JPH022361A - イー・コリおよびエス・セレビシエにおけるｈｉｖ蛋白質の発現 - Google Patents
イー・コリおよびエス・セレビシエにおけるｈｉｖ蛋白質の発現Info
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- JPH022361A JPH022361A JP63294460A JP29446088A JPH022361A JP H022361 A JPH022361 A JP H022361A JP 63294460 A JP63294460 A JP 63294460A JP 29446088 A JP29446088 A JP 29446088A JP H022361 A JPH022361 A JP H022361A
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
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- C12N2740/10011—Retroviridae
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は細菌および酵母系における蛋白質の発現に関す
る。さらに詳しくは、本発明はイー・コリ（Ｅ、 ｃｏ
ｌ ｉ）およびエス・セレビシエ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）におけるヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩＶ）
蛋白質ＨＩＶ ｐ１７の発現に関する。
る。さらに詳しくは、本発明はイー・コリ（Ｅ、 ｃｏ
ｌ ｉ）およびエス・セレビシエ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）におけるヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩＶ）
蛋白質ＨＩＶ ｐ１７の発現に関する。
発明の背景
エイズ（ＡＩＤＳ）および関連疾患の原因である１イＩ
■はレトロウィルス族の一員である。ヒトＴ−リンパ指
向性（ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）ウィルス・タイプＩ
ｎ （ＨＴＬＶ−ｉｌｌ） 、す７ハ節症ウィルス（Ｌ
ＡＶ）およびエイズ関連レトロウィルス（Ａ ＲＶ）を
包含するＨＩＶのいくつかの単離体が存在する。
■はレトロウィルス族の一員である。ヒトＴ−リンパ指
向性（ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）ウィルス・タイプＩ
ｎ （ＨＴＬＶ−ｉｌｌ） 、す７ハ節症ウィルス（Ｌ
ＡＶ）およびエイズ関連レトロウィルス（Ａ ＲＶ）を
包含するＨＩＶのいくつかの単離体が存在する。
ＨＩ Ｖタイプ２と命名された関連レトロウィルスは最
近、西アフリカでエイズに関係することが示されている
。グヤデルら（Ｇｕｙａｄｅｒ、 ｅｔ ａｌ、） 、
不イチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）３２６ ： ６６２（１９
８７）。
近、西アフリカでエイズに関係することが示されている
。グヤデルら（Ｇｕｙａｄｅｒ、 ｅｔ ａｌ、） 、
不イチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）３２６ ： ６６２（１９
８７）。
ＨＩＶゲノムの分子特性は、該ウィルスが池のレトロウ
ィルスと同一の全ｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎ〜・組織を呈す
ることが証明されている。ラトナーら（１？ａｔｎｅｒ
、 ｅＬ ａｌ、） 、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３
↓３ ： ２７７ （１９８５） 、ワインーホブソン
ら（Ｖａｉｎ−１（ｏｂｓｏｎ、 ｅｔ ａｌ、） 、
セル（Ｃｅｌｌ） ４０ ： ９ （１９８５）。加え
て、それは、より通常のレトロウィルスでは見い出され
ない少なくとも５つの遺（分子：ｓｏ ｒ、ｔ ａ
ｔ ３、ａ ｒ ｔ／ｌ ｒ ｓ、３’
ｏ ｒ ｆおよびＲを３有する。
ィルスと同一の全ｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎ〜・組織を呈す
ることが証明されている。ラトナーら（１？ａｔｎｅｒ
、 ｅＬ ａｌ、） 、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３
↓３ ： ２７７ （１９８５） 、ワインーホブソン
ら（Ｖａｉｎ−１（ｏｂｓｏｎ、 ｅｔ ａｌ、） 、
セル（Ｃｅｌｌ） ４０ ： ９ （１９８５）。加え
て、それは、より通常のレトロウィルスでは見い出され
ない少なくとも５つの遺（分子：ｓｏ ｒ、ｔ ａ
ｔ ３、ａ ｒ ｔ／ｌ ｒ ｓ、３’
ｏ ｒ ｆおよびＲを３有する。
エイズのひどさは、ＨＩＶによる感染の早期かつ正確な
診断ならびに血液銀行からのＨＩ Ｖ汚染試ｆ、・１の
検出および排除を極めて重要とする。ガロら（Ｇａｌｌ
ｏ、 ｅｔ ａｌ、）は、米国特許第４５２０１１３号
、血清中の抗〜ＨＴＬＶ−１抗体の存在を検出するため
のＨＴ Ｌ Ｖ −［［から得られる抗原の使用を開示
している。モンタニエラ（Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒｅｔ
ａｌ、）は、欧州特許出願Ａ−１３８６６７号、該ウィ
ルスによる感染を検出するための特異化しＡＶ抗原の使
用を開示している。ババスら（Ｐａｐａｓ。
診断ならびに血液銀行からのＨＩ Ｖ汚染試ｆ、・１の
検出および排除を極めて重要とする。ガロら（Ｇａｌｌ
ｏ、 ｅｔ ａｌ、）は、米国特許第４５２０１１３号
、血清中の抗〜ＨＴＬＶ−１抗体の存在を検出するため
のＨＴ Ｌ Ｖ −［［から得られる抗原の使用を開示
している。モンタニエラ（Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒｅｔ
ａｌ、）は、欧州特許出願Ａ−１３８６６７号、該ウィ
ルスによる感染を検出するための特異化しＡＶ抗原の使
用を開示している。ババスら（Ｐａｐａｓ。
ｅｔ ａｌ、）は、米国特許出頭６−６６４９７２号（
ダーウエント（Ｄｅｒｖｅｎｔ）受入番号８５−１１０
２６８／１８） 、ＨＴＬＶ−１１：よる感２Ｊを検出
するためのイー・コリにおけるＨＴＬＶ−１工ンベロー
プ蛋白質コーディング配列の発現およびそれにより発現
される蛋白質の使用を開示している。
ダーウエント（Ｄｅｒｖｅｎｔ）受入番号８５−１１０
２６８／１８） 、ＨＴＬＶ−１１：よる感２Ｊを検出
するためのイー・コリにおけるＨＴＬＶ−１工ンベロー
プ蛋白質コーディング配列の発現およびそれにより発現
される蛋白質の使用を開示している。
クロールら（Ｃｒｏｗｌ、 ｅｔ ａｌ、）は、セル（
Ｃｅｌｌ）±↓： ９７９ （１９８５） 、ＨＴＬＶ
−［１１エンベロープ蛋白質遺伝子、ｅｎｖ、の一部の
イー・コリにおける発現およびＨＴＬＶ−ＩＩＩによる
感染の検出用としてのかかる蛋白質の使用を報告してい
る。カセイら（Ｃａｓｅｙ、 ｅｔ ａｌ、）は、ジで
−ナル・オブ・バイ０ロジー（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）５５
：４１７（１９８５）、ｌのｇａｇ遺伝子産生物、ｐ２
４と呼ばれるＨＴＬＶ−ＩＩＩの内部構造蛋白質の精製
、およびＨＴＬＶ−［［による感染を検出するための該
蛋白質の使用を報告している。
Ｃｅｌｌ）±↓： ９７９ （１９８５） 、ＨＴＬＶ
−［１１エンベロープ蛋白質遺伝子、ｅｎｖ、の一部の
イー・コリにおける発現およびＨＴＬＶ−ＩＩＩによる
感染の検出用としてのかかる蛋白質の使用を報告してい
る。カセイら（Ｃａｓｅｙ、 ｅｔ ａｌ、）は、ジで
−ナル・オブ・バイ０ロジー（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）５５
：４１７（１９８５）、ｌのｇａｇ遺伝子産生物、ｐ２
４と呼ばれるＨＴＬＶ−ＩＩＩの内部構造蛋白質の精製
、およびＨＴＬＶ−［［による感染を検出するための該
蛋白質の使用を報告している。
当該分野における多くの研究者達はエイズ・レトロウィ
ルスの種々の抗原の細菌における発現について研究して
きた。最近、ＨＩＶの特定のフラグメントの配列を有す
る新規なペプチドがエイズ・ウィルスへの暴露の検出用
試薬して用いるために組み立てられた。フサンド（Ｃｏ
ｓａｎｄ） 、米国特許第４６２９７８３号：カボンら
（Ｃａｐｏｎ、 ｅｔ ａｌ、）、欧州特許出頭Ａ−１
８７０４１号。感染した個人において血清抗体を検出す
るためのエイズ・レトロウィルスポリメラーゼ遺伝子（
ｐｏｌ）のエンドヌクレアーゼ領域からの組立体ポリペ
プチドの使用がステイマーら（Ｓｔｅｉｍｅｒ、 ｅＬ
ａｌ、）、ンチーナル・オブ・パイロロジー（ＪＪｉ
ｒｏｌ、） ５８ ：９（１９８６）、によって記載さ
れている。
ルスの種々の抗原の細菌における発現について研究して
きた。最近、ＨＩＶの特定のフラグメントの配列を有す
る新規なペプチドがエイズ・ウィルスへの暴露の検出用
試薬して用いるために組み立てられた。フサンド（Ｃｏ
ｓａｎｄ） 、米国特許第４６２９７８３号：カボンら
（Ｃａｐｏｎ、 ｅｔ ａｌ、）、欧州特許出頭Ａ−１
８７０４１号。感染した個人において血清抗体を検出す
るためのエイズ・レトロウィルスポリメラーゼ遺伝子（
ｐｏｌ）のエンドヌクレアーゼ領域からの組立体ポリペ
プチドの使用がステイマーら（Ｓｔｅｉｍｅｒ、 ｅＬ
ａｌ、）、ンチーナル・オブ・パイロロジー（ＪＪｉ
ｒｏｌ、） ５８ ：９（１９８６）、によって記載さ
れている。
ＨＴＬＶ−ＩＩＩ ｃＤＮＡをコード付けするｅｎＶ
遺伝子配列を含有する組立体ベクターで形質転換した細
胞によって発現されたポリペプチドおよびかかる免疫反
応性ポリペプチドのＨＴＬＶ−［の検出用アッセイにお
ける使用がチアング（Ｃｈａｎｇ）、欧州特許出願Ａ−
１８５４４４号、に記載されている０ ドウ６ンコら（
Ｄｏｗｂｅｎｋｏ、 ｅｔ ａｔ、）は、エイズ・レト
ロウィルスｐ２４ ｇａｇ蛋白質のイー・コリにおけ
る発現およびその診断剤としての使用を開示している。
遺伝子配列を含有する組立体ベクターで形質転換した細
胞によって発現されたポリペプチドおよびかかる免疫反
応性ポリペプチドのＨＴＬＶ−［の検出用アッセイにお
ける使用がチアング（Ｃｈａｎｇ）、欧州特許出願Ａ−
１８５４４４号、に記載されている０ ドウ６ンコら（
Ｄｏｗｂｅｎｋｏ、 ｅｔ ａｔ、）は、エイズ・レト
ロウィルスｐ２４ ｇａｇ蛋白質のイー・コリにおけ
る発現およびその診断剤としての使用を開示している。
ＨＴＬＶ−［１コア抗原のイー・コリにおける合成およ
びヒト血清との免疫反応性も、グライエプら（Ｇｈｒａ
ｙｅｂ、 ｅｔ ａｌ、） 、デイ・イー・エヌ（Ｄ
Ｎ Ａ）旦：９３ （１９８６）およびステイマーら（
Ｓｔｅｉｍｅｒ、 ｅｔ ａｌ、） 、ジャーナル・オ
プ・バイ０ロジー（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）Ｉ５０・２８３
（１９８Ｇ）によって報告されている。
びヒト血清との免疫反応性も、グライエプら（Ｇｈｒａ
ｙｅｂ、 ｅｔ ａｌ、） 、デイ・イー・エヌ（Ｄ
Ｎ Ａ）旦：９３ （１９８６）およびステイマーら（
Ｓｔｅｉｍｅｒ、 ｅｔ ａｌ、） 、ジャーナル・オ
プ・バイ０ロジー（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）Ｉ５０・２８３
（１９８Ｇ）によって報告されている。
エイズ・ウィルスに対するワクチンを開発するために研
究は続行されている。最近の報告は、免疫反応性領域を
含有する合成ペプチドが免疫原性か否かおよび該ペプチ
ドに２１する抗体がＨＩ Ｖｐ１７１白質の領域を認識
するか否かを決定するために、エイズ・ウィルス中のチ
モンンα１−免疫反応性蛋白質を確認する試みとして行
われた最初の研究を記載している。ナイローら（＼ａｙ
ｌｏｒｅｔ ａｔ、） 、プロ／−ディングズ・オブ・
ナンヨナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏ
ｃ、 ＸａｔｌＡｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳ、Ａ８４ ：
２９５１（１９８７）。
究は続行されている。最近の報告は、免疫反応性領域を
含有する合成ペプチドが免疫原性か否かおよび該ペプチ
ドに２１する抗体がＨＩ Ｖｐ１７１白質の領域を認識
するか否かを決定するために、エイズ・ウィルス中のチ
モンンα１−免疫反応性蛋白質を確認する試みとして行
われた最初の研究を記載している。ナイローら（＼ａｙ
ｌｏｒｅｔ ａｔ、） 、プロ／−ディングズ・オブ・
ナンヨナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏ
ｃ、 ＸａｔｌＡｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳ、Ａ８４ ：
２９５１（１９８７）。
ウィルスによる細胞の感染は、細胞表面レセプターのウ
ィルス認識、続いてのウィルス粒子の細胞表面上への再
分布を含む。ある種のウィルスは原形質膜を直接貫通す
るが、多くのものは被覆膜孔にてエンドサイト−シスに
付され、続いてブレＪソソーム状エンドソーム中に入る
。該エンドサイトの低ｐＨ環境がウィルス粒子の膜とプ
レリソソーム状エンドソームの膜間の融合反応を触媒し
、かくしてウィルスコアが細胞質に入るのを可能とする
。パターソンら（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、 ｅｔ ａｌ、
） 、ワクチア （Ｖａｃｃｉｎｅ） ４ ニア９ （
１９８６）。ＨＩＶ−１はレセプター媒介エンドサイｉ
・−シス経路に吸収されることが示唆されている。マト
ンら（１１ａｄｄｏｎ、 ｅｔ ａｌ、） 、セル（Ｃ
ｅｌｌ） ４７：３３３ （］９８６）。その標的細胞
のＨＴＶの最初の認識は、該標的細胞のＣＤ４抗原に結
合するウィルス表面蛋白質ｇｐ１２０による。
ィルス認識、続いてのウィルス粒子の細胞表面上への再
分布を含む。ある種のウィルスは原形質膜を直接貫通す
るが、多くのものは被覆膜孔にてエンドサイト−シスに
付され、続いてブレＪソソーム状エンドソーム中に入る
。該エンドサイトの低ｐＨ環境がウィルス粒子の膜とプ
レリソソーム状エンドソームの膜間の融合反応を触媒し
、かくしてウィルスコアが細胞質に入るのを可能とする
。パターソンら（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、 ｅｔ ａｌ、
） 、ワクチア （Ｖａｃｃｉｎｅ） ４ ニア９ （
１９８６）。ＨＩＶ−１はレセプター媒介エンドサイｉ
・−シス経路に吸収されることが示唆されている。マト
ンら（１１ａｄｄｏｎ、 ｅｔ ａｌ、） 、セル（Ｃ
ｅｌｌ） ４７：３３３ （］９８６）。その標的細胞
のＨＴＶの最初の認識は、該標的細胞のＣＤ４抗原に結
合するウィルス表面蛋白質ｇｐ１２０による。
ｇｐ１６０／ｇｐ１２０表面蛋白質で観察されたかなり
の異質性および抗原の多様性の観点より、ウィルス侵入
過程における最初の付着過程への干渉ヲベースとするワ
クチンは効果的な手法ではないようである。
の異質性および抗原の多様性の観点より、ウィルス侵入
過程における最初の付着過程への干渉ヲベースとするワ
クチンは効果的な手法ではないようである。
しかしながら、その亜膜が局在しているｇａｇ蛋白質（
ゲルデルブロムら（Ｇｅｌｄｅｒｂｌｏｍ、 ｅｔ ａ
ｔ、）、パイロＯジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ） １５６
： １７１ （１９８７））は、経膜蛋白質ｇｐ４１
およびウィルス膜またはその代わりにｇａｇ ｐ２４
およびおそらくはｇａｇ ｐ１５ウィルスＲＮＡと近
接して接触する好位置にあり、それによりウィルス侵入
に関与するフンフォメーノヨン変化および脱被覆過程で
中心的な役割を果たす。さらに、ｇａｇｐ１７はミリス
チル化されたＮ−末端を有することが判明している。ミ
リスチル化はピリオンの集合およびウィルス成分の原形
質膜への輸送に関与するとされてきた。レインら（Ｒｅ
ｉｎ、 ｅｔ ａｌ、） 、ブロンーディングズ・オプ
・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンンズ（Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔｌ、 ＡｃａｄＳｃｉ、）８３ニア２４
６ （１９８６）、リー；）（Ｒｈｅｅｅｔ ａｌ、
） 、”ヤーナル・オブ・パイコロン−（ＪＶｉｒｏｌ
、）βｌ ： １０４５ （１９８７）、 ミリスチ
ル化蛋白質は、−ｔｌｌに、原形質膜中に局存する。
ゲルデルブロムら（Ｇｅｌｄｅｒｂｌｏｍ、 ｅｔ ａ
ｔ、）、パイロＯジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ） １５６
： １７１ （１９８７））は、経膜蛋白質ｇｐ４１
およびウィルス膜またはその代わりにｇａｇ ｐ２４
およびおそらくはｇａｇ ｐ１５ウィルスＲＮＡと近
接して接触する好位置にあり、それによりウィルス侵入
に関与するフンフォメーノヨン変化および脱被覆過程で
中心的な役割を果たす。さらに、ｇａｇｐ１７はミリス
チル化されたＮ−末端を有することが判明している。ミ
リスチル化はピリオンの集合およびウィルス成分の原形
質膜への輸送に関与するとされてきた。レインら（Ｒｅ
ｉｎ、 ｅｔ ａｌ、） 、ブロンーディングズ・オプ
・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンンズ（Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔｌ、 ＡｃａｄＳｃｉ、）８３ニア２４
６ （１９８６）、リー；）（Ｒｈｅｅｅｔ ａｌ、
） 、”ヤーナル・オブ・パイコロン−（ＪＶｉｒｏｌ
、）βｌ ： １０４５ （１９８７）、 ミリスチ
ル化蛋白質は、−ｔｌｌに、原形質膜中に局存する。
ウィルコックスら（Ｗｉｌｃｏｘ、 ｅｔ ａｌ、）
、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｒａｉｓｔｒｙン
２６ ： ｌ Ｏ２９（１９８７）。
、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｒａｉｓｔｒｙン
２６ ： ｌ Ｏ２９（１９８７）。
ｇａｇ ｐ１７蛋白質は、そのＨＩＶ中相またはＩ＊
ｘｉ可能性を確立するための免疫学的研究の好個の対象
である。中和抗体を誘導するｐ１７の可能性についての
直接の証明は、チモシンα１に対する抗血清が効果的に
Ｈｒｖｑ染を中和するという観察に由来する。チモシン
α、はｐ１７に対し４４ないし５０％相同の１８のアミ
ノ酸の領域を含有する。サリンら（Ｓａｒｉｎ、 ｅｔ
ａｌ。）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） 、２３２
：１１３５ （１９８６）。
ｘｉ可能性を確立するための免疫学的研究の好個の対象
である。中和抗体を誘導するｐ１７の可能性についての
直接の証明は、チモシンα１に対する抗血清が効果的に
Ｈｒｖｑ染を中和するという観察に由来する。チモシン
α、はｐ１７に対し４４ないし５０％相同の１８のアミ
ノ酸の領域を含有する。サリンら（Ｓａｒｉｎ、 ｅｔ
ａｌ。）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） 、２３２
：１１３５ （１９８６）。
チモンンα、に相同の領域を網羅した合成ｐ１７ペブチ
ド同族体はいくつかのＨＩＶの異なる株をｉｎ ｖ：
ｔｒｏで中和する抗体を誘導する。ナイローら（Ｎａｙ
ｌｏｒ、 ｅｔ ａｌ、） 、プロシーディングズ・オ
ブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａ口、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、） Ｕ
ＳＡ８土：２９５１ （１９８７）。
ド同族体はいくつかのＨＩＶの異なる株をｉｎ ｖ：
ｔｒｏで中和する抗体を誘導する。ナイローら（Ｎａｙ
ｌｏｒ、 ｅｔ ａｌ、） 、プロシーディングズ・オ
ブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａ口、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、） Ｕ
ＳＡ８土：２９５１ （１９８７）。
最近、エイズ・ワクチンとして（重用する最も効果的な
タイプの免疫原に関する種々の仮説が提案されている。
タイプの免疫原に関する種々の仮説が提案されている。
サルク（Ｓａｌｋ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３２
ユニ４７３ （１９８７）。
ユニ４７３ （１９８７）。
発明の要約
本発明の１の具体例において、イー・コリ（Ｅ、 ｃｏ
ｌ ｉ）中で機能する調節要素のフレーム中に融合され
たＨＩＶ ｐ１７？Ｊ白質またはｐ１７の誘導体につ
いてのＤＮＡコーディング配列を何するイー・コリ発現
ベクターが提供される。
ｌ ｉ）中で機能する調節要素のフレーム中に融合され
たＨＩＶ ｐ１７？Ｊ白質またはｐ１７の誘導体につ
いてのＤＮＡコーディング配列を何するイー・コリ発現
ベクターが提供される。
もう１つの具体例において、好ましくは、酵母株エス・
セレビシエ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で用いる酵
母発現ベクターが提供される。該ベクターは酵母中で機
能する調節要素のフレーム中に融合したＨＩＶ ｐ１
７蛋白質またはｐ１７の誘導体についてのＤＮＡコーデ
ィング配列を有する。
セレビシエ（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で用いる酵
母発現ベクターが提供される。該ベクターは酵母中で機
能する調節要素のフレーム中に融合したＨＩＶ ｐ１
７蛋白質またはｐ１７の誘導体についてのＤＮＡコーデ
ィング配列を有する。
もう１つの具体例において、ＨＩＶ蛋白質が回収可能な
量で発現されるような許容条件下で、ＨＩＶ ｐ１７
発現ベクターで形質転換されたイー・つりを培養し、該
蛋白質を該培養系から単離することよりなるイー・コリ
においてＨＩＶ ｐ１７蛋白質を産生ずる方法が提供
される。
量で発現されるような許容条件下で、ＨＩＶ ｐ１７
発現ベクターで形質転換されたイー・つりを培養し、該
蛋白質を該培養系から単離することよりなるイー・コリ
においてＨＩＶ ｐ１７蛋白質を産生ずる方法が提供
される。
本発明のもう１つの具体例において、許容条件下で、Ｈ
ＩＶ ｐ１７発現ベクターで形質転換した酵母を培養す
ることよりなる酵母においてＨＩＶ ｐ１７蛋白質を
産生ずる方法が提供される。
ＩＶ ｐ１７発現ベクターで形質転換した酵母を培養す
ることよりなる酵母においてＨＩＶ ｐ１７蛋白質を
産生ずる方法が提供される。
該蛋白質は回収可能な量で発現され、培養系から単離で
きる。
きる。
本発明のもう１つの具体例において、１またはそれ以上
の組換体ＨＩＶ−抗原およびその適当な担体よりなるＨ
Ｉ Ｖ感染に対し個人において保護を刺激するワクチ
ンが提供される。
の組換体ＨＩＶ−抗原およびその適当な担体よりなるＨ
Ｉ Ｖ感染に対し個人において保護を刺激するワクチ
ンが提供される。
発明の詳細な記載
本発明の発現ベクターを調製するには、ｐ１７について
コード付けするＤＮＡ配列またはその免疫学的に同等な
誘導体をイー・コリまたは酵母中で機能する調節要素の
フレーム中に融合する。該ｐ１７コーディング配列は、
ウィルスｍ ＲＮ ｔ’、を単離し、逆転写によりｃＤ
ＮＡを調製することによって、ＨＩＶまたはＨＩＶ−感
染細胞から公知技術により調製される。
コード付けするＤＮＡ配列またはその免疫学的に同等な
誘導体をイー・コリまたは酵母中で機能する調節要素の
フレーム中に融合する。該ｐ１７コーディング配列は、
ウィルスｍ ＲＮ ｔ’、を単離し、逆転写によりｃＤ
ＮＡを調製することによって、ＨＩＶまたはＨＩＶ−感
染細胞から公知技術により調製される。
該ｐ１７コーディング配列を担持するｃＤＮＡクローン
はオリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼ−７ヨンプロー
ブを使用することによって同定できる。該プローブは報
告されているｐ１７の公知配列（ラトナーら（Ｒａｔｎ
ｅｒ、 ｅｔ ａｌ、） 、前掲、参照）に基づいて設
計できる。該ｐｌ？コーディング配列を担持するクロー
ンを同定した後、該コーディング配列を制限エンドヌク
レアーゼの使用によって切り出し、クローニングベクタ
ーおよび／または発現ベクターに挿入できる。別法とし
て、ＨＩＶｐ１７発現ツノセットをＴｙトランスポゾン
を使用するなどして組み込むことができる（べ一ケら（
Ｂｏｅｋｅ、 ｅｔ ａｌ、） 、セル（Ｃｅｌｌ）生
立：４９１ （１９８５））。「発現カセット」とは
、該ｐ１７コーディング配列および発現に必要な調節領
域を意味する。また、ンオーら（Ｓｈａｗ、ｅｔ ａｌ
）、サイｘンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２２６ ： ｌ
１６５ （１９８４））によって報告されているごとく
、該ｐ１７コーディング配列はＨＩＶライブラリー、例
えばλＢＨＩＯから得ることもできる。該コーディング
配列は化学的ＤＮＡ合成技術によって合成することもで
きる。
はオリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼ−７ヨンプロー
ブを使用することによって同定できる。該プローブは報
告されているｐ１７の公知配列（ラトナーら（Ｒａｔｎ
ｅｒ、 ｅｔ ａｌ、） 、前掲、参照）に基づいて設
計できる。該ｐｌ？コーディング配列を担持するクロー
ンを同定した後、該コーディング配列を制限エンドヌク
レアーゼの使用によって切り出し、クローニングベクタ
ーおよび／または発現ベクターに挿入できる。別法とし
て、ＨＩＶｐ１７発現ツノセットをＴｙトランスポゾン
を使用するなどして組み込むことができる（べ一ケら（
Ｂｏｅｋｅ、 ｅｔ ａｌ、） 、セル（Ｃｅｌｌ）生
立：４９１ （１９８５））。「発現カセット」とは
、該ｐ１７コーディング配列および発現に必要な調節領
域を意味する。また、ンオーら（Ｓｈａｗ、ｅｔ ａｌ
）、サイｘンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２２６ ： ｌ
１６５ （１９８４））によって報告されているごとく
、該ｐ１７コーディング配列はＨＩＶライブラリー、例
えばλＢＨＩＯから得ることもできる。該コーディング
配列は化学的ＤＮＡ合成技術によって合成することもで
きる。
ＨＩＶ ｐ１７亜膜蛋白質についてのコーディング配
列は、本発明にて記載するごとくに、イー・コリもしく
は酵母発現ベクターに挿入することができる。
列は、本発明にて記載するごとくに、イー・コリもしく
は酵母発現ベクターに挿入することができる。
本発明の好ましい具体例において、ｐ１７コーディング
配列は、［標品Ｊｐ１７が発現されるようにイー・コリ
もしくは酵母発現ベクターに挿入する。「標品」とは、
発現される該ｐ１７蛋白質がＮ−末端メチオニンを有し
かつ欠失もしくは変化を有しないｐ１７についての完全
なアミノ酸配列を有することを意味する。加えて、ｐ１
７はより大きいＨＩＶ蛋白質の１のフラグメントとじて
ではなく、完全な蛋白質、例えばｐ５５ ｇａｇとし
て発現される。また、本発明のｐ１７蛋白質のＣ−末端
領域がイー・コリもしくは酵母中の発現ベクターへ正し
く挿入されると、停止コドンの位置によりｐ１７が直接
発現される結果となる。
配列は、［標品Ｊｐ１７が発現されるようにイー・コリ
もしくは酵母発現ベクターに挿入する。「標品」とは、
発現される該ｐ１７蛋白質がＮ−末端メチオニンを有し
かつ欠失もしくは変化を有しないｐ１７についての完全
なアミノ酸配列を有することを意味する。加えて、ｐ１
７はより大きいＨＩＶ蛋白質の１のフラグメントとじて
ではなく、完全な蛋白質、例えばｐ５５ ｇａｇとし
て発現される。また、本発明のｐ１７蛋白質のＣ−末端
領域がイー・コリもしくは酵母中の発現ベクターへ正し
く挿入されると、停止コドンの位置によりｐ１７が直接
発現される結果となる。
該停止コドンは完全なｇａｇ蛋白質が正常にプロセノン
ングに付される地点に挿入される。
ングに付される地点に挿入される。
「調節領域」とは、転写および引続いての翻訳に必要な
発現制御配列、例えばプロモーターおよびリポソーム結
合部位を意味する。調節可能な調節領域、すなわち構造
的ではなく誘導または活動化を要する調節シグナルが好
ましい。かかるベクターは、典型的には、調節要素に加
えてベクターか宿主細胞集団で安定にｆＩ持されるのを
可能とする領域、すなわちレプリコンまたは？！２製開
始点、および１またはそれ以上の選択マーカー、すなわ
ち該ベクターを担持する宿主に対し選択可能な表現型を
与える遺伝子よりなる。
発現制御配列、例えばプロモーターおよびリポソーム結
合部位を意味する。調節可能な調節領域、すなわち構造
的ではなく誘導または活動化を要する調節シグナルが好
ましい。かかるベクターは、典型的には、調節要素に加
えてベクターか宿主細胞集団で安定にｆＩ持されるのを
可能とする領域、すなわちレプリコンまたは？！２製開
始点、および１またはそれ以上の選択マーカー、すなわ
ち該ベクターを担持する宿主に対し選択可能な表現型を
与える遺伝子よりなる。
ＨＩＶ−蛋白質についてのコーディング配列の誘導体は
、（票準的なりＮＡ組換えまたは合成技術を用いること
によって調装できる。ｐ１７野生型コーディング配列の
使用に加えて、例としては、ｌまたはそれ以上の塩基対
の付加、置換または欠失、あるいは発現されて得られた
蛋白質が「天然の」蛋白質から変化したものであってな
おその免疫原特性を保持する、すなわちＨＩＶによる感
染を抑制する免疫応答を引き出すことができるような放
射線照射もしくは化学的突然変異が包含される。。
、（票準的なりＮＡ組換えまたは合成技術を用いること
によって調装できる。ｐ１７野生型コーディング配列の
使用に加えて、例としては、ｌまたはそれ以上の塩基対
の付加、置換または欠失、あるいは発現されて得られた
蛋白質が「天然の」蛋白質から変化したものであってな
おその免疫原特性を保持する、すなわちＨＩＶによる感
染を抑制する免疫応答を引き出すことができるような放
射線照射もしくは化学的突然変異が包含される。。
イー・コリにおいて本発明の具体例で用いることかでき
る発現ベクターの例は、例えば、ｐＡＳｌ、ローゼンベ
ルグら（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、 ｅｔ ａｌ、）、メト
・エンザイモル（Ｍｅｔｈ、 Ｅｎｚｙｍｏｌ、）上立
土：１２３ （１９８３）＋ｐＣＱＶ２、ホレンら（Ｂ
ｏｌｌｅｎ、 ｅｔ ａｌ、） 、エフ・イー・ビイ・
ニス・レターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ） １
６６：６７ （］９８４）、またはｔｒｐプロモーター
、マクグラスら（ＭｃＧｒａｔｈ、 ｅｔ ａｔ、）
、ネイチ＋ −（Ｎａｔｕｒｅ）２９５ ： ４２３
（１９８２）を包含する。酵母においては、本発明の具
体例で用いることができる発現ベクターの例は、例えば
ＰＨ０５プロモーターを基礎とするベクター（ミャノハ
ラら（Ｓｌｉｙａｎｏ−ｈａｒａ、 ｅｔ ａｌ、）
、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−
・オブ・サイエン／ズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃ
ａｄ、 Ｓｃｉ、） ＵＳＡ ８０ 川（１９８３）；
クラマーら（Ｋｒａｍｅｒ、 ｅｔ ａｔ、） 、ブロ
ンーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ
・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａ１１． Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、）ＵＳＡ 及↓：３６７ （１９８４））、
ＴＲＰＩプロモーター（ドブソンら（Ｄｏｂｓｏｎ、
ｅｔ ａｌ、）、ヌクレイツク・アシノズ・リサーチ（
Ｎｕｃｌｅｉｃ＾ａｉｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）１上：
２２８７ （１９８３） ）およびＰＧＫプロモータ
ー（メロ−ら（Ｓｌｅｌｌｏｒ。
る発現ベクターの例は、例えば、ｐＡＳｌ、ローゼンベ
ルグら（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、 ｅｔ ａｌ、）、メト
・エンザイモル（Ｍｅｔｈ、 Ｅｎｚｙｍｏｌ、）上立
土：１２３ （１９８３）＋ｐＣＱＶ２、ホレンら（Ｂ
ｏｌｌｅｎ、 ｅｔ ａｌ、） 、エフ・イー・ビイ・
ニス・レターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ） １
６６：６７ （］９８４）、またはｔｒｐプロモーター
、マクグラスら（ＭｃＧｒａｔｈ、 ｅｔ ａｔ、）
、ネイチ＋ −（Ｎａｔｕｒｅ）２９５ ： ４２３
（１９８２）を包含する。酵母においては、本発明の具
体例で用いることができる発現ベクターの例は、例えば
ＰＨ０５プロモーターを基礎とするベクター（ミャノハ
ラら（Ｓｌｉｙａｎｏ−ｈａｒａ、 ｅｔ ａｌ、）
、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−
・オブ・サイエン／ズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃ
ａｄ、 Ｓｃｉ、） ＵＳＡ ８０ 川（１９８３）；
クラマーら（Ｋｒａｍｅｒ、 ｅｔ ａｔ、） 、ブロ
ンーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ
・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａ１１． Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、）ＵＳＡ 及↓：３６７ （１９８４））、
ＴＲＰＩプロモーター（ドブソンら（Ｄｏｂｓｏｎ、
ｅｔ ａｌ、）、ヌクレイツク・アシノズ・リサーチ（
Ｎｕｃｌｅｉｃ＾ａｉｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）１上：
２２８７ （１９８３） ）およびＰＧＫプロモータ
ー（メロ−ら（Ｓｌｅｌｌｏｒ。
ｅｔ ａｌ、） 、／−ン（Ｇｅｎｅ） ２４ ： １
（１９８３）ヒノツエマノら（ｌｌｉｔｚｅｍａｎ
、 ｅｔ ａｔ、） 、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）
２±９ ： ６２０ （１９８３））を包含する。実
施例にて詳しく記載するごとく、本発明の好ましい具体
例においては、酵母発現ベクター、ＡＲＧ３およびＴＤ
Ｈ３を用いる。
（１９８３）ヒノツエマノら（ｌｌｉｔｚｅｍａｎ
、 ｅｔ ａｔ、） 、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）
２±９ ： ６２０ （１９８３））を包含する。実
施例にて詳しく記載するごとく、本発明の好ましい具体
例においては、酵母発現ベクター、ＡＲＧ３およびＴＤ
Ｈ３を用いる。
また、ＨＩＶｐ１７Ｚ白質フラグメントおよび誘導体も
、例えば他のＨＩＶ頌縁玉縁蛋白質なわちｐ２４、ｐ１
５またはｅｎＶもしくはｐｏｌ領域の蛋白質、肝炎８表
面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ガラクト７牛ナーゼ（ｇａｌＫ
）遺伝子の産生物あるいはイノフルエンザＮＳＩ蛋白質
の量でまたは部分（ヤングら（Ｙｏｕｎｇ、 ｅｔ ａ
ｌ、） 、プロ／−ディングズ・オブ・ナンヨナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ
、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、）ＩｊＳＡ ８０：６１０
５ （１９８３））との融合蛋白質として発現される。
、例えば他のＨＩＶ頌縁玉縁蛋白質なわちｐ２４、ｐ１
５またはｅｎＶもしくはｐｏｌ領域の蛋白質、肝炎８表
面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ガラクト７牛ナーゼ（ｇａｌＫ
）遺伝子の産生物あるいはイノフルエンザＮＳＩ蛋白質
の量でまたは部分（ヤングら（Ｙｏｕｎｇ、 ｅｔ ａ
ｌ、） 、プロ／−ディングズ・オブ・ナンヨナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ
、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、）ＩｊＳＡ ８０：６１０
５ （１９８３））との融合蛋白質として発現される。
本発明により産生される組換体ＨＩＶ ｐ１７は、本
発明の発現ベクターで形質転換された微生物または細胞
を培養することによって単離し収穫できる。培養条件、
例えば、分析物、代謝産物、他の培地成分および温度は
、ｐ１７蛋白質の発現を促進するように選択される。典
型的には、形質転換したイー・コリ培養物は、エアレー
ソヨンしつつ選択圧力下、炭素および窒素の同化源を含
有する栄養ブロス中で対数期増殖（Ａ、１２゜が約０４
〜０．６）まで培養する。誘導に先立ち、および誘導後
さらに１〜１／２ないし５時間、回収可能な量の蛋白質
が発現されるまで培養を継続して増殖させる。
発明の発現ベクターで形質転換された微生物または細胞
を培養することによって単離し収穫できる。培養条件、
例えば、分析物、代謝産物、他の培地成分および温度は
、ｐ１７蛋白質の発現を促進するように選択される。典
型的には、形質転換したイー・コリ培養物は、エアレー
ソヨンしつつ選択圧力下、炭素および窒素の同化源を含
有する栄養ブロス中で対数期増殖（Ａ、１２゜が約０４
〜０．６）まで培養する。誘導に先立ち、および誘導後
さらに１〜１／２ないし５時間、回収可能な量の蛋白質
が発現されるまで培養を継続して増殖させる。
形質転換した酵母培養物は、典型的には、アミノ酸の不
存在においてグルコースを含有する酵母窒素をベース中
で培養し、約０．４−〇、６のＡ １１２０まで増殖さ
せる。酵母細胞によって発現されたｐ１７は標準的な細
胞抽出技術を用いて培養系から抽出できる。すなわち、
ｐ１７は発現の後細胞内に残るのである。
存在においてグルコースを含有する酵母窒素をベース中
で培養し、約０．４−〇、６のＡ １１２０まで増殖さ
せる。酵母細胞によって発現されたｐ１７は標準的な細
胞抽出技術を用いて培養系から抽出できる。すなわち、
ｐ１７は発現の後細胞内に残るのである。
培養系から単離したＨＩＶ ｐ１７蛋白質は（票準的
な蛋白質精製技術を用いてさらに精製し、純度について
チエツクし、後の処方用に貯蔵できる。
な蛋白質精製技術を用いてさらに精製し、純度について
チエツクし、後の処方用に貯蔵できる。
本発明の方法を用いて産生された組換体蛋白質はヒトに
おけるワクチンとして使用するのに適する。適当な担体
またはアジュバントと共に、単独またはｐ２４およびｐ
１５と組み合わせたＨ Ｉ Ｖ抗原、例えば成熟ｇａｇ
構造蛋白質ｐ１７よりなる医薬組成物はＨＩＶが関係す
る病気の開始を防止するのに用いることができる。
おけるワクチンとして使用するのに適する。適当な担体
またはアジュバントと共に、単独またはｐ２４およびｐ
１５と組み合わせたＨ Ｉ Ｖ抗原、例えば成熟ｇａｇ
構造蛋白質ｐ１７よりなる医薬組成物はＨＩＶが関係す
る病気の開始を防止するのに用いることができる。
有効なＨＩＶワクチンはウィルス媒介のならびに細胞−
細胞間の感染の伝達を防止すべきであり、かくして体液
および細胞介在免疫をともに引き出さなくてはならない
。
細胞間の感染の伝達を防止すべきであり、かくして体液
および細胞介在免疫をともに引き出さなくてはならない
。
ｐ１７は、それ自体で、あるいは脂質と一緒に、または
池のＨＩＶ蛋白質と組み合わせて、ＨＩＶによる個人の
初期感染を抑制するワクチン、ウィルスに暴露された個
人において細胞の感染を抑制するワクチン、およびウィ
ルスの細胞から細胞への広がりを抑制するワクチンで用
いることができる。ヒトに使用するワクチンの製造用と
しての組換体ｐ１７蛋白質またはその誘導体の使用は、
調製物か弱毒化ウィルスまたは特に断りのない限り生き
たウィルス調製から得られるものではないという付加利
点を有する。
池のＨＩＶ蛋白質と組み合わせて、ＨＩＶによる個人の
初期感染を抑制するワクチン、ウィルスに暴露された個
人において細胞の感染を抑制するワクチン、およびウィ
ルスの細胞から細胞への広がりを抑制するワクチンで用
いることができる。ヒトに使用するワクチンの製造用と
しての組換体ｐ１７蛋白質またはその誘導体の使用は、
調製物か弱毒化ウィルスまたは特に断りのない限り生き
たウィルス調製から得られるものではないという付加利
点を有する。
本発明のワクチンにおいて、好ましくは生理学的ｐｔ−
＋に緩衝化した本発明のｐ１７蛋白質の水性溶液を直接
用いることができる。別法として、先に凍結乾燥しであ
るいはそれなくして、該ｐ１７蛋白質をいずれの種々の
公知アジュバントとも混合でき、または吸着できる。か
かるアジュバントは、とりわけ、水酸化アルミニウム、
ムラミルジペプチドおよびＱｕｉｌＡのごときサポニン
を包含する。また、該ｐ１７蛋白質は公知の医薬上許容
される担体、例えば塩化ナトリウム、酢酸塩、グルツー
ス、マンニトールおよびアルフミンと一緒に処方できる
。別法として、ｐ１７Ｗ白質はリポソームのごときミク
ロ粒子中にカプセル化し、または殺したホルデテラ属細
菌もしくはテタナストキソイドのごとき公知の免疫刺激
マクロ分子につなぐことができる。
＋に緩衝化した本発明のｐ１７蛋白質の水性溶液を直接
用いることができる。別法として、先に凍結乾燥しであ
るいはそれなくして、該ｐ１７蛋白質をいずれの種々の
公知アジュバントとも混合でき、または吸着できる。か
かるアジュバントは、とりわけ、水酸化アルミニウム、
ムラミルジペプチドおよびＱｕｉｌＡのごときサポニン
を包含する。また、該ｐ１７蛋白質は公知の医薬上許容
される担体、例えば塩化ナトリウム、酢酸塩、グルツー
ス、マンニトールおよびアルフミンと一緒に処方できる
。別法として、ｐ１７Ｗ白質はリポソームのごときミク
ロ粒子中にカプセル化し、または殺したホルデテラ属細
菌もしくはテタナストキソイドのごとき公知の免疫刺激
マクロ分子につなぐことができる。
別法として、ｐ１７およびｌまたはそれ以上の他のワク
チン剤よりなる多価ワクチンを調製することができる。
チン剤よりなる多価ワクチンを調製することができる。
かかる他の剤は、例えば、他のＨＩＶ−抗原あるいは種
々の病理微生物、ウィルスまたは細胞からの抗原であり
得る。
々の病理微生物、ウィルスまたは細胞からの抗原であり
得る。
加えて、融合蛋白質よりなるワクチン、例えば肝炎Ｂウ
ィルスのＳ蛋白質に融合したｐ１７は、本発明のイー・
コリまたは酵母発現系を用いて調製できる。実施例６に
記載するごとく、ｐ１７融合蛋白質コーディング配列を
用い、ｐ１７−３蛋白質を発現する哺乳動物細胞１）１
７−３蛋白質発現プラスミドまたはワクチニア組換体ウ
ィルスを用いて該融合蛋白質を発現することもできる。
ィルスのＳ蛋白質に融合したｐ１７は、本発明のイー・
コリまたは酵母発現系を用いて調製できる。実施例６に
記載するごとく、ｐ１７融合蛋白質コーディング配列を
用い、ｐ１７−３蛋白質を発現する哺乳動物細胞１）１
７−３蛋白質発現プラスミドまたはワクチニア組換体ウ
ィルスを用いて該融合蛋白質を発現することもできる。
他の融合、例えば、プラスモジイウムＣ８Ｐ反復と融合
したｐ１７も行うことができる。酵母、哺乳動物細胞も
しくはワクチニア発現系におけるｇｐ４１またはｇｐ１
６０との融合蛋白質の同時発現を行うこともできる。
したｐ１７も行うことができる。酵母、哺乳動物細胞も
しくはワクチニア発現系におけるｇｐ４１またはｇｐ１
６０との融合蛋白質の同時発現を行うこともできる。
ワクチン調製についての方法の一般的記載は、例エハ二
二一・トレンズ・アンド・ディベロソプメンツ・イン・
ワクチンズ（Ｎｅｗ Ｔｒｅｎｄｓ ａｎｄＤｅｖｅｌ
ｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ） 、ボラ−
ら（Ｊｏｌｌｅｒｅｔ ａｔ、） ＩＥ、ユニハーンイ
ティ・パーク・プレス（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｒ
ｋ Ｐｒｅｓｓ） 、バルチモア、メリーランド州、米
国（１９７８）；ダルスガードら（Ｄａｌｓｇａａｒｄ
、 ｅｔ ａｌ、） 、アクタ・ベト・スカンド（Ａｃ
ｔａ、 Ｙｅｔ、 ５ｃａｎｄ、） １８ ： ３４
９ （１９７７）；リクハイト（Ｌｉｋｈｉｔｅ ）
、米国特許第４３７２９４５号およびアルモルら（Ａｒ
ｍｏｒ、 ｅｔ ａｌ、）、米国特許第４４７４７５７
号中に見い出すことができる。
二一・トレンズ・アンド・ディベロソプメンツ・イン・
ワクチンズ（Ｎｅｗ Ｔｒｅｎｄｓ ａｎｄＤｅｖｅｌ
ｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ） 、ボラ−
ら（Ｊｏｌｌｅｒｅｔ ａｔ、） ＩＥ、ユニハーンイ
ティ・パーク・プレス（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｒ
ｋ Ｐｒｅｓｓ） 、バルチモア、メリーランド州、米
国（１９７８）；ダルスガードら（Ｄａｌｓｇａａｒｄ
、 ｅｔ ａｌ、） 、アクタ・ベト・スカンド（Ａｃ
ｔａ、 Ｙｅｔ、 ５ｃａｎｄ、） １８ ： ３４
９ （１９７７）；リクハイト（Ｌｉｋｈｉｔｅ ）
、米国特許第４３７２９４５号およびアルモルら（Ａｒ
ｍｏｒ、 ｅｔ ａｌ、）、米国特許第４４７４７５７
号中に見い出すことができる。
有効量のワクチンをつくめために各ワクチン中に存在さ
せるべきｐ１７蛋白質の量、すなわち免疫保護応答を刺
激する量は、ワクチンにアジュバントを使用するか否か
に依存する。一般に、各用量は０．１〜１０００μｇ１
好ましくは１−１００μｇｏ）ｐ１７蛋白質よりなると
考えられる。最適量は、抗体力価および他の免疫応答を
モニターする標準的な臨床実験によって決定できる。初
期ワクチン接種に続き、患者には例えば４週間後に好ま
しくはブースターワクチン接種を行い、続いて例えば各
６〜１２力月にブースター注射を繰り】ヌす。
せるべきｐ１７蛋白質の量、すなわち免疫保護応答を刺
激する量は、ワクチンにアジュバントを使用するか否か
に依存する。一般に、各用量は０．１〜１０００μｇ１
好ましくは１−１００μｇｏ）ｐ１７蛋白質よりなると
考えられる。最適量は、抗体力価および他の免疫応答を
モニターする標準的な臨床実験によって決定できる。初
期ワクチン接種に続き、患者には例えば４週間後に好ま
しくはブースターワクチン接種を行い、続いて例えば各
６〜１２力月にブースター注射を繰り】ヌす。
エイズにス・ｊするワクチン生産用イー・コリもしくは
酵母で発現されたｐ１７蛋白質の使用に加え、発現され
た工白質を診断剤として用いることもてきる。
酵母で発現されたｐ１７蛋白質の使用に加え、発現され
た工白質を診断剤として用いることもてきる。
免疫診断剤として、ｐ１７蛋白質をいずれの標準的な免
疫検出アッセイ、例えば酵素免疫法（ＥＬＩＳＡ）、ｒ
サンドイッチイムノアッセイ」、ＱＱ 合ｔ’ｏ 合ア
ッセイまたはＨＩＶセロコンバージョン（ｃｅｒｏｃｏ
ｎｖｅｒｓ １ｏｎ）用のラジオイムノアッセイ（Ｒ１
〜）に用いることもできる。
疫検出アッセイ、例えば酵素免疫法（ＥＬＩＳＡ）、ｒ
サンドイッチイムノアッセイ」、ＱＱ 合ｔ’ｏ 合ア
ッセイまたはＨＩＶセロコンバージョン（ｃｅｒｏｃｏ
ｎｖｅｒｓ １ｏｎ）用のラジオイムノアッセイ（Ｒ１
〜）に用いることもできる。
ＨＩ Ｖと反応する抗血清の産生を刺激するためにｐ１
７蛋白質、その誘導体もしくはフラグメントを用いるこ
ともできる。多クローン抗体を増加させる能力は、コー
ラ−およびミルスティン（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ ５ｌ
ｉｌｓｔｅｉｎ） 、不イチ＋ （Ｎａｔｕｒｅ）λ
５６ ： ４９５ （１９７５）によって初めて記載さ
れたけ準的な技術あるいは細胞融合もしくは形質転換の
池の技術によって単クローン抗体を産生ずることを可能
とする。
７蛋白質、その誘導体もしくはフラグメントを用いるこ
ともできる。多クローン抗体を増加させる能力は、コー
ラ−およびミルスティン（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ ５ｌ
ｉｌｓｔｅｉｎ） 、不イチ＋ （Ｎａｔｕｒｅ）λ
５６ ： ４９５ （１９７５）によって初めて記載さ
れたけ準的な技術あるいは細胞融合もしくは形質転換の
池の技術によって単クローン抗体を産生ずることを可能
とする。
ｐ１７またはｐ１７のフラグメントに向く抗体も細胞培
養物中のｐ１７遺伝子産生物の存在を検出するのに有用
である。加えて、かかる抗体は、例えばアフィニティー
精製、ｃＤＮＡプローブの組立において、およびＨＩＶ
感染についての治療における中和剤として有用である。
養物中のｐ１７遺伝子産生物の存在を検出するのに有用
である。加えて、かかる抗体は、例えばアフィニティー
精製、ｃＤＮＡプローブの組立において、およびＨＩＶ
感染についての治療における中和剤として有用である。
また、ｐ１７蛋白質はＨＩＶに対する効果的な治療剤と
して用いることができる。治療剤としては、ｐ１７はウ
ィルス介在のならびに細胞−細胞間の感染の伝達を防止
しおよび減少させるのに用いることができる。ｐ１７は
単独でまたは池の剤、例えば池のＨＩＶ蛋白質またはア
ジドチミジン（ＡＺＴ）のごとき抗ウィルス剤と組み合
わせて用いる、二とができる。
して用いることができる。治療剤としては、ｐ１７はウ
ィルス介在のならびに細胞−細胞間の感染の伝達を防止
しおよび減少させるのに用いることができる。ｐ１７は
単独でまたは池の剤、例えば池のＨＩＶ蛋白質またはア
ジドチミジン（ＡＺＴ）のごとき抗ウィルス剤と組み合
わせて用いる、二とができる。
実施例
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明はそれらに限定されるものではない。
、本発明はそれらに限定されるものではない。
実施例１
イー・コリｐ１７クローニングベクターｐＲＩＴＩ２９
２０の調製 プラスミドｐＢＨ１０を出発材ｆ４として用い、ＨＩ
Ｖのｇａｇ領域を継代クローンした。この領域の遺伝子
操作により、２つの中間体プラスミド１）ＴＩＴ］２９
１５およびｐＲＩＴ１２９１７を得た。プラスミドｐＲ
ＩＴ１２９１７はｐ１７についてのコーディング領域に
対応する基本単位ＤＮＡフラグメントを含有する。遺１
云子工学分野の当業者に公知の方法（例えば、「モレキ
ュラー・クロー二／グ（＼Ｉｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ） Ｊ 、マニアティスら（Ｉｌｌａｎｉａｔ
ｉｓ、 ｅｔ ａｌ、） 、コールド・スフリング・ハ
ーバ−・ラホラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｌｌａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ） 、ニューヨーク
（１９８２）墾照）を用い、かく組み立てた該プラスミ
ドを用いてＨＩＶｐ１７蛋白質をイー・コリまたは酵母
いずれかで発現させる。
２０の調製 プラスミドｐＢＨ１０を出発材ｆ４として用い、ＨＩ
Ｖのｇａｇ領域を継代クローンした。この領域の遺伝子
操作により、２つの中間体プラスミド１）ＴＩＴ］２９
１５およびｐＲＩＴ１２９１７を得た。プラスミドｐＲ
ＩＴ１２９１７はｐ１７についてのコーディング領域に
対応する基本単位ＤＮＡフラグメントを含有する。遺１
云子工学分野の当業者に公知の方法（例えば、「モレキ
ュラー・クロー二／グ（＼Ｉｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ） Ｊ 、マニアティスら（Ｉｌｌａｎｉａｔ
ｉｓ、 ｅｔ ａｌ、） 、コールド・スフリング・ハ
ーバ−・ラホラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｌｌａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ） 、ニューヨーク
（１９８２）墾照）を用い、かく組み立てた該プラスミ
ドを用いてＨＩＶｐ１７蛋白質をイー・コリまたは酵母
いずれかで発現させる。
出発材料はＨＩＶの全ｃＤＮＡを含有するクローンＢＨ
ＩＯ−Ｒ２であった。ＢＨＩＯ−Ｒ２はλＢＨＩＱのＳ
ｓｔ Ｉインサート（ジオ−ら（Ｓｈａｗ、 ｅｔ
ａｌ、、前掲）をｐＳＰ６４のＳｓｔ １部位（ブテ
ラーら（Ｂｕｔｌｅｒ、 ｅＬ ａｌ、） 、ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ。
ＩＯ−Ｒ２であった。ＢＨＩＯ−Ｒ２はλＢＨＩＱのＳ
ｓｔ Ｉインサート（ジオ−ら（Ｓｈａｗ、 ｅｔ
ａｌ、、前掲）をｐＳＰ６４のＳｓｔ １部位（ブテ
ラーら（Ｂｕｔｌｅｒ、 ｅＬ ａｌ、） 、ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ。
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、） ２５７ ： ５７７２ （１
９８２） ）に挿入することによって組み立てたプラス
ミドｐＢＨＩＯの誘導体である。クローニング法は２つ
の工程を含むものであった。
９８２） ）に挿入することによって組み立てたプラス
ミドｐＢＨＩＯの誘導体である。クローニング法は２つ
の工程を含むものであった。
一ニング
ＢＨＩＯ−Ｒ２をＰｓｔｌ制限酵素で消化して塩基６７
９から塩基１４１Ｇに伸びるＨＩＶ配列を含有するＰｓ
ｔｌフラグメントを得た。該Ｐｓｔｌフラグメントをベ
クターｐＳ２のＰｓｔ１部位に挿入した。ｐＳ２は５ａ
ｌｒ部位にＮ ｃ ｏ １リンカ−を含有するＤＮＡイ
ンサートを担持するｐｕｃ １８誘導体である。該Ｐｓ
ｔｌフラグメントをＮ−末端ｐ１７領域が該Ｎｃｏ１部
位近くとなるような向きに挿入した。それにより中間体
プラスミドｐＲＩＴ１２９１５を得た。このベクターは
１４番目のアミノ酸コドンに重複するＣ１ａ１部位を有
する。
９から塩基１４１Ｇに伸びるＨＩＶ配列を含有するＰｓ
ｔｌフラグメントを得た。該Ｐｓｔｌフラグメントをベ
クターｐＳ２のＰｓｔ１部位に挿入した。ｐＳ２は５ａ
ｌｒ部位にＮ ｃ ｏ １リンカ−を含有するＤＮＡイ
ンサートを担持するｐｕｃ １８誘導体である。該Ｐｓ
ｔｌフラグメントをＮ−末端ｐ１７領域が該Ｎｃｏ１部
位近くとなるような向きに挿入した。それにより中間体
プラスミドｐＲＩＴ１２９１５を得た。このベクターは
１４番目のアミノ酸コドンに重複するＣ１ａ１部位を有
する。
ｐＲＩＴ１２９１５をＮｃｏｌおよびＣｏａ＋制限酵素
で消化し、最も大きいフラグメントを精製し、ｐ１７コ
ーディング配列のＮ−末端部分を有するＮｃｏｌ−Ｃｌ
ａｌ合成アダブクーで結んだ。該１）１７Ｎ−末端アダ
ブタ−は以下のコドン配列を有する。
で消化し、最も大きいフラグメントを精製し、ｐ１７コ
ーディング配列のＮ−末端部分を有するＮｃｏｌ−Ｃｌ
ａｌ合成アダブクーで結んだ。該１）１７Ｎ−末端アダ
ブタ−は以下のコドン配列を有する。
該コドン配列はイー・フリおよび酵母における最適コド
ン使用に従って変化させた。すなわち、特異的アミノ酸
についてのコドンを効果的かつ好ましいリーディング配
列が得られるように選択した。
ン使用に従って変化させた。すなわち、特異的アミノ酸
についてのコドンを効果的かつ好ましいリーディング配
列が得られるように選択した。
かく組み立てたプラスミドｐＲＩＴ１２９１７はｐｌ
７ Ｎ −末ｂ”ｌのＡＴＧイニンエーターコドンに
重複するＮｃｏ１部位を含有する。Ｘｂａ １部位は、
成熟ｐ１７のＣ−末端配列から３３塩基対下流にある停
止コドンに重複する。
７ Ｎ −末ｂ”ｌのＡＴＧイニンエーターコドンに
重複するＮｃｏ１部位を含有する。Ｘｂａ １部位は、
成熟ｐ１７のＣ−末端配列から３３塩基対下流にある停
止コドンに重複する。
ｂ）ｐ１７コーディング領域のイー・コリ発現ｐＲＩＴ
１２９１７から単離した４２９ｂｐＮｃｏ Ｉ−Ｒｓａ
ＩフラグメントをｐＯＴｓ−Ｎｃａｌイー・コリ発現
ベクターに結んだ。プラスミドｐＯＴｓ−Ｎｃｏｌは、
ローゼンヘルグら（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、 ｅｔ ａｔ
、） 、メト・エンザイモル（Ｍｅｔｈ。
１２９１７から単離した４２９ｂｐＮｃｏ Ｉ−Ｒｓａ
ＩフラグメントをｐＯＴｓ−Ｎｃａｌイー・コリ発現
ベクターに結んだ。プラスミドｐＯＴｓ−Ｎｃｏｌは、
ローゼンヘルグら（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、 ｅｔ ａｔ
、） 、メト・エンザイモル（Ｍｅｔｈ。
Ｅｎｚｙｍｏｌ、） １０１： １２３ （１９８３
） Ｉこ３己載されているプラスミドｐＡＳ ｌの誘導
体である。
） Ｉこ３己載されているプラスミドｐＡＳ ｌの誘導
体である。
ｐＯＴｓ−ＮｃｏｌはｐＡＳ １において用いるのと同
様の転写および翻訳用のプロモーターおよびリポソーム
結合部位を利用する。ｐＯＴｓ−Ｎｃｏ［で得るれる合
成オリゴヌクレオチドの挿入によって、ｐＡＳ ｌのＢ
ａｍＨＩ制限部位をＡＴＧ間始コドンに重複するＮｃｏ
１部位に変化させた。
様の転写および翻訳用のプロモーターおよびリポソーム
結合部位を利用する。ｐＯＴｓ−Ｎｃｏ［で得るれる合
成オリゴヌクレオチドの挿入によって、ｐＡＳ ｌのＢ
ａｍＨＩ制限部位をＡＴＧ間始コドンに重複するＮｃｏ
１部位に変化させた。
ｐＯＴｓ−Ｎｃｏ ＩはあらかじめＸｂａ ｌ制限酵素
で開き、Ｔ４ポリメラーゼ修復し、Ｎｃｏ＋制限酵素で
消化した。最も大きいフラグメントを４２９ｂｐ Ｎ
ｃｏｌ−Ｒｓａ１７ラグメントに結んだ。それによって
イー・コリｐ１７発現プラスミドが得られ、これを用い
て２つの・イー・コリ株： Ａ Ｒｌ ２０およびΔＲ
５８をアンピシリン耐性とした。モノ１らＵｏｔｔ、
ｅｔ ａｌ、） 、プｏンーディノグブ・オブ・す／
ヨナル・アカデミ−・オブ・サイエノシズ（Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、） ８２ ：８８
（１９８５）。
で開き、Ｔ４ポリメラーゼ修復し、Ｎｃｏ＋制限酵素で
消化した。最も大きいフラグメントを４２９ｂｐ Ｎ
ｃｏｌ−Ｒｓａ１７ラグメントに結んだ。それによって
イー・コリｐ１７発現プラスミドが得られ、これを用い
て２つの・イー・コリ株： Ａ Ｒｌ ２０およびΔＲ
５８をアンピシリン耐性とした。モノ１らＵｏｔｔ、
ｅｔ ａｌ、） 、プｏンーディノグブ・オブ・す／
ヨナル・アカデミ−・オブ・サイエノシズ（Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、） ８２ ：８８
（１９８５）。
実施例２
イー・コリｐ１７発現プラスミドｐＲＩＴ１３０１７の
調製 ｐ１７蛋白質のＮ−末端コーディング領域を有する３５
８ｂｐ Ｎｃｏｌ−Ｐｖｕ１７ラグメントを得るために
、実施例１に記載したプラスミドｐＲＩＴ１２９２０を
ＮｃｏｌおよびＰＶＩＪＩＩ制限酵素で消化した。ｐ１
７のＣ−末端コーディング領域を含有するＰｖｕｌｌ−
Ｘｈｏ１合成アダブクーを調ａした。
調製 ｐ１７蛋白質のＮ−末端コーディング領域を有する３５
８ｂｐ Ｎｃｏｌ−Ｐｖｕ１７ラグメントを得るために
、実施例１に記載したプラスミドｐＲＩＴ１２９２０を
ＮｃｏｌおよびＰＶＩＪＩＩ制限酵素で消化した。ｐ１
７のＣ−末端コーディング領域を含有するＰｖｕｌｌ−
Ｘｈｏ１合成アダブクーを調ａした。
実施例１に記載したごとくに、イー・コリおよび酵母で
の最適コドン使用に従ってコドン配列を変化させた。３
５８ｂｐ Ｎｃｏｌ−Ｐｖｕｎ７ラグメントおよび４
５ｂｐ ＰｖｕＩ［−Ｘｈｏ１合成アダプターを、あ
らかじめＮｃｏｌおよびＸｈｏｌ酵素で開いたｐＯＴｓ
−Ｎｃｏ Ｉプラスミドに結んだ。かくしてイー・フリ
において成熟ｐ１７蛋白質を発現するイー・コリプラス
ミドｐＲＩＴ１３０１７を得た。
の最適コドン使用に従ってコドン配列を変化させた。３
５８ｂｐ Ｎｃｏｌ−Ｐｖｕｎ７ラグメントおよび４
５ｂｐ ＰｖｕＩ［−Ｘｈｏ１合成アダプターを、あ
らかじめＮｃｏｌおよびＸｈｏｌ酵素で開いたｐＯＴｓ
−Ｎｃｏ Ｉプラスミドに結んだ。かくしてイー・フリ
において成熟ｐ１７蛋白質を発現するイー・コリプラス
ミドｐＲＩＴ１３０１７を得た。
実施例３
酵母発現ベクターｐＲＩＴ１２９１４の調製出発材料は
、酵母発現ベクターｐ ＲＩ ＴＩ Ｏ７７４、ＡＲＧ
３プロモーターおよび転写停止領域間に唯一のＢａｍ８
１部位を有する発現カセットを含有する２μ部分酵母発
現ベクターであった。
、酵母発現ベクターｐ ＲＩ ＴＩ Ｏ７７４、ＡＲＧ
３プロモーターおよび転写停止領域間に唯一のＢａｍ８
１部位を有する発現カセットを含有する２μ部分酵母発
現ベクターであった。
プラスミドｐＲＩＴ］０７７４の組立はカベシンら（Ｃ
ａｂｅｚｏｎ、 ｅｔ ａｌ、） 、プロシーデイ／ダ
ブ。
ａｂｅｚｏｎ、 ｅｔ ａｌ、） 、プロシーデイ／ダ
ブ。
オブ・ナンコナル・アカデミミー・オブ・サイエンンズ
（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、）
ＵＳ、Ａ ８１６５９４ （１９８６）中（こ８己載
されている。
（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、）
ＵＳ、Ａ ８１６５９４ （１９８６）中（こ８己載
されている。
ｐＲＩＴ１０７７４のＨｉ ｎｄＩｆｆ制限酵素テノ消
化により、発現カセットを有するＩ−ｔ ｉ ｎ ｄ
［１フラグメントが得られる。このフラグメントを、あ
らかじめＢａｍＨ１酵素で開いたｐＲＩＴ１２３７７（
ハルフォードら（Ｈａｒｆｏｒｄ、 ｅｔ ａｌ、）
、カレント・ジエ不ティノクス（Ｃｕｒｒ、 Ｇｅｎｅ
ｔ、）１土３１５〜３１９ （＋９８７） ）と混合
した。ｐＲＩＴ］２３７７はＬＥＵ２遺伝子を有する完
全な２μを基礎とする酵母ベクターであり、これにより
ロイ／ン選択が付与された。粘着末端を修復するために
フラグメントおよびプラスミドの混合物をクレノーＤＮ
Ａポリメラーゼで処理し、結んだ。
化により、発現カセットを有するＩ−ｔ ｉ ｎ ｄ
［１フラグメントが得られる。このフラグメントを、あ
らかじめＢａｍＨ１酵素で開いたｐＲＩＴ１２３７７（
ハルフォードら（Ｈａｒｆｏｒｄ、 ｅｔ ａｌ、）
、カレント・ジエ不ティノクス（Ｃｕｒｒ、 Ｇｅｎｅ
ｔ、）１土３１５〜３１９ （＋９８７） ）と混合
した。ｐＲＩＴ］２３７７はＬＥＵ２遺伝子を有する完
全な２μを基礎とする酵母ベクターであり、これにより
ロイ／ン選択が付与された。粘着末端を修復するために
フラグメントおよびプラスミドの混合物をクレノーＤＮ
Ａポリメラーゼで処理し、結んだ。
かくして酵母発現ベクターｐＲＩＴ１２９１４を得た。
ｐＲＩＴ］２９１４は完全な酵母２μＤＮＡ配列、酵母
におけるプラスミドの選択および維持に必要な酵母ＬＥ
Ｕ２遺伝子、イー・コリにおけるプラスミドの選択およ
び複製に必要なイー・コリ・レプリコン配列およびイー
・コリ・アンビンリン遺伝子、ならびに唯一のＢａｍＨ
Ｉによって分１４されたＡＲＧ３プロモーターおよびＡ
ＲＧ３ターミネータ−配列よりなる酵母発現カセットを
含有する。
におけるプラスミドの選択および維持に必要な酵母ＬＥ
Ｕ２遺伝子、イー・コリにおけるプラスミドの選択およ
び複製に必要なイー・コリ・レプリコン配列およびイー
・コリ・アンビンリン遺伝子、ならびに唯一のＢａｍＨ
Ｉによって分１４されたＡＲＧ３プロモーターおよびＡ
ＲＧ３ターミネータ−配列よりなる酵母発現カセットを
含有する。
実施例４一
実施例１のイー・コリ発現ベクターｐＲＩＴ１２９２０
て出発し、ＮｃｏｌおよびＸｂａ ［制限酵素での消化
によって４２９ｂｐ ｐ１７フラグメントを得た。こ
のフラグメントを２つの異なる酵母発現プラスミドに挿
入した。実施例３に記載するごとく、最初のもの、ｐＲ
ＩＴ１２９１４はＡＲＧ３プロモーターおよびターミネ
ータ−領域間に単一のＢａｍ８１部位を有し、それ自身
のＡＴＧイニンエーターフドコド有する遺伝子フラグメ
ントの発現に有用である。プラスミドｐＲＩＴ＋２９１
／ｌをＢａｍＨ１酵素で開き、タレ／−ＤＮＡポリメラ
ーゼで満たし、あらかじめクレノーＤ ＮＡポリメラー
ゼフラグメントで満たしたＮｃｏｆ−Ｘｂａｌ ｐ１
７フラグメントに結んだ。
て出発し、ＮｃｏｌおよびＸｂａ ［制限酵素での消化
によって４２９ｂｐ ｐ１７フラグメントを得た。こ
のフラグメントを２つの異なる酵母発現プラスミドに挿
入した。実施例３に記載するごとく、最初のもの、ｐＲ
ＩＴ１２９１４はＡＲＧ３プロモーターおよびターミネ
ータ−領域間に単一のＢａｍ８１部位を有し、それ自身
のＡＴＧイニンエーターフドコド有する遺伝子フラグメ
ントの発現に有用である。プラスミドｐＲＩＴ＋２９１
／ｌをＢａｍＨ１酵素で開き、タレ／−ＤＮＡポリメラ
ーゼで満たし、あらかじめクレノーＤ ＮＡポリメラー
ゼフラグメントで満たしたＮｃｏｆ−Ｘｂａｌ ｐ１
７フラグメントに結んだ。
第２の酵母発現プラスミド、ｐＲＩＴＩ２５４４ （ハ
ルフォードら（ｔ（ａｒｆｏｒｄ、 ｅｔ ａｌ、）
、カレント・ジェ不ティノクス（Ｃｕｒｒ、 Ｇｅｎｅ
ｔ、）上↓：３１５ （１９８７）は発現カセットを除
きｐＲ［Ｔｌ２９＋４に同じである。ｐＲＩＴ１２５４
４はＴＤＨ３プロモーターおよびＡＲＧ３ターミネータ
−領域間に単一のＢａｍ８１部位がある発現カセットを
有し、ＡＴＧイニシェークーコドンを欠く遺伝子フラグ
メントの発現に有用である。
ルフォードら（ｔ（ａｒｆｏｒｄ、 ｅｔ ａｌ、）
、カレント・ジェ不ティノクス（Ｃｕｒｒ、 Ｇｅｎｅ
ｔ、）上↓：３１５ （１９８７）は発現カセットを除
きｐＲ［Ｔｌ２９＋４に同じである。ｐＲＩＴ１２５４
４はＴＤＨ３プロモーターおよびＡＲＧ３ターミネータ
−領域間に単一のＢａｍ８１部位がある発現カセットを
有し、ＡＴＧイニシェークーコドンを欠く遺伝子フラグ
メントの発現に有用である。
ｐＲＩＴＩ２５４４をＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、マ
ングビーンヌクレアーゼで処理し、Ｎｃｏ Ｉ−Ｘｂａ
Ｉ ｐｌ ７フラグメントに結んだ。このフラグメ
ントは、ＴＡＧ停止フドコド保持させるために、Ｎｃｏ
Ｉ伸長部をマングビーンヌクレアーゼ消化によって欠失
し、Ｘｂａ Ｉ伸長部をクレノーＤＮＡポリメラーゼで
満たすように：Ａ製した。か（して、プラスミドｐＲＩ
Ｔ！２９５７を得た。ｐＲＩＴ１２９５３およびｐＲＩ
Ｔ１２９５７を用いてＬＥＤ、酵母株ＴＣＹＩ（ホイレ
ルソら（Ｈｏｙｌａｅｒｔｓ、 ｅｔ ａｔ、） 、エ
フφイー働ビイーｘス・レターズ（ＰＥＢＳ Ｌｅｔ
ｔｅｒｓ） ２０４ ：８３ （１９８’６））を形質
転換し、それより酵母ｐ１７発現株Ｙ６８４およびＹ６
８６を得た。
ングビーンヌクレアーゼで処理し、Ｎｃｏ Ｉ−Ｘｂａ
Ｉ ｐｌ ７フラグメントに結んだ。このフラグメ
ントは、ＴＡＧ停止フドコド保持させるために、Ｎｃｏ
Ｉ伸長部をマングビーンヌクレアーゼ消化によって欠失
し、Ｘｂａ Ｉ伸長部をクレノーＤＮＡポリメラーゼで
満たすように：Ａ製した。か（して、プラスミドｐＲＩ
Ｔ！２９５７を得た。ｐＲＩＴ１２９５３およびｐＲＩ
Ｔ１２９５７を用いてＬＥＤ、酵母株ＴＣＹＩ（ホイレ
ルソら（Ｈｏｙｌａｅｒｔｓ、 ｅｔ ａｔ、） 、エ
フφイー働ビイーｘス・レターズ（ＰＥＢＳ Ｌｅｔ
ｔｅｒｓ） ２０４ ：８３ （１９８’６））を形質
転換し、それより酵母ｐ１７発現株Ｙ６８４およびＹ６
８６を得た。
実施例５
酵母ｐ１７発現プラスミドｐＲＩＴ１３０１６の調製
実施例２に記載したイー・コリｐ１７発現ベクターｐＲ
ＩＴ１３０１７で出発し、Ｎ ｃ ｏ ｌおよびＸｂａ
ｌ制限酵素での消化によって３３０ｂｐのｐ１７フラ
グメントを得た。このフラグメントを、あらかじめＢａ
ｍＨＩ制限酵素で開いたプラスミドｐＲＩＴ］２９１４
（実施例４に記載）と１昆合した。該混合物をクレノ
ーＤ Ｎ Ａポリメラーゼで満たし、結んだ。成熟ｐ１
７蛋白質を発現する酵母プラスミドｐＲＩＴＩ３０１６
を得た。
ＩＴ１３０１７で出発し、Ｎ ｃ ｏ ｌおよびＸｂａ
ｌ制限酵素での消化によって３３０ｂｐのｐ１７フラ
グメントを得た。このフラグメントを、あらかじめＢａ
ｍＨＩ制限酵素で開いたプラスミドｐＲＩＴ］２９１４
（実施例４に記載）と１昆合した。該混合物をクレノ
ーＤ Ｎ Ａポリメラーゼで満たし、結んだ。成熟ｐ１
７蛋白質を発現する酵母プラスミドｐＲＩＴＩ３０１６
を得た。
ｐＲＩＴ１３０１６を用いてＬＥＵ’酵母株ＴＣＹｌを
形質転換し、それより酵母ｐ１７発現株Ｙ７３４を得た
。
形質転換し、それより酵母ｐ１７発現株Ｙ７３４を得た
。
実施例６
ｐ１７−３Ｍ合蛋白質についての発現ベクターの組立
肝炎Ｂウィルス融合蛋白質のＨ！Ｖ ｐ１７Ｓ蛋白質
についての発現ベクターの組立は２つの工程で行うこと
ができる。
についての発現ベクターの組立は２つの工程で行うこと
ができる。
出発材料は（実施例２に記載した）イー・コリ発現プラ
スミドｐＲＩＴ１３０１７およびプラスミドｐＲ［Ｔ１
０７７７であった。プラスミドｐＲＩＴ１０？７７は第
２コドン近くのＸｈｏ １部位および停止コドンの近く
でかつその下流のＢａｍＨ１部位に挟まれたＳ遺伝子を
含有するｐＢＲ３２２誘導体である。ｐＢＲ３２２のＳ
ｃｉ１部位は停止コドンから２８１ｂｐ下流に位置する
。
スミドｐＲＩＴ１３０１７およびプラスミドｐＲ［Ｔ１
０７７７であった。プラスミドｐＲＩＴ１０？７７は第
２コドン近くのＸｈｏ １部位および停止コドンの近く
でかつその下流のＢａｍＨ１部位に挟まれたＳ遺伝子を
含有するｐＢＲ３２２誘導体である。ｐＢＲ３２２のＳ
ｃｉ１部位は停止コドンから２８１ｂｐ下流に位置する
。
（ＡＴＧコドンに重複する）Ｎｃｏ１部位、（停止コド
ンに重複する） Ｂｃ Ｉ １部位および（停止コドン
を過ぎての）Ｘｈｏ １部位の脇にあるｐ１７コーディ
ング領域を有するプラスミドｐＲ１”Ｔ１３０１７をＸ
ｈｏ Ｉ制限酵素で開き、ｐＲＩＴ１０７７７から得た
Ｘｈｏ−３ａｌｌ Ｓ７５グメントに結ぶことができ
る。
ンに重複する） Ｂｃ Ｉ １部位および（停止コドン
を過ぎての）Ｘｈｏ １部位の脇にあるｐ１７コーディ
ング領域を有するプラスミドｐＲ１”Ｔ１３０１７をＸ
ｈｏ Ｉ制限酵素で開き、ｐＲＩＴ１０７７７から得た
Ｘｈｏ−３ａｌｌ Ｓ７５グメントに結ぶことができ
る。
Ｘｈｏ１部位を保持する得られたプラスミドはｐ１７コ
ーディング配列の近（かつそれより下流で正しい向きの
Ｓ遺伝子を有する。ｐ１７遺伝子末端の停止コドンを除
去し、Ｉ）１７−３融合蛋白質の発現用の正しいリーデ
ィングフレームを得るために、中間体プラスミドをＢｅ
Ｉ ｌおよびｘｈＯ■消化によって開き、マングビー
ンヌクレアーゼ処理して望まない伸長部を浦化し、再び
桔ふことができる。得られたプラスミドはＳコーディン
グ領域をフレーム中に含有する。
ーディング配列の近（かつそれより下流で正しい向きの
Ｓ遺伝子を有する。ｐ１７遺伝子末端の停止コドンを除
去し、Ｉ）１７−３融合蛋白質の発現用の正しいリーデ
ィングフレームを得るために、中間体プラスミドをＢｅ
Ｉ ｌおよびｘｈＯ■消化によって開き、マングビー
ンヌクレアーゼ処理して望まない伸長部を浦化し、再び
桔ふことができる。得られたプラスミドはＳコーディン
グ領域をフレーム中に含有する。
ｂ）ｐ１７−３融合蛋白質についての酵母発現ベクター
の組立 Ｎｃｏ Ｉ−ＢａｍＨＩ７ラグメントをｐ１７Ｓ蛋白質
についてのコーディング領域を有するプラスミドから調
製し、（実施例３に記載した）ｐＲＩＴ１２９１４のＢ
ａｍＨ１部位に挿入できる。
の組立 Ｎｃｏ Ｉ−ＢａｍＨＩ７ラグメントをｐ１７Ｓ蛋白質
についてのコーディング領域を有するプラスミドから調
製し、（実施例３に記載した）ｐＲＩＴ１２９１４のＢ
ａｍＨ１部位に挿入できる。
クレノーＤＮＡポリメラーゼで満たし次いで結んだ後、
ｐ ］ １７−３酵母発現ベクタを得る。
ｐ ］ １７−３酵母発現ベクタを得る。
実施例フ
イー・フリおよび酵母産生物の特性測定モノトら（Ｓｌ
ｏｔｈ、 ｅｔ ａｔ、） 、プロシーディングズ・オ
ブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンンズ（Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、） Ｕ
ＳＡ ８２・８８ （１９８５）によって記載されて
いるごとく、プラスミドｐＲＩＴ１２９２０Ｓ ｐＲＩ
Ｔ１３０１７またはｐＯＴｓ−Ｎｃｏ Ｉのうち１つを
有するイー・コリ株を増殖し、誘導した。２％グルコー
スを含有し、アミノ酸０６７５％なしのデイフコ（Ｄｉ
ｒｃｏ）酵母窒素ベース中で、プラスミドｐＲＩＴ１２
９５３、Ｉ）ＲＩＴ１２９５７、ｐＲＩＴ１２９１４、
ｐＲＩＴ１２５４４またはｐＲＩＴ１３０１６を有する
酵母細胞を対数期まで増殖し、遠心によって収集した。
ｏｔｈ、 ｅｔ ａｔ、） 、プロシーディングズ・オ
ブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンンズ（Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、） Ｕ
ＳＡ ８２・８８ （１９８５）によって記載されて
いるごとく、プラスミドｐＲＩＴ１２９２０Ｓ ｐＲＩ
Ｔ１３０１７またはｐＯＴｓ−Ｎｃｏ Ｉのうち１つを
有するイー・コリ株を増殖し、誘導した。２％グルコー
スを含有し、アミノ酸０６７５％なしのデイフコ（Ｄｉ
ｒｃｏ）酵母窒素ベース中で、プラスミドｐＲＩＴ１２
９５３、Ｉ）ＲＩＴ１２９５７、ｐＲＩＴ１２９１４、
ｐＲＩＴ１２５４４またはｐＲＩＴ１３０１６を有する
酵母細胞を対数期まで増殖し、遠心によって収集した。
充填した細胞（０，１ｇ）に、イソプロパツール中の４
０ｍＭｐ＞１３Ｆ（フェニルメチルスルホニルフルオラ
イド）の最初の２０μｇ、次いで５ＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動についての試料緩衝液２００μり
（０，１２５Ｍ）リス−ＨＣｌ、ｐＨ６，８，２０％グ
リセロール、４％ＳＤＳ、６Ｍウレアおよび１０％２−
メルカプト−エタノールを含有）を加えた。試料を攪拌
して混合し、さらに２〜２０μＱを試料緩衝液中に希釈
して４０μＱの最終容量とし、１００°Ｃで５分間イン
キュベートし、レムリ （Ｌａｅｍｍ Ｉ ｉ） 、不
イチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）えλ７ ： ６８０ （１９
７１）の方法によって１５％の分離ゲル、５％の積重ゲ
ルを通じる電気泳動に付した。
０ｍＭｐ＞１３Ｆ（フェニルメチルスルホニルフルオラ
イド）の最初の２０μｇ、次いで５ＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動についての試料緩衝液２００μり
（０，１２５Ｍ）リス−ＨＣｌ、ｐＨ６，８，２０％グ
リセロール、４％ＳＤＳ、６Ｍウレアおよび１０％２−
メルカプト−エタノールを含有）を加えた。試料を攪拌
して混合し、さらに２〜２０μＱを試料緩衝液中に希釈
して４０μＱの最終容量とし、１００°Ｃで５分間イン
キュベートし、レムリ （Ｌａｅｍｍ Ｉ ｉ） 、不
イチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）えλ７ ： ６８０ （１９
７１）の方法によって１５％の分離ゲル、５％の積重ゲ
ルを通じる電気泳動に付した。
特異的抗体での「インサイチュ」免疫検出によってｐ１
７類縁蛋白質を検出した（バーネット（Ｂｕｒｎｅｔｔ
ｅ） 、アナリティカル・バイオケミストリ（Ａｎａｌ
、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、）１土２ ： １９５ （１９８
１）；ゲルシオニら（Ｇｅｒｓｈｏｎｉ、 ｅｔ ａｌ
、）、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ
、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、）１工↓： １ （１９８３
）、トウピインら（Ｔｏｗｂｉｎ。
７類縁蛋白質を検出した（バーネット（Ｂｕｒｎｅｔｔ
ｅ） 、アナリティカル・バイオケミストリ（Ａｎａｌ
、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、）１土２ ： １９５ （１９８
１）；ゲルシオニら（Ｇｅｒｓｈｏｎｉ、 ｅｔ ａｌ
、）、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ
、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、）１工↓： １ （１９８３
）、トウピインら（Ｔｏｗｂｉｎ。
ｅｔ ａｌ、） 、ジャーナル・オン・イミュノロジカ
ル・メソノズ（Ｊ、 １ｍｍｕｎｏ１． Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ） ７２ ： ３１３（１９８４）参ｎ、ｇ、）。ｐ
１７類縁蛋白質はプラスミドｐＲＩＴ１２９２０または
ｐＲＩＴ１３０１７を汀するイー・コリ株の全蛋白質と
プラスミド１）ＲＩＴＩ２９５３、ｐＲＩＴ１２９５７
またはｐＲＩＴ１３０１６を有する酵母株の全蛋白質と
の間に検出され、一方、ｐ１７ｆｆｌ縁蛋白質はｐ。
ル・メソノズ（Ｊ、 １ｍｍｕｎｏ１． Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ） ７２ ： ３１３（１９８４）参ｎ、ｇ、）。ｐ
１７類縁蛋白質はプラスミドｐＲＩＴ１２９２０または
ｐＲＩＴ１３０１７を汀するイー・コリ株の全蛋白質と
プラスミド１）ＲＩＴＩ２９５３、ｐＲＩＴ１２９５７
またはｐＲＩＴ１３０１６を有する酵母株の全蛋白質と
の間に検出され、一方、ｐ１７ｆｆｌ縁蛋白質はｐ。
ＴＳ−Ｎｃｏ＋を有するイー・コリ株の全蛋白質とｐＲ
ＩＴ１２９１４またはｐｉ’！１Ｔ１２５４４を有する
酵母株の全蛋白質との間には検出されなうＸっだ。
ＩＴ１２９１４またはｐｉ’！１Ｔ１２５４４を有する
酵母株の全蛋白質との間には検出されなうＸっだ。
２％グルコースを含有し、アミノ酸０６７５％なしのデ
イフッ（Ｄｉｒｃｏ）酵母窒素ベース中で、ｐＲＩＴ１
２９］４、ｐＲＩＴ１２９５３、ｐＲＩＴ１２５４４．
１）ＲＩＴ１２９５７またはｐＲＩＴ１３０１６を有す
る酵母株ＴＣＹ ｌからの細胞を０４のＯＤ、、ｏｎｍ
まで増殖した。細胞（２０ｍＱ、培養物）を３Ｈ標識ミ
リスチン酸く二ニー・イングランド・ヌクレア（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）、ボストン、マサ
チューセノソ州） １ ｍＣｉ テロ ０分間漂識し
、次いで遠心によって収集した。細胞を冷Ｈ，Ｏで洗浄
し、３ｍＭｍチンスレイトール（ＤＴＴ） 、１％ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および１ｍＭ ＰＭＳ
Ｆを含有する５ｍＭトリス−ＨＣｌ （ｐＨ７，４）
１００μρ中に再懸濁し、攪拌混合機中での３０秒の激
しい噴出攪拌を６回行い、各攪拌の間に水上で冷却する
ことによって１００ｍｇガラスピーズで細かくした。エ
ノベンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒ４） ５４１４遠心管
中で１分間遠心することによって破片を除去した。タウ
ラーら（Ｔｏｗｌｅｒ、 ｅｔ ａｌ、） 、プロンー
ディングズ・オン・す／ヨナル・アカデミ−・オン・サ
イエン７ズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓ
ｃｉ、） ８３ ： ２８１２（１９８６）。室温にて
、新たに調製した４Ｍヒドロキンルアミン、２０ｍＭグ
リンン、ｐＨ１０の７μＱで抽出物２０μＱを３．５時
間処理した。
イフッ（Ｄｉｒｃｏ）酵母窒素ベース中で、ｐＲＩＴ１
２９］４、ｐＲＩＴ１２９５３、ｐＲＩＴ１２５４４．
１）ＲＩＴ１２９５７またはｐＲＩＴ１３０１６を有す
る酵母株ＴＣＹ ｌからの細胞を０４のＯＤ、、ｏｎｍ
まで増殖した。細胞（２０ｍＱ、培養物）を３Ｈ標識ミ
リスチン酸く二ニー・イングランド・ヌクレア（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）、ボストン、マサ
チューセノソ州） １ ｍＣｉ テロ ０分間漂識し
、次いで遠心によって収集した。細胞を冷Ｈ，Ｏで洗浄
し、３ｍＭｍチンスレイトール（ＤＴＴ） 、１％ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および１ｍＭ ＰＭＳ
Ｆを含有する５ｍＭトリス−ＨＣｌ （ｐＨ７，４）
１００μρ中に再懸濁し、攪拌混合機中での３０秒の激
しい噴出攪拌を６回行い、各攪拌の間に水上で冷却する
ことによって１００ｍｇガラスピーズで細かくした。エ
ノベンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒ４） ５４１４遠心管
中で１分間遠心することによって破片を除去した。タウ
ラーら（Ｔｏｗｌｅｒ、 ｅｔ ａｌ、） 、プロンー
ディングズ・オン・す／ヨナル・アカデミ−・オン・サ
イエン７ズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓ
ｃｉ、） ８３ ： ２８１２（１９８６）。室温にて
、新たに調製した４Ｍヒドロキンルアミン、２０ｍＭグ
リンン、ｐＨ１０の７μＱで抽出物２０μＱを３．５時
間処理した。
１１０５ｃｐを含有するヒドロキシルアミン処理したお
よび未処理の試料をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動およびＸ線蛍光撮影に付した。
よび未処理の試料をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動およびＸ線蛍光撮影に付した。
電気泳動の後、ケルを４０％メタノール１０％酢酸中で
固定し、Ｘ線蛍光撮影用のアンプリファイ（Ａｍｐｌｉ
ｆｙ） （アメルスハム・インターナショナル（Ａｉ
ｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ） 、英国
）で処理し、真空中にて濾紙上で乾燥し、コタノクーＸ
−ＯｍａｔＳフィルムを用い、−７０℃でＸ線蛍光撮影
に付した。
固定し、Ｘ線蛍光撮影用のアンプリファイ（Ａｍｐｌｉ
ｆｙ） （アメルスハム・インターナショナル（Ａｉ
ｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ） 、英国
）で処理し、真空中にて濾紙上で乾燥し、コタノクーＸ
−ＯｍａｔＳフィルムを用い、−７０℃でＸ線蛍光撮影
に付した。
結果は、ｐＲＩＴ１２９５３、ｐＲＩＴ］２９５７およ
びｐＲＩＴ１３０１６を含有する細胞が約１７ｋｄの蛋
白質を合成し、該蛋白質はヒドロキシルアミンに安定で
あることを示し、これは３Ｈ−ミリスチン酸塩漂識がア
ミド結合中に存在することを示す。ｐＲＩＴ１２９１４
またはｐＲＩＴ ｌ ２５４４を有する細胞からの抽出
物に対して特異的な標識バンドは検出されなかった。
びｐＲＩＴ１３０１６を含有する細胞が約１７ｋｄの蛋
白質を合成し、該蛋白質はヒドロキシルアミンに安定で
あることを示し、これは３Ｈ−ミリスチン酸塩漂識がア
ミド結合中に存在することを示す。ｐＲＩＴ１２９１４
またはｐＲＩＴ ｌ ２５４４を有する細胞からの抽出
物に対して特異的な標識バンドは検出されなかった。
酵母産生物はアミド結合中に存在する共有結合ミリスチ
ン酸を含有することが判明した。かくして、酵母産生物
は、ウィルスｐ１７の場合に見い出されたごとく、Ｎ−
末端グリシノに付着したミリストイル脂肪酸残基を有す
る翻訳後に（ご飾された蛋白質である。（サルンガハラ
ンら（３ａｒｎｇａｄｈａｒａｎ、 ｅｔ ａｌ、）
、コミューニケイン？ｌン（Ｃｏｍｍ−ｕｎｉｃａＬｉ
ｏｎ） １２５、アブストラクッ・オン・インターナ
ショナル・フンファランス・オン・エイズ（入ｂｓｔｒ
ａｃｔｓ ｏｆ Ｉｎｔｌ、 Ｃｏｎｆ、 ｏｎ ＡＩ
ＤＳ）、１９８６年６月、パリ、フランス）。
ン酸を含有することが判明した。かくして、酵母産生物
は、ウィルスｐ１７の場合に見い出されたごとく、Ｎ−
末端グリシノに付着したミリストイル脂肪酸残基を有す
る翻訳後に（ご飾された蛋白質である。（サルンガハラ
ンら（３ａｒｎｇａｄｈａｒａｎ、 ｅｔ ａｌ、）
、コミューニケイン？ｌン（Ｃｏｍｍ−ｕｎｉｃａＬｉ
ｏｎ） １２５、アブストラクッ・オン・インターナ
ショナル・フンファランス・オン・エイズ（入ｂｓｔｒ
ａｃｔｓ ｏｆ Ｉｎｔｌ、 Ｃｏｎｆ、 ｏｎ ＡＩ
ＤＳ）、１９８６年６月、パリ、フランス）。
特許出願人 スミス・クライン−アール・アイ・ティ
代理人弁理士青山 葆 はか１名
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で機能する調節要
素のフレーム中に融合されたＨＩＶｐ１７またはｐ１７
の誘導体についてのＤＮＡコーディング配列を有するこ
とを特徴とするイー・コリ発現ベクター。 （２）ラムダのＰＬプロモーターの調節要素を有するこ
とを特徴とする特許請求の範囲第（１）項記載の発現ベ
クター。 （３）ｐＡＳ１の調節要素を有することを特徴とする特
許請求の範囲第（１）項記載の発現ベクター。 （４）成熟ＨＩＶｐ１７蛋白質についてのコーディング
配列を有することを特徴とする特許請求の範囲第（１）
項記載の発現ベクター。 （５）ラムダのＰＬプロモーターの調節要素を有するこ
とを特徴とする特許請求の範囲第（４）項記載の発現ベ
クター。 （６）ｐＡＳ１の調節要素を有することを特徴とする特
許請求の範囲第（５）項記載の発現ベクター。 （７）プラスミドｐＲＩＴ１３０１７またはその誘導体
であるｐ１７についてのＤＮＡコーディング配列を有す
ることを特徴とする特許請求の範囲第（６）項記載の発
現ベクター。 （８）特許請求の範囲第（１）項記載のベクターによっ
て形質転換されたイー・コリによって発現されたＨＩＶ
ｐ１７。 （９）該ｐ１７のＮ−末端コーディング領域が【遺伝子
配列があります】 であることを特徴とする特許請求の範囲第（４）項記載
の発現ベクター。 （１０）該ｐ１７のＣ−末端コーディング領域が： 【遺伝子配列があります】 であることを特徴とする特許請求の範囲第（４）項記載
の発現ベクター。 （１１）該ｐ１７のＣ−末端コーディング領域が： 【遺伝子配列があります】 であることを特徴とする特許請求の範囲第（９）項記載
の発現ベクター。 （１２）該ｐ１７のＮ−末端コーディング領域が： 【遺伝子配列があります】 であることを特徴とする特許請求の範囲第（５）項記載
の発現ベクター。 （１３）該ｐ１７のＣ−末端コーディング領域【遺伝子
配列があります】 であることを特徴とする特許請求の範囲第（１２）項記
載の発現ベクター。 （１４）特許請求の範囲第（１）項記載のベクターで形
質転換されたイー・コリ細胞。 （１５）ｐ２４蛋白質についてのコーディング配列の一
部に連結した成熟ｐ１７蛋白質についてのコーディング
配列を有することを特徴とする特許請求の範囲第（１）
項記載の発現ベクター。 （１６）ｐＲＩＴ１２９２０またはその誘導体であるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第（１５）項記載の発現
ベクター。 （１７）酵母中で機能する調節要素のフレーム中に融合
したＨＩＶｐ１７またはｐ１７の誘導体についてのＤＮ
Ａコーディング配列を有することを特徴とする酵母発現
ベクター。（１８）群：ＡＲＧ３、ＴＤＨ３、ＰＨＯ５
、ＴＲＰ１およびＰＧＫから選択されるプロモーターを
有することを特徴とする特許請求の範囲第（１７）項記
載の発現ベクター。 （１９）ＡＲＧ３プロモーターおよび停止配列に作動可
能に連結したｐ１７コーディング配列を有することを特
徴とする特許請求の範囲第（１７）項記載の発現ベクタ
ー。 （２０）ＴＤＨ３プロモーターおよび停止配列に作動可
能に連結したｐ１７コーディング配列を有することを特
徴とする特許請求の範囲第（１７）項記載の発現ベクタ
ー。 （２１）成熟ＨＩＶｐ１７についてのコーディング配列
を有することを特徴とする特許請求の範囲第（１７）項
記載の発現ベクター。 （２２）ｐＲＩＴ１３０１６またはその誘導体であるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第（２１）項記載の発現
ベクター。 （２３）該ｐ１７のＮ−末端コーディング領域が： 【遺伝子配列があります】 であることを特徴とする特許請求の範囲第（２１）項記
載の発現ベクター。 （２４）該ｐ１７のＣ−末端コーディング領域が： 【遺伝子配列があります】 であることを特徴とする特許請求の範囲第（２３）項記
載の発現ベクター。 （２５）該ｐ１７のＣ−末端コーディング領域が： 【遺伝子配列があります】 であることを特徴とする特許請求の範囲第（２１）項記
載の発現ベクター。 （２６）特許請求の範囲第（１７）項記載の発現ベクタ
ーで形質転換された酵母細胞によって発現されたことを
特徴とするＨＩＶｐ１７。 （２７）特許請求の範囲第（１７）項記載のベクターで
形質転換されたことを特徴とする酵母細胞。 （２８）株エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）であることを特徴とする特許請求の範囲第（２７）
項記載の酵母細胞。 （２９）エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
） ＹＣＹ１株であることを特徴とする特許請求の範囲
第（２８）項記載の酵母細胞。 （３０）ｐ２４蛋白質についてのコーディング配列の一
部に連結した成熟ｐ１７蛋白質についてのコーディング
配列を有することを特徴とする特許請求の範囲第（１７
）項記載の発現ベクター。 （３１）ｐＲＩＴ１２９５３またはその誘導体であるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第（３０）項記載の発現
ベクター。 （３２）ｐＲＩＴ１２９５７またはその誘導体であるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第（３０）項記載の発現
ベクター。 （３３）ＨＩＶｐ１７蛋白質が回収可能な量で発現され
るような許容条件下でＨＩＶｐ１７発現ベクターで形質
転換したイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を培養し、該培養
系から該蛋白質を単離することを特徴とするイー・コリ
においてＨＩＶｐ１７蛋白質を産生する方法。 （３４）該発現ベクターがプラスミドｐＲＩＴ１３０１
７またはその誘導体であることを特徴とする特許請求の
範囲第（３３）項記載の方法。 （３５）ＨＩＶｐ１７またはその誘導体が成熟蛋白質と
して発現されることを特徴とする特許請求の範囲第（３
３）項記載の方法。 （３６）ＨＩＶｐ１７がＨＩＶのｅｎｖまたはｐｏｌ領
域からの蛋白質との融合蛋白質として発現されることを
特徴とする特許請求の範囲第（３３）項記載の方法。 （３７）ＨＩＶｐ１７が肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）Ｂ
ウィルスのＳ蛋白質との融合蛋白質として発現されるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第（３３）項記載の方法
。 （３８）ＨＩＶｐ１７蛋白質が回収可能な量で発現され
るような許容条件下で、ＨＩＶｐ１７発現ベクターで形
質転換した酵母を培養し、該蛋白質を該培養系から単離
することを特徴とする酵母においてＨＩＶｐ１７蛋白質
を産生する方法。 （３９）該酵母が酵母株エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）であることを特徴とする特許請求の範
囲第（３８）項記載の方法。 （４０）該発現ベクターがプラスミドｐＲＩＴ１３０１
７またはその誘導体であることを特徴する特許請求の範
囲第（３９）項記載の方法。 （４１）ＨＩＶｐ１７またはその誘導体が成熟蛋白質と
して発現されることを特徴とする特許請求の範囲第（３
８）項記載の方法。 （４２）ＨＩＶｐ１７がＨＩＶのｅｎｖまたはｐｏｌ領
域からの蛋白質との融合蛋白質として発現されることを
特徴とする特許請求の範囲第（３８）項記載の方法。 （４３）ＨＩＶｐ１７が肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）Ｂ
ウィルスのＳ−蛋白質との融合蛋白質として発現される
ことを特徴とする特許請求の範囲第（３８）項記載の方
法。 （４４）１またはそれ以上の組換体ＨＩＶ抗原およびそ
の適当な担体よりなることを特徴とするＨＩＶによる感
染に対して個人における保護を刺激するためのワクチン
。 （４５）ＨＩＶ−抗原のうちの１つがイー・コリから得
られた組換体ＨＩＶｐ１７蛋白質であることを特徴とす
る特許請求の範囲第（４４）項記載のワクチン。 （４６）ＨＩＶ抗原のうちの１つが酵母から得られた組
換体ＨＩＶｐ１７蛋白質であることを特徴とする特許請
求の範囲第（４４）項記載のワクチン。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US12419887A | 1987-11-24 | 1987-11-24 | |
| US124198 | 1987-11-24 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH022361A true JPH022361A (ja) | 1990-01-08 |
Family
ID=22413400
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63294460A Pending JPH022361A (ja) | 1987-11-24 | 1988-11-21 | イー・コリおよびエス・セレビシエにおけるｈｉｖ蛋白質の発現 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0322394A3 (ja) |
| JP (1) | JPH022361A (ja) |
| AU (1) | AU2579688A (ja) |
| DK (1) | DK643188A (ja) |
| PT (1) | PT89057A (ja) |
| ZA (1) | ZA888701B (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5130247A (en) * | 1989-09-19 | 1992-07-14 | Merck & Co., Inc. | Expression of fusion protein of HIV envelope and HBsAG |
| US5130248A (en) * | 1989-09-19 | 1992-07-14 | Merck & Co., Inc. | Expression of fusion protein of HIV envelope and HBsAg |
| NZ235538A (en) * | 1989-10-12 | 1992-06-25 | Viral Technologies Inc | Peptides immunoreactive with antibodies to hiv p17; carrier-bound peptides, vaccines, immunoassay and a method for forming antibody enriched sera |
| JP3853384B2 (ja) * | 1994-09-09 | 2006-12-06 | 株式会社三菱化学ヤトロン | 抗サイモシンα１モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ |
| ITTO20020286A1 (it) * | 2002-03-29 | 2003-09-29 | Medestea Int Spa | Uso della proteina p17 isolata per la preparazione di un medicamento atto ad inibire gli effetti immunostimolanti che la proteina prodotta d |
| GB0417494D0 (en) * | 2004-08-05 | 2004-09-08 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1341423C (en) * | 1984-10-31 | 2003-03-04 | Paul A. Luciw | Recombinant proteins of viruses associated with lymphadenopathy syndrome and/or acquired immune deficiency syndrome |
| WO1986006099A1 (en) * | 1985-04-08 | 1986-10-23 | Genetic Systems Corporation | EXPRESSION AND DIAGNOSTIC USE OF gag ENCODED PEPTIDES WHICH ARE IMMUNOLOGICALLY REACTIVE WITH ANTIBODIES TO LAV |
| EP0230222A1 (en) * | 1986-01-06 | 1987-07-29 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Expression of HTLV-III gag-Gene |
| EP0293792A3 (en) * | 1987-06-01 | 1990-01-17 | The Du Pont Merck Pharmaceutical Company | Human immunodeficiency virus gag-encoded proteins |
-
1988
- 1988-11-17 DK DK643188A patent/DK643188A/da not_active Application Discontinuation
- 1988-11-21 JP JP63294460A patent/JPH022361A/ja active Pending
- 1988-11-21 ZA ZA888701A patent/ZA888701B/xx unknown
- 1988-11-22 AU AU25796/88A patent/AU2579688A/en not_active Abandoned
- 1988-11-23 PT PT89057A patent/PT89057A/pt not_active Application Discontinuation
- 1988-11-23 EP EP88870175A patent/EP0322394A3/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK643188A (da) | 1989-05-25 |
| ZA888701B (en) | 1990-08-29 |
| AU2579688A (en) | 1989-05-25 |
| PT89057A (pt) | 1989-11-30 |
| EP0322394A3 (en) | 1990-05-09 |
| DK643188D0 (da) | 1988-11-17 |
| EP0322394A2 (en) | 1989-06-28 |
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