JPH022373A - アミノペプチダーゼーｐをコードする遺伝子、該遺伝子を有する組換えｄｎａ，該組換えｄｎａを有する生存細胞株及び該細胞を用いてアミノペプチダーゼーｐを製造する方法 - Google Patents
アミノペプチダーゼーｐをコードする遺伝子、該遺伝子を有する組換えｄｎａ，該組換えｄｎａを有する生存細胞株及び該細胞を用いてアミノペプチダーゼーｐを製造する方法Info
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- JPH022373A JPH022373A JP63156193A JP15619388A JPH022373A JP H022373 A JPH022373 A JP H022373A JP 63156193 A JP63156193 A JP 63156193A JP 15619388 A JP15619388 A JP 15619388A JP H022373 A JPH022373 A JP H022373A
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- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
この発明は遺伝子組換え法によるアミンイグチグーゼー
Ｐの製造法に関するものである。
Ｐの製造法に関するものである。
（従来技術）
アミノ４デチダーゼーＰについてはこれまでにエシェリ
ヒア属およびツタ腎臓にその存在が認められている（
Ｙａｒｏｎ、 Ａ、 ＆ Ｍ１ｙｎｏｒ＋ Ｄ、、 Ｂ
ｉｏｅｈｓｍ。
ヒア属およびツタ腎臓にその存在が認められている（
Ｙａｒｏｎ、 Ａ、 ＆ Ｍ１ｙｎｏｒ＋ Ｄ、、 Ｂ
ｉｏｅｈｓｍ。
Ｂｌｏｐｈｙｉ、 Ｒｓｓ、 Ｃｏｍｍｕｎ、 ３２．
６５８（１９６８）、 Ｄｅｈｍ。
６５８（１９６８）、 Ｄｅｈｍ。
Ｐ、 ＆Ｎｏｒｄｗｉｇ、 Ａｍ、 Ｅｕｒ、 、Ｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 １７．３６４〜３７１（１９７０）
）。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 １７．３６４〜３７１（１９７０）
）。
しかしながら、これらの従来より知られている微生物又
は動物細胞はアミノペプチダーゼ−Ｐの生産能が極めて
低いために、経済的なアミン檀ブチダーゼ−Ｐの製造法
としては不適である。
は動物細胞はアミノペプチダーゼ−Ｐの生産能が極めて
低いために、経済的なアミン檀ブチダーゼ−Ｐの製造法
としては不適である。
（本発明が解決しようとする課題）
本発明が解決しようとする課題は遺伝子工学の手法を用
いてエシェリヒア属あるいはサツカロミセス属に属する
微生物によシ経済的なアミノ４デチダーゼーＰの型造法
を提供することにある。
いてエシェリヒア属あるいはサツカロミセス属に属する
微生物によシ経済的なアミノ４デチダーゼーＰの型造法
を提供することにある。
（課題を解決するための手段）
上述の課題を解決するために、本発明者らはデオキシリ
ボ核酸（以下ＤＮＡと記す）供与菌としてエシェリヒア
・コリＨＢＩＯＩ菌を用い、これよジアミノ４ブチダー
ゼ−Ｐ生成に関与する遺伝情報を有するＤＮＡを抽出し
、ついでこのアミノ−（プチダ−ゼーＰ生成に関与する
遺伝情報を有するＤＮＡを組み込んだプラスミドを得て
、このシラスミドをエシェリヒア属あるいはサツカロミ
セス属の微生物に導入し、これらの中よりアミノＲブチ
ダーゼーＰ活性の増強した組換え体微生物を選択した。
ボ核酸（以下ＤＮＡと記す）供与菌としてエシェリヒア
・コリＨＢＩＯＩ菌を用い、これよジアミノ４ブチダー
ゼ−Ｐ生成に関与する遺伝情報を有するＤＮＡを抽出し
、ついでこのアミノ−（プチダ−ゼーＰ生成に関与する
遺伝情報を有するＤＮＡを組み込んだプラスミドを得て
、このシラスミドをエシェリヒア属あるいはサツカロミ
セス属の微生物に導入し、これらの中よりアミノＲブチ
ダーゼーＰ活性の増強した組換え体微生物を選択した。
本発明の微生物を用いることによって、従来の天然株を
用いる方法に比べて極めて高い収率でアミノペプチダー
ゼーＰを生産できることを見出した。すなわち、アミノ
ペプチダーゼ−Ｐ活性を有する微生物はいくつか知られ
ており（Ｔ、Ｙｏｓｈｉｍｏｔ。
用いる方法に比べて極めて高い収率でアミノペプチダー
ゼーＰを生産できることを見出した。すなわち、アミノ
ペプチダーゼ−Ｐ活性を有する微生物はいくつか知られ
ており（Ｔ、Ｙｏｓｈｉｍｏｔ。
ａｔ ａｌ、、 Ａｇｒｔｃ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｓｍ
、 ５２．２１７（１９８８））これより染色体ＤＮＡ
を常法により抽出しく Ｈ，５ａｉｔ。
、 ５２．２１７（１９８８））これより染色体ＤＮＡ
を常法により抽出しく Ｈ，５ａｉｔ。
ａｎｄ Ｋ、 Ｍｉｕｒａ、 Ｂｉｏｃｈ４ｍ、 Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ、 ７２゜６１９（１９６３）
） 、常法により制限エンドヌクレアーゼで処理する
。
ｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ、 ７２゜６１９（１９６３）
） 、常法により制限エンドヌクレアーゼで処理する
。
我々の実験では制限エンドヌクレアーゼとしてＰｓｔ
Ｉを用いてアミノペプチダーゼ−Ｐ生成に関与する遺伝
情報を担うＤＮＡフラグメントを得たが、他の制限エン
ドヌクレアーゼ例えばＢａｍＨ［、５ａｔ１ ＋ Ｈｉ
ｎｄ ＩＩＩ 、 ＥｃｏＲＩなどを用いてもＰｓｔ
Ｉと同様の結果が得られる可能性がある。
Ｉを用いてアミノペプチダーゼ−Ｐ生成に関与する遺伝
情報を担うＤＮＡフラグメントを得たが、他の制限エン
ドヌクレアーゼ例えばＢａｍＨ［、５ａｔ１ ＋ Ｈｉ
ｎｄ ＩＩＩ 、 ＥｃｏＲＩなどを用いてもＰｓｔ
Ｉと同様の結果が得られる可能性がある。
ベクターＤＮＡとしてはｐＢＲ３２２、ｐＵｃ１９など
のエシェリヒア・コリーのリラックスタイププラスミド
よシ得られたものならばどのようなものでもよい。この
ベクターにアミノペプチダーゼ−Ｐ生成に関与する遺伝
情報を担うＤＮＡフラグメントを組み込む方法は特定の
方法を要しない。
のエシェリヒア・コリーのリラックスタイププラスミド
よシ得られたものならばどのようなものでもよい。この
ベクターにアミノペプチダーゼ−Ｐ生成に関与する遺伝
情報を担うＤＮＡフラグメントを組み込む方法は特定の
方法を要しない。
かくして得られたアミノベゾチダーゼーＰ生成に関与す
る遺伝情報を担うＤＮＡフラグメントを祖み込んだシラ
スミドをエシェリヒア属の微生物に含有せしめる方法も
まだ、従来知られているすべての形質転換方法が可能で
ある。
る遺伝情報を担うＤＮＡフラグメントを祖み込んだシラ
スミドをエシェリヒア属の微生物に含有せしめる方法も
まだ、従来知られているすべての形質転換方法が可能で
ある。
組換えプラスミドの受容菌としては、エシェリヒア属の
中でアミノベグチダーゼーＰ活性をもたないものあるい
は弱いものを用いる方が、アミン被ブチダーゼーＰ生成
に関与する遺伝情報を担うＤＮＡフラグメントを組み込
んだプラスミドを保有する形質転換株を選別、分離する
のに都合がよい。
中でアミノベグチダーゼーＰ活性をもたないものあるい
は弱いものを用いる方が、アミン被ブチダーゼーＰ生成
に関与する遺伝情報を担うＤＮＡフラグメントを組み込
んだプラスミドを保有する形質転換株を選別、分離する
のに都合がよい。
かくして得られたアミノペプチダーゼ−Ｐ生産菌を培養
する方法は、従来のエシェリヒア属の培養方法と特に変
らない。すなわち培地としては炭素源、窒素源、無機イ
オン、さらに必要に応じアミノ酸、ビタミン等の有機微
量栄養素を含有する通常のものである。
する方法は、従来のエシェリヒア属の培養方法と特に変
らない。すなわち培地としては炭素源、窒素源、無機イ
オン、さらに必要に応じアミノ酸、ビタミン等の有機微
量栄養素を含有する通常のものである。
炭素源としてはグルコース、シークロース等及びこれら
を含有する澱粉加水分解、糖蜜等が用いられる。窒素源
としてアンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩
、その他が使用できる。より好ましく硬デトン、トリプ
トン、肉エキス、酵母エキス等の天然素材なども使われ
る。
を含有する澱粉加水分解、糖蜜等が用いられる。窒素源
としてアンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩
、その他が使用できる。より好ましく硬デトン、トリプ
トン、肉エキス、酵母エキス等の天然素材なども使われ
る。
培養は好気的条件下で培地の…及び温度を適宜調節しつ
つ、実質的にアミノペプチダーゼ−Ｐの生成蓄積が最高
になるところまで行われる。
つ、実質的にアミノペプチダーゼ−Ｐの生成蓄積が最高
になるところまで行われる。
培養菌体よりアミノ−！ブチダーゼーＰを採取するには
通常以下のような方法が用いられる。
通常以下のような方法が用いられる。
培養菌体を冷却遠心機等で集菌した後、適当なバッファ
ーに懸濁し、超音波あるいはダイノミルなどで菌体を破
砕して抽出液を得る。
ーに懸濁し、超音波あるいはダイノミルなどで菌体を破
砕して抽出液を得る。
アミノ−！ブナダーゼーＰ遺伝子はまた適当な発現ベク
ターに組み込みこれを宿主細胞に導入すれば酵母でも発
現させることができる。酵母に外来遺伝子を発現させる
ための各種シャトル・ベクターは既にいくつか報告され
ている。（ＨｅｉｔｚｍａｎらＮａｔｕｒｅ ２９３
、７１７〜７２２（１９８１） 、宮下ら、 Ｐｒｏｃ
。
ターに組み込みこれを宿主細胞に導入すれば酵母でも発
現させることができる。酵母に外来遺伝子を発現させる
ための各種シャトル・ベクターは既にいくつか報告され
ている。（ＨｅｉｔｚｍａｎらＮａｔｕｒｅ ２９３
、７１７〜７２２（１９８１） 、宮下ら、 Ｐｒｏｃ
。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｅｔ、 ＵＳＡ、 ８０．
１−５（１９８３））これらのベクターはエシェリヒア
・コリおよび酵母両方の宿主で増殖することができる。
１−５（１９８３））これらのベクターはエシェリヒア
・コリおよび酵母両方の宿主で増殖することができる。
また、酵母遺伝子のプロモーター配列を内蔵している。
基本的には発現ベクターすべてがアミノベゾチダーゼー
Ｐ遺伝子の発現に利用可能である。動物細胞や細菌の利
用に較べ酵母を利用すればアミノ梨ブチダーゼーＰ産生
能のレベルをより高くすることも可能である。酵母菌で
アミノペプチダーゼ−Ｐ遺伝子を発現させる例を以下に
記す。
Ｐ遺伝子の発現に利用可能である。動物細胞や細菌の利
用に較べ酵母を利用すればアミノ梨ブチダーゼーＰ産生
能のレベルをより高くすることも可能である。酵母菌で
アミノペプチダーゼ−Ｐ遺伝子を発現させる例を以下に
記す。
酵母−エシェリヒア・コリ シャトル・ベクターｐＡＴ
７７ 、 ｐＡＭ８２が宮下ら（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ
、 Ａｃａｄ。
７７ 、 ｐＡＭ８２が宮下ら（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ
、 Ａｃａｄ。
Ｓｅｔ、’ ＵＳＡ ８０１−５ （１９８３））によ
って報告されている。ベクターｐＡＭ８２はｐＡＴ７７
の誘導体であり、両者ともａｒｓｌのマーカーを持ち（
Ｓｔｉｎｅｈｃｏｍｂ ＤＴｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ
２８２．３９−４３（１９７９） 、 ２μｍｏｒｌ
（Ｂｒｏａｃｈ Ｊ、 Ｒ，ａｔ ａｌ、 Ｇｅｕｅ、
８． １２１−１３３（１９７９）。
って報告されている。ベクターｐＡＭ８２はｐＡＴ７７
の誘導体であり、両者ともａｒｓｌのマーカーを持ち（
Ｓｔｉｎｅｈｃｏｍｂ ＤＴｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ
２８２．３９−４３（１９７９） 、 ２μｍｏｒｌ
（Ｂｒｏａｃｈ Ｊ、 Ｒ，ａｔ ａｌ、 Ｇｅｕｅ、
８． １２１−１３３（１９７９）。
ｌｅｕ ２ （Ｒａｔｚｋｌｎ Ｂ、ａｔ ａ
ｌ Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ。
ｌ Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ。
’；ｃｉ、 ＵＳＡ ７４．４７４−４９１（１９７９
）） 、酵母の酸性フォスファターゼ（ＡＰａｓｅ ）
に対するプロモーターを持っている。両ベクターともア
ンピシリン耐性マーカー（ＡＰγ）を持つｐＢＲ３２２
の３，７００塩基からなるＤＮＡ画分と増巾オリジンを
持っている。ＡＰａａｅプロモーターは培養液中で高濃
度リン酸を低濃度にンフトすると始めて誘導される。ア
ミノペゾチダーゼーＰ遺伝子を発現させるために、ｐＡ
ＰＰＯ４のＰｓｔ Ｉ −Ｋｐｎ Ｉフラグメントをエ
シェリヒア・フリのフレノウ画分またはＴ４ＤＮＡポリ
メラーゼで処理した後、このフラグメントとＸｈｏ Ｉ
で切断したｐＡＭ８２をエシェリヒア・コリのフレノウ
両分またはＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理したものとをつ
なぎ合わせ、アミノペプチダーゼ−Ｐをコードスル配列
を酵母ＡＰａｓｅ ７’ロモ一ター配列の下流に持つノ
・イブリッドプラスミドをエシェリヒア・コリにてクロ
ーニングし選別する。
）） 、酵母の酸性フォスファターゼ（ＡＰａｓｅ ）
に対するプロモーターを持っている。両ベクターともア
ンピシリン耐性マーカー（ＡＰγ）を持つｐＢＲ３２２
の３，７００塩基からなるＤＮＡ画分と増巾オリジンを
持っている。ＡＰａａｅプロモーターは培養液中で高濃
度リン酸を低濃度にンフトすると始めて誘導される。ア
ミノペゾチダーゼーＰ遺伝子を発現させるために、ｐＡ
ＰＰＯ４のＰｓｔ Ｉ −Ｋｐｎ Ｉフラグメントをエ
シェリヒア・フリのフレノウ画分またはＴ４ＤＮＡポリ
メラーゼで処理した後、このフラグメントとＸｈｏ Ｉ
で切断したｐＡＭ８２をエシェリヒア・コリのフレノウ
両分またはＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理したものとをつ
なぎ合わせ、アミノペプチダーゼ−Ｐをコードスル配列
を酵母ＡＰａｓｅ ７’ロモ一ター配列の下流に持つノ
・イブリッドプラスミドをエシェリヒア・コリにてクロ
ーニングし選別する。
次に、得られたシラスミドｐＡＭ８２ｐＡＰＰをサツカ
ロミセス・セレビシェＡＨ２２へ以下の如く導入スる。
ロミセス・セレビシェＡＨ２２へ以下の如く導入スる。
サツカロミセス・セレビシェＡＨ２２の細胞（ｌｅｕ
２ 、 ｈｉｓ ４ 、 ｃａｎ １ 、 Ｃｉｒ”
）を５００ｄ容振とうフラスコ中の１００１ｄＹＰＤ培
地（１チ酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコー
ス、ＰＨ５，３）で３０℃にて好気的に振とう培養する
。指数増殖期中期（６１０ｎｍにおける吸光度０．８）
に３５０ Ｏｒｐｍで５分間遠心分離して細胞を集め、
ＴＥ緩衝液（１ｍＭ ）リス−塩酸、ｐＨ７，５，０，
１ｍＭ ＥＤＴＡ ）で１回洗浄し、同じ緩衝液５ ｍ
ｌに懸濁する。この細胞懸濁液の０．５Ｍを試験管にと
り、これに０．２ Ｍ Ｃ）ｆ３ＣＯＯＬＩまたは１．
０ Ｍ ＣｓＣ１を同量添加し、次いで懸濁液を３０℃
で１時間振とつする。懸濁液の細胞を３５００ｒｐｍで
５分間遠心分離して集め、１Ｍソルビトールで１回洗浄
し、チモリアーゼ（Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ ） ５０００
溶液（１Ｍソルビトール、０．１Ｍクエン酸緩衝液−１
０ｍＭ ＥＤＴＡ −Ｑ、 ４ ｍＱ／１ｎｌチモリア
ーゼ５０００ ） １ｍｌに再び懸濁する。この懸濁液
を３７℃で１時間緩かに振とうしてプロトプラストを調
製する。このプロトプラストをＩＭのソルビトールで３
回洗浄し、ＩＭンルビトー＃ −１０ｍＭ ＣａＣ２２
−１０ｍＭ ）リス−塩酸の溶液１． Ｏｒｎｌ （ｐ
Ｈ７，５）に再懸濁する。プラスミドＤＮＡ （ｐＡＭ
８２ｐＡＰＰ ）を２０μ９７ｍ１となるようにプロト
プラスト懸濁液に添加し、この混合物を５分間室温でイ
ンキュベートする。次いで、４０％？リエチレングリコ
ール４０００−１０ ｍＭ ＣａＣｌ２−１０ ｍＭ
）リス−塩酸の溶液（ｐＨ７，５） ５ ｍｌをこの混
合物に加え、１０分波速心分離してプロトプラストを沈
・澱せしめ、１Ｍソルビトール−１０ｍＭＣａＣ６２４
−１０１ＴＬＭ ）リス−塩酸の溶液（ｐＨ７，５）５
ｍｌに再懸濁する。懸濁液の一部０．２ ｍｌを１０ｍ
１再生寒天培地に加え、０．１Ｍソルビトール、０．６
７チデイフコ・イースト・ナイトロジエン・ベース。
２ 、 ｈｉｓ ４ 、 ｃａｎ １ 、 Ｃｉｒ”
）を５００ｄ容振とうフラスコ中の１００１ｄＹＰＤ培
地（１チ酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコー
ス、ＰＨ５，３）で３０℃にて好気的に振とう培養する
。指数増殖期中期（６１０ｎｍにおける吸光度０．８）
に３５０ Ｏｒｐｍで５分間遠心分離して細胞を集め、
ＴＥ緩衝液（１ｍＭ ）リス−塩酸、ｐＨ７，５，０，
１ｍＭ ＥＤＴＡ ）で１回洗浄し、同じ緩衝液５ ｍ
ｌに懸濁する。この細胞懸濁液の０．５Ｍを試験管にと
り、これに０．２ Ｍ Ｃ）ｆ３ＣＯＯＬＩまたは１．
０ Ｍ ＣｓＣ１を同量添加し、次いで懸濁液を３０℃
で１時間振とつする。懸濁液の細胞を３５００ｒｐｍで
５分間遠心分離して集め、１Ｍソルビトールで１回洗浄
し、チモリアーゼ（Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ ） ５０００
溶液（１Ｍソルビトール、０．１Ｍクエン酸緩衝液−１
０ｍＭ ＥＤＴＡ −Ｑ、 ４ ｍＱ／１ｎｌチモリア
ーゼ５０００ ） １ｍｌに再び懸濁する。この懸濁液
を３７℃で１時間緩かに振とうしてプロトプラストを調
製する。このプロトプラストをＩＭのソルビトールで３
回洗浄し、ＩＭンルビトー＃ −１０ｍＭ ＣａＣ２２
−１０ｍＭ ）リス−塩酸の溶液１． Ｏｒｎｌ （ｐ
Ｈ７，５）に再懸濁する。プラスミドＤＮＡ （ｐＡＭ
８２ｐＡＰＰ ）を２０μ９７ｍ１となるようにプロト
プラスト懸濁液に添加し、この混合物を５分間室温でイ
ンキュベートする。次いで、４０％？リエチレングリコ
ール４０００−１０ ｍＭ ＣａＣｌ２−１０ ｍＭ
）リス−塩酸の溶液（ｐＨ７，５） ５ ｍｌをこの混
合物に加え、１０分波速心分離してプロトプラストを沈
・澱せしめ、１Ｍソルビトール−１０ｍＭＣａＣ６２４
−１０１ＴＬＭ ）リス−塩酸の溶液（ｐＨ７，５）５
ｍｌに再懸濁する。懸濁液の一部０．２ ｍｌを１０ｍ
１再生寒天培地に加え、０．１Ｍソルビトール、０．６
７チデイフコ・イースト・ナイトロジエン・ベース。
２チグルコース・アミノ酸混合溶液（Ｌ−グルタミン酸
、Ｌ−アスノクラギン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−プロリン
、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−） ＩＪ ７’
）ファン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン。
、Ｌ−アスノクラギン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−プロリン
、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−） ＩＪ ７’
）ファン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン。
Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−メチオニン
、グルシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、ｒ”
−’）ジン、Ｌ−シスチン、Ｌ−ヒスチジンおよびＬ
−アルギニン各５ ｍ９／ｄｌを含む）および２チ寒天
から成る最小寒天プレー）（ｐＨ５，３）上に展開し、
Ｌｅｕ” トランスフォーマントを選択する。
、グルシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、ｒ”
−’）ジン、Ｌ−シスチン、Ｌ−ヒスチジンおよびＬ
−アルギニン各５ ｍ９／ｄｌを含む）および２チ寒天
から成る最小寒天プレー）（ｐＨ５，３）上に展開し、
Ｌｅｕ” トランスフォーマントを選択する。
この形質転換体、即ちｐＡＭ８２ｐＡＰＰを含むサツカ
ロミセス・セレビシェＡＨ２２（ｐＡＭ８２ＡＤＦ −
１／ＡＨ２２）を３０℃で好気的にヒスチジン（２０μ
ｇ／ｍｌ ）を補充した１ ００ ｍｌの高すン酸パー
コルダ−（ｈｉｇｈ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｒｋｈ
ｏｌｄｏｒ ）最小培地（２０，０ｇ／ｌグルコース、
２．０ ｇ／ｌアスノ！ラギン１、５１／ｄｌ ＫＨ
２ＰＯ４，２，０１／ｌ （洲、）２Ｓｏ４．０．５屑
Ｍ、５ｏ４−７Ｈ２０、０，３３１７１ＣａＣｌ２”２
Ｈ２０、０，１ｍ９／ｌＫｌ 、０．２５ ｍ９／ｌ
ＦｅＳＯ４”７Ｈ２０１０，０４ｍ９ＡＭｎＳＯａ参４
Ｈ２０、０，０２ｍ９／ｌ （ＮＨ，）６ＭＯ７０２４
−４Ｔ（２０、０，６０■／ｌ Ｈ３ＢＯ３，０，０４
■４Ｃ口Ｓ０４・５Ｈ２０、０，３１ηｌｌ ＺｎＳＯ
４’７Ｈ２０、０，２０ｍｌｉ／ｌサイアミン塩酸塩。
ロミセス・セレビシェＡＨ２２（ｐＡＭ８２ＡＤＦ −
１／ＡＨ２２）を３０℃で好気的にヒスチジン（２０μ
ｇ／ｍｌ ）を補充した１ ００ ｍｌの高すン酸パー
コルダ−（ｈｉｇｈ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｒｋｈ
ｏｌｄｏｒ ）最小培地（２０，０ｇ／ｌグルコース、
２．０ ｇ／ｌアスノ！ラギン１、５１／ｄｌ ＫＨ
２ＰＯ４，２，０１／ｌ （洲、）２Ｓｏ４．０．５屑
Ｍ、５ｏ４−７Ｈ２０、０，３３１７１ＣａＣｌ２”２
Ｈ２０、０，１ｍ９／ｌＫｌ 、０．２５ ｍ９／ｌ
ＦｅＳＯ４”７Ｈ２０１０，０４ｍ９ＡＭｎＳＯａ参４
Ｈ２０、０，０２ｍ９／ｌ （ＮＨ，）６ＭＯ７０２４
−４Ｔ（２０、０，６０■／ｌ Ｈ３ＢＯ３，０，０４
■４Ｃ口Ｓ０４・５Ｈ２０、０，３１ηｌｌ ＺｎＳＯ
４’７Ｈ２０、０，２０ｍｌｉ／ｌサイアミン塩酸塩。
ｉ ｏ、 ｏ ｗｉイノシトール、 ０．２ 敷）ぐン
トテン酸カルシウム、 ０．２ ｍ９／ｌピリドキシン
塩酸塩、 ０．０５ｍｇｔ７ｆｎｌ ／ｊラーアミノ安
息香酸、９．２０ｍ９７１ニコチン酸および２．０γ／
ｌピオチンを含有、ＰＨ５，３）中で培養する。細胞密
度が６１０ｎｍにおける吸光度で０．４に達した時サン
プルを取出し遠心分離して低リン酸最小培地（２０，０
Ｖ′ｌグルコース、２．０１／ｌアスノぐラギン、 １
．５ Ｆｌ／ｌ ＫＣｌ 、 ２．０ Ｅ／１（ＮＨ４
）２ｓｏ４． ｏ、 ５ ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２
０、０，３３，９，′１ＣｎＣ１２−２Ｈ２０、０，１
ｍ９／ｌ ＫＩ 、 ０．２５ｍ９／ｌ ＦｅＳＯ４−
７Ｈ２０、０，０４，’ｎ９／ｌ ＭｎＳＯ４”４Ｈ２
０、０，０２ｍ９／１（ＮＨ４）６Ｍｏ７０２４’４Ｈ
２０、０，６”９／ｌ Ｈ３ＢＯ３，０，０４ｍＱ／ｌ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２０、０，３１、ＷＩ ＺｎＳＯ４
’７Ｈ２０、０，２Ｗｌサイアミン塩酸塩、 １０．０
ｍ／ｊ／ｌイノシトール。
トテン酸カルシウム、 ０．２ ｍ９／ｌピリドキシン
塩酸塩、 ０．０５ｍｇｔ７ｆｎｌ ／ｊラーアミノ安
息香酸、９．２０ｍ９７１ニコチン酸および２．０γ／
ｌピオチンを含有、ＰＨ５，３）中で培養する。細胞密
度が６１０ｎｍにおける吸光度で０．４に達した時サン
プルを取出し遠心分離して低リン酸最小培地（２０，０
Ｖ′ｌグルコース、２．０１／ｌアスノぐラギン、 １
．５ Ｆｌ／ｌ ＫＣｌ 、 ２．０ Ｅ／１（ＮＨ４
）２ｓｏ４． ｏ、 ５ ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２
０、０，３３，９，′１ＣｎＣ１２−２Ｈ２０、０，１
ｍ９／ｌ ＫＩ 、 ０．２５ｍ９／ｌ ＦｅＳＯ４−
７Ｈ２０、０，０４，’ｎ９／ｌ ＭｎＳＯ４”４Ｈ２
０、０，０２ｍ９／１（ＮＨ４）６Ｍｏ７０２４’４Ｈ
２０、０，６”９／ｌ Ｈ３ＢＯ３，０，０４ｍＱ／ｌ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２０、０，３１、ＷＩ ＺｎＳＯ４
’７Ｈ２０、０，２Ｗｌサイアミン塩酸塩、 １０．０
ｍ／ｊ／ｌイノシトール。
０、２ ｍｑ／ｌパントテン酸カルシウム、 ０．２
ｍ９／ｌピリドキシン塩酸塩、０．０５■４ノ２ラアミ
ノ安息香酸。
ｍ９／ｌピリドキシン塩酸塩、０．０５■４ノ２ラアミ
ノ安息香酸。
９．２・腑ニコチン酸ａｎｄ ２． Ｏｒ／ｌビオチン
を含有、ｐＨ５，３）ｌ Ｏ０ｍｌ中で懸濁して誘発さ
せる。対照のサンプルは途中で低リン酸培地に移さない
以外は同様に処理する。６１０ｎｍにおける細胞密度が
吸光度で０．８に達した時、誘発した培養液と誘発しか
かった培養液のサンプル１００Ｍを遠心分離する。
を含有、ｐＨ５，３）ｌ Ｏ０ｍｌ中で懸濁して誘発さ
せる。対照のサンプルは途中で低リン酸培地に移さない
以外は同様に処理する。６１０ｎｍにおける細胞密度が
吸光度で０．８に達した時、誘発した培養液と誘発しか
かった培養液のサンプル１００Ｍを遠心分離する。
得られた細胞をチモリアーゼ５００ （１００糺し’Ｍ
） １．２Ｍソルビトール、５０ｍＭＩＪン酸塩（ｐ
Ｈ７，２’）および１４ ｍＭ ２−メルカプトエタノ
ールを含む溶液５ゴ中に懸濁し、懸濁液を３０℃で３０
分間インキ・、ベートする。遠心分離してゾロドプラス
トを集め、０．１チドリトンＸ−１００１５０綱リン酸
塩（ｐＨ７，２）１ｍおよびフェニルメチルスルフォニ
ルフロライド１ ｍＭ中に分離する。分離物（１ｙｓｉ
ｔｅ ）を１ｌ１０００ｒｐで２０分間遠心分離して清
澄にする。これらエシェリヒアコリーあるいハサッカロ
マイセス・セレビシェの菌体抽出液を硫安沈澱分画法、
ＤＥＡＥ−セファデックスなどのイオン交換クロマトグ
ラフィーなどを行い、さらにＤｇＡＥ−５ＰＷ ＋Ｐｈ
ｅｎｙｌ −５ＰＷなどの高速液体クロマトグラフィー
などを行ってアミノベゾチダーゼーＰの精製標品を得る
。
） １．２Ｍソルビトール、５０ｍＭＩＪン酸塩（ｐ
Ｈ７，２’）および１４ ｍＭ ２−メルカプトエタノ
ールを含む溶液５ゴ中に懸濁し、懸濁液を３０℃で３０
分間インキ・、ベートする。遠心分離してゾロドプラス
トを集め、０．１チドリトンＸ−１００１５０綱リン酸
塩（ｐＨ７，２）１ｍおよびフェニルメチルスルフォニ
ルフロライド１ ｍＭ中に分離する。分離物（１ｙｓｉ
ｔｅ ）を１ｌ１０００ｒｐで２０分間遠心分離して清
澄にする。これらエシェリヒアコリーあるいハサッカロ
マイセス・セレビシェの菌体抽出液を硫安沈澱分画法、
ＤＥＡＥ−セファデックスなどのイオン交換クロマトグ
ラフィーなどを行い、さらにＤｇＡＥ−５ＰＷ ＋Ｐｈ
ｅｎｙｌ −５ＰＷなどの高速液体クロマトグラフィー
などを行ってアミノベゾチダーゼーＰの精製標品を得る
。
以上、本発明の微生物を用いることにより、従来知られ
ているエシェリヒア・コリーのアミノペプチダーゼ−Ｐ
生産菌を用いる場合に比べ、単位蛋白質あたりの生産量
が極めて高いことにより、アミノ被ブチダーゼ−Ｐの分
離・精製の際に有利である。
ているエシェリヒア・コリーのアミノペプチダーゼ−Ｐ
生産菌を用いる場合に比べ、単位蛋白質あたりの生産量
が極めて高いことにより、アミノ被ブチダーゼ−Ｐの分
離・精製の際に有利である。
またアミノペプチダーゼ−Ｐの用途としては、本酵素の
基質特異性がＸ −Ｐｒｏ−・・・のＸの後を特異的に
切断しＰｒｏ−・・・なるペプチドを遊離するところか
ら天然型のＮ末端がプロリンである蛋白質ペプチドのＮ
末端を揃えることなどに利用できる。
基質特異性がＸ −Ｐｒｏ−・・・のＸの後を特異的に
切断しＰｒｏ−・・・なるペプチドを遊離するところか
ら天然型のＮ末端がプロリンである蛋白質ペプチドのＮ
末端を揃えることなどに利用できる。
例えばエシェリヒア・コリーで生産されたレフンビナン
） ＢＳＦ −２ＯＮ末端を揃えるのに利用されている
（特願昭６ｌ−３０２６９９）。
） ＢＳＦ −２ＯＮ末端を揃えるのに利用されている
（特願昭６ｌ−３０２６９９）。
実施例１゜
エシェリヒア脅コリＨＢＩＯＩ （Ｂｏｙｅｒ、 Ｈ，
Ｗ、 ｅｔａｌ、、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、 ４１．４
５９（１９６９） ）をアミノベゾチダーゼーＰを生産
する原株として、次のような方法でアミノペプチダーゼ
−Ｐ生成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡフラグメント
を分離し、新規に著量のアミノペプチダーゼ−Ｐを生産
する菌を造成した。
Ｗ、 ｅｔａｌ、、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、 ４１．４
５９（１９６９） ）をアミノベゾチダーゼーＰを生産
する原株として、次のような方法でアミノペプチダーゼ
−Ｐ生成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡフラグメント
を分離し、新規に著量のアミノペプチダーゼ−Ｐを生産
する菌を造成した。
（１）染色体ＤＮＡの調製
エシェリヒア・コリＨＢＩＯＩを４０（１！のＬ培地（
トリジトン１チ、酵母エキス０．５％、ＮａＣｔｏ、５
優、グルコース０．１チ、ｐＨ７，２に調整）中３７℃
で約３時間振盪培養を行い、対数増殖期の菌体を集菌後
フェノール法による通常のＤＮＡ抽出法（Ｈ。
トリジトン１チ、酵母エキス０．５％、ＮａＣｔｏ、５
優、グルコース０．１チ、ｐＨ７，２に調整）中３７℃
で約３時間振盪培養を行い、対数増殖期の菌体を集菌後
フェノール法による通常のＤＮＡ抽出法（Ｈ。
５ａｉｔｏ ａｎｄ Ｋ、 Ｍｉｕｒａ、 Ｂｌｏｃｈ
ｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ。
ｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ。
７２、６）、９（１９６３） ）によって染色体ＤＮＡ
を抽出精製し、最終２０ηを得た。
を抽出精製し、最終２０ηを得た。
（２）染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入（１）で得
た染色体ＤＮＡおよびベクターｐＢＲ３２２（タカラ市
販品）の各１０μＩをとシ、各々に制限エンドヌクレア
ーゼの１種、Ｐｉｔ Ｉを３７℃、１時間作用させてＤ
ＮＡ鎖を切断した。次に各々をフェノール処理、クロロ
ホルム処理後、エタノール沈澱回収し、両ＤＮＡ切断物
を１ ｍＭ ＡＴＰ及び１０ｍＭソチオスレイトール、
６．６ ｒｎ）Ｊ（ＭｇＣ６２を含む６６ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣＩ ｓ ｐＨ７，５中でＴ４ＤＮＡ ！７７！
／−ゼ（タカラ）１００ユニツトと共に混合し、混合物
を４℃、昼夜反応させた。
た染色体ＤＮＡおよびベクターｐＢＲ３２２（タカラ市
販品）の各１０μＩをとシ、各々に制限エンドヌクレア
ーゼの１種、Ｐｉｔ Ｉを３７℃、１時間作用させてＤ
ＮＡ鎖を切断した。次に各々をフェノール処理、クロロ
ホルム処理後、エタノール沈澱回収し、両ＤＮＡ切断物
を１ ｍＭ ＡＴＰ及び１０ｍＭソチオスレイトール、
６．６ ｒｎ）Ｊ（ＭｇＣ６２を含む６６ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣＩ ｓ ｐＨ７，５中でＴ４ＤＮＡ ！７７！
／−ゼ（タカラ）１００ユニツトと共に混合し、混合物
を４℃、昼夜反応させた。
（３）コンピテント細胞の調製
エシェリヒア・コリＤＨ１（Ｌｏｗ、 Ｂ、 Ｐｒｏｃ
。
。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ６０．１６０（１
９６８））を５０！ｎｌ！のＬ培地に接１し、培養液の
６５０ｍμにおける吸光度がおよそ０．４〜０．５にな
るまで３０℃で振盪培養−た。培養終了後、培養液を０
℃にて２０分間放置し、次に菌体を遠心分離によシ集め
、５０ ｍＭＣａ Ｃ４２溶液２５ｍ１に懸濁し、０℃
に１時間放置後、遠心分離により菌体を集め、５０ｍＭ
ＣａＣ６２と２０係グリセロール溶１５ｔＡ！に菌体を
再び懸濁し、得られた菌体懸濁液を０．５ ｄずつエソ
Ｒンドルフチューブに入れ、−７０℃にて凍結保存した
。
９６８））を５０！ｎｌ！のＬ培地に接１し、培養液の
６５０ｍμにおける吸光度がおよそ０．４〜０．５にな
るまで３０℃で振盪培養−た。培養終了後、培養液を０
℃にて２０分間放置し、次に菌体を遠心分離によシ集め
、５０ ｍＭＣａ Ｃ４２溶液２５ｍ１に懸濁し、０℃
に１時間放置後、遠心分離により菌体を集め、５０ｍＭ
ＣａＣ６２と２０係グリセロール溶１５ｔＡ！に菌体を
再び懸濁し、得られた菌体懸濁液を０．５ ｄずつエソ
Ｒンドルフチューブに入れ、−７０℃にて凍結保存した
。
（４）形質転換と形質転換株の取得
（３）で調製したコンピテント細胞懸濁液２００μぎに
（２）で調製したＤＮＡ溶液を加え、０℃、３０分間放
置後、４２℃で２分間のヒートショックを与えた後、再
び０℃に３０分間放置してＤＮＡを細胞内に取込ませた
。
（２）で調製したＤＮＡ溶液を加え、０℃、３０分間放
置後、４２℃で２分間のヒートショックを与えた後、再
び０℃に３０分間放置してＤＮＡを細胞内に取込ませた
。
次に、この懸濁液にＬ培地をＩＭ加え、３７℃で１時間
培養を行った後、テトラサイクリン２０μｊｉ／ｒｎｌ
を含有するし培地寒天プレートに塗抹し３７℃で一部イ
ンキユペートした。出現したコロニーを今度はアンピシ
リン２５μｊｉ／ｍｌを含有するし培地寒天プレートに
それぞれ塗抹し、３７℃で一部インキーペートし成育の
有無を検定し、テトラサイクリンを含む培地では成育す
るがアンピシリンを含む培地では成育しないコロニーヲ
アミノベプチダーゼーＰ生産を検定する候補法としてｐ
ｉｃｋ＋ｊｐシた。
培養を行った後、テトラサイクリン２０μｊｉ／ｒｎｌ
を含有するし培地寒天プレートに塗抹し３７℃で一部イ
ンキユペートした。出現したコロニーを今度はアンピシ
リン２５μｊｉ／ｍｌを含有するし培地寒天プレートに
それぞれ塗抹し、３７℃で一部インキーペートし成育の
有無を検定し、テトラサイクリンを含む培地では成育す
るがアンピシリンを含む培地では成育しないコロニーヲ
アミノベプチダーゼーＰ生産を検定する候補法としてｐ
ｉｃｋ＋ｊｐシた。
（５）アミノペプチダーゼ−Ｐ生産の検定（４）でｐｉ
ｃｋ ＩＩＩ） した約１０００コロニーの検定候補法
をそれぞれテトラサイクリン２０μｇ７ｙｔｔを含むし
一培地３００μｌ に植菌（９６穴プレート使用）し、
３７℃で２４時間培養した。この培養液の５０ μｌに
３ ｍＭ Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−／Ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉ
ｄｅ （２０ｍＭＴｒｉｓ−ＭＣ６，ｐＨ８，０に溶解
）の５０μぎを加え、さらにＰｒｏｌｉｎｅ １ｍ１ｎ
ｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ５０μｌ（０，１ユニツト）を
加えて、３７℃で４時間反応させた。この反応液に５０
μｌのＦａｓｔ Ｇａｒｎｅｔ ＧＢＣＳｏｌ （１
ｍＶＩＭＩｎ１Ｍ酢酸バッファ 、ｐ＋（４，０＋１
０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液）を加え、アゾ色素（
赤色）の生成量を５５０℃ｍの吸収で測定した。その結
果、原株のＨＢ ］、０１の対照に比べ約１０倍程活性
の強い候補法が得られた。
ｃｋ ＩＩＩ） した約１０００コロニーの検定候補法
をそれぞれテトラサイクリン２０μｇ７ｙｔｔを含むし
一培地３００μｌ に植菌（９６穴プレート使用）し、
３７℃で２４時間培養した。この培養液の５０ μｌに
３ ｍＭ Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−／Ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉ
ｄｅ （２０ｍＭＴｒｉｓ−ＭＣ６，ｐＨ８，０に溶解
）の５０μぎを加え、さらにＰｒｏｌｉｎｅ １ｍ１ｎ
ｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ５０μｌ（０，１ユニツト）を
加えて、３７℃で４時間反応させた。この反応液に５０
μｌのＦａｓｔ Ｇａｒｎｅｔ ＧＢＣＳｏｌ （１
ｍＶＩＭＩｎ１Ｍ酢酸バッファ 、ｐ＋（４，０＋１
０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液）を加え、アゾ色素（
赤色）の生成量を５５０℃ｍの吸収で測定した。その結
果、原株のＨＢ ］、０１の対照に比べ約１０倍程活性
の強い候補法が得られた。
この候補法について、さらに無細胞抽出物レベルでの酵
素活性を検討するために以下の実験を行った。
素活性を検討するために以下の実験を行った。
２０μｇ７Δａのテトラサイクリンを含むし一培地の１
００−の入った坂ロフラスコに植菌し３７℃で一部撮盪
培養し、培養終了後集菌し３０μＭのＭｎＣ６２を含む
２０ ｍＭ Ｔｒｉｍ−ＨＣｔ、 ｐＨ８，５溶液に懸
濁し、０℃で超音波破砕し遠心によシ抽出液を得だ。こ
の細胞抽出液を用いて次のようにアミノペプチダーゼ−
Ｐの活性を測定した。
００−の入った坂ロフラスコに植菌し３７℃で一部撮盪
培養し、培養終了後集菌し３０μＭのＭｎＣ６２を含む
２０ ｍＭ Ｔｒｉｍ−ＨＣｔ、 ｐＨ８，５溶液に懸
濁し、０℃で超音波破砕し遠心によシ抽出液を得だ。こ
の細胞抽出液を用いて次のようにアミノペプチダーゼ−
Ｐの活性を測定した。
２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ、 ｐＨ８，０の０．７
１ｎｌと細胞抽出液のＱ、 ｌ ｍｌと２ ｍＭのＧｌ
ｙ−Ｐｒｏ−／ＮａｐｈｔｈｙｌａｍｉｄｅのＱ、 ｌ
ｍｌとを混合し、３７℃で１０分間反応した。
１ｎｌと細胞抽出液のＱ、 ｌ ｍｌと２ ｍＭのＧｌ
ｙ−Ｐｒｏ−／ＮａｐｈｔｈｙｌａｍｉｄｅのＱ、 ｌ
ｍｌとを混合し、３７℃で１０分間反応した。
そして１００℃で２分間の熱処理により反応を停止した
後、バチルス−コアグランス由来のプロリンイミノベゾ
チダーゼ（牛丼薬品）の０．３ユニツトの０．１コを添
加し、さらに３７℃で３０分間反応した。そして１Ｍ酢
酸バッファー、ＰＨ４，０と１０チのＴｒｉｔｏｎ Ｘ
−１００からなる溶液中１吟ゼの濃度でＦａｓｔ Ｇ
ａｒｎｅｔ ＧＢＣを含む試薬をＱ、５ ｍｌ加えて発
色させた。この赤色度を５５０℃ｍの吸収で測定した。
後、バチルス−コアグランス由来のプロリンイミノベゾ
チダーゼ（牛丼薬品）の０．３ユニツトの０．１コを添
加し、さらに３７℃で３０分間反応した。そして１Ｍ酢
酸バッファー、ＰＨ４，０と１０チのＴｒｉｔｏｎ Ｘ
−１００からなる溶液中１吟ゼの濃度でＦａｓｔ Ｇ
ａｒｎｅｔ ＧＢＣを含む試薬をＱ、５ ｍｌ加えて発
色させた。この赤色度を５５０℃ｍの吸収で測定した。
その結果、表１に示すように原株ＨＢＩＯＩおよび宿主
株ＤＨＩ Ｋ比し約８倍の比活性の上昇が認められた。
株ＤＨＩ Ｋ比し約８倍の比活性の上昇が認められた。
また、この組換え菌株をｐＡＰＰｏ １／Ｉ）Ｈｌと命
名し、ＦＥＲＭ −９８２７として寄託されている。
名し、ＦＥＲＭ −９８２７として寄託されている。
まだユニットは
として表わしだ。
表
（６） ｐＡＰＰ旧の挿入ＤＮＡ部分の制限酵素地図
アミノベゾチダーゼーＰ生成に関与する遺伝情報を担う
ＤＮＡフラグメントを含むプラスミドｐＡＰＰ０１は常
法により調製された（ Ｔ、 Ｍａｎｉａ目８ｅｔ ａ
ｌ、・、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 ｐ
９３ （１９８２）、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ）。
アミノベゾチダーゼーＰ生成に関与する遺伝情報を担う
ＤＮＡフラグメントを含むプラスミドｐＡＰＰ０１は常
法により調製された（ Ｔ、 Ｍａｎｉａ目８ｅｔ ａ
ｌ、・、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 ｐ
９３ （１９８２）、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ）。
そして主として６塩基配列を認識する制限酵素での切断
により制限酵素地図を作製したところ図１に示すような
切断部位を有することが分った。
により制限酵素地図を作製したところ図１に示すような
切断部位を有することが分った。
またＰｓｔ ｌで切り出した挿入部分はほぼ４ ｋｂの
大きさであった。
大きさであった。
実施例２゜
次にｐＡＰＰＯｌの４ ｋｂの挿入フラグメントを短縮
化するために以下のような検討を行った。
化するために以下のような検討を行った。
先ずｐＡＰＰｏ １より４ ｋｂのＰｓｔ Ｉフラグメ
ントを切り出し、シラスミドｐｕｃ １９のＰｓｔ ｌ
サイトに挿入したｐＡＰＰｏ２を構築した（図２）。
ントを切り出し、シラスミドｐｕｃ １９のＰｓｔ ｌ
サイトに挿入したｐＡＰＰｏ２を構築した（図２）。
次にｐＡＰＰｏ２をＫｐｎ ｌで切断しておよそ１．７
ｋｂと７．１ ｋｂのフラグメントを調製した。すなわ
ち、ｐＡＰＰｏ２２０μｙを制限酵素Ｋｐｎ Ｉで切断
し、この反応液をエチゾウムプロマイドを含む０．９％
アガロースゲル電気泳動により１．７ｋｂと７．１ ｋ
ｂの２つのフラグメントを分離し、それぞれダルを切り
出した。このダルをそれぞれ透析チューブに入れ電気的
に透析チューブ中の９０ｍＭＴｒｉｇ−ホウ酸バッファ
ーｐＨ７，５に溶出させ、フェノール処理、クロロホル
ム処理を行い、エタノール沈澱として１．７ｋｂと７．
１ ｋｂのフラグメントをそれぞれ０．８Ｉ！ｌと５μ
ｙ回収した。
ｋｂと７．１ ｋｂのフラグメントを調製した。すなわ
ち、ｐＡＰＰｏ２２０μｙを制限酵素Ｋｐｎ Ｉで切断
し、この反応液をエチゾウムプロマイドを含む０．９％
アガロースゲル電気泳動により１．７ｋｂと７．１ ｋ
ｂの２つのフラグメントを分離し、それぞれダルを切り
出した。このダルをそれぞれ透析チューブに入れ電気的
に透析チューブ中の９０ｍＭＴｒｉｇ−ホウ酸バッファ
ーｐＨ７，５に溶出させ、フェノール処理、クロロホル
ム処理を行い、エタノール沈澱として１．７ｋｂと７．
１ ｋｂのフラグメントをそれぞれ０．８Ｉ！ｌと５μ
ｙ回収した。
次に図２に示したようＫ ７．１ ｋｂフラグメントに
ついてはそのｉｔ連結反応を行い、ｐＡＰＰｏ３を取得
した。このｐＡＰＰｏ３を形質転換したｐＡＰＰＯ３／
ＪＭ８３株は実施例１によって述べた方法でアミノベゾ
チダーゼーＰ活性の検定をしたところ療法と同じ活性し
か示さなかった（表２）。
ついてはそのｉｔ連結反応を行い、ｐＡＰＰｏ３を取得
した。このｐＡＰＰｏ３を形質転換したｐＡＰＰＯ３／
ＪＭ８３株は実施例１によって述べた方法でアミノベゾ
チダーゼーＰ活性の検定をしたところ療法と同じ活性し
か示さなかった（表２）。
１．７ｋｂのフラグメント・については、このフラグメ
ントを同じ（ｐＵｃ１９ （タカラ、市販）のＫｐｎ
Ｉ部位に連結反応により挿入しｐＡＰＰｏ４を取得した
。
ントを同じ（ｐＵｃ１９ （タカラ、市販）のＫｐｎ
Ｉ部位に連結反応により挿入しｐＡＰＰｏ４を取得した
。
このｐＡＰＰｏ ４を形質転換したｐＡＰＰＯ４／ＪＭ
８３株は表２に示すように高いアミノイプチダーゼーＰ
活性を示し、療法ＨＢＩＯＩに比し約４０倍の比活性を
示した。これらのことからアミノペプチダーゼ−Ｐ生成
に関与する遺伝情報を担うＤＮＡフラグメントはこの１
．７ｋｂのＫｐｎ Ｉ −Ｐｓｔ Ｉフラグメント中に
存在することが明らかとなった。ここに高いコピー数に
までエシェリヒア・コリ内で複製可能なｐＵＣベクター
を用いることによって著量のアミノペプチダーゼ−Ｐを
生産するｐＡＰＰＯ４／ＪＭ８３菌株を造成することに
成功した。本菌株はＦＥＲＭ−９８２８として寄託され
ている。
８３株は表２に示すように高いアミノイプチダーゼーＰ
活性を示し、療法ＨＢＩＯＩに比し約４０倍の比活性を
示した。これらのことからアミノペプチダーゼ−Ｐ生成
に関与する遺伝情報を担うＤＮＡフラグメントはこの１
．７ｋｂのＫｐｎ Ｉ −Ｐｓｔ Ｉフラグメント中に
存在することが明らかとなった。ここに高いコピー数に
までエシェリヒア・コリ内で複製可能なｐＵＣベクター
を用いることによって著量のアミノペプチダーゼ−Ｐを
生産するｐＡＰＰＯ４／ＪＭ８３菌株を造成することに
成功した。本菌株はＦＥＲＭ−９８２８として寄託され
ている。
表 ２
実施例３゜
次にｐＡＰＰｏ４のＫｐｎ Ｉ −Ｐｓｔ Ｉ １．７
ｋｂフラグメントの塩基配列を決定した。塩基配列は
Ｍ１３ファージ（Ｊ、 Ｍｅｓｓｌｎｇ ａｔ ａｔ、
、 Ｇｅｎｅ、 １９．２６９（’８２） ）を使った
ジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Ｆ。
ｋｂフラグメントの塩基配列を決定した。塩基配列は
Ｍ１３ファージ（Ｊ、 Ｍｅｓｓｌｎｇ ａｔ ａｔ、
、 Ｇｅｎｅ、 １９．２６９（’８２） ）を使った
ジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Ｆ。
Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ
、 Ａｅａｄ、 Ｓｃ１． Ｕ、Ｓ、Ａ＋７４、５４６
３（’７７） ）の方法により決定した。決定された塩
基配列およびアミノ酸配列を第３図に示しだ。ここに決
定されたアミノ酸配列は実施例２で造成したｐＡＰＰｏ
４／ＪＭ８３菌株を培養することより精製されたアミ
ノペゾチダーゼーＰ蛋白質を用いて決定されたＮ末端ア
ミノ酸部分配列２０個と一致した。
、 Ａｅａｄ、 Ｓｃ１． Ｕ、Ｓ、Ａ＋７４、５４６
３（’７７） ）の方法により決定した。決定された塩
基配列およびアミノ酸配列を第３図に示しだ。ここに決
定されたアミノ酸配列は実施例２で造成したｐＡＰＰｏ
４／ＪＭ８３菌株を培養することより精製されたアミ
ノペゾチダーゼーＰ蛋白質を用いて決定されたＮ末端ア
ミノ酸部分配列２０個と一致した。
図１はｐＡＰＰＯｌのアミノペプチダーゼ−Ｐの遺伝子
の制限酵素地図、 図２はｐＡＰＰＯｌよりｐＡＰＰＯ４の構築図、図３は
アミノペプチダーゼ−Ｐ遺伝子領域の全塩基配列とアミ
ノペプチダーゼ−Ｐのアミノ酸配列。
の制限酵素地図、 図２はｐＡＰＰＯｌよりｐＡＰＰＯ４の構築図、図３は
アミノペプチダーゼ−Ｐ遺伝子領域の全塩基配列とアミ
ノペプチダーゼ−Ｐのアミノ酸配列。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）アミノペプチダーゼ−Ｐ活性をもつポリペプチド
をコードする遺伝子。 （２）遺伝子が下記の塩基配列を有するものである第１
請求項記載の遺伝子。 【遺伝子配列があります】 （３）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における１
〜３番目のＡＴＧ配列からはじまり、該ＡＴＧ配列から
少くとも前記塩基配列における１３２１〜１３２３番目
のＣＡＡ配列までの配列ベースを有するものである第１
請求項記載の遺伝子。 （４）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における４
〜６番目のＡＧＴ配列からはじまり、該ＡＧＴ配列から
少くとも前記塩基配列における１３２１〜１３２３番目
のＣＡＡ配列までの配列ベースを有するものである第１
請求項記載の遺伝子。 （５）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における１
３２１〜１３２３番目のＣＡＡ配列で終る塩基配列のも
のである第３請求項記載の遺伝子。 （６）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における１
３２１〜１３２３番目のＣＡＡ配列で終る塩基配列のも
のである第４請求項記載の遺伝子。 （７）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における１
３２４〜１３２６番目のＴＧＡ配列で終る塩基配列のも
のである第３請求項記載の遺伝子。 （８）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における１
３２４〜１３２６番目のＴＧＡ配列で終る塩基配列のも
のである第４請求項記載の遺伝子。 （９）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における１
番目のＡからはじまり、該Ａから前記塩基配列における
１３２３番目のＡで終る配列ベースを有するものである
第１請求項記載の遺伝子。 （１０）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における
４番目のＡからはじまり、該Ａから前記塩基配列におけ
る１３２３番目のＡで終る配列ベースを有するものであ
る第１請求項記載の遺伝子。 （１１）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における
−３６７番目のＧからはじまり、該Ｇから前記塩基配列
における１４８３番目のＣで終る配列ベースを有するも
のである第１請求項記載の遺伝子。 （１２）遺伝子が、下記のアミノ酸配列（ I ）に対応
する塩基配列を有するものである第１請求項記載の遺伝
子。 （１３）遺伝子が下記のアミノ酸配列（II）に対応する
塩基配列を有するものである第１請求項記載の遺伝子。 【遺伝子配列があります】 （１４）アミノペプチダーゼ−Ｐ活性を有するポリペプ
チドをコードした遺伝子および原核生物の細胞もしくは
真核生物の細胞中で複製可能なベクターＤＮＡよりなり
、かつ該遺伝子のコード配列がプロモーター配列の下流
位置にあることを特徴とする組換えＤＮＡ。（１５）遺
伝子が、第２請求項記載の塩基配列を有するものである
第１４請求項記載の組換えＤＮＡ。 （１６）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における
１〜３番目のＡＴＧ配列からはじまり、該ＡＴＧ配列か
ら少なくとも前記塩基配列における１３２１〜１３２３
番目のＣＡＡ配列までの配列ベースを有するものである
第１４請求項記載の組換えＤＮＡ。 （１７）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における
４〜６番目のＡＧＴ配列からはじまり、該ＡＧＴ配列か
ら少なくとも前記塩基配列における１３２１〜１３２３
番目のＣＡＡ配列までの配列ベースを有するものである
第１４請求項記載の組換えＤＮＡ。 （１８）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における
１３２１〜１３２３番目のＣＡＡ配列で終る塩基配列の
ものである第１６請求項記載の組換えＤＮＡ。 （１９）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における
１３２１〜１３２３番目のＣＡＡ配列で終る塩基配列の
ものである第１７請求項記載の組換えＤＮＡ。 （２０）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における
１３２４〜１３２６番目のＴＧＡ配列で終る塩基配列の
ものである第１６請求項記載の組換えＤＮＡ。 （２１）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における
１３２４〜１３２６番目のＴＧＡ配列で終る塩基配列の
ものである第１７請求項記載の組換えＤＮＡ。 （２２）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における
１番目のＡからはじまり、該Ａから前記塩基配列におけ
る１３２３番目のＡで終る配列ベースを有するものであ
る第１４請求項記載の組換えＤＮＡ。 （２３）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における
４番目のＡからはじまり、該Ａから前記塩基配列におけ
る１３２３番目のＡで終る配列ベースを有するものであ
る第１４請求項記載の組換えＤＮＡ。 （２４）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における
−３６７番目のＧからはじまり、該Ｇから前記塩基配列
における１４８３番目のＣで終る配列ベースを有するも
のである第１４請求項記載の組換えＤＮＡ。 （２５）遺伝子が、第１２請求項記載のアミノ酸配列（
I ）に対応する塩基配列を有するものである第１４請
求項記載の組換えＤＮＡ。 （２６）遺伝子が、第１３請求項記載のアミノ酸配列（
II）に対応する塩基配列を有するものである第１４請求
項記載の組換えＤＮＡ。 （２７）原核生物の細胞株がエシェリヒア属に属するも
のである第１４請求項記載の組換えＤＮＡ。 （２８）原核生物の細胞株がエシェリヒア・コリに属す
るものである第１４請求項記載の組換えＤＮＡ。 （２９）真核生物の細胞株がサッカロミセス属に属する
ものである第１４請求項記載の組換えＤＮＡ。 （３０）真核生物の細胞株がサッカロミセス・セレビシ
ェに属するものである第１４請求項記載の組換えＤＮＡ
。 （３１）アミノペプチダーゼ−Ｐ活性を有するポリペプ
チドをコードした遺伝子および原核生物の細胞もしくは
真核生物の細胞中で複製可能なベクターＤＮＡよりなり
、かつ該遺伝子のコード配列がプロモーター配列の下流
位置にある組換えＤＮＡにより形質転換された真核生物
もしくは原核生物の細胞。 （３２）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列を有する
ものである第３１請求項記載の細胞。 （３３）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における
１〜３番目のＡＴＧ配列からはじまり、該ＡＴＧ配列か
ら少なくとも前記塩基配列における１３２１〜１３２３
番目のＣＡＡ配列までの配列ベースを有するものである
第３１請求項記載の細胞。 （３４）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における
４〜６番目のＡＧＴ配列からはじまり、該ＡＧＴ配列か
ら少なくとも前記塩基配列における１３２１〜１３２３
番目のＣＡＡ配列までの配列ベースを有するものである
第３１請求項記載の細胞。 （３５）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における
１３２１〜１３２３番目のＣＡＡ配列で終る塩基配列の
ものである第３３請求項記載の細胞。 （３６）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における
１３２１〜１３２３番目のＣＡＡ配列で終る塩基配列の
ものである第３４請求項記載の細胞。 （３７）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における
１３２４〜１３２６番目のＴＧＡ配列で終る塩基配列の
ものである第３３請求項記載の細胞。 （３８）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における
１３２４〜１３２６番目のＴＧＡ配列で終る塩基配列の
ものである第３４請求項記載の細胞。 （３９）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における
１番目のＡからはじまり、該Ａから前記塩基配列におけ
る１３２３番目のＡで終る配列ベースを有するものであ
る第３１請求項記載の細胞。 （４０）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における
４番目のＡからはじまり、該Ａから前記塩基配列におけ
る１３２３番目のＡで終る配列ベースを有するものであ
る第３１請求項記載の細胞。 （４１）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における
−３６７番目のＧからはじまり、該Ｇから前記塩基配列
における１４８３番目のＣで終る配列ベースを有するも
のである第３１請求項記載の細胞。 （４２）遺伝子が、第１２請求項記載のアミノ酸配列（
I ）に対応する塩基配列を有するものである第３１請
求項記載の細胞。 （４３）遺伝子が、第１３請求項記載のアミノ酸配列（
II）に対応する塩基配列を有するものである第３１請求
項記載の細胞。 （４４）原核生物の細胞がエシェリヒア属に属するもの
である第３１請求項記載の細胞。（４５）原核生物の細
胞がエシェリヒア・コリに属するものである第３１請求
項記載の細胞。 （４６）真核生物の細胞がサッカロミセス属に属するも
のである第３１請求項記載の細胞。 （４７）真核生物の細胞がサッカロミセス・セレビシェ
に属するものである第３１請求項記載の細胞。 （４８）アミノペプチダーゼ−Ｐ活性を有するポリペプ
チドをコードした遺伝子および原核生物の細胞もしくは
真核生物の細胞中で複製可能なベクターＤＮＡよりなり
、かつ該遺伝子のコード配列がプロモーター配列の下流
位置にある組換えＤＮＡにより形質転換された真核生物
もしくは原核生物の細胞を培地に培養し、生産されたア
ミノペプチダーゼ−Ｐを採取することを特徴とするアミ
ノペプチダーゼ−Ｐの製造法。 （４９）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列を有する
ものである第４８請求項記載の方法。 （５０）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における
１〜３番目のＡＴＧ配列からはじまり、該ＡＴＧ配列か
ら少なくとも前記塩基配列における１３２１〜１３２３
番目のＣＡＡ配列までの配列ベースを有するものである
第４８請求項記載の方法。 （５１）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における
４〜６番目のＡＧＴ配列からはじまり、該ＡＧＴ配列か
ら少なくとも前記塩基配列における１３２１〜１３２３
番目のＣＡＡ配列までの配列ベースを有するものである
第４８請求項記載の方法。 （５２）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における
１３２１〜１３２３番目のＣＡＡ配列で終る塩基配列の
ものである第５０請求項記載の方法。 （５３）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における
１３２１〜１３２３番目のＣＡＡ配列で終る塩基配列の
ものである第５１請求項記載の方法。 （５４）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における
１３２４〜１３２６番目のＴＧＡ配列で終る塩基配列の
ものである第５０請求項記載の方法。 （５５）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における
１３２４〜１３２６番目のＴＧＡ配列で終る塩基配列の
ものである第５１請求項記載の方法。 （５６）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における
１番目のＡからはじまり、該Ａから前記塩基配列におけ
る１３２３番目のＡで終る配列ベースを有するものであ
る第４８請求項記載の方法。 （５７）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における
４番目のＡからはじまり、該Ａから前記塩基配列におけ
る１３２３番目のＡで終る配列ベースを有するものであ
る第４８請求項記載の方法。 （５８）遺伝子が、第２請求項記載の塩基配列における
−３６７番目のＧからはじまり、該Ｇから前記塩基配列
における１４８３番目のＣで終る配列ベースを有するも
のである第４８請求項記載の方法。 （５９）遺伝子が、第１２請求項記載のアミノ酸配列（
I ）に対応する塩基配列を有するものである第４８請
求項記載の方法。 （６０）遺伝子が、第１３請求項記載のアミノ酸配列（
II）に対応する塩基配列を有するものである第４８請求
項記載の方法。 （６１）原核生物の細胞がエシェリヒア属に属するもの
である第４８請求項記載の方法。（６２）原核生物の細
胞がエシェリヒア・コリに属するものである第４８請求
項記載の方法。 （６３）真核生物の細胞がサッカロミセス属に属するも
のである第４８請求項記載の方法。 （６４）真核生物の細胞がサッカロミセス・セレビシェ
に属するものである第４８請求項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63156193A JP2757376B2 (ja) | 1988-03-25 | 1988-06-24 | アミノペプチダーゼーｐをコードする遺伝子、該遺伝子を有する組換えｄｎａ，該組換えｄｎａを有する生存細胞株及び該細胞を用いてアミノペプチダーゼーｐを製造する方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63-71138 | 1988-03-25 | ||
| JP7113888 | 1988-03-25 | ||
| JP63156193A JP2757376B2 (ja) | 1988-03-25 | 1988-06-24 | アミノペプチダーゼーｐをコードする遺伝子、該遺伝子を有する組換えｄｎａ，該組換えｄｎａを有する生存細胞株及び該細胞を用いてアミノペプチダーゼーｐを製造する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH022373A true JPH022373A (ja) | 1990-01-08 |
| JP2757376B2 JP2757376B2 (ja) | 1998-05-25 |
Family
ID=26412264
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63156193A Expired - Fee Related JP2757376B2 (ja) | 1988-03-25 | 1988-06-24 | アミノペプチダーゼーｐをコードする遺伝子、該遺伝子を有する組換えｄｎａ，該組換えｄｎａを有する生存細胞株及び該細胞を用いてアミノペプチダーゼーｐを製造する方法 |
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|---|---|
| JP (1) | JP2757376B2 (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62115281A (ja) * | 1985-09-20 | 1987-05-26 | シタス コ−ポレイシヨン | 細菌性ｎ−末端のメチオニンペプチダ−ゼ |
-
1988
- 1988-06-24 JP JP63156193A patent/JP2757376B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62115281A (ja) * | 1985-09-20 | 1987-05-26 | シタス コ−ポレイシヨン | 細菌性ｎ−末端のメチオニンペプチダ−ゼ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2757376B2 (ja) | 1998-05-25 |
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