胞への付着の原理［Ｕｒｉｓｕ　Ｔ
、Ｈ，らｒｌｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、Ｊ　５２゜６９
５−７０１　（Ｉ，９８６）］、その免疫原活性［Ｚｈ
ａｎｇ　Ｊ、Ｍ、らｒＤｅｖ、Ｂｏｉｌ、５ｔａｎｄ、
Ｊ　６１．１７３−１８５　（Ｉ９８５）］及びその構
造［Ｚｈａｎｇ　Ｊ、Ｍ、　ｒｌｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕ
ｎ、Ｊ　４８．４２２４２７　（Ｉ９８５）］に関して
多数の研究が行われている。

純化した百日咳菌の線毛を接種したマウスが、その後に
おけるビルレント細菌による鼻腔内感染に対して防御さ
れることが観察された（、ＲｏｂｉｎｓｏｎらｒＤｅｖ
、Ｂｏｉｌ、５ｔａｎｄ、Ｊ　６］、１６５−１７２　
（Ｉ９８５）］が、精製した線毛又は線毛から単離され
たサブユニットをベースとする無細胞ワクチンの調製で
は、百日咳菌の異なる菌株において観察される抗原性の
変化を考慮しなければならない。

実際、特殊な血清形の繊毛による免疫では、異なる血清
形の繊毛を含有する菌株による感染に対して常に防御免
疫を形成できるわけではない。

たとえば、抗血清形２抗体は、タイプ２の凝集原を含有
する百日咳菌細胞のみを凝集し、抗血清形６抗体につい
ても同様のことが言える［ＣｏｗｅｌｌＪ、Ｌ、らｒｌ
ｎｆ、ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ、Ｊ　Ｖｏｌ、５５．　Ｎｏ
、４　９１６−９２２（Ｉ９８７）］。

さらに、抗血清形２及び３モノクロナ一ル抗体がインビ
トロで、血清形に関して特異的に百日咳菌をＶＩＲＯ細
胞に結合させることが観察されており［Ｇｏｒｒｉｎｇ
ｅらｒＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５ｅｃｔ、Ｊ　
２６．　５−９（Ｉ９８５）］、これにより、繊毛は抗
原的に相違するしのであることが示唆される。従って、
完全に満足できる多価の無細胞性ワクチンの開発のため
には、百日咳菌によって発現される多数の異なった抗原
タイプの繊毛に関する知識の獲得が基本的に重要である
と考えられる。

血清形２に相当する大きい線毛性サブユニットをコード
付ける遺伝子が近年クローン化され、配列決定されてい
る［Ｌｉｖｅｙ　Ｊ、ら「モレキュラー・マイクロバイ
オロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、
）Ｊ　１（２）、　２０３−２０９　（Ｉ９８７）］。

発明者らは、百日咳菌の新規な線毛性サブユニットをコ
ード付ける新規な遺伝子を単離し、配列決定した。サブ
ユニットの成熟部分のアミノ末端配列は、線毛２．３及
び６のものと同様ではあるが、同一ではない。

従って、本発明の目的は、百日咳菌の新規な腺毛性サブ
ユニットをコード付ける遺伝子のクローニング及び配列
決定にある。

本発明の他の目的は、上記サブユニット又はそのフラグ
メントをコード付ける遺伝子を包含することを特徴とす
る組換えプラスミド、及び該組換えプラスミドによって
形質転換させた宿主微生物にある。

本発明のさらに他の目的は、線毛性サブユニット又はそ
の領域のものと同じアミノ酸配列を有する免疫学的に活
性なペプチドにある。

さらに本発明の他の目的は、抗百日咳無細胞ワクチンの
調製における上記ペプチドの使用にある。

本発明の他の目的は、該明細書の記載及び後述の実施例
より明白になるであろう。

本発明がさらに理解されるように、該明細書において使
用する用語に関して簡単に説明する。

この用語は、各々がドナー生物（バンクが形成される）
由来のＤＮＡフラグメントを有する宿主微生物の一群の
クローンを意味する。

ゲノムバンクは、各クローンに含有される一群の各フラ
グメントを組み合わせてトナー生物の全染色体ＤＮＡを
再構成できる場合を代表例として定義される。

発現 これは、宿主微生物が与えられた遺伝子によってコード
付けられたタンパク質を合成する機構をいつ。

該機構は転写［すなわち、ＤＮＡからメッセンンヤ−Ｒ
ＮＡ（ｍＲＮＡ）へ遺伝情報を映ずことコ及び翻訳［す
なわち、Ｊ、Ｄ、　ＷａＬｓｏｎ　ｒモレキュラー・バ
イオロジー・オブ・ザ・ジーン（ｈｌｏｌｅｃｕｌａｒ
　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆｔｈｅ　Ｇｅｎｅ）Ｊ　Ｗ、Ａ
、　Ｂｅｎｊａｍｉｎ　Ｉｎｃ、発行、第３版（Ｉ９７
６）によって記載された遺伝暗号の原則（コドン、すな
わち特定のアミノ酸をコード付けするヌクレオチド塩基
のトリプレットに関する）に従ってｍＲＮＡからタンパ
ク質に情報を移すこと］の過程を包含する。各種のコド
ンが同じアミノ酸をコード付けできるが、各アミノ酸に
ついては、これらの特殊なコドンのみであり、他にはな
い。

制限酵素 これは、特異な部位（制限酵素の認識部位）でＤＮＡ分
子を切断する加水分解酵素である。

クローニングベクター これは、宿主微生物に移される際、復製を可能にするす
べての遺伝情報を含有するＤＮＡ分子をいう。クローニ
ングベクターの例としては、プラスミド及びいくつかの
バクテリオファーノのＤＮＡ及びコスミッドがある。

プラスミドＤＮＡ　（環状の形状を有する）を適当な手
段で切断し、異種ＤＮＡのフラグメントを挿入し、再度
環を閉じて、元よりら大きい分子を形成する（組換えＤ
ＮＡ分子又はハイブリッドプラスミド）。

異種ＤＮＡフラグメント（すなわち、ベクターによって
形質転換される生物によっては一般に生産されないタン
パク質をコード付けるＤＮＡのフラグメント）を挿入す
るためにベクターを使用する。

プライマー これは、酵素法によって配列決定されるべきジングルス
トランドの領域に相捕的な１５−５０塩基のオリゴヌク
レオチドである。

次に、添付図面について簡単に説明する。

第１図は百日咳菌の菌株ＳＡＩから得られたＳＴＸ線毛
をコード付ける遺伝子のヌクレオチド配列及び対応する
アミノ酸配列を示す。

遺伝子を同定しかつ配列決定するために使用した合成オ
リゴヌクレオチドを矢印（−一）で示す。

開始のメチオニン、成熟タンパク質の１番目のアミノ酸
及びストップコドンを二二二で示す。

ＳＴＸ線毛の成熟部分とシグナル配列との間の切断部位
を（↓）で示す。制限酵素Ｂａｎ旧及びＥｃｏＲＩの切
断部位を（−−−一）で示す。

第２図はＳＴＸ、　ＳＴ２、ＳＴ３及びＳＴ６線毛の成
熟部分のＮｌ＋、末端配列を比較する図である。

同じアミノ酸残基を＝＝コでグループ分けしている。

第３図はＳＴＸ線毛（上方の列）及びＳＴＺ線毛（下方
の列）の類似性を示す。

百日咳菌のビルレンスに関連する遺伝子のクロニングに
おける最近の進歩によれば、これらの同定のための最適
な方法が、大腸菌における遺伝子の直接的な発現［Ｌｏ
ｃｈｔら「ヌクレイツク・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、）ｊ　１４．３２５１３
２６１　（Ｉ９８６）；　　Ｎ１ｃｏｓｉａらｒＰ、Ｎ
、Ａ、Ｓ、　　ＵＳＡＪ　８３．　４６３１−４６３５
　（Ｉ９８６）］に基く方法ではなく、遺伝子を含有す
るクローン化ＤＮＡフラグメントの特殊なプローブの使
用による同定に基く方法であることが明らかになってい
る。

従って、本発明では、百日咳菌の菌株１６５（血清形ｌ
、２．３）のアミノ末端領域をエドマン法によって配列
決定し、Ｚｈａｎｇ　Ｊ、Ｍ、によって開示された方法
［ｒＤｅｖ、Ｂｉｏｌ、５ｔａｎｄ、Ｊ　６１．１７３
−１８５　（Ｉ９８５）］により精製した。

アミノ酸配列は、 ＮＨ−Ａｓｐ−Ａｓｐ　Ｇｌｙ−Ｔｈｒ　　ｌｉｅ　　
Ｖａｌ　　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　　ｌｉｅ
　Ｔｈｒ〔該配列は血清形２の繊毛の主サブユニット（
Ｌｉｖｅｙ　Ｊ、らｌｌ１ｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ、Ｊ　　１　（２）、　２０３２０９　（Ｉ
９８７）］のものと同一であることが確認された〕であ
り、該アミノ酸配列を、遺伝暗号の相対的なデジエネラ
ンーを考慮して、オリゴヌクレオチドの合成に使用した
。

この目的には、アミノ酸７−１２に相当する領域が選ば
れ、自動システムにより、第３の塩基の変性を有する一
吐（ファミリー）のオリゴヌクレオチド（可能なトリブ
レットの組合せのすべて）を合成した。

このファミリーをプローブＡと称する。該ファミリーは
次の如く表される。

！ｌｅ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ　　Ｔｈｒ　　Ｉｌｅ　　
ＴｈｒＡＴＣＡＣＣＧＧＣＡＣＣＡＴＣＡＣ ＴＴＴＴ ＧＧＧＡ ついで、プローブＡ　　（Ａｒｒａｎｄ　Ｊ、Ｅ、の方
法［ヌクレイツク・アンラド・ハイブリダイゼーション
ア・プラクティカル・アプローチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄ１１ｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：　Ａ　Ｐｒａｃ
ｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ）　Ｂ、Ｄ。

Ｈａｍｅｓ−Ｓ、　Ｈｉｇｇｉｎｓ編、（Ｉ９８５）、
ｐ３４］によってマーク付けした〕を、百日咳菌遺伝子
ライブラリー内で、プローブとハイブリダイズする染色
体ＤＮＡフラグメントを有するクローンを確認するため
に使用した。

本発明によれば、百日咳菌のゲノムで代表される遺伝子
ライブラリーは細菌の染色体を好適な制限酵素によって
消化することにより作製される。

この目的に、百日咳菌の各種の菌株を使用できる。

詳しくは、市販の百日咳菌の菌株１６５（血清形１．２
．３）　（ＳＣＬＡＶＯ）を使用した。

この菌株の染色体を溶菌化した細胞から抽出し、制限酵
素５ａｕ３Ａによって該酵素の供給者の推奨する方式で
消化し、エタノールによる沈殿及び遠心分離によって回
収する。このようにして得られた染色体ＤＮＡフラグメ
ントをクローニングベクターに導入し、プローブＡとの
ハイブリダイゼーション後、Ｓａｎｇｅｒ　Ｆ、らの方
法［ｒＰ、Ｎ、Ａ、Ｓ、Ｊ　７４．５４６３（Ｉ９７７
）］によって配列決定した。

この方法は酵素的ンークエンシングシステムに基くもの
であり、長鎖及び短鎖の公知ＤＮＡフラグメントの配列
の決定に特に適している。

この方法では、ジングルストランド形で配列決定される
フラグメント及びジングルストランドの開始領域に相補
的である小さいプライマーオリゴヌクレオチド（塩基１
５−５０個）を利用できることが必要である。該方法に
従って、ＤＮＡフラグメントをＭ１３ファージベクター
内でクローン化した。使用される好適なファージベクタ
ーは、Ｍ１３ｍｐ８［Ｍｅｓｓｉｎｇ　ＪらｒＮｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅｒ、Ｊ　９．３０９（Ｉ９
８１）コ及びＭ１３ｍｐ９　［Ｍｅｓｓｉｎｇ　Ｊ、ら
ｒＧｅｎｅＪ　１９２６３　（Ｉ９８２）］であり、こ
れらでは、クローニング部位の位置は、挿入体の配列が
２つの対向末端から始じまって限定されることを可能に
するプライマーのアニーリング部位に対して逆の様式で
で配置される。実際には、ファージ（予め酵素Ｂａｍ旧
で消化）を、公知の技術によって、Ｔ４　ＤＮＡリガー
ゼの存在下でリゲーションし、ＤＮＡフラグメントに接
合させた。

ついで、リゲーション混合物を、Ｍａｎｄｅｌ　Ｍ、及
び旧ｇａによって開示された方法［「ジャーナル・才ブ
・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ
、）　Ｊ５３、１５４　（Ｉ９７０）］に従いＣａＣＱ
　ｔでコンピテントした大腸菌の形質転換に使用した。

適切な培養基上、温度３５ないし４０’Ｃで１夜培養し
て形質転換体を選別した。

得られた陽性のプラーク（白色）をニトロセルロースフ
ィルターに移し、Ａｒｒａｎｄ法に従ってマーク付けし
たプローブＡとハイブリダイズさせた。

陽性のハイブリダイゼーションングナルを示したプラー
クのうち２つを使用し、サンガー法に従い、連続ブライ
マー戦略（ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅ　ｐｒｉｍｅｒｓｓｔ
ｒａｔｅｇｙ）を使用して（Ｓｔｒａｕｓｓ　Ｅ、Ｃ，
ら［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、
ＢｉｏｃｈｅＩｌｌ、）Ｊ１５４、３５３　（Ｉ９８６
）］ジングルストランドＤＮＡの配列決定を行った。

このようにして、１つのプラークのジングルストランド
の配列が、プローブの調製に使用されたＮ−末端アミノ
酸配列からのものと同一であって、ＳＴ２遺伝子がコー
ド付ける血清形２の線毛性サブユニットのＮ−末端領域
に相当するヌクレオチド領域を含有することが明らかに
なった。

しかしながら、他のプラークのジングルストランドはＳ
Ｔ２遺伝子のものと類似してはいるが、同一ではないヌ
クレオチド配列を有する領域を含有しており、この結果
、異なる遺伝子の存在が推測された。

遺伝子を含有する全染色体ＤＮＡフラグメントを得ろた
めには、このクローンが遺伝子の一部分（ＳＴＸと称す
る）のみの含有していればよいことから、百日咳菌の遺
伝子ライブラリーを、クローニングベクターとしてコス
ミッドを使用して作製した。

コスミッドは、λファージのＣＯ８末端が挿入されたあ
る種のプラスミドである。これらは、組換え分子がウィ
ルス性タンパク質を含有し、これによりウィルス粒子を
形成することを可能にする。

コスミッドのＤＮＡを、ウィルス粒子により、λファー
ジであるかの如く細菌内に挿入する。

λＤＮＡは非常に大きいが、コスミッドは比較的小さい
ため、ＤＮＡの長いフラグメントをベクターに挿入でき
る。

詳しくは、コスミソドｐｃＨ７９［Ｈｏｈｎ　Ｂ、らｊ
’−ＧｅｎｅＪｌｌ、　２９１−２９８　（Ｉ９８０）
］及び百日咳閑の菌株ＳＡＩ［Ａｒ１ｃｏ　３．及びＲ
ａｐｐｕｏｌｊ　Ｒ，ｒンヤーナル・才ブ・バクテリオ
ロジーＪ　（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　１６９．
２８４７２８５３　（Ｉ９ｇ？）］を使用した。

百日咳菌Ｓ＾１の染色体ＤＮＡを溶菌細胞から分離し、
酵素５Ａｕ３Ａによって部分的に消化（７た。

エタノールによる沈殿及び遠沈による分離の後、３５−
４５に塩基（Ｋｂ）の染色体ＤＮＡフラグメントを単離
し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼの存在下でリゲーションして
、予め酵素Ｂａｍ旧で消化したコスミッドに接合させた
。ついで、このリゲーション混合物を大腸菌の形質転換
に使用し、アンピシリンを添加した選択培地で形質転換
体を選別した。

陽性のコロニーについて、２対のプローブＩ−２及び３
−４（ＳＴＸ及びＳＴ２の予め配列決定されている領域
の異なる部位に対して相捕的である）を使用するハイブ
リダイゼーション法によって分析した。

詳しくは、プローブ（自動システムによって合成される
）は下記の配列を有する。

プローブＩ　　（ＳＴＸ）　ＣＣＧ　ＣＣＣＡ　Ｔ　Ｇ
　ＣＣＧ　Ａ　Ａ　Ｇ　Ａ　Ｃプローブ２　　（ＳＴＸ
）　（ｉ　ＣＣＧ　Ｇ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ａ　ＣＡ
　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ｃプローブ３　　（ＳＴ２）　ＣＣＴ　
Ｔ　ＣＡ　Ｇ　ＣＴ　Ｔ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ａ　Ｔプロ
ーブ４　　（ＳＴ２）　Ｇ　Ｔ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ａ　
ＣＧ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　Ｇコロニーをニトロセルロ
ースフィルターに移し、溶菌し、２対のプローブとハイ
ブリダイズさせた（二重にテストする）。

２対のプローブについて６５℃、６時間でプレハイブリ
ダイゼーションを行い、一方、ハイブリダイゼーション
を４つのプローブについて各々異なる温度で実施した。

このようにして、対をなすプローブの両方とハイブリダ
イズしたいくつかの陽性のクローンを確認した。

染色体ＤＮＡフラグメント（ＳＴＸ遺伝子を含む）を含
有するコスミッドを同定するため、迅速抽出法［Ｍａｎ
ｉａｔｉｓら［モレキュラー・クローニングニア・ラボ
ラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）Ｊ
　（Ｉ９８２）、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒ、ニューヨーク］によってコスミッドを陽性のコロニ
ーから抽出し、ＥｃｏＲｌでの消化によって分析した。

これにより、これらのうちの１つ（以下、ｐｓＭ２８０
と表示する）がＳＴＸ遺伝子の予め同定されている部分
と同一の配列を含有することが明らかになった。

本発明に従い、遺伝子の配列決定を行うため、ＳＴＸに
関して特異なプローブとハイブリダイズする百日咳菌Ｓ
ＡＩの染色体ＤＮＡのフラグメントをコスミツドｐｓＭ
２８０がら抽出し、大腸菌ベクターにサブクローン化し
た。

本発明の目的に適するベクターは、組換えＤＮＡ技術で
一般的に使用されるプラスミド、ウィルス及びバタテリ
オファージの中から選ばれる。

詳しくは、外来のＤＮＡフラグメントが組込まれたクロ
ーンの迅速かつ容易な同定を可能にするプラスミドｐＵ
ｃ１２　（２７３０ｂｐ）　［Ｍｅｓｓｉｎｇ　Ｊ、ら
によってｒＧｅｎｅＪ　１９．２５９　（Ｉ９８２）に
開示］を使用した。

事実、該プラスミドはβ−ラクタマーゼ及びβガラクト
キシダーゼ用遺伝子のキャリヤーであり、宿主の大腸菌
菌株がアンピノリン含有培地で生育することを可能にす
る。外来のフラグメントがβ−ガラクトキシダーゼ用遺
伝子内に存在する制限部位（特にクローニングに好適で
ある）間に挿入されている場合には、遺伝子が中断され
酵素を生産できなくなる。

このようにして、ガラクトースと類似の物質（減成され
る場合であっても、色素産生性の分子を生成する）を使
用することにより、プラスミドを含有するものから組換
えコロニー（着色されない）を区別できる。

本発明に従い、コスミッドｐｓＭ２８０を制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩによって消化し、消化混合物をアーガロースゲル
上に負荷した（二重にテストする）。

電気泳動後、ＤＮＡバンドをニトロセルロースフィルタ
ーに移し、プローブｌ及び２（適当にマーク付けした）
とハイブリダイズさせた。

プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーショ
ンを各プローブについて異なる操作条件下で実施した。

フィルターを適当に洗浄し、ラジオグラフィーに供した
。

得られた結果は、両プローブに関して陽性の１．２Ｋｂ
のバンドが唯１つ存在することを示した。

該バンドに相当する染色体ＤＮＡフラグメントを電気溶
出し、ついでリゲーションを行って、予め１’：ｃｏＲ
Ｉで消化したプラスミドｐＵｃ１２に接合させた。

このリゲーションを、緩衝混合物中、Ｔ４　ＤＮＡリガ
ーゼの存在下、ＤＮＡフラグメントが過剰のプラスミド
／　ＤＮＡフラグメント比（好ましくは１／３）で実施
した。

リゲーション終了後、混合物を使用してコンピテント大
腸菌を形質転換させ、アンピンリンを添加した培養基上
で形質転換体を選別した。

このようにして得られた陽性のクローンから、所望の組
換えプラスミドを含有するいくつかのものを単離した。

これらのうちの１つ（ｐｓＭ２８１と表示する）を使用
して、１．２Ｋｂ染色体ＤＩＩＡフラグメントを単離し
、配列決定に供した。

配列決定を、連続プライマー戦略を使用するサンガー法
に従って実施した。

ｒｐＵＣンークエンノング」キットを使用し、かっα［
Ｐ”］　トレーサーとしてＡＴＰを使用して、正常なり
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒプロトコールに従い、変性プラスミ
ドについてシーフェンシング反応を行った。

上記操作によって、１　、２Ｋｂフラグメントがコスミ
ソドｐＨｃ７９の３７５塩基領域及びＳＴＸ遺伝子の８
４４塩基領域（これらのヌクレオチド配列及びアミノ酸
配列を第１図に示す）で構成されることが明らかになっ
た。

８４４塩基領域の５′末端から塩基６２８個下流に位置
するストップコドンまで伸長する配列内で開放読み取り
フレームが確認された。さらに、５Ｔｘａ伝子がコード
付ける成熟タンパク質のヌクレオチド配列及びアミノ酸
配列が、ＳＴ２サブユニットのアミノ末端配列の場合と
同様にして確認された。

この配列（Ｎ−末端アミノ酸：　ＮＨ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ
−ＧｌｙＴｈｒ−１１ｅ４ａｌ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌ
ｙで表される）は、線毛性ＳＴ２サブユニットの成熟タ
ンパク質とその分泌シグナル（リーダー配列）との間に
存在するものと同一のテトラペプチドＡｌａ−Ａｌａ−
Ｈｉｓ−Ａｌａによって先導される。このテトラペプチ
ド（膜リーダーーペプチダーゼに関する特異な切断部位
を表わす）は、中央の疎水性ドメイン（アミノ酸−６な
いし−１６）（リーダー配列の特徴である）及び−２１
位のメチオニンを含有するアミノ酸２９個のアミ、ノ酸
配列によって先導される。

２１位メチオニンをコード付けるＡＴＧは、おそらく、
翻訳コドンであろう。実際、該コドンの下流から成熟タ
ンパク質の開始点（ＧＡＡ）までの配列は、シグナル配
列の代表的な長さ及び特性［Ｐｅｒｌｍａｎ　Ｄ、らｒ
Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌｌ　１６７、３９１−４０９
（Ｉ９８３）］を有するポリペプチドをコード付ける。

ＳＴＸ遺伝子生産物のアミノ酸配列（そのヌクレオチド
配列から推測される）は、ＳＴ２遺伝子生産物とかなり
類似している。２つのタンパク質の大きい類似性が、ア
ミノ末端領域及び他の線毛性タンパク質について見られ
る如く、最高の保存塵を有するものであるアミノ酸１２
個のアルボキシ末端領域で観察された［Ｌｉｖｅｙらｒ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｊ（２）、
　２０３−２０９　（Ｉ９８７）］。

成熟タンパク質の類似性の全体の度合は、アミノ酸レベ
ルで６６％及びヌクレオチドレベルで６１％と評価され
る。

ＳＴＸの予測されるシグナル配列は、タンパク質の残部
よりもＳＴ２サブユニットに対してわずかに低い類似性
（５２％）を有する。さらに、Ｓｒ１及びＳＴＸの配列
によって予測される疎水塵（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉ
ｔｙ）／ＩＪｔ水度（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ）
モデルは非常に類似している。

結局のところ、百日咳菌のＳＴＸ遺伝子は分子量的２０
Ｋｄを有する線毛タイプの成熟タンパク質をコード付け
、血清形の異なる線毛２．３又は６に又は新規な線毛に
相当すると考えられる。

本発明に従い、百日咳菌の染色体遺伝子において存在す
る２種類の遺伝子ＳＴ２及びＳＴＸの間の関連性を確認
するため、ゲノム分析を行った。

詳述すれば、百日咳菌１６５の染色体ＤＮＡを各種の制
限酵素で消化し、消化混合物をＳＴＸ及びＳＴ２遺伝子
に関して特異なプローブとハイブリダイズさせた。

いずれの場合にも、両プローブとハイブリダイズできた
バンドは確認されなかった。

これは、２つの遺伝子が単一のオペロン内に又は相互に
近接して位置していないが、最小距離数Ｋｂで位置しな
ければならないことを示している。

このような事実は、百日咳菌ＳＡＩの遺伝子ライブラリ
ーから両遺伝子を含有するコスミッドが存在しないこと
によっても確認された。

本発明によれば、ＳＴＸ遺伝子がコード付ける成熟タン
パク質のもの又はその免疫学的に活性な領域のものと同
一のアミノ酸配列を有するペプチドは、無細胞性の多価
抗百日咳ワクチンの調製に特に有用である。本発明に係
るプラスミドｐｓＭ２８１をＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０３
　（ｐｓＭ２８１）として、アメリカン・カルチャー・
センターに１９８７年１２月７日付けで寄託している（
寄託番号：　ＡＴＣＣ６７５７２）。

以下の実施例は本発明を説明するためのものであって、
本発明を限定するものではない。

実施例１ 百日咳菌１６５から染色体ＤＮＡの抽出電文 β−カザミノ酸 （ｃａｓａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ）　（ＤＩＦＣＯ）ＣＱ ＭｇＣＱｔ・６Ｈ，Ｏ Ｋ、ＰＯ。

ニコチン酸 グルタチオン ０．２　ｇ ｏ、１９ ０．５　ｇ Ｏ，０２９ ０，０１９ デンプン　　　　　　　　　　１．００９ＨｔＯｌρ 吋　　　　　　　　　　　　　　　　　６．８予め１２
０°Ｃにおいて１５分間殺菌した上記組成の発酵培養基
１００Ｒ１２に百日咳菌の菌株１６５（血清形ｌ、２．
３）を接種し、３７℃で３日間撹拌下（２００ｒｐｍ）
に維持した。

この時間の経過後、ローター５ｏｒｖａｌｌ　ＲＣ５Ｂ
モデル５Ｓ３４において４°Ｃで遠心処理して（Ｉ０分
間、５０００ｒｐｍ）、上澄み液から細胞を分離し、ｌ
ｏｏｍＭＮａＣＱ、　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ｉ（ＣＱ（
ｐＨ７，５）を含有する溶液で洗浄した（２　Ｘ　１２
０ｉｆｌり。

このようにして得られた懸濁液を上述の如くして再度遠
心分離し、細胞を回収し、リゾチーム（ＳＩＧＭＡ）　
１　ｔｔｔｇｈ（ｌを含有する緩衝溶液（Ｉ００ｍＭ　
ＥＤＴＡ。

５０ｍＭ　ＮａＣＱ、　２．５％ショ糖；　ｐＨ６，９
）　１０ｍ（！中に再度壁間化した。＠濁液を撹拌し、
３７℃に３０分間維持し、ドデシルスルホン酸ナトリウ
ム（ＳＤＳ）を最終濃度１％まで添加し、６０°Ｃに３
０分間推持した。

予めＩ　ｘｓｓｃ　（Ｉ　ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ　Ｎａ
Ｃ（！、　１５ｍＭクエン酸ナトリウム）中３７℃で３
０分間インキュベートしたプロテアーゼ　ｌ　ｕｈＱを
該溶液に添加し、得られた溶液を３７℃で２時間反応さ
せた。ＮａＣａを最終濃度ＩＭで添加した後、混合物を
水中に３０分間維持し、ついで遠沈した。上澄み液中に
含有されるＤＮＡを冷エタノール（−２０’Ｃ）２−３
容で沈殿させ、ガラス棒で集め、０，１ｘＳＳＣ１０π
Ｑ中に再度懸濁化させた。懸濁液をゆるやかに撹拌しな
がら室温（２０−２５℃）に１夜推持し、ＲＮＡ５ｅ　
（Ｉ０７／ｍＱ）を添加した後、３７℃に３０分間維持
した。

溶液の塩濃度をｔｘｓｓｃとし、フェノール（ｌ容）で
抽出し、ゆっくりと撹拌しながら室温に推持した溶液に
イソプロパツールを添加することによってＤＮＡを沈殿
させた。

ついで、遠心分離によってＤＮＡを回収し、０．１×５
ＳＣＩＩ（２中に再度懸濁化させた。

染色体ＤＮＡの量（分光光度計Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｍｅ
ｒモデル５１５を使用し、ＯＤ　２６０での分光測光の
読みにより評価）ｌ；ｔ　０．８４５ｍｇ／ｉｃであっ
た。

実施例２ 線毛性サブユニットをコード付ける遺伝子の実施例１で
得られた染色体ＤＮＡ　１０μ９を、反応緩衝溶液［６
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ（ｐＨ７，５）、５０ｍＭ　Ｎ
ａＣＱ１５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２ｔ］　２００μＱ中、制
限酵素５ａｕａＡ　１００単位（ＩＩ）により３７℃に
おいて１．５時間消化した。

このようにして消化したＤＮＡを混合物に３Ｍ酢酸ナト
リウム及びエタノールを添加することによって沈殿させ
、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機において４℃、１２０
００ｒｐｍで１５分間遠沈して分離し、ついでＴＥｍ衝
溶液［１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（４（ｐＨ８，０）、１
　ｍＭ　ＥＤＴＡ］　ｔｏ。

μＱ中に再度懸濁化させた。同時にファージＭ１３ｍｐ
８（５μ９）及びＭ１３ｍｐ９　（５ｕ９）を、別個に
、反応緩衝溶液［１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２　（ｐ
Ｈ７，８）、１０ｍＭ　ＭｇＣ１２ｔ、５０ｍＭ　Ｎａ
ＣＱ）　５０ｕＱ中、酵素ＢａｍＨ［（Ｂｏｈｅｒｉｎ
ｇｅｒ）２０Ｕにより３７℃で１．５時間消化した。

ついで消化混合物からファージＤＮＡを沈殿させ、遠沈
によって分離し、上述のＴＥ緩衝液に再度＠濁化させた
。

染色体ＤＮＡフラグメント（Ｉ，５μ９）を含有する溶
液１５μｃを、リゲーンヨン緩衝溶液［６６ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ　−ＨＣＱ　（ｐＨ７，６）、１　ｍＭ　ＡＴＰ、
　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２ｔ、　１０ｍＭジチオトレイト
ール）　１．２５村中、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ１０の存
在下、ファージＤＮＡ溶液１２．５μｆｆ　（Ｉ，２５
μ９）と共に１４℃で１８時間リガーゼ処理した。

ついで、リゲーション混合物１２５μＱずつを使用して
、５０ａ＋Ｍ　ＣａＣａ、での処理によりコンピテント
とした［Ｍａｎｄｅｌ　Ｍ、及び旧ｇａ　ｒＪ、Ｍｏ１
．Ｂｉｏｌ、　Ｊ　５３゜１５４　（Ｉ９７０）］大腸
菌７１／１ｇ　［Ｍｉｌｌｅｒ　Ｊ、Ｈ，ｒエクスペリ
メンツ・イン・モレキュラー・ジエネティックス（Ｅｘ
ｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ）Ｊ（Ｉ９７２）、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、、ニューヨーク］を形質転
換させた。アンピシリン５０μ９７村、０．０３ｍＶＩ
ＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド）及び０．０５％Ｘ−ゲル（５−ブロモ−４−クロロ
−３−インドリル−〇−ガラクトピラノシド）を添加し
て選択的としたＩＸＹＴ培地プレートし８９／ρＢａｃ
ｔｏ　Ｔｒｉｐｔｏｎｅ　（ＤＩＦＣＯ）、５９／（ｌ
　Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ　（ＤＩＦＣ
Ｏ）及び５９／（ｌ　ＮａＣ（２］上に細胞を置き、恒
温室において３７℃で１２時間インキュベートすること
によって、形質転換体の選別を行った。

このようにして、陽性のプラーク（白色）　１４０００
個を得た。

Ｂ）特異性プローブの作製 百日咳菌１６５の線毛の大きいタンパク質サブユニット
（２）のＮ−末端部をエドマン法によって分析したとこ
ろ、下記配列を有することを示した。

＋１１１−Ａｓｐ−Ａｓｐ　Ｇｌｙ−Ｔｈｒ　　ｌｌｅ
　Ｖａｌ　　ｌｌｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　　Ｉｌ
ｅ　Ｔｈｒアミノ酸配列配列推測されるヌクレオチドを
、遺伝暗号の相対的なデジェネラシーを考慮して、オリ
ゴヌクレオチド（プローブとして使用される）の合成に
使用した。詳しくは、下記配列を有する一群（ファミリ
ー）のオリゴヌクレオチドの合成にあたり、自動システ
ム　Ｉ　　Ｐｌｕｓ　ＤＮＡ合成装置（Ｂｅｃｋｍａｎ
）を使用した。

１１ｅ　Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ　　Ｔｈｒ　　ｌｉｅ　　Ｔ
ｈｒＡＴＣＡＣＣＧＧＣＡＣＣＡＴＣＡＣ ＴＴＴＴ ＧＧＧＡ ＾ｒｒａｎｄの方法［ｒＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈ
ｙｂｒｉｄｊｓａｔ４ｏｎ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　
ＡｐｐｒｏａｃｈＪ　Ｂ、Ｄ、Ｈａｎｅｓ−Ｓ、旧ｇｇ
ｉｎｓｇ、Ｐｒｅｓｓ　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　ＤＣ（
Ｉ９８５）、ｐ３４］に従って、オリゴヌクレオチド０
．９μ９を、５′ＯＨ末端部でα［Ｐ”］　ＡＴＰ　５
００μＣｉ　（３０００Ｃｉ／ミリモル）でマーク付け
した。算定された固有活性度［シンチレータ−ＬＳ　７
５００　（Ｂａｃｋｍａｎ）］は８．３ｘｌＯ’　ｃｐ
ｍ／μ９（ＤＮＡ）であった。

ＭＩ３における遺伝子ライブラリーのプラークをニトロ
セルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆５ｃ
ｈｎｅｌｌ　Ｏ，４５μ！ｌ）に移し、このフィルター
について、Ｐ、Ｊ、Ｍａｓｏｎ及びＪ、買ｉ１１ｉａｍ
ｓの方法（ｒＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉ
ｓａｔｉｏｎ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏ
ａｃｈＪｐ１２３）に従って、上記特異性プローブによ
るハイブリダイゼーションを行った。プレハイブリダイ
ゼーションを３９℃、６時間で行い、ハイブリダイゼー
ションを３９℃、１８時間で行った。最後に、２５°Ｃ
において、フィルターを０．１％ドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＳＤＳ）、６　Ｘ５ＳＣ（０，Ｐ、Ｍ　ＮａＣｌ２
．０．０９Ｍクエン酸Ｎａ）で１時間洗浄し、ラジオグ
ラフィックプレート　Ｋｏｄａｋ　Ｘ−Ｏｍａｔ　ＡＲ
と接触させた。

このようにして、陽性のシグナルを示したプラーク５個
が確認された。これらのうちの２つについて同定した。

陽性のプラーク２個のジングルストランドをＭｅｓｓｉ
ｎｇ　Ｊ、の方法［［メソッズ・オブ・エンザイモロジ
ー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）ｊ　Ｖ
、１０１　（Ｉ９８３）］によって抽出し、５ｔｒａｕ
ｓｓ　Ｅ、　Ｃ，らによってｒＡｎａｌｙｔｉｃａｌ　
Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ　１５４．３５３　（Ｉ９８６）に
開示された連続プライマー戦略によって配列決定した。

ジングルストランドの１つの配列は、ＳＴ２遺伝子のも
のと同じ領域を含有し、他方は、類似してはいるが、同
一ではない配列を含有していた（異なる遺伝子の存在を
示唆する）（ＳＴＸと称する）。

実施例３ Ａ）百日咳菌ＳＡＩのゲノムバンクの作製遺伝子ＳＴＸ
の完全暗号配列を得るため、コスミッドｐＨｃ７９を使
用して百日咳菌ＳＡＩのゲノムバンクを作製した。

実施例１に記載の如くして抽出した百日咳菌ＳＡＩの染
色体ＤＮＡ　５００μ９を、制限酵素５ａｕ３Ａ　５１
Ｊによって３７℃、１５分間で部分的に消化した。

このようにして消化したＤＮＡを、溶液にエタノールを
添加することによって沈殿させ、分離後、ＬＯｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ、　　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ緩衝溶液０．５ｎ（ｌ
に懸濁化させた。

溶液を、１　ｍＭ　ＮａＣＱ、　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、
　　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ緩衝溶液（ｐＨ７，５）　３５
ｘσ中に溶解したショ糖濃度勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔ）
（Ｉ０％から４０％）に負荷した。

ライで、ローターＢｅｃｋｍａｎ　ＳＷ　２Ｂにおいて
、濃度勾配を２６００Ｏｒｐｍで１６時間遠心分離した
。

フラクション（各１１１Ｑずつ）を集め、各フラクショ
ンに含有されたＤＮＡの分子量をアーガロースでの電気
泳動［Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ、らｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ
ａｌＪ　（Ｉ９８２）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）Ｉ
ａｒｂｏｒ。

ニューヨーク］によって測定した。

３５−４５ＫｂのＤＮＡフラグメントを含有するフラク
ションを透析し、上述の如くしてエタノールでＤＮＡを
沈殿させた。

ついで、遠沈によってＤＮＡを分離し、１０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓｌｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ緩衝溶液（ｐＨ７，５）にＤ
ＮＡａ度１μｇ／μ＆で懸濁化させた。

染色体ＤＮＡフラグメントをクローン化した。

コスミッドｐ）ｌｃ７９２０μ９を、消化混合物２００
μＣ中、酵素ＢａｍＨＩ　４０Ｕにより３７℃、１時間
で消化した。

リゲーション混合物１０μＱ中、Ｔ４　Ｄ！ＪＡリガー
ゼＩＵの存在下で、染色体ＤＮＡ　２μ９をコスミソド
ＤＮＡ　０．５μ９と共に１４℃において１８時間リガ
ーゼ処理した。

この時間の経過後、リゲーション混合物２．５μａをＳ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｐａｃｋａｇｅｎｅキットと共に
インビトロで使用した。

このようにして得られた組換えコスミッドを大腸菌の菌
株ＪＭ１０９に接種し、形質転換体をＬＢ培地（Ｂａｃ
ｔｏ　Ｔｒｉｐｔｏｎｅ　１０９、Ｂａｃｔｏ　Ｙ、Ｅ
、　５ｇ、ＮａＣＣ１０り、ｌ１ｙＯＩ　Ｑ：　　ｐＨ
７，５）上で選別した。

陽性のコロニー約１５０００個が生産された。

ついて、コロニー１５００個を、下記の配列を有する２
対のプローブを使用してスクリーニングした。

プローブＩ　　（ＳＴＸ）　ＣＣＧ　ＣＣＣＡ　Ｔ　Ｇ
　ＣＣＧ　Ａ　Ａ　Ｇ　Ａ　Ｃプローブ２　　（ＳＴＸ
）　Ｇ　ＣＣＧ　Ｇ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ａ　ＣＡ　
Ａ　Ｔ　Ｇ　Ｃプローブ３　　（ＳＴ２）　ＣＣＴ　Ｔ
　ＣＡ　Ｇ　ＣＴ　Ｔ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ａ　Ｔプロー
ブ４　　（ＳＴ２）　Ｇ　Ｔ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ａ　Ｃ
Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　ＧＨｅｃｋｍａｎオートシス
テムによってオリゴヌクレオチドを合成し、下記の方法
によって５’ＯＨ末端においてα［Ｐ”］　ＡＴＰ　１
０５μＣｉでマーク付けした。

ヌクレオチド２００ｎ７を、Ｋｉｎａｓｅ緩衝液３ｕＱ
。

ＡＴＰ　２１μＱ、　Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼｔ
ｏｕｘ（Ｉμｍ２）でなる水溶液３０μＱに懸濁化させ
た。

混合物を３７℃に４５分間推持し、酵素を６５℃、】０
分間で脱活性化した。

ついで、マーク付けしたプローブを、ＴＥ緩衝溶液（ｐ
Ｈ８）中、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０で精製して、組
込まれなかったマーカーを除去した。

フラクション１３個（各１５０μρずつ）を集めた。

各フラクション２μＱをンンチレーンション液ｄｍＱ中
に入れ、シンチレータ−で測定した。

バンク（コスミッド）のコロニーをニトロセルロースフ
ィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ
　Ｏ，４５μｍ）に移し、ＮａＯＨで溶菌した後、サザ
ン法（Ｍａｎｉａｔｉｓ１９８２）によって不動化させ
た。フィルターを、上述の如くしてマーク付けした２対
のプローブでハイブリダイズさせた（２重にテストした
）。

プレハイブリダイゼーション処理を６５℃、６時間で行
い、ハイブリダイゼーションを下記の温度において１８
時間で行った。

プローブｌに関して　５３℃ プローブ２に関して　４７°Ｃ プローブ３に関して　４１℃ プローブ４に関して　４５℃ ついで、フィルターを洗浄し、前記実施例のＣ）に記載
した如く、ラジオグラフィックプレートと接触させた。

４種類のプローブとハイブリダイズしたクローン５個を
上述の方法によって単離した。

クローンから抽出したコスミッドをＥｃｏＲＩでの消化
によって分析した。これらのうち３種類がプローブ３及
び４と類似するが、同一ではない配列を含有しており、
１種類が予め単離されたＳＴＸ遺伝子の領域と同一の配
列を含有しており、残りのらの（プローブｌ及び３とハ
イブリダイズしたもの）はＳＴＸ遺伝子のものと同一で
ない配列を含有していることが明らかになった。

ＳＴＸ遺伝子を有するコスミッドを含有するコロニーを
ｐｓＭ２８０と名付けた。

コスミッドｐｓＭ２８０を迅速抽出法によって抽出し、
その２５０ｎ９をｌ００ｎ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ２　
（ｐＨ７，５）、５０ｍＭＮａＣＱ１１０ｍＭ　ＭｇＣ
Ｑｔの消化混合物１０μｃ中、ＥｃｏＲＩ（Ｂｏｈｅｒ
ｉｎｇｅｒ）　５　ｔｌにより３７℃、１時間で消化し
た。

ついで、６５℃で１０分間処理して酵素反応を停止させ
、混合物を２つの０．８％アーガロースゲルに平行して
負荷し、８０ｖ、３時間で電気泳動した後、ＤＮＡのバ
ンドをニトロセルロースフィルター（Ｍｉｃｒｏ　Ｆｉ
ｌｔｒａｔｉｏｎシステム；　Ｑ、４５μｍ）２個に移
し、上記Ｃ）で記載した方法に従ってプローブ１及び２
とハイブリダイズさせた。

プレハイブリダイゼーション処理を、６ＸＳＳＣ（Ｉ　
Ｘ　５ＳＣ１＝　１５０ｍＭ　ＮａＣｌ２．２５＋＋＋
Ｍクエン酸Ｎａ）、１ＯＸＤｅｎｈａｒｄｔ　（Ｉ　Ｘ
Ｄｅｎｈａｒｄｔ＝　１％Ｆｉｃｏｌｌ、　１％ＰｖＰ
１％ＢＳＡ　ＰｅｎｔａｘフラクションＶ）及び変性し
た鮭の精子５０μ９７１の混合物１０ｇ！σ中、フィル
ターＮｏ、　１については５３℃、４時間、フィルター
Ｎ００２については４７℃、４時間で実施した。

ハイブリダイゼーションを、フィルターＮｏ、　１につ
いてはプローブ１　６００μ（！（６ＸｌＯ’ｃｐｍ／
ｙＤＮＡ）を、フィルターＮ０２２についてはプローブ
２６００μＱ　（８，４Ｘ１０″ｃｐｍ／γＤＩＩＡ）
を添加した上記混合物ｌ０ｙＯ中で実施した。

ついで、フィルターＮｏ、Ｉ及びＮＯ４２をそれぞれ５
３℃及び４７℃で１夜インキユベートした。最後に、フ
ィルターを、０，１％ドデンル硫酸ナトリウムを含有す
る６　Ｘ５ＳＣ１ｏＯＩｎｆ！ずつで４回（Ｉ５分間）
洗浄し、ラジオグラフィックプレートＫｏｄａｋ　Ｘ−
ＯｍａｔＡＲと一８０℃で１夜接触させた。

その結果、両プローブとハイブリダイズする陽性のバン
ド（Ｉ，２Ｋｂ）　１つのみが存在することを示した。

ベクターｐＵｃ１２１μ９を消化混合物１０μρ中、Ｅ
ｃｏＲＩ　　５　Ｕによって３７℃、１時間で消化した
。

６５°Ｃに１０分間維持して酵素反応を脱活性化し、Ｄ
ＮＡをエタノールで沈殿させ、遠沈によって分離した。

ついで、消化プラスミドＤＮＡ　５０ｎｆＪを、リゲー
ソヨン混合物２５μｅ中、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼＩＵの
存在下、１２℃で１夜処理して、ＤＮＡの１．２Ｋｂ　
ＥｃｏＲＩフラグメン）・６６ｎ９を接合させた。

リゲーンヨン混合物２０μＣを使用して、コンピテント
大腸菌ＪＭ１０３　（Ｍａｎｉａｔｉｓ；　１９８２）
　２００．４ｚ１２を形質転換させた。ついで、アンピ
シリン５０γ／ＷＱ。

Ｘゲル４０γ／ｍ（ｌ及びＩＰＴＧ　１２５γ／＋Ｃを
添加したＬＢ寒天培地プレート上、３７℃、１８時間で
形質転換体の選別を行った。

陽性のクローン２４個を得た。このうち１７個は所望の
組換えプラスミドを含有していた。

これらの１つ（ｐｓＭ２８１）を、迅速抽出によって陽
性のクローンから抽出した。

Ｄ）　　ｐｓＭ２８１の配列決定 ３ａｎｇｅｒらの方法［ｒＰ、Ｎ、Ａ、Ｓ、Ｊ　７４．
５４６３　（Ｉ９７７）］に従い、連続プライマー戦略
［５ｔｒａｕｓｓらｒＡｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ　１５４．５５３　（Ｉ９８６）］
によって組換えプラスミドｐｓＭ２８１の配列決定を行
った。プライマーとして使用するオリゴヌクレオチドを
、自動システムｌ　　Ｐｌｕｓ　ＤＮ人合成装置（Ｂｅ
ｃｋｍａｎ）によって合成した。

ｒｐＵｃシークエンンング」キット及びトレーサーとし
てα［Ｐ”］　ｄＡＴＰを使用し、変性プラスミド上、
正常Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒプロトコールに従ってシーフ
ェンシング反応を行った。

電気泳動分離に使用した装置はＭａｃｒｏｐｈｏｒシー
クエンシングシステム（ＬＫＢ）である。

このようにして配列決定された完全１．２Ｋｂフラグメ
ントは、コスミッドｐＨＣ７９の塩基３７５個及びＳＴ
Ｘ遺伝子の塩基８４４個で構成されていた（第１図）。

第３図に示すように、ＳＴＸ遺伝子産生物のアミノ酸配
列は、ＳＴ２遺伝子の産生物との類似性を有している。

ゲノム分析 百日咳菌１６５の染色体を実施例１の如くして抽出し、
ＤＮＡの一部を各種の酵素によって別個に消化した。

詳しくは、染色体ＤＮＡ　１．５７１を、酵素３ｔｕｌ
。

５ｐｈｌ、　Ｓｍａｌ、　ＰｖｕＩｒ、Ｐｓｔｌ、　Ｅ
ｃｏＲｌ及びＢａｍＨＩ　（各々１５１１　）により、
消化混合物２０１Ｑ中、３７℃、３時間で消化した。

ついで、混合物を０．８％アーガロースゲル上に負荷し
、１００■において３−４時間泳動させた。

染色体ＤＮＡのバンドをニトロセルロースに移し、実施
例２に記載の如くして、プローブＩ及び４と別々にハイ
ブリダイズさせた。

いずれの場合にも、２つのプローブとハイブリダイズす
るバンドは全く確認されなかった。

これは、これら２つの遺伝子が単一オペロン内に又は相
互に隣接して位置しないが、最小距離数Ｋｂで存在しな
ければならないことを示している。

該ｉ１Ｚ実は百日咳菌の遺伝子ライブラリーから両遺伝
子を含有するコスミッドが欠けていることによっても確
認される。

４図面の簡単な説明 第１図は百日咳菌の菌株ＳＡＩから得られたＳＴＸ線毛
をコード付ける遺伝子のヌクレオチド配列及び対応する
アミノ酸配列を示す図、第２図はＳＴＸ。

ＳＴ２、ＳＴ３及びＳＴ６線毛の成熟部分のＮｌ＋、末
端配列を示す図、及び第３図はＳＴＸ線毛及びＳ７２線
毛の類似性を示す図である。

（ほか１名） 図面の浄書（内容に変更なし） ロＱコロυ■ＯＣコロυω口００口Ｑ−ロＱΦロ＋ψＱ
Ｏφ口Ｑ−ロ←０の　←　０・　ｃ＋Ｊ　　←　−−リ
　←　い　ザ　←　二重　ロ　０−・　の　←　句嘩　
へ　←　−奢　■　く　−一・！　く　・−健０１ｊ　
　ユｅ＋　Φ　υ　−Ｑ−一く一−＋Ｑ−へ←工のＱ−
凶Ｃシ寸く一！Ｑ−のυ工Φ（←ψＱ顛ｃｐｆｉ　　（
ｊＩ＋ｕＸ　　（Ｊｈ６　　Ｃ：ｌコ（Ｊ＋−（５１：
　　ｃ５ｅ　　Ｑコ　〇−υ閲０−　Ｑぶ　く・−ＣＩ
＋＜−＜＞＜−＜−　←ω　Ｑ≦　〇−〇〈　く←　（
Ｊ　：　　ＩＪ　＜　　Ｃ：ｌ　（：ｌ　　←←　（Ｊ
Ｃ：ｌ　　（ｊ（ｊ　　←−く←　Ｑく６　Ｌ＋　　ｅ
Ｊ　Ｉ＋　ロ閃 Ｑ＋＋Ｉ＋１ＩＩＱぶ （ｊ　Ｃ：ｌ　　Ｃ：３　：＞　　＜←くψ　ＣＪ　＞
　　（ｊ　ＯＣＪ　＞　　（ＪＣくψ　Ｃ−１ｊ−Ｊ（
ｊに　ロコ　くｄく＞　ロー　ＣＪ　＆＋　　ｌｊ　−
＋　　＜　ｖ＋　　＜諷　ヒー　←■　（−＜−　υ−
←印　く１−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　新規な線毛性サブユニットをコード付ける百日咳菌
   に属する菌株の染色体ＤＮＡから単離された遺伝子であ
   って、下記ヌクレオチド配列（ I ）を有することを特
   徴とする、遺伝子。 【遺伝子配列があります】 ２　請求項１記載のものにおいて、線毛性サブユニット
   が下記アミノ酸配列（II）で表される、遺伝子。 【遺伝子配列があります】 ３　請求項１記載の遺伝子に含有される成熟線毛性サブ
   ユニットをコード付ける構造遺伝子であって、下記ヌク
   レオチド配列（III）を有することを特徴とする、構造
   遺伝子。 【遺伝子配列があります】 ４　請求項３記載のものにおいて、前記成熟線毛性サブ
   ユニットが下記アミノ酸配列（IV）で表される構造遺伝
   子。 【遺伝子配列があります】 ５　請求項１記載の遺伝子を含有することを特徴とする
   、百日咳菌に属する菌株から単離された染色体ＤＮＡフ
   ラグメント。 ６　請求項５記載のものにおいて、第１図に示されたヌ
   クレオチド配列を有する、染色体ＤＮＡフラグメント。 ７　請求項１又は２記載の遺伝子にクローニングベクタ
   ーを結合させることによって得られた組換えＤＮＡ分子
   。 ８　請求項３又は４記載の遺伝子にクローニングベクタ
   ーを結合させることによって得られた組換えＤＮＡ分子
   。 ９　請求項５又は６記載の染色体ＤＮＡフラグメントに
   クローニングベクターを結合させることによって得られ
   た組換えＤＮＡ分子。 １０　請求項７−９のいずれか１項に記載のものにおい
   て、前記ベクターが細菌又は酵母における発現用のプラ
   スミドである、組換えＤＮＡ分子。 １１　請求項１０記載のものにおいて、プラスミドがｐ
   ＵＣ１２である、組換えＤＮＡ分子。 １２　プラスミドを請求項５記載の染色体ＤＮＡフラグ
   メントに結合させたことを特徴とする、請求項１１記載
   のｐＳＭ２８１組換えＤＮＡ分子。 １３　請求項７−１２のいずれか１項に記載の組換えＤ
   ＮＡ分子によって形質転換させた微生物であって、該微
   生物が大腸菌、桿菌類及び酵母の中から選ばれるもので
   あることを特徴とする、微生物。 １４　大腸菌ＪＭ１０３（ｐＳＭ２８１）ＡＴＣＣ６７
   ５７２である、請求項１３記載の微生物。 １５　単独で又は高分子支持体に結合された状態で、百
   日咳菌による感染に対して防御的な特異な抗体応答をヒ
   トにおいて誘発する免疫学的に活性な合成ペプチドであ
   って、該ペプチドがアミノ酸配列（II）により、又はそ
   の領域で表されることを特徴とする、免疫活性合成ペプ
   チド。 １６　請求項１５記載のペプチドを治療上有効な量で含
   有してなる、百日咳菌による感染に対して防御免疫をヒ
   トにおいて誘発する医薬組成物。 １７　請求項１５記載のペプチド又は請求項１６記載の
   組成物を免疫学的に有効な量で投与することを特徴とす
   る、百日咳菌による感染に対してヒトにおいて免疫を誘
   発する方法。