JPS61502377A - ポリペプチドの製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリペプチドの製造 発明の分野 この発明は組換ＤＮＡ技法に関し、そして遺伝的に操作された真核細胞の助けに よるポリペプチドの製造、この遺伝的に操作された細胞、真核細胞を形質転換す るために有用な新規なベクター並びにこの真核細胞及びこのベクターの製造方法 、並びにベクターとしての染色体外り？ゲームＤＮＡの使用に関する。

発明の背景 原核細胞及び真核細胞を、これらの細胞によっては通常発現されないか又は同じ レベルでは発現されないポリペプチドをそれらが発現するように操作する技術は 近年大きな発展をとげた。組換ＤＮＡ工学において必要な材料は、目的ポリペプ チドをコードする構造遺伝子、この遺伝子を挿入することができるベクター、こ の遺伝子を有するこのベクターを受け入れそして増殖に際してこの遺伝子を有す るこのベクターを再生産しそして目的ポリペプチドを生産する宿主、及び多数の 酵素を含んで成る。ポリペプチド、例えばヒトインシュリン、成長ホルモン、イ ンターフェロン、組織ゾラスミノーケ９ンアクチペーター等をコードする遺伝子 が知られている。一般に使用されるベクターは特にシラスミド（染色体ＤＮＡと は独立に複製することができるＤＮＡの環状デュプレックスから成る染色体外遺 伝要素）、そしてさらにバクテリオファージ（ファージ；蛋白質壁により包囲さ れたＤＮＡの線状デュプレックスから成る細菌ウィルス）、及びコスミド（ファ ージ粒子中に詰められたシラスミドＤＮＡ　）である。使用される宿主は原核性 （核を有しない）又は真核性（核を有する）細胞、例えば、原核生物、例えば細 菌、例えばニジエリシャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）、ある いは真核性の酵母、例えばサツカロミセス・セレビシェ−しくけヒトの細胞であ る。重要な酵素はＤＮＡポリメラーゼ（単鎖ＤＮＡを２本鎖形に転換するため） 、逆転写酵素（メツセンジャーＲＮＡ鋳型に対する相補的ＤＮＡを合成するだめ ）、ＲＮＡポリメラーゼ（２本鎖ＤＮＡの放射性ＲＮＡコピーを調製するため） 、ターミナルトランスフェラーゼ（ＤＮＡデュプレックスの３′−末端にオリゴ デオキシヌクレオチドティ／Ｌ’　全付加するため）、ＤＮＡすｊ−ゼ（ＤＮＡ デュプレックス中の単鎖ニックをシールするため、及び平滑末端ＤＮＡデュプレ ックスを共有結合的に連結するため）、制限エンドヌクレアーゼ（ＤＮＡデュプ レックスを所望の配列において切断するため）、ＤＮアーゼＩ（２本鎖ＤＮＡを 非常に限定的に処理してニックを導入するため）、ヌクレアーゼ（例えばＳ工、 単鎖核酸を破壊するため）、エキソヌクレアーゼ（デュプレックスＤＮＡの末端 からヌクレオチドを除去するため）、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＡＴＰからの γ−Ｐの転移によってポリヌクレオチドの５′−末端をラベルするため）、及び エリＡポリメラーゼ（ＡＴＰからＲＮＡの遊離３′−ヒドロキシル基への贋の重 合のため）である。

組換ＤＮＡ技法における主要な段階は、ａ）対応するｍＲＮＡからの逆転写によ り、全ＤＮＡからショットガンクローニングにより又は化樟合成により調製する ことができる、目的ベグチドをコーｒする構造遺伝子の調製、 ｂ）適当なベクターへの前記の得られた遺伝子の、上記の種々の酵素による導入 、 Ｃ）前記遺伝子を担持する新しく造成されたベクターの受容体宿主への移行（形 質転換）、ｄ）形質転換された宿主のみが生存する条件下で培養することにより 一般に行われる、未形質転換宿主からの形質転換された宿主の選択、 ｅ）外来性構造遺伝子の発現を許容する条件下での選択された形質転換宿主の培 養、及び所望によシ、ｆ）発現された。ｉ？　ＩＪ　、２プチドの単離及び精製 、を含んで成る。

主要な段階の各々は１又は複数の単位段階から成り、そしてこれらの段階を実施 するための多くの変法が知られている。組換ＤＮＡ技法による目的ポリペプチド の好結果の製造並びに最終的には単離及び精製のため、多段合成の各段階は注意 深く計画されそして実施されなければならない。一般的な概念は知られているが 、多くの予見できない落し穴や欠点が目ざすゴールへの到達を妨害するかもしれ ない。困難は主として、生細胞が外来性構造遺伝子を受け入れ、それを対応する ｍＲＮＡに転写し、そして後者を目的ポリペプチドに翻訳することを強制された 場合に、その細胞が予見できない挙動をすることによる。

欠点の１つは、細胞が外来性要素を排除する傾向を有することである。形質転換 された細胞を未形質転換細胞から選択するため、及び培養中に後者が現われるこ とを防止するために、外来性構造遺伝子を有するベクターは、未形質転換細胞が 生存できない条件下で形質転換細胞の生存を可能にする表現型形質をコードする 発現可能なりＮＡを含有しなければならない。細胞のためのこのような選択マー カーＤＮＡは例ｉば、アンピシリン又はテトラサイクリンに対する耐性を提供す るＤＮＡであり、そして酵母、例えハサッカロミセス・セレビシェ−のためには 、栄養要求性遺伝的背景中で生存をもたらす遺伝子、例えばＬＥＵ　２又はＨＩ Ｓ　３である。

多段合成中の１又は複数の段階を改良する幾つかの新規な手段もしくは方法又は これらの改良が当業者により感謝されるであろう。なぜなら、このような任意に 選択できる方法は完全合成の改良の可能性を提供するからである。従って、選択 マーカーＤＮＡを必要とせず、そして今まで知られてるベクターによっては形質 転換され得ない細胞の形質転換のために使用され得るベクターを手にすることが 非常に望ましいであろう。

染色体外リポゾームＤＮＡ（ｒＤＮＡ　）の部分が酵母ベクター造成において使 用されている（３５）。しかしながら、完全な染色体外ｒＤＮＡ分子は今までベ クターとして使用されていない。このような染色体外ＤＮＡ要素はり？シームＲ ＮＡをコードする遺伝子を担持する。

これらは、多数の下等真核生物、例えば非細胞スラている〔概観するためには、 Ｂｒａｕｎ　ｒ　Ｒ，及び５ｅｅｂｅｃｋ　ｒ　Ｔ、　（１）、並びにＬｏｎｇ 、Ｅ、Ｏ，及びＤａｖ　ｉ　ｄ　（２）を参照のこと〕。染色体外ｒＤＮＡ分子 は染色体から独立して複製し、そして生物体の有糸分裂サイクルにわたって存在 する。これらは細胞及びその核と関連して安定に維持され、これらは間期（１ｎ ｔｅｒｐｈａｓｅ）の間はとんど独占的に含有される。

ＤＮＡの小片の自律複製が下等生物、例えば酵母においてしばしば達成された。

しかしながらこのような配列の安定性は一般に貧弱である。例えば酵母において は、選択圧の非存在下では、このような配列は原則として２０〜４０世代の間に 失われる。このようなりＮＡ分子の安定性は、動原体から生ずる配列がそれに連 結される場合に改良され得る。しかしながら、このような動原体配列は異種（ｈ ｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）系においては安定性を有しないと予想される。

従って、染色体外要素は異種性細胞中で安定に受け継がれるようには考えられな かった。

驚くべきことに、染色体外ｒＤＮＡがベクターとして有用であることが見出され た。植物細胞を包含する真核細胞において高い形質転換率を有し、そして増殖中 に細胞と関連して安定に維持されることが見出この発明の目的は、外来性遺伝子 を真核細胞に導入するためのベクターとして染色体外ｒＤＮＡを使用し、染色体 外ｒＤＮＡとベゾチドをコードする外来性遺伝子とから成る新規なベクターを提 供することであり、この新規なベクターは驚くべきことにそれにより形質転換さ れた真核細胞、さらに異種性真核細胞と関連して安定に維持され、そして細胞の 複製中に失われない。

形質転換率が非常に高く、そして細胞の複製中にベクターが失われないので、ベ クターに選択マーカー　ＤＮＡを設ける必要がない。

この発明の他の目的は、新規なベクターによシ形質転換された真核細胞を提供す ることである。

この発明の他の対象は、前記ベクター及び前記形質転換された真核細胞の製造方 法、並びにポリペプチドの製造方法におけるそれらの使用である。

ドするＤＮＡ　（挿入部）を真核細胞に導入することができるＤＮＡ　０ 染色体外ＩＪ　、ｉ？フレームＮＡ（ｒＤＮＡ）　：単細胞真核生物中に染色体 外に見出され、リポゾームＲＮＡをコードする１又は複数の遺伝子を担持し、そ して自律的に（染色体の複製から独立して）複製するＤＮＡ　。

パリンドロームＤＮＡ　：　１又は複数の対称中心を有するＤＮＡ分子。

以込：デオキシリビ核酸。

挿入部：構造遺伝子及び場合によっては追加のＤＮＡ配列から成り、ｒＤＮＡに とって外来性のＤＮＡ配列。

構造遺伝子：ポリペプチドをコードし、適当なプロモーター、終止配列及び場合 によっては他の制御ＤＮＡ配列を具備しており、そして正しいリーディングフレ ームを有する遺伝子。

ブロモ−ター：転写を開始するためにＲＮＡ　ｙｊ？　ＩＪメラーゼがそれに結 合するＤＮＡＮ玉鎖上識部位。

シグナル配列：、１＝リペグチドに付加されておシ、該ポリペプチドをエンドプ ラズムレティクラムに結び付け、そして蛋白質の分泌のために必須のアミノ酸配 列をコードするＤＮＡコード配列。

（選択）遺伝マーカー：未形質転換細胞から形質転換された細胞を選択すること ができる表現型形質この発明は、染色体外ＩＪ　、ｌ−’シームＤＮＡ（ｒＤＮ Ａ）又はその機能的断片、並びにポリペプチドをコードする外来性構造遺伝子及 び場合によっては追加のＤＮＡ配列を含有する挿入部を含んで成る真核性バイブ リドベクターに関する。

この発明はさらに、外来性遺伝子の真核細胞への導入のためのベクターとしての 、染色体外リボゾームＤＮＡ又はその機能的断片の使用に関する。

この発明のバイブリドベクターの造成において有用な染色体外ｒＤＮＡは知られ ており、そして種々の単細胞真核生物から、特に２つの門すなわちサコロマ５ｐ ｅｃｉｅ８　）、バラメジウム・スペシス（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ観のためには １及び２を参照のこと）。染色体外ｒＤＮＡ源は容易に入手できる（３）。

染色体外ｒＤＮＡは・ヤリンドローム性又は時として非・ぐリントローム性分子 であり、これは環状であることができるが、しかしながらほとんどの場合線状で ある。それが小枝（゛遺伝的”核）であるか大枝（パ代謝″核）であるかに依存 して、１個の真核細胞核中に１個又は複数のコピーが存在する。ｒＲＮＡのだめ の転写ユニットは中断されていてもよい。染色体外ｒＤＮＡは、例えば塩化セシ ウム（ＣｓＣｔ）を用いる平衡密度遠心のごとき常法により、その分離源から単 離される。

染色体外ｒＤＮＡの機能的断片は、選択を必要としない程高い形質転換効率、安 定性及び／又は複製機能を保持しているＤＮＡセグメントである。このような断 片は、種々の制限酵素、例えばＢｇｌ　ＩＩ、Ｂａｍ　ＨＩ　％Ｔａｑ　１等に より、そして場合によっては次に例えばアガロースゲル電気泳動によシ分離する ことによって得ることができる。フィデルム・ポリセファルムの染色体外ｒＤＮ Ａの制限地図は参照分献（３１）に開示されている。

挿入部の外来性構造遺伝子は、グリコジル化されたポリペプチドを包含する種々 のポリペプチド、例えば栄養素を製造するため及び化学において酵素反応を行う ために使用することができる酵素、又は非酵素性ポＩＪ　ｄプチド、例えばホル モン、免疫調節性、抗ウイルス性及び抗腫瘍性を有するポリペプチド、抗体、種 々の抗原、ワクチン、凝固因子、食料等をコードするＤＮＡである。このような ポリペプチドの例には、インシュリン、成長ホルモン、リンフ才力イン、抗−レ ニン抗体、ンマトスタチン、及び特にインターフェロン、例えばα−１β−又は γ−型のヒト−インターフェロン、例えばヒトー白血球インターフェロン、ヒト ー線維芽細胞インターフェロン、ヒト−リンパ芽球性インターフェロン、ヒト免 疫インターフェロン、肝炎表面抗原等がある。１例として、構造遺伝子はヒトー 組織ゾラスミノーグンアクチベータ−（ＴＰＡ）をコードする。

たらし、あるいは植物全体又はその部分Ｏ成長を改良する。

構造遺伝子は追加のＤＮＡ配列、好ましくはプロモーター及び／又は他の制御配 列に連結することができ、これらは受容体細胞に依存して選択されなければなら ない。

例えば、受容体細胞が酵母であれば、好ましくは高度に発現される酵母の遺伝子 の、例えばサツカロミセス・セレビシェ−のプロモーターが使用さジル。

すなわち、ＴＲＰ　１遺伝子、ＡＤＨＩ又はＡＤＨＩＩ遺伝子、酸性ホスファタ ーゼ（耶曵又は立並）遺伝子、又ハチトクローム遺伝子のプロモーター、あるい は解糖経路に関与するプロモーター、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド− ３−ホスフェートデヒドログ（ＰＧＫ）　、ヘキソキナーゼ、ピルベートデヒド ロゲナーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフエードイソメラ ーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホス フェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼの遺 伝子のプロモーター、を使用することができる。この発明の好ましいベクターは 、転写調製を伴うプロモーター、例えば増殖条件の変更によってターンオン又は ターンオフすることができるＰＨ０５遺伝子、ヨ」遺伝子、及び増加又は減少す るだけで抑制され又は抑制解除されプロモーター、例えばＨＴＬＶ　ＸＳＶ４０ 、ワクシニアプロモーター等である。植物プロモーターは、例えばＴｉシラスミ ド又はカリフラワーモザイクウィルスのそれである。

プロモーターは、ｍＲＮＡのそしてそれ故にポＩＪ−ｅ７’チドの効果的な発現 を保証するように構造遺伝子のコード領域に作用可能に連結される。

この発明のベクターの挿入部に場合によっては含まれる他の配列に例えばシグナ ル配列、例えばゾロモーターに天然に連結されているそれ、例えばＰ）（０５シ グナル配列、又はポリペプチドに天然に連結されているそれ、例えばＴＰＡシグ ナル配列、あるいは酵母インベルターゼ又はα−ファクター遺伝子のシグナル配 列である。他方、プロモーターに天然に連結されているシグナル配列の部分とポ リにプチドシグナル配列の部分との連結により融合シグナル配列を造成すること ができる。

この発明のバイブリドベクターはまた、プロモーターの機能のためには必須では ないか又は重要ではないがしかし例えば該バイブリドベクターにより形質転換さ れた細胞の増殖において重要な機能を発揮する追加のＤＮＡ配列を含有すること ができる。このような追加のＤＮＡ配列は原核細胞及び／又は真核細胞に由来し 、そして染色体ＤＮＡ配列及び／又は染色体外ＤＮＡ配列を包含することができ る。例えば、追加のＤＮＡ配列は、プラスミドＤＮＡ　、例えば原核性又は真核 性シラスミドＤＮＡ　、ウィルスＤＮＡ及び／又は染色体ＤＮＡ　、例えば細菌 性、酵母性又は高等真核性染色体ＤＮＡ　、特に細菌プラスミド、例えばニジエ リシャ・コリのグラスミドｐＢＲ３２２又は関連プラスミド、バクテリオファー ジλ、酵母２μプラスミド、及び／又は酵母染色体ＤＮＡに由来し、又はこれら から成ることができる。

追加のＤＮＡ配列は複製開始点及び／又は選択遺伝マーカーを担持することがで きる。

場合によっては、マーカーの表現型発現に基いて形質転換体の選択を促進する遺 伝マーカーを使用することができる。適当なマーカーは特に、抗生物質耐性を発 現するそれ、又は栄養要求変異体の場合には宿主の障害を補完する遺伝子である 。対応する遺伝子は、例えば、抗生物質シクロヘキシミドに対する耐性を付与し 、又は栄養要求変異体に原栄養性をもたらす。

染色体外ｒＤＮＡの・クリンドローム性の観点から、この発明のバイブリドベク ターは１個又は複数個、特に２個の挿入部を含有することができ、これらの挿入 部は対称中心の右及び／又は左に挿入される。

ｒＤＮＡ中の挿入部の読みの方向は外側から内側へでも又はその逆であってもよ い。制限部位が染色体外ｒＤＮＡを３個又はそれより多くのセグメントに分割す る。例えば、フィザルム・ポリセファルムのｒＤＮＡの対称中心の各部位上に２ 個のＢｇｌ　ＩＩ　、２個のＨｉｎｄ■、２個のＥｃｏＲＩｓ及び２個のＨａ址 Ｉの制限部位が存在し、従って前記ｒＤＮＡは３個〜５個のセグメントに分割す ることができる。挿入部は制限部位により形成される２個のセグメントの間に位 置し、好ましくは対称中心から一層離れた制限部位に位置する。

この発明のｊＬ娠注性バイブリドベクター、構造遺伝子及び場合によっては追加 のＤＮＡ配列を含有する挿入部が染色体外ｒ　ＲＮＡ又はその機能的断片に導入 されるように、常法に従って調製される。

インビトロ法は、ｒＤＮＡを適当な制限酵素により断片に切断し、そして、必要 であれば適切なリンカｉを付加しそして／又はセグメント及び挿入部の末端を他 の常法により好結果の連結が得られるように調製した後、セグメントと挿入部を 連結することから成る。

イン−ビトロでＤＮＡを連結するために種々の技法が使用される。幾つかの制限 エンドヌクレアーゼにより形成される平滑末端（完全に塩基対を成しているＤＮ Ａ　７’ニゲレツクス）はＴ　４　ＤＮＡ　ＩＪガーゼにより直接に連結するこ とができる。さらに一般的には、ＤＮＡはその単鎖接着末端を介してリンクされ 、そしてＤＮＡ　ＩＪガーゼ、例えばＴ　４　ＤＮＡ　！Ｊガーゼにょシ共有結 合的に閉じられる。このような単鎖接着末端は、ずれた末端を生成せしめるエン ドヌクレアーゼによってＤＮＡを切断することにより形成することができる（　 ＤＮＡデュゾレックスの２本の鎖が数ヌクレオチド離れた異る点において切断さ れる）。単鎖はまた、ターミナルトランスフェラーゼを用いて平滑末端又はずれ のある末端にヌクレオチドを付加することによりパホモポリマーティリング、あ るいは適当なエキソヌクレアーゼ、例えばλ−エキソヌクレアーゼにより平滑末 端ＤＮＡの１つの鎖を単に消化することによって形成することもできる。ずれの ある末端を形成するだめの他の方法は、平滑末端ＤＮＡに、ずれのある末端を形 成するエンドヌクレアーゼのだめの認識部位を含有する化学合成リンカ−ＤＮＡ を連結し、そして生ずるＤＮＡを対応するエンドヌクレアーゼで消化することか ら成る。

効率的に発現されるためには、構造遺伝子は、転写機能を含む配列（７°ロモー ター）及び翻訳機能を含む配列（リテゾーム結合部位）に対して適切に位置しな ければならない。さらに、真核性バイブリドベクターの造成は、それが正しい転 写の開始及び停止を可能にする。ようになされなければならない。

目的とする真核細胞ベクターを含有する連結混合物は形質転換段階において、又 はケ゛ル電気泳動により目的ベクターを濃縮した後に使用される。

制限ヌクレアーゼで処理した後に得られるｒＤＮＡセグメントは挿入ＤＮＡとの 連結実験において混合物として使用することができ、又は他の方法として、個々 の断片へのクロマトグラフ分離の後、段階的連結を行うことが可能である。例え ば、後者の場合、ｒＤＮＡを例えばＢｇｌ　１７で消化した後、大ＤＮＡセグメ ント及び２個の小ＤＮＡセグメントを分離し、この後挿入部をまず大セグメント に連結し、次に小断片を連結する。これに代る方法として、挿入部をまず小セグ メントに連結し、そして第２段階においてｒＤＮＡの大セグメントに連結する。

染色体外ｒＤＮＡへの挿入部の導入はまたインービ？で、すなわち完全なｒＤＮ Ａで形質転換された細胞、例えば細菌、動物、植物又は特に酵母の細胞中で行う こともできる。この目的のため、細胞、例えばサツカロミセス・セレビシェ−を 下記のようにして全ｒＤＮＡで形質転換し、この後この形質転換された細胞を、 外来性構造遺伝子、場合によっては制御プロモーター及び停止配列、並びにｒＤ ＮＡ制限部位からのフランキングｒＤＮＡ配列を含有する挿入部ＤＮＡによシ形 質転換する。全ｒＤＮＡ及び条件が調えられた挿入部による形質転換を同時に行 うこともできる。

形質転換の後、ｒＤＮＡ及び挿入配列の両者は細胞内で相同性組換により連結さ れる。

形質転換体の検出を促進するため、同時形質転換技法を適用することができ、こ れによって例えば同時形質転換シラスミドＹｅｐ　１３を使用することができる （３２）。

目的とするバイブリドベクターを含有する細胞のスクリーニング及び選択の後、 該ベクターを単離し、そして他の細胞を形質転換するだめに使用することができ 、あるいは細胞−細胞融合により直接に移行させることができる。

この発明の他の観点は、？リペプチドを生産することができる形質転換された真 核細胞の製造方法を含み、この方法は１章に記載した真核性ノ・イブリドベクタ ーにより真核細胞を形質転換することを含んで成る。

このバイブリドベクターのだめの受容体として任意の真核細胞を使用することが できる。例として、真核性菌類、例えば酵母、アスペルギルスｓｐ。

ｓｐ−）、ペニシリウムｓｐ、（Ｐｅｎｊｃｉｌｌｉｕｍ　ｓｐ、　）、セファ ロスポリウムｓｐ、　（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｓｐ　）、ムコ−Ａ／ 　８Ｐ　（Ｍｕｃｏｒ　ａｐ。）、特ニサッカロミセス・セレビ７　ス”！　ｋ 　キｋ　ス−＝ガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　）、ｃｈｒｙｓｏ ｇｅｎｕｍ　）　、又はセファロスポリウム・アクレれる。この発明のバイブリ ドベクターはまた、すべての植物、特に分類上の群、被子植物門（Ａｎｇｊｏｓ ｐｅｒｍａｅ）及び裸子植物門（Ｇｙｍｎｏｓｐｅｒｍａｅ　）のそれの形質転 換のためにも適当である。

裸子植物門の内、球果植物網（Ｃｏｎ１ｆｅｒａｅ　）の植物が特に興味深い。

被子植物門の内、特に興味ある植物は、落葉樹及び潅木に加えて、次の植物、す なわちナス科（５ｏｌａｎａｃｅａｅ　）　、アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａ ｅ　）、キク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ　）、ユリ科（Ｌｉ１ｉａｃｅａｅ　） 、ブドウ科（Ｖｉｔａｃｅａｅ　）、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ 　）、ミカン科（Ｒｕｔａｃｅａｅ　）　、パイナツプル科（Ｂｒｏｍｅｌｉａ ｃｅａｅ　）　、アカネ科（Ｒｇｂｉａｃｅａｅ　）、ツバキ科（Ｔｈｅａｃｅ ａｅ　）　、バショウ科（Ｍｕｓａｃｅａｅ　）又はイネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａ ｅ　）の植物、及びマメ目（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ　）　、特にマメ科（Ｐａ ｐｉｌｉｏｎａｃｅａｅ　）の植物である。好ましい植物は、ナスｉＡｌ、、Ｓ 　ｏ　１　ａ　ｎ　ａ　ｃ　ｅ　ａ　ｅ　’）。

アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ　）及びイネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）を代 表するものである。

特に、ニコチアナ（Ｎ１ｃｏｔｉａｎａ　）　、＜チュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ　 ）、ヒョシアムス（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ　）、ブラッシ力（Ｂｒａｓｓｉｃａ 　）及びロリウム（Ｌｏｌｉｕｍ）の種、例えばニコチアナ・タバクム（Ｎ１ｃ ｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ　）、ニコチアナ・ゾルムパグニホＩＪ　７　（ Ｎｉｃｏｔｉａｎａｐｌｕｍｂａｇｅｎｉｆｏｌｉａ　）　、ペチュニア・ヒブ リダ（Ｐｅｔｕｎｉａ　ｈｙｂｒｉｄａ　）　、ヒョシアムス・ムチクス（Ｈｙ ｏｇｃｙａｍｕｓ　ｍｕｔｉｃｕｓ　）、プランシカーナプス（Ｂｒａｓｓｉｃ ａ　ｎａｐｕａ　）　、プラクシカ０ラバ（Ｂｒａｓａｉｃａｒａｐａ）、及ヒ ロリウム・ムルチフロルム（Ｌｏｌｉｕｍｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ　）が挙げら れる。

植物細胞の形質転換の分野においては、特に高収量栽培植物、例えばトウモロコ シ、米、小麦、大麦、ライ麦、オート麦及びキビ類に関心が集中している。

原形質体からの再生によって製造することができるすべての植物をこの発明のバ イブリドベクターによシ形質転換することができる。今まで、穀類を含ことはで きなかった。穀類細胞を包含するイネ科植物の細胞をこの発明のバイブリドベク ターにより形質転換することができることを示すことができる。

同様にして、世界的には合計収穫量及び栽培面積は少いとしても、ソラヌム（Ｓ ｏｌａｎｕｍ　）属、ニコチアナ属、ブラッシカ属、ベータ（Ｂｅｔａ　）　、 ビスム（Ｐｉｓｕｍ　）　、ファセオルス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　）、グリシン （Ｇｌｙｃｉｎｅ　）、へりアンサス（Ｈｅ１ｉａｎｔｈｕｓ　）、アリウム（ ＡＡｌｌｌｕ　）　、小麦、大麦、オート、セタリア（５ｅｔａｒｉａ　）、菜 種、米、シトニア（Ｃｙｄｏｎｉａ　）、ピルス（Ｐｙｒｕｓ　）、マルス（Ｍ ａｌｕｓ　）、ルプス（Ｒｕｂｓ　）、７ラガリア（Ｆｒａｇａｒｉａ　）、プ ルヌス（Ｐｒｕｎｕｓ　）、アラキス（Ａｒａｃｈｉｓ　）、セヵレ（Ｓｅｃａ ｌｅ）、！９ニカム（Ｐａｎｉｃｕｍ　）、サッヵルム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ　 ）、コツエア（Ｃｏｆｆｅａ　）、カメリア（ＣａｍｅｌＬｉａ　）、ムサ（Ｍ ｕｓａ　）、アナナス（Ａｎａｎａｓ　）、ピチス（Ｖｉｔｉｓ）又はシトラス （Ｃ１ｔｒｕｓ　）の栽培植物の形質転換が可能であり、そして望ましい。

アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ　）の内、ブラック力（Ｂｒａｇｓｉｃａ　 ）属、例えば菜種、黒カラン及び白カラン、並びにキャベツ及びビート、例えば 、ブラック力１う／’？　（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｒａｐａ　）、特にブラック力 。う／４１ｅＶジャストライト（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｒａｐａ　ａｙ　Ｊｕｓｔ Ｒｉｇｈｔ　）が特に挙げられる。

真核細胞の他の例は無を椎動物、特に昆虫、例えｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ　） 、並びにを椎動物、特に哺乳動物細胞、例えばＨｅＬａ細胞、チャイニーズハム スター卵巣細胞、Ｔ−及びＢ−細胞ハイブリドーマ、黒色腫細胞、例えば？ウェ ス（Ｂｏｗｅｓ　）黒色腫等に由来する。

真核性バイブリドベクターにょる真核細胞の形質転換は当業界において知られて いる方法によって行われる。

この発明はまた、この発明の形質転換された真核細胞の製造方法に関し、この方 法は形質転換可能な真核細胞を形質転換条件下で真核性バイブリドベクターで処 理することを特徴とする 特に、この発明の方法は、 ａ）細胞壁を有する真核細胞の形質転換のため、細胞壁を除去し、そして得られ た細胞壁を有しないスフェロプラスト又は原形質体（ｆロトプラスト）を、例え ばポリエチレングリコール（ＰＥＧ　）及びＣａ２＋イオンの存在下で真核性バ イブリドベクターで処理し；あるいは、 ｂ）細胞壁を有しない真核細胞の形質転換のために、受容体細胞上へのベクター ＤＮＡのリン酸カルシウム沈澱により、真核細胞を真核性バイブリドベクターで 処理し； そして所望により、細胞壁を再生せしめ、そして形質転換された細胞を選択し又 はスクリーニングする；ことを特徴とする。

菌類及び植物細胞の細胞壁を消化しそしてそれによって形質転換可能な細胞を調 製するために、種々の酵素が知られている。グルコシダーゼ、例えばカタツムリ 腸液（５ｎａｉｌ　ｇｕｔ　ｊｕｔｅｓ　）　（例えば、グルスラーゼ（Ｇｌｕ ｓｕｌａｓｅ　；商標）もしくはヘリカーゼ（Ｈｅ１ｉｃａｓｅ　；商標）、又 は微生物から得られる酵素混合物〔例えば、チモリアーゼ（Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ 　：商標）が好ましく、これらは浸透圧的に安定した溶液（例えば１Ｍマンニト ール）中で使用される。

この発明の真核性バイブリドベクターによる、細胞壁を有しない細胞及びスフェ ロプラスト（菌類）又は原形質体（植物）の形質転換は、ベクターを含有する全 連結混合物により又はベクターを濃縮した後に達成することができ、そして当業 界において知られている一般的な方法により、例えば酵母についてはｔ（ｉｎｎ ｅｎ等、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　、　ＵＳＡ　＊　７５ 　＋１９２９（１９７８）により記載されている方法によシ行う。

原形質体、細胞培養物の細胞、植物組織中の細胞、花粉、花粉管、卵細胞、胚の り又は種々の発達段階の接合体及び胚が、形質転換のための適切な出発材単離さ れた植物原形質体、細胞又は組織は、それ自体公知の方法により、又は公知の方 法に類似する方法によシ得ることができる。

単離された細胞及び組織を得るための適当な出発材料である単離された植物原形 質体は、植物の任意の部分、例えば葉、胚、茎、花、根又は花粉から得ることが できる。葉の原形質体を使用するのが好ましい。単離された原形質体はまた細胞 培養物からも得られる。原形質体を単離する方法は、例えばＧａｍｂｏｒｇ　、 　Ｏ，Ｌ、及びＷｅｔｔｅｒ　、　Ｌ、Ｒ，＋　Ｐｌａｎｔ　Ｔｉ５ｓｕｅＣｕ ｌｔｕｒｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　、　１９７５　、１１−２１に記載されている。

新規なバイブリドベクターの植物細胞への移行は、植物に感染せしめるための天 然系、例えば植物細菌、植物ウィルス、又は昆虫もしくは植物病原菌による移送 を用いないで、直接性われる。これは、ベクター及び植物原形質体を適当な溶液 に導入し、そしてこれらをその中に、ベクターが原形質体に取り込まれるまで保 持することにより、形質転換することが望所される植物細胞を移送されるべきバ イブリドベクターで直接処理することにより達成される。この段階を、遺伝子の 移行のだめの微生物学的研究において使用される技法と組み合わせることにより 、例えばポリーＬ−オルニチンもしくはポリーＬ−リジンによる処理、リポゾー ム融合、、　ＤＮＡ蛋白質複合体形成、原形質膜における電荷の変更、微生物原 形質体との融合、又はリン酸カルシウム同時沈澱、ヒートショック又はエレクト ロポレーション（ｅｒｅｃｔｒｏ−ｐｏｒａｔｉｏｎ　）と組み合わせることに より、そして特にポリエチレングリコールによる処理、ヒートショック及びエレ クトロポレーションによシ、形質転換頻度を改良することができる。さらに、最 後に記載した３つの技法の組合わせを用いることができる。

バイブリドベクター及び受容体原形質体がその中に導入される適当な溶液は、好 ましくは、原形質体培養のために使用される浸透圧的に安定化された培地である 。個々の成分又は成分群を異にする多くの培地がすでに入手可能である。しかし ながら、すべての培地の組成は次の原則に従う。すなわち、これらは、約１０ｍ ９／ｌ〜数百ｍ９／１３の濃範囲の１群の無機イオン（いわゆる多量要素、例え ばニトレート、ホスフェート、サルフェート、カリウム、マグネシウム、鉄）、 最大濃度が数■々である他の群の無機イオン（いわゆる微量要素、例えばコバル ト、亜鉛、銅、マンガン）、次に多数のビタミン（例えば、イノシトール、葉酸 、チアミン）、エネルギー及び炭素源、例えばシュークロース又はグルコース、 そしてさらに０．０１〜１０　ｍ９／ｌの濃度範囲のオーキシン及びサイトカイ ニン類の天然又は合成植物ホルモンの形の成長調節剤を含有する。培地はさらに 、糖アルコール（例えばマンニトール）もしくは糖（例えばグルコース）又は塩 イオン（例えばＣａＣ２２）により浸透圧的に安定化され、そして５．６〜６． ５の範囲のｐ＋（に調整される。

常用の培地の一層詳細な記載は、例えばＫｏｂｌｉｔｚ　ｒ）Ｌ　、　Ｍｅｔｈ ｏｄｉｓｃｈｅ　Ａｓｐｅｋｔｅ　ｄｅｒ　Ｚｅｌｌ　ｕｎｄ　Ｇｅｗｅｂｅｚ ’ｕｃｈｔｕｎｇｂｅｉ　Ｇｒａｍｉｎｅｅｎ　ｕｎｔｅｒ　ｂｅｓｏｎｄｅｒ ｅｒ　ＢｅｒＭｃｋｓｉｃｈｔｉｇｕｎｇｄｅｒ　Ｇｅｔｒｅｉｄｅ　、　Ｋｕ ｌｔｕｒｐｆｌａｎｚｅ　ＸＸＬ　１９７４　ｒ　９３　−１５７に見出される 。

酵母スフェロプラスト及び植物細胞原形質体のために特に適当な形質転換技法は “ポリエチレングリコール処理”であり、ここで、この発明の範囲内で″ポリエ チレングリコール”とはポリエチレングリコールそれ自体のみならず、原形質膜 を同様に変形しそして例えば細胞融合の分野において使用されるすべての物質の ための一般的用語として理解されよう。従ってこの用語はまた、一層長い鎖長の 他の多価アルコール、例えばポリプロピレングリコール（４２５〜４０００ｇ／ ｒｒＩＯ１ｅ）、ポリビニルアルコール、又はヒドロキシル基が部分的にもしく は完全にエーテル化されている多価アルコール、及び農業において一般に使用さ れておりそして植物により耐えられそして例えば次の刊行物：　”　Ｍｅ　Ｃｕ ｔｃｈｅｏｎ’ｓＤｅｔｅｒｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ　Ａ ｎｎｕａｌ　’　＋　Ｍ　Ｃパプリッシワグ社、リツ・ゾウード、ニュー・シャ ーシー。

１９８１　；　５ｔａｃｈｅ　ＨＫ　ｒ　’　Ｔｅｎ５ｉｄ−Ｔａｓｃｈｅｎｂ ｕｃｈ　’　。

カールハンサーフェルラーク、ミュニッヒ／ピエナ。

１９８１　、に記載されている洗剤を包含する。

ポリエチレングリコールそれ自体を使用する場合、１０００〜１０，０００　、 ｊ９／ｍｏｌｅ、好ましくは３０００〜８０００　ｇ／ｒｎｏｌｅの範囲の分子 量を有するポリエチレングリコールを使用するのが好ましい。

上記の物質の内、ポリエチレングリコール自体を使用するのが好ましい。

ポリエチレングリコール処理においては、原形質体の懸濁液を培地に加えそして 次にポリエチレングリコールと培地との混合物中のベクターを加えるか、又は好 ましくは、原形質体及びベクターをまず培地に加えそして次にポリエチレングリ コールを加えるか、いずれかの方法により行うことができる。

この発明のバイブリドベクターを用いて、上記の方法によシ驚くほど高く且つ再 現性ある形質転換頻度が達成される。しかしながら、この頻度は後にさらに詳細 に記載する適切な方法によりさらに改良されよう。

エレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎ　＋　Ｅ、等ｒ　ＴｈｅＥＭＢＯＪｏ ｕｒｎａｌヱ、８４１−８４５（１９８２））においては、原形質体が等張渡（ ｏｓｍｏｔｉｃｕｍ　）　、例えばマンニトール／マグネシウム溶液に移され、 そして原形質体懸濁液が電極間のエレクトロボレーター室に導入される。懸濁液 に対してコンデンサーを放電することにより、原形質体が高電圧短時間の電気的 インパルスにかけられ、それによって原形質膜の極性化及び膜中の開孔が行われ る。

熱処理においては、原形質体が等張渡、例えばマンニトール／塩化カリシウムの 溶液に懸濁され、そしてこの懸濁液が好ましくは水溶中、小容器例えば遠心管中 で加熱される。加熱時間は選択された温度に依存するであろう。一般に、この値 は４０℃１時間〜８０Ｃ１秒間の範囲である。４５℃５分間において最適の結果 が得られる。次に、懸濁液を室温又はそれよシ低温に冷却する。

さらに、細胞外ヌクレアーゼを不活性化することによって形質転換効率が増加さ れ得ることが見出された。このような不活性化は、植物により耐えられる２価陽 イオン、例えばマグネシウム又はカルシウムを用いて、そしてまた、好ましくは 高い…値（最適−範囲９〜１，０．５である）において形質転換を行うことによ って実施することができる。

驚くべきことに、この発明のバイブリドベクターの使用が、遺伝子工学分野にお いて長い間目標であった形質転換頻度の顕著な増加をもたらす。さらに、選択マ ーカーの使用は必要でない。

形質転換の後、細胞壁が再生されなければならない。この再生は、スフェロプラ ストを寒天中に包埋することによって便利に行われる。例えば、溶融した寒天（ 約５０℃）をスフェロプラストと混合する。

溶液を増殖温度（約３０℃）に冷却した後、固層が得られる。この寒天層がスフ ェロプラスト又は原形質体からの必須の拒大分子の急速な拡散又は喪失を防止し 、そしてそれによって細胞壁の再生を促進する。しかしながら、細胞壁の再生は また（低効率ではあるが）あらかじめ形成された寒天層上にスフェロプラストを 置くことによっても得られる。

場合によっては、選択マーカーが存在する場合には、形質転換された細胞の再生 及び選択の両者を同時に可能にするように再生寒天を調製する。アミノ酸生合成 経路の酵素が選択マーカーとして使用される場合、再生は好ましくは最少培地寒 天中で行われる。非常に高い再生効率が必要であれば、次の２段階法、すなわち （１）富複合培地（ｒｉｃｈ　ｃｏｍｐｌｅｘｍｅｄｉｕｍ　）での細胞壁の再 生、及び（２）細胞層を選択寒天グレートにレプリカすることによる形質転換さ れた細胞の選択、が有利である。

スクリーニング方法は、バイブリドベクターの配列と相同なラベルされたＤＮＡ 断片とのインーシチュ・ハイブリダイゼーション〔例えば、Ｈｉｎｎｅｎ等（３ ０）に従う〕、導入された遺伝子の産物の抗体が入手可能であればインーシチュ ・イムノアッセイ、又は形質転換ベクターによりコードされる遺伝子産物を測定 する他のスクリーニング法が含まれる。

他の方法として、真核細胞は、この発明のノ・イブリドベクターと遺伝マーカー を含有する第２のベクターとにより同時形質転換することができる。

この発明はまた、染色体外ｒＤＮＡ及び構造遺伝子を含んで成る真核性バイブリ ドベクターにより形質転換された真核細胞に関する。

この発明の形質転換された真核細胞は選択圧なくして増殖するという利点を有す る。場合に工っては、特に純粋な形質転換されたセルラインを得るために、選択 圧を適用することができる。

この発明はさらにポリペプチドの製造方法に関し、この方法は、該ぼり議ゾチド をコードするこの発明の真核性バイブリドベクターにより形質転換されたこの発 明の真核細胞を培養し、そして所望により、このポリペプチドを単離することを 特徴とする。

この発明の形質転換された真核細胞は、当業界において知られている方法により 、炭素、窒素、無機塩、及び必要であれば増殖促進物質の資化性源を含有する液 体培地中で培養される。

種々の炭素源を使用することができる。好ましい炭素源の例は資化性炭水化物、 例えばグルコース、マルトース、マンニトールもしくはラクトース、又は酢酸塩 でちり、これらは単独で又は適当な混合物として使用することができる。適当な 窒素源は例えばアミノ酸、例えばカブミノ酸、ペプチド、並びに蛋白質及びその 分解生成物、例えばトリプトン、べ１７’）ン又は肉エキス、さらには酵母エキ ス、マルトエキス、コーンステイープリカー、並ヒニアンモニウム塩、例えば塩 化アンモニウムを包含し、これらは単独で又は適当な混合物として使用すること ができる。使用することができる無機塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、マ グネシウム及びカルシウムの硫酸塩、塩化物、リン酸塩及び炭酸塩を包含する。

さらに、栄養培地はまた増殖促進物質を含有することができる。増殖を促進する 物質は例えば増殖促進剤、微量元素、例えば鉄、亜鉛、マンガン等、又は個々の アミノ酸を包含する。

構造遺伝子のプロモーターが制御される場合、増殖培地の組成は最大レベルのｍ ＲＮＡ転写物が得られるように適合されなければならず、例えば、Ｓ、セレビシ ェ−においてＰ）！、０５プロモーターを使用する場合、このプロモーターの抑 制解除のため増殖培地は低濃度の無機リン酸塩を含有しなければならない。

培養は常法を用いることによって行われる。培養条件、例えば温度、培地の−及 び発酵温度は、最高レベルの目的ポリペプチドが生産されるように選択される。

一般に、増殖は好気的条件下液体深部培養において、振とり又は攪拌を伴って、 約２５℃〜３５℃にて、ＰＨ４〜８、例えば約Ｐ［（７において、そして約４〜 ２０時間にわたって、好ましくは目的蛋白質の最大収量が達成されるまで行われ る。

形質転換された植物細胞の場合、植物原形質体がイン−ビトロで培養され、ある いは他の方法として、カルス又は全植物体が形成される。

外来性ポリペプチドが形質転換された細胞中でその機能を発揮する場合があり、 そしてこのような状況下では単離は必要でない。

所望により、発現されたポリペプチドの単離及び精製は当業界において知られて いる方法に従って行われる。

形質転換され、た細胞が十分な細胞濃度に増殖した後、発現された蛋白質の回収 のための第１段階は細胞内から蛋白質を遊離せしめることから成る。はとんどの 方法において、まず酵素的消化により、例えばグルコシダーゼを用いて細胞壁を 除去する。次に、得られたスフェロプラストを洗剤、例えばトリトンで処理する 。別の方法として、機械的力、例えば剪断力（例えば、Ｘ−プレス、フレンチプ レス）、又はガラスピーズとの振とうが細胞を破壊するために適当である。生じ た蛋白質混合物を、常用手段、例えばポリエチレンイミンによる処理によるほと んどの非蛋白質性物質の除去、溶液を硫酸アンモニウム又はトリクロロ酢酸で飽 和することによる蛋白質の沈澱、グル電気泳動、透析、クロマトグラフィー例え ばイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ又 は逆相ＨＰＬＣ、適当なセファデックス■カラム上での分子サイズ分画により、 目的ポリペプチドについて濃縮する。前精製された生成物の最終精製は、例えば 抗体アフィニティークロマトグラフィーにより達成される。

グリコジル化された蛋白質及び非グリコジル化蛋白質の混合物は、例えばコンカ ナバリン−Ａセファロース■カラム上でのクロマトグラフィーにより分離するこ とができる。非グリコジル化生成物はカラムを通過し、他方、グリコフル化され た生成物は選択的に吸着し、そして常用手段、例えばＫＳ　ＣＨのごとき、チャ オトローゾ剤との組合わせにおけるα−メチルマンノシドにより溶出され得るで あろう。

酵素的に、例えばエンドグリコシダー−＋！ｈＨの作用によりグリコジル基を除 去することも可能である。

この方法はグリコジル化されていない生成物を実質的に純粋な形で製造すること を可能にする。

この発明はさらにこの発明の方法によって製造した場合はいつでもそのポリ＜プ チドに関する。

この発明はさらに、この発明の方法に従って得ることができるポリペプチドに関 する。

この発明は特に、真核性バイブリドベクター、形質転換された真核細胞及びそれ らの製造方法、並びに例に記載するポリ被ゾチドの製造方法に関する。

次の例はこの発明を説明するのに役立つが、しかしそれを限定するものとして解 釈してはならない。

実験の部 例において次の略号を使用する。

ＢＳＡ　：　ウシ血清アルブミン ＤＴＴ：　１．４−ジチオスレイトール（１，４−ジメルカプト−２，３−ゾタ ンゾオール） ＥＤＴＡ　：　エチレンジアミン四酢酸ＳＯ８：　ドデシル硫酸ナトリウム ＴＮＥ　：　１００　ｍＭ　ＮａＣＬ、１０　ｍＭ　Ｔｒｊｓ・ＨＣＬ（ｐＨ７ ，４）及び１　ｍＭ　ＥＤＴＡを含有する溶液ＴｒｉＩＩ−ＨＣｔニドリス−（ ヒドロキシメチル）−アミノエタン、ＨＣｔによシー調整 ＴＥ　：　１０　ｍＭ　Ｔｒｊｓ−ＨＣＡ　（ｐＨ７，５）及び１ｍＭＥＤＴＡ を含有する溶液。

例１．　フィザルム・ポリセファルムの線状染色体外ｒＤＮＡ　Ｋ　ヨるサツカ ロミセス・セレビシェ−のｆｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　、ライス コンシン大学、マジソン）　ｆ　Ｄａｎｉｅｌ及びＢａｌｄｗｉｎ　（１９６４ ）　（４）により記載された液体培地中で増殖せしめる。ｒＤＮＡ　’ｋＢｅｈ ｒｅｎｓ等（１９８２）　（５）によシ記載されたようにして単離する。

れているようにして（Ｈｉｎｎｅｎ等、１９７８．３０　）調製する。

Ｃ）形質転換 １０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣ４（ｐＨ７，５）　、　１０　ｍＭ　ＣａＣ４２゜ ＩＭンルビトール中ススフェロプラスト　２　Ｘ　１０９細胞／ｍ１）１００Ａ Ｚを、ａ）に従って得られたｒＤＮＡ（１μｍ／μｊ）１０μ！と混合し、そし て室温で２０分間インキュベートする。１−の２０チポリエチレングリコール４ ０００（シグマ）を加え、そしてこの混合物を室温にて３０分間保持する。次に 、細胞全１０００Ｘ７にて５分間遠心分離し、そして０．５−のＩＭンルピトー ルに再懸濁する。細胞’ｉｌｏｍ７！０５０℃に保持されたＹＰＤ再生寒天（Ｙ ＰＤ再生寒天：２０　ｆ−／Ａバクトベプトン、　１０　Ｖｌｔ−パクト酵母エ キス、　２０９−／Ａダルコース、１８２νｆンルビトール。

３０　ｆｌ／ｌ！、寒天）と混合し、そしてＹＰＤ寒天グレート（ＹＰＤ寒天： 　２０　’ｔ／Ａバクトペゾトン、　１０　ＶＡバクト酵母エキス、　２０　Ｖ Ａグルコ−、ｘ、　、　２０　Ｐ％＃　寒天）上に注加する。プレートを３０℃ にて３〜４日間インキエペートする。

形質転換グレートのローン（ｌａｗｎ　）からの細胞（例１ｃ）ｉ新しいＹＰＤ プレート上に、個々のコロニーの増殖を許容する細胞濃度において拡げ、そして ３０℃にて２日間インキュベーションを行う。単一コロニーからの細胞材料を拾 い上げて１００−のＹＰＤ液体培地（ＹＰＤ寒天プレートと同様であるが寒天金 倉まない、ｌｃ’ｊ−参照のこと）に接種する。細胞全３０℃、２０Ｏｒｐｍに て１夜増殖せしめる。全ＤＮＡの単離のため、細胞’１５０００Ｘ５’にて５分 間遠心分離し、そして１０ｍ／のＩＭンルビトール。

５０　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　１４　ｍＭ　ＤＴＴ　（ジチオスレイトール）に再 懸濁する。次に、１ｒｎ９のチモリアーゼ６０，０００（マイルス）を加え、そ して３０℃にて約６０分間インキュベーションを行う。形質されるスフェロプラ ストを遠心分離し、そして１０−のＩＭソルビトールｐ　５０　ｒｒＩＭＥＤＴ Ａ中に再懸濁する。グルカナーゼＫ（ペーリンが−、マンハイム）を０．２　ｍ ９／ｌｒｉの濃度で加え、そしてこの混合物音３７℃にて３０分間インキエペー トする。スフェロプラストを前記のようにして遠心分離し、そして１　’Ｉｒ　 ＳＤＳ　ｐ　１０　ｒｎＮ！Ｔｒｌｓ／ＨＣｔ（Ｐ’　８　）　、　１０　ｍＭ 　ＥＤＴＡ　ｓ　０．１　’９／−ゾロテイナーゼに中に再懸濁し、そして３７ ℃にて１時間インキ−ベートする。この溶液を同容量のフェノールで２回及びク ロロホルムで１回抽出する。ＤＮＡを２容量のエタノールで沈澱せしめ、そして ３Ｔｎｔの１０　ｍＭ　Ｔｒ　ｉｓ／ＨＣ２（ｐａｌ　７．５　）　、　１　ｍ Ｍ　ＥＤＴＡに再懸濁する。３．９テのＣ５Ｃｔ’ｚ加えて溶液の屈折率ｆ　ｎ 　＝１．４０１とする。この溶液全ＴＶ　８６５ンルバル垂直ローター中で１８ 時間、３８０００　ｒｐｍ　＊　１５℃にて遠心する。チェーグに底部から穿孔 することによってＣｓＣｌグラジェント’を画分する（２０画分／チューブ）。

２０μｊの各両分金ニトロセルロースＰＭ（５ｃｈｌｅｊｃｈｅｒ及びＳｃｈ’ ｕｌｌ　）に移し、そしてフィルターｋ　１．５　Ｍ　ＮａＣ１、０，Ｉ　Ｍ　 ＮａＣｔ中に浸漬し、２×ＳＳＣ（下記を参照のこと）中で洗浄し、そして８０ ℃でインキュベートし、フィルターを８０℃にて真空下でインキクベートする（ ドツト分析）。形質転換された細胞からのＤＮＡ及び形質転換されていない細胞 からのＩ）ＮＡ　’ｉ含むフィルターを、二りクトランスレーションによｐ５２ ｐ−ラベルされたプラスミドＤＮＡ　［Ｍａｎｉａｔｉｓ等（７）　ｒ　ｐ　１ ０９　）によジノ・イグリダイズせしめる（ハイブリダイゼーション条件は下記 参照のこと）。使用されるＤＮＡは非転写内部スペーサー領域からの２．０　ｋ ｂｐ　Ｓａｌ　ｌ断片である。この分析は、５ｓｃｅｒｅから単離されたｒ　Ｄ ＮＡが、５ｓＣｔグラジエント中で、ｐ−ｐｍから得られる真正の線状染色体外 ｒＤＮＡの密度に対応する密度において沈降することを示す。

Ｃ５Ｃｔグラジエントからの画分子　１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣＬ　（ｐＨ８ ）　ｐ　１　ｒｎｈｌ　ＥＤＴＡ　（＝ＴＥ　）により１０倍稀釈し、セして２ 容量のエタノールを添加することＫよってＤＮＡ　全沈澱せしめる。

ＤＮＡ　ｅ　１００μ！のＴｇに再懸濁する。２μｍのＤＮＡを、４０μ！の容 積中Ｔａｑ　ｌによシ、供給者（ペーリンガー〕によシ与えられた詳細に従って 消化する。ＤＮｋｆ、ＴＢＦ緩衝液中アガロースゲル電気泳動（１％アがロース グル）により分離しく　Ｍａｎｉａｔｉｓ等（７）　、　１５６頁〕、５ｏｕｔ ｈｅｒｎ　［Ｍａｎｉａｔｉｓ等（７）。

３８２頁〕に従ってニトロセルロースＦ紙に移シ、そして上記と同じ放射性ラベ ルしたシラスミドＤＮＡ断片とハイブリダイズせしめる。ノ・イブリダイゼーシ ョン緩衝液は０．０１６４ウシ血清アルグミン。

０．０１６％フィコールｔｏ、ｏｔ６．ｔｅｌＪビニルピロリドン、　０．６　 Ｍ　ＮａＣ１、０，Ｉ　Ｔｒｉｓ／ＭＣ２（ｐＨ８，０）　。

０、　ＯＯ４Ｍ　ＥＤＴＡ　、　０．０８％ＮＩＬＨ２ＰＯ４＃　４０　％ホル ムアミド、　０．１６％ＳＤＳ　、　０．１　ｍ！Ｍ！子牛胸腺ＤＮＡから成る 。ハイブリダイゼーションは３７℃にて４８時間行う。フィルター’ｅ　ｏ、　 ｉ　ｘ　ｓｓｃ中で６５℃にて２時間インキクベートする（　Ｉ　Ｘ　ＳＳＣは ０．１５　ＭＮａＣｔ。

０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐｉ（７，２））。この結果は、制限断片が ｐ、ｐ、の真正なｒＤＮＡの断片に対応すること金示す。Ｓ、ｅｅｒ、　ＪＨ− Ｄ　５　（Ｊ、　Ｃａｒｂｏｎ。

サン・タバｒバラ大学）を同いて同じ実験を行うことｓ、ボンベ（Ｓ、　ｐｏｍ ｂｅ　）株江−Ｌｅｕｌ−３２（Ｕ。

Ｌｅｕｐｏｌｄ　、ベルン大学微生物学研究所から入手）を１００ｍ／のＹＥＴ 、培地（５Ｍ！バクト酵母エキス。

３０　ｆ／Ｚグルコース）中で増殖せしめ、そしてスフェロプラス）　ｆ　Ｂｅ ａｃｈ及びＮｕｒｓｅ（６）に記載されたようにして調製する。形質転換法はＳ 、ｃｅｒについて記載したのと同様であるが、但し、スフェロプラスト緩衝液［ １，２Ｍソルビトール、５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ＰＩ（５，６）　＃　１ ０　ｍＭ　ＣａＣｌ２　＊　１０　ｔｔＶ′ｒｎｌ子牛胸腺ＤＮＡ″ｌを使用す る。ＰＥＧインキュベ〒ジョン段階の後、スフエログラス）　／　ＤＮＡ混合物 全２％寒天全含有するＹＥＬ培地（５０℃に保持）１０ｒｎｔ中に懸濁し、そし てＹＥＩ、　ｆレート（５シｆバクト酵母エキス、　３０　ＶＺグルコース、　 ２０　ｆ／Ｉ、寒天）上に注加する。インキュベーションは３０℃にて４日間で ある。

形質転換ローンからの純化された単一コロニーに由来するＤＮＡ　ｆ　Ｓ、ｃｅ ｒについて記載したようにして単離する（２を参照のこと）。但し、グルカナー ゼ源として、例３１．）のもとで記載されたクエン酸緩衝液系中、トリコデルマ 拳ハルチアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｆａｎｕｍ　）抽出物５Ｐ２ ３４（）ｙｉ？−エンザイムス）を使用する。

Ｓ、４ンベの形質転換された細胞中にｐ、ｐ、のｊＤＮＡが存在することを証明 するために、例２に記載したドツト分析を用いる。ｓ、ボンベｈ−ｕｒａ　４− ２９４（Ｕａ　Ｌｅｕｐｏｌｄ　、ベルン大学）を用いて同じ実験を行うことが できる。

例５．　フィザルム・ポリセファルムの線状染色体外ｒＤＮＡによるセファロス ポリウム・アクレモニ１１５５０（アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクシ ョン）を、１００−の濾過された４８ｃ培地（１１，８ＶＢコーンステイープ、 　２０９−／ｌ、シュークロース、　４．５　ＶＡ酢酸アンモニウム、　０．５ 　Ｖｔ：ＣａＳＯ４ｅ　Ｏ０５ｔ／Ｊ　ＭｇＳＯ４）中で増殖せしめる。約１７ ・の菌糸を得、そして５０−の０．７ＭＫＣｌ　、　０．０５ＭＫＨ２ＰＯ４（ ｐＨ６，０）　’ｔ’５回洗浄する（　２０００ｘｙにて５分間遠心分離）。菌 糸を５０−のＬｌ／ＫＣｔ−ＫＨ２ＰＯ４（ｐｉ−’１６．０　）　ＣＩ　ｆｉ ’のＬ１酵素１５０ゴ（ＢＤＨケミカルス）　、　０．７　ＭＫＣｌ、　０．０ ５　ＭＫＨ２ＰＯ４（ｐ）（６０）〕中に再懸濁し、そして３０℃にて４時間イ ンキ−ベートする（顕微鏡分析により決定する場合約６０〜７０チのスフェロプ ラスト’を与える）。ガラス綿で濾過することによシ未消化の菌糸からスフェロ ！ラスト全取り出し、そして遠心分離によって４回洗浄し、そして５０−の０． ７　Ｍ　ＫＣｌ　、　０．０５　ＭＫＨ２ＰＯ４（ｐｉ（６，０）に再懸濁する 。最後に、合計４×１０　個のスフェロプラストを１．２７！のＣ３Ｔ（：　１ ０　ｍＭ　ＣａＣｌ２．２Ｍツルピトー／’　ｔ　２５　ｍＭＴｒｉｓ／４（Ｃ １（ｐｉ（７，８）　〕に再懸濁する。３００　ｔｔｌを含有する７μｊのＴＥ と混合する（対照サンプルはｒＤＮＡ　金伴わないで適用する）。溶液を室温に て２０分間インキュベートし、次に５−の５０％ＰＥＧ（Ｈ２Ｏ中）を加え、そ して３０℃にて２０分間インキュベーションを行う。最後に、４０ｄの０．７　 ＭＭＣｌ　、　Ｏ，，０５Ｍ　ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６，０）を加え、そして細胞 を２０００Ｘ７にて１０分間遠心分離し、２０ｍ／の同じ緩衝液中に再懸濁し、 再び遠心分離し、そして０，５−の同じ緩衝液中に再び懸濁する。

アリコートを、５０℃に保持された１０−の再生寒天［３０ＶＡ　？イコフィル （Ｍｙｃｏｐｈｉｌ　）　（ベクトン、ティッキンソン・アンド・カンノやニー ）、４　ＶＡバクト酵母エキス、　９０　ｆｌ−ＩＡ　ＫＣｌ　、　２５１μ寒 天〕と混合し、そして同じ組成の寒天プレート上に注加する。

プレートを２５℃にて９日間インキュベートする。

１片の菌糸（３ｃｍ　Ｘ　３　ａｎ　）を形質転換グレートから切り取シ、そし て５−の４８ｍ培地（例５を参照のこと）中で２５℃にて２５０　ｒｐｍでイン キュベートする。３日間の後、この培養物を用いて１００７！の同じ培地に接種 し、そしてインキーペーションをさらに３日間行う。次に、５−のこの培養物を 用いて１００　ｍｌの濾過された４８ｅ培地に接種し、そして上記の条件下で２ ４時間インキ−ベートする。スフェログラス）を例５のもとで記載したのと同様 にして調製する。但し、これらを最終的に２．５−の細胞溶解緩衝液［５０ｍＭ 　Ｔｒｉｓ／ＨＣ１（ｐＩ４７．５　）、５ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　１　％　ＳＤ Ｓ　、　２０　ｍ９７ｍ１グロテイナーゼＫ〕中に懸濁する。１０μｊのジエチ ルピロカルボネートを加え、そして混合物を３７℃、５０ｒｐｍにて４時間イン キュベートする。溶液を６５℃にて２０分間加熱し、そして次に室温にて２５， ０ＯＯｘｙ−で遠心分離する。上清を２容量のエタノールで沈澱せしめ、そして 沈降物全３ゴのＴＥに再懸濁する。ＣｓＣ１密度グラジェント上での両分及びｒ 　ＤＮＡの両分はＳ、セレビシェ−のｒＤＮＡについて記載したのと同様である （例２を参照のこと）。

用ｒＤＮＡ／ＴＰＡバイブリドの造成 （ＩＡ　）　ｆｆｉ制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ　ｍ　にューイングランド ビオラブス）によシ５ｏμ！の全容量中で、供給者の指示に従って消化する。５ ０μ！のフェノールを加えることによってＤＮＡ　ｉ　１回抽出する。

３回のクロロホルム抽出の後、ＤＮＡｆｆ１エタノールによシ沈澱せしめ、そし て１００μ！のニックトランスＬ’　−’／　＝ｓ　ン緩衝液（Ｍａｎｉａｔｉ ｓ等（７）　１１２頁を参照のこと〕に再懸濁する。４種類のｄＡＴＰ　、　ｄ ＧＴＰ　、　ｄｃＴＰ及びＴＴＰ　’ｉ最終濃度８０μＭに添加した後、ＤＮＡ ポリエリーゼエのＫｌｅｎｏｗ断片５ユニツ）を加え、そして混合物を記載され ているようにして［Ｍａｎｉａｔｉｓ等（７）　１１７頁〕インキ−ベートする 。混合物を上記のようにしてフェノール及びクロロホルムで抽出し、そしてＤＮ Ａ　ｆｔエタノールで沈澱せしめる。１８ｍ０ＢａｍＨＩリンカー（５’−ＣＧ ＧＡＴＣＣＧ　−３’　、　：、−イングランドビオラプス）　ｆ　５０　μＢ の６　ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ（ｐＪ（７，５）　、　１０ｍＭＭｇＣｔ２．４　 ｍＭＤＴＴ　、　０．５ＭＡＴＰ及び３５ＵのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ ペーリンガー）中で３７℃にて３０分間キナーゼ処理し［Ｍａｎｉａｔｉｓ等（ ７）　１２５頁を参照のこと］、０．９μｔのキナーゼ処理されたリンカ−及び ０．６μデの平滑末端ベクターＤＮＡ’ｉ　２５　μＰの６０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ Ｃｔ（ｐＩ（７，５）　−１０ｒｎｂｌ　ＭｇＣｔ２ｅ　５　ｒｎｂｌｉ　ＤＴ Ｔ　ｅ　３．５ｍＭ　ＡＴＰ及び４５０ＵのＴ　４　ＤＮＡリガーゼにューイン グランドビオラブス）中室温にて一夜連結する。

連結されたＤＮＡ　’ｅ　、１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｅ　０．３　Ｍ酢酸ナトリ ウム（ｐＨ６，０）及び０．５４容積のインゾロパノールの存在下で、イングロ Δノール沈澱により過剰のリンカ−から分離する。室温にて３０分間インキ−ベ ートした後、ＤＮＡ１遠心分離により沈降せしめる。

ベレン）ｋ空気乾燥し、５０μ！のＢａｍＨＩ緩衝液（二、−イングランドビオ ラプス）に再懸濁し、そしてＢａｍＨＩによシ消化する。混合物音、ＴＢＥ緩衝 液中０．６％のソフトアガロースダル（シグマ）中で電気泳動することによシ分 離する。２．７　ｋｂ　ＤＮＡ断片をアがロースダルから切シ出し、フェノール により３回、及びクロロホルムで２回抽出し、そして壬タノールで沈澱せしめる 。５００μ？のプラスミドｐＢＲ３２２ｆ　ＢａｍＨＩで消化し、そして２００ μＪの消化されたＤＮＡ　’ｉ上記の２．７　ｋｂ　ＢａｍＨＩ断片と混合する 。ＤＮＡ　（ｉ−２０μ！の６０　ｍＭＴｒｉｓ−ＨＯ２（ｐＨ７，５）　、　 １０　ｒｒＭＭｇＣｔ２−１　ｍＮＴ　ＡＴＰ　ｅ　５　碩ＤＴＴ及び４００Ｕ のＴ４ＤＮＡ　！Ｊガーゼ中で１５℃にて６時間連結する。２μ！のアリコー） ’ｔｌｏＯμ！のカルシウム処理された形質転換コンピテントＥ、コ！Ｊ　ＨＢ 　１０１細胞（Ｍａｎｉａｔｔｓ等（７）　２５０頁〕に加え、そして形質転換 体を、１００μシーのアンピシリン金含有スるＬＢ寒天プレート（Ｉ、Ｂ　：　 １０　ＶＪのバクトドリゾトン。

５　Ｖｌ、のバクト酵母エキス、５Ｖ！のＮａＣｔｐ　１５Ｖ！の寒天）上で選 択する。１０μ？鷹のテトラサイクリン感受性の１０個のコロニーを拾い上げ、 そしてグラスミドＤＮＡ、　ｆ　Ｍａｎｉａｔｉｓ等（：（７）、３６６頁〕に より記載されたＨｏｌｍｅｓ及びＱｕｉｇｌｅｙの方法により単離する。

スヘての単離体がｐＢＲ３２２のテトラサイクリン耐性遺伝子内に挿入された２ 、７ｋｂの１３ｍｍＨ断片を含有することが見出される。１つの単離体を拾い上 げ、そして記載されているようにして［Ｍａｎｉａｔｉｓ等（７）９２頁〕グラ スミドＤＮＡを調製する。２０μデのシラスミドＤＮＡ　ｉ　２００μ！の全容 量中で制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで消化し、そしてＤＮＡ　’ｉ　０． ６％ソフトアがロースダル（ＴＨＥ緩衝液）上に適用する。

２．７ｋｂの断片を切シ出し、そして２回フェノール処理する。クロロホルムに よる２回の抽出の後、ＤＮＡをエタノールによシ沈澱せしめ、そして２０μ！の ＴＥ緩衝、液に再懸濁する。

１μｍの２．７　ｋｂ　ＢａｍＨＩ断片を、制限エンドヌクレアーゼＢｇｌ■に よシあらかじめ切断された（供給者及び消化条件二二エーイン、グランドビオラ プス）ｐ、ｐ、のｒＤＮＡ　１０１ｔＰと混合する。ＤＮＡ　ｆ　５０　ｔｔＡ の６０　ｍＭ　ＴｒｌｌＩ−ＨＣｌ　（ｐ）１７．５　）　ｐ　１０　ｍＭ　Ｍ ｇＣｌ２．　ＩｎＩＭＡＴＰ　、　５　ｍＭ　ＤＴＴ及び４００ＵのＴ　４　Ｄ ＮＡリガーゼ中で１５℃にて一夜連結する。反応混合物、を０２５ＭのＮａＣ２ とし、そしてＤＮＡ　’ｉエタノールにより沈澱せしめる。ＤＮＡ　ｔ　Ｂｇｌ 　ＩＩ緩衝液（二一一イングランドビオラブス）中に再懸濁し、そしてＢｇｌ■ 制限酵素で２時間消化する。次に、ＤＮＡ’ｅエタノールにより再び沈澱せしめ 、そして上記の連結混合物中に再懸濁する。この連結／消化サイクルを４回反復 した後に、このＤＮＡ　ｉ例２に記載したようにして形質転換実験のために使用 する。

形質転換グレートからの細胞全使用して２０ｍの低Ｐｉ培地（Ｍｅｙｈａｅｋ等 （８）　、　１９８２　：）に接種する。

１〜２　Ｘ　１０　／ｄの細胞密度において低Ｐｉ培地からの細胞をツルパルＳ Ｓ　３４０−ター中での３００Ｏｒｐｍにおける１０分間の遠心分離によシ集め る。培地の塩成分を含有する（すなわち、アミノ酸、グルコース、ビタミン、微 蚤元素を含有しない）緩衝液中で細胞を洗浄する。細胞を室温にて５分間３００ ０ｒｐｍにて遠心分離する。沈降した細胞を合計容積４−の冷６６　ｍＭ　’） ン酸ナトリウム緩衝液（ｐ）１７．４）及び０．１　％　（ｖ／ｖ　）のＴｒｉ ｔｏｎ　Ｘ　−１００に再懸濁する。

細胞懸濁液を３０−のコレックスチーープに移し、８Ｊのガラスピーズ（直径Ｑ 、４ｅｗ）ｉ加え、そして懸濁液ｔポルテックスミキサー（サイエンティフィッ ク・インストルメンツ社、米国）上で全速で４分間振とうし、そして次に水浴中 で冷却する。この方法によシ９０チ以上の細胞が破壊される。細胞破片及びガラ スピーズ全ツルペルＨＢ　−４０一ター中テ８０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間 の遠心分離により沈降せしめる。上清を二フインドルフチューブに移し、液体窒 素中で凍結し、そして−６０℃にて貯蔵ＴＰＡ活性を決定する。基質としてＤ− Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ　−ｐＮＡ　（Ｋａｂｉ　Ｓ　−２２５１）　ｅ使用す る。４０５　ｎｍにおける吸収を非特異的開裂について補正し、そしてウロキナ ーゼ標準と関連付ける。

回収された活性は０．　Ｉ　ＷＪ細胞培養物に相当する。

シラスミドｐＪＤＢ　２０７　／　Ｐ）［０５−ＴＰＡ（ＩＡ）は次のように製 造する。

３μデのｐＢＲ３２２を制限エンドヌクレアーゼＢａｌ　Ｉ　（ＢＲＬ　）及び ｐｖｕ　ｎ　（ビオラプス）によシ、供給者の推奨に従って完全消化する。ｐＢ Ｒ３２２のＢａｌ　ｒ／Ｐｖｕ　Ｕ　２重消化が３７３８　ｂｐ及び６２２　ｂ ｐの２個の制限断片をもたらす。２個の断片をＴＢＥ（９０ｍＭＴｒｉｓ・Ｈｃ ｔ（ｐＨ８，３）　、　２．５ｍＥＤＴＡ。

９０ｍＭ硼酸〕緩衝液中エチの低融点アガロースゲル上で分離する。ＤＮＡバン ドをエチジウムプロミドで染色し、そして３６６　ｎｍにおける長波長ＵＶ光線 のもとて可視化する。３７３８　ｂｐ断片を含有するアガロース片全グルから切 シ取り、６５℃にて液化し、５００　ｍＭ　ＮａＣｔに調整し、そして６５℃に て２０分間インキュベートする。１容量のフェノール〔１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ Ｃｔ（ｐＨ７，５）　、　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　５００　ｍＭＮａＣｌで平 衡化したもの〕を加える。水相全フェノールで２回、そしてクロロホルムで１回 再抽出する。

ＤＮＡ　’（ｉ＝　２．５容量の冷純エタノールで沈澱せしめ、そして遠心分離 によシ集める。ＤＮＡベレットヲ冷８０チェタノールで洗浄し、そして次に真空 乾燥する。

ＤＮＡ　’ｋ　ＴＥ中に０．１５　Ｔｎ９７ａｔの濃度で再懸濁する。

単離された３　７３８　ｂｐ　ＤＮＡ断片は、Ｂａ１Ｅ及びＰｖｕ　１１による ２重消化から生ずる２個の平滑末端を有する。ＤＮＡ　ｉ平滑末端連結により環 化する。０．６μｍのＤＮＡ　ｆ　３０　ｐｉの６０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｔ （ｐＨ７，５）＊１０　ｍＭ　ＭｇＣ６２ｅ　１０　ｍＭ　ＤＴＴ　、４　ｍＭ 　ＡＴＰ　ｅ及び９００ＵのＴ　４　ＤＮＡすが−ゼ（ビオラプス〕中で室温に て一夜インキュベートする。Ｍａｎｄｅ１等α１の方法によシ調製された、カル シウム処理された形質転換コンピテントＥ６コリ（Ｅ、　ｃｏｌｔ　）ＨＢ　１ ０１細胞５μ！。混合物を５分間氷上に保持し、次に３７℃にて２分間インキユ ベートシ、そして室温にて１０分間置いた後、１００μか−のアンピシリンを含 有するＬＢ寒天プレート上にグレートする。６個のａｍｐ　Ｒコロニーを拾い上 げ、そして１００μｍ鷹のアンピシリンを含有するＬＢ培地（上記の通りである が寒天を含まない）１０〇−中で個別に増殖せしめる。

Ｍａｎｉａｔｉｓ等（（７）９２頁〕により記載された方法を用いて細胞からプ ラスミドＤＮＡを調製する。Ｈａｅ　■（ビオラプスから販売、消化条件は供給 者によシ示唆された通り）、Ｐｖｏｌｌ及びＢａｔ　Ｉによるシラスミドの制限 消化物’ｉ　ＴＢＥ緩衝液中１．５％アガロースダル上で分析する。新しく形成 された連結断片の制限パターン及び予想サイズは、プラスミドが同一であシ、そ してＢａｌ　Ｉ　−Ｐｖｏ　Ｉｆ断断片金色ｐＢＲ３２２配列のすべてを含有す ることを示す。これらのシラスミドはＢａｌ　Ｉ制限部位を欠いておシ、そして ｐＢＲ３２２ΔＢａ１Ｉと称される。

ｐＪＤＢ　２０７　／　ＰＨ０５，ＰＨ０３［：　Ｍｅｙｈａｃｋ等（８）〕は 制御される及び構成的酵母酸性ホスファターゼの遺伝子ｐＢＲ３２２ΔＢａ１ｌ 　ｔ”制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩによシ消化する。完全消化の後、酵素 を６５℃にて２分間不活性化する。両ＤＮＡ　’ｉエタノールによシ沈澱せしめ 、そして１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｔ（ｐＨ３、Ｏ）中にそれぞれ０．２　ｍ Ｖｍｌの濃度で再懸濁する。０．５μ？ずつの２つのＢａｍＨＩ消化ＤＮＡ　’ （ｒ−緒にし、そして３００ＵのＴ　４　ＤＮＡ　ＩＪガーゼを含有する２０μ ！の連結緩衝液中で１５℃にて２０時間連結する。連結混合物の５μｊのアリコ ート’ｅ、５０μ！のカルシウム処理されたＥ、コ’ＪＨＢＩＯＩ細胞に加え、 そして例Ａａに記載したようにして形質転換を行う。形質転換されたＥ、コリ細 胞全アンピシリン及びテトラサイクリンに対するそれらの耐性について試験する 。８個のａｍｐＲ，Ｌｅｔｓコｏ　＝　−ｆ単離し、そして１００　ｔｔｆ／ｍ ｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地１００ｆｎｔ中で増殖せしめる。シラスミ ドＤＮＡ　’ｉ細胞から単離する（　Ｍａｎｉａｔｉｓ等、　（７）　９２頁〕 。ＢａｍＨＩによる制限消化は、４つのグラスミドが３．７ｋｂベクタ一断片（ ｐＢＲ３２２ΔＢＩＬＩ　Ｉ　）のほかに５．１ｋｂ挿入部を含有することを示 す。Ｓａｌ　Ｉ　にューイングランドビオラブス〕による制限消化が挿入された ５、　１　ｋｂ断片の向きを決定する＝２個のグラスミドが第４図に示すように 方向付けられた挿入部を有する。これらの時計方向である。

例Ｂ、ＰＨ０５グロモーター及びＰＨ０５転写停止シグナルを含有する発現シラ スミドの造成〔第５図５μ？のｐ　３０　ＤＮＡ　（例Ａを参照のこと〕を制限 エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ　（ペーリンが−）によす完全消化する。生ずる 接着末端をフィルインするため、５０μ！の５０　ｍＭ　ＮａＣｔ、　１０　ｍ ＭＴｒｉｓ−ＨＣｔ（ｐ７、５　）　−１０ｒｎＢ／Ｉ　ＭｇＣ６２ｅ　１　ｒ ｒＬＭＤＴＴ　−０，２５ｍＭｄＡＴＰ及び０，２５綱ｄＴＴＰ中１μ？のＥｃ ｏ消化ｐ３０′ｆ：１ユ＝ｙトのＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ大断片。

ＢＲＬ　）と共に３７℃にて３０分間インキーベートスる。メタノール沈澱から 回収されたＤＮＡ　ｅ常法通シ連結し、そして例Ａに記載したようにコンピテン トＥ、コ！ＪＨＢＩＯＩ細胞の形質転換のために用いる。

ＥｃｏＲＩ消化に対して耐性のクローンｔｐ　３０（ＥｃｏＲＩＲ）と称する。

離 マツプされている（２５〕。転写停止のためのシグナルはＰＨ０５遺伝子の０． ３７　ｋｂ　５ａｕ３Ａ−Ｐｓｔ　Ｉ断片中に位置することが示されている。５ ａｕ３Ａ−Ｐｓｔ　Ｉ断片のヌクレオチド配列全第６図中に示す。５μｍのｐＪ ＤＢ　２０７／嬰ヅ、胆丑ＤＮＡ　（８）を制限エンドヌクレアーゼ５ａｕ３Ａ 及びｐＳｔｌにより完全消化する。制限断片を’ｌ’ＢＥ緩衝液中垂直１５チ低 融点アガロ−スケ９ル上で分離する。０．３７　ｋｂ　５ａｕ３Ａ−Ｐｓｔ　Ｉ 断片の位置金エチソウムブロミド染色により決定し、そしてこのＤＮＡ断片を含 有するできるだけ小さいグルブロックを切シ取る。

Ｍ１３ｍｐ９ファーゾＤＮＡは、１群のユニーク制限部位を有する有用なりロー ニングベクターである（１１）。

５μｍのＭ１３ｍｐ９　ＤＮＡ　ｋ制限エンドヌクレオチドＢａｍＨｒ及びｐａ ｔ　ｌにより完全消化する。大きい方の７、２　ｋｂ　ＤＮＡ断片全０．５　％ 低融点アガロースダル上で非常に小さい断片（８ｂｐ　）から分離する。大ＤＮ Ａ断片を含有するグルブロックをグルから切シ取る。

ｐＪＤＢ　２０７　／　ＰＩ（０５ｙＰＨ０３の０．３７　ｋｂ　５ａｕ３Ａ− Ｐｓｔ　Ｉ断片（例Ｂｂ　ｉ参照のこと）を含むグルブロック及びＭ１３ｍｐ９ の７．２　ｋｂ　ＢａｍＨＩ−Ｐｓｔ　Ｉ断片を含むグルブロックを６５℃にて 液化し、およそ等モル量で混合し、そしてＩ（２０で稀釈してアガロースの濃度 ヲ０１３ｍに稀釈する。６０　ｍＭＴｒｉａ−Ｈｃｔ（ｐＩ（７，５）　、　１ ０ｍＭＭｇＣｔ２ｔ　１０　ｍＭＤＤＴ　ｐ　１　ｍＭ　ＡＴＰ及び６００−’ ＝ニラ結を行う。ニューイングランドビオラプスによって公表されたマニュアル ６Ｍ１３クローニング及びＤＮＡ配列決定系”に従って、ＥａコリＪＭ　１０１ 　（Ｃａ＋ト）株のコンピテント細胞のトランスダクションを行う。

多数の白色ゾラークからのファージ金増殖せしめ、そして制限エンドヌクレアー ゼＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ及びＰｓｔ　Ｉによる開裂によりそれらのＤＮＡ挿入部のサ イズについ由来クローン全単離し、そしてＭ１３ｍｐ９／ＰＨ０５（５ａｕ３Ａ −Ｐｓｔ　Ｉ　）と称する。

ファー’）　Ｍ１３ｍｐ９中にクローン化されたもとのＰＨ０５転写停止断片を 、Ｈａｅ　ＩＩＩ　−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ断片として、Ｂａ１．［及びＩ（ｉｎｄ 　［１で開裂されたシラスミドｐ　３０　（ＥｃｏＲＩＲ）中で再クローニング する。Ｍ１３ｍｐ９／ＰＨ０５（５ａｕ３Ａ−Ｐｓｔ　Ｉ　）　ＤＮＡ　ｆ制限 エンドヌクレアーゼ）（ａｅ　■及びＨｉｎｄ　［１で完全に開裂せしめる。生 ずる２つのＤＮＡ断片’ｉ　ＴＢＥ緩衝液中１．５％の垂直低融アガロースダル 上で分離する。０．３９ｋｂの断片をグルから切シ取られたデルブロック中に単 離する。

ｐ　３０　（ＥｃｏＲＩＲ）のＤＮＡ　ｔ−Ｂｉｔ　！及び）（ｉｎｄＩＩＩで 消化する。大３．９８　ｋｂ断片ｉ　ＴＢＥ緩衝液中０．５％低融点アガロース ダル上で分離し、そして該ＤＮＡ断片を含有するグルプロッタを切り取ることに よシ単離する。

０、３９　ｋｂ　Ｈａｅ　ＩＩＩ　−Ｈｉｎｄ　Ｉｍ転写停止断片を含むグルブ ロック及びｐ　３０　（ＥｃｏＲＩＲ）の３．９８　ｋｂ　Ｂａ１ｌ−Ｈｉｎｄ 　ＩＩＩ断片を含むデルブロックを６５℃にて溶融し、そしておよそ等モル量で 混合する。連結及びコンピテント細胞コＩＪ　ＨＢ　１０１細胞の形質転換は例 Ａに記載した通シである。形質転換された細胞のＤＮＡをＢａｔ　Ｉ及びＨａｅ 　Ｉｎによる開裂によって分析する。

ＰＨ０５転写タ一ミネーシヨン断片を含有するクローンをさらに分析し、そして ｐ３１と称する（第５図を参照のこと〕。

る。このベクター中で発現されるべき外来性コード配列全プロモーターと転写停 止配列との間に便利に挿入することができるであろう。

発現シラスミドｐ３１は、ｍＲＮＡ出発部位を含むＰＨ０５プロモ一ター配列、 酸性ホスファターゼの翻訳開始コドンＡＴＧ　、及び酸性ホスファターゼシグナ ル配列の部分全コードする追加の４０ヌクレオチドを含有する。この造成におい ては、シグナル配列のためのヌクレオチド及びＡＴＧ　ｆ　Ｂａｌ　１３１消化 によシ除去する。ＰＨ０５プロモーターを成熟ＴＰＡコード配列に連結すること を可能にするようにＥｃｏＲＩリンカ−を導入する。

２０μｍのｐ　３０　ＤＮＡ　（例Ａｂを参照のこと）を制限エンドヌクレアー ゼ１３ａｌ　ｌによシ消化して３．７及び５．１　ｋｂの２つの断片を生じさせ る。フェノール／クロロホルムで抽出した後１．ＤＮＡ１１００μ！の２０　ｍ ＭＴｒｉｓ　（ｐＨｓ、ｏ　）　、　１００ｍＭＮａＣ４，１２ｒｒＩＭＭｇＣ ６２，１２ｒｎＭＣａＣｔ２及びｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ中で２Ｕのエキソヌクレア ーゼＢａｔ　３１　（ＢＲＬ　）で消化する。

２μψずつのＤＮＡのアリコートを３０℃における１５秒、３０秒、４５秒及び ６０秒のインキュベーションの後に取シ出し、そしてすぐに５０μ！のフェノー ル及び６０μ！のＴＮＥと混合する。フェノール／クロロホルムによる抽出及び エタノール沈澱の後、ＤＮＡｆ　１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＩ（８，０）に１ ００　ｔｔｆｉ−／ｍｌの濃度で再懸濁する。Ｂａｔ　１３によるエキソヌクレ オチド開裂の程度を分析するため、各時点からの０．５μｍのＤＮＡ’ｔエンド ヌクレアーゼＢａｍＨＩによシ消化し、そしてＴｒｉｓ−ポレート緩衝液（ｐＨ ８，３）中１．５％アがロースダル上で分析する。４５秒間のＢａｌ　３１消化 の後、断片の各末端から平均７０　ｂｐが除去される。

さらに実験するため４５秒時点からのＤＮＡ　ｅ使用する。

アニールされた２末鎖ＥｃｏＲＩ　ＩＪンカーをその平滑末端により、Ｂａｌ　 ３１処理されたＤＮＡ断片に連結する。０．５　ｔｔＰのＢａｌ　３１処理され たＤＮＡ　（例Ｃａ　ｆ参照のこと）を、２０　μｉの６０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　 （ｐＨ７，５）　。

１０　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０　ｍＭ　ＤＴＴ　、　４　ｍＭ　ＡＴＰ及び６０ ０ＵのＴ　４　ＤＮＡ　’Ｊガーゼ（ビオラプス）中で５０倍過剰のキナーゼ処 理されたＥｃｏＲＩ　！Ｊンカーと共に室温にて１６時間インキ−ベートする。

Ｔ　４　ＤＮＡリガーゼの不活性化（６５℃にて１０分間）の後、過剰の）：ｃ ｏＲＩリンカ−ｆｊｒ：５０　ｔｔＡの容量中で５０ＵのＥｃｏＲＩ：（ペーリ ンガー）により開裂する。ＤＮＡをフェノール／クロロホルムによシ抽出し、エ タノールにより沈澱せしめ、そしてＸ　ＯｍＭ　Ｔｒｔｓ　、　ｌ　ｍＭ　ＥＤ ＴＡ中に再懸濁する。

制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＪは両ｎａｔＩ断片の末端に付加されたＥｃｏ Ｒｒリンカ−のみならず５．１ｋｂ断片中の内部ＥｃｏＲ丁部位全部位裂せしめ て３．９ｋｂ及び１．２ｋｂの断片を生じさせる。３．７ｋｂ及び３．９ｋｂの 断片金、９０　ｍＭ　Ｔｒｔｓ−ＨＣｔ（ｐＨ８，３）　、　９０ｍＭ硼酸及び ２．５　ｍＭ　ＥＤＴＡ中Ｏ，Ｓ％低融点アガロースゲル（シグマ）上で１．２ 　ｋｂ断片から分離する。ＤＮＡバンドをエチジウムプロミドで染色し、３６６ ｎｍの長波長四光線のもとて可視化する。３．７ｋｂ及び３．９ｋｂの２つの大 ＤＮＡ断片は分離しない。これらを、１つのダルブロック中にダルから切シ出し 、そして例４ａに記載したようにして抽出する。

ＥｃｏＲＩ接着末端で終る線状断片全連結によシ環化する。約０．２５　μ？の 断片ｆｆ：１００　ｔｉｎの６０ｍＭ。

Ｔｒｊｓ　（ｐＨ７，５）　、　１０　ｍＭＭｇｅｔ２．１０　ｍＭＤＴＴ　ｔ ｌ　ｍＭ　ＡＴＰ及び６００ＵのＴ　４　ＤＮＡリガーゼ中で１５℃にて４時間 連結する。

連結混合物の１０μ！のアリコーｔ−ｆｃｌ　００μ！のカルシウム処理された 形質転換コンピテントＥ、コり　Ｉ（Ｂ　１０１細胞（例Ａａ　ｆ参照のこと） に加える。

３５個の形質転換されたａｍｐＲコロニーｉ、１００μ？鷹のアンピシリンを含 有するＬＢ培地に別々に増殖せしめる。。シラスミドＤＮＡ　ｆ　Ｈｏｌｍｅａ 及びＱｕｉｇｌｅＹ（（７）３６６頁を参照のこと〕の方法によシ調製し、そし てＥｃ　ｏＲＩ／ＢａｍＨＩによる２重消化によって分析する。

３５個のコロニーのほとんどが、期亜プロモーター中のＥｃｏＲＩ　リンカ−の 付加の位置について、個々のＤＮＡ分子のＢａｌ　３１消化の程度に依存して相 互に異る。ヌクレオチド配列分析のため、シラスミドＤＮＡ全ＥｃｏＲＩで消化 する。フェノール／クロロホルムで抽出した後、制限処理されたＤＮＡ　ｉエタ ノールで沈澱せしめる。ＤＮＡ脱リン酸し、そして５′−末端をラベルする。ラ ベルされたＤＮＡ断片全第２の制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで開裂せしめ る。生成物全０．８　％低融点アがロースダル上で分離する。０．５−　Ｑ、　 ６　ｋｂの５７−ラベルされたＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を例Ａａに記載した ようにして低融点アガロースから単離する。ＥｃｏＲＩリンカ−に隣接するヌク レオチド配列の決定のため、異るＤＮＡ断片を化学的に分解し、そして生成物ｆ 　Ｍａｘａｍ及びＧ１１ｂｅｒｔ　（１２）により記載されたようにしてポリア クリルアミドゲル電気泳動により分離する。

異るクローン及びＰＨ０５配列の対応する最終ヌクレオチドの位置（これにＥｃ ｏＲＩ　ＩＪンカーが続＜）ｔ−第１表に挙げる（さらに第８図全参照のこと） 。

第　１　表 ｐｈ　−１３７ ｄ）　ＰＨ０５Ｒｆロモーターを含有する０、　５３　ｋｂ！ラスミドｐＲは５ ３４　ｂｐのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片上にＰＨ０５Ｒプロモーターを含有す る。第３ａ図の番号に従って、この断片は、ヌクレオチド−５４１（ＢａｍＨＩ 部位）からヌクレオチド−１０までの朋勉プロモーター配列をカバーする。ヌク レオチド−１０に連結されたｇｃｏＲＩリンカ−（例ｃｂ　１参照のこと）はＥ ｃｏＲＩ開裂の後２個のＧ−残基金もたらす。

！ラスミドルＲを制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化する 。０．５３　ｋｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片’に０．５％の低融点アガロー スダル上で分離し、そして例Ａａに記載したようにして単離する。ヌクレオチド 配列を第９図に示す。

同様にして、プラスミドｐＹｔ消化し、そしてＰＩ（０５Ｙ７’Ｏモーター全含 有する０、　５３　ｋｂのＢａｍＨＩ　−Ｅｃ　ｏＲＩ断片を単離する。

ラスミドル３１中のＳａｔ　ｌ　−ＥｃｏＲＩ断片の直立 ５μｍのグラスミドｐ３１（例Ｂｄヲ参照のこと〕ｆｆｉ　Ｍ　ｌ＋ｆｌエンド ヌクレアーゼＳａｌ　ｌで消化する。制限処理されたＤＮＡ　ｆｆｉエタノール で沈澱せしめ、そして５０　μＢの１００　ｍＭＴｒｉｓ　（ｐｔ−１７，５） 　、　５０　ｍＭＮａｃ４５　ｍＭ　Ｍｇｅｔ、、中に再懸濁する。ＤＮＡ　ｆ 　ＥｃｏＲＩで完全消化する。制限断片ｆ　Ｔｒｉｓ　−ｙＷフレート　ＥＤＴ Ａ緩衝液（ｐＨ８，３）中０．８％低融点アがロースダル上で分離する。　丑３ ．５　ｋｂ　ＤＮＡ断片ｉ、ＤＮＡバンドを含有する小ダルブロック中に単離す る。

上記の方法と同様にして、５μ？ずつのクローンｐＲ及びｐＹ　（第１表及び第 ８図を参照のこと）ｉｓａｌｌ及びＥｃｏＲＩで消化する。０．８　ｋｂ　ＤＮ Ａ断片を低融点アガロースゲルの小ブロツク中に単離する。

ベクターｐ３１の３．５　ｋｂ　Ｓａｔ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ断片０．６７μｆを 、それぞれ！ラスミドルＲ又はｐｙの０．８ｋｂＳａｌ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ断片 ０．３４　ｔｔ’ｉ−に連結する。ＤＮＡ断片を含有する適切なｒルブロックを 混合し、そして６５℃にて溶融せしめる。液化したダルを３倍に稀釈する。合計 容量２４０　ｔＪの６０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ＦＪ４７、５　）　、　１０　ｍ Ｍ　Ｍｇｅｔ２．１０　ｍＭ　ＤＴＴ　、　１　ｍＭ　ＡＴＰ及び７．４０　Ｕ のＴ　４　ＤＮＡリガーゼ（ビオラプス）中で１５℃にて一夜、連結を行う。２ μｊずつの連結アリコー）’１ｌｏＯμ！のカルシウム処理された形質転換コン ピテントＥ、コリＨＢ　１０１細胞に加える（例Ａａを参照のこと）。

８個の形質転換されたａｍｐＲコロニーｋｌｏＯμｍ鷹のアンピシリンを含有す るＬＢ培地中で別々に増殖せしめる。シラスミドＤＮＡ　全制限分析によ）分析 する。

各群のクローンは同一でちる。各１クローンをさらに使用し、そしてそれぞれｐ ３１Ｒ又はｐ３１Ｙと称する（第７図）。

ファルコン細胞培ｓフラスコ（１７５ｍ”）［１０ＸＩＯ個のＨｅＬａ細胞の一 次接種物を接種し、そして５チのウシ胎児血清を補充したダルベコの改変イーグ ル培地（ＤＭＥ　）　２５　ｄ中に保持する。コンフルエントに達するまで培地 ’ｔ３日ごとに交換する。

コンフルエント単層培養物’１ＰＢｓ（リン酸緩衝化塩溶液：溶液ｊ当りｓｏｙ のＮａＣｔ＊　２　ｔのＫＣｌ　ｓ１４．４５’のＮａ２ＨＰＯ４及び２１のＫ Ｈ２ＰＯ４〕で２回洗浄し、そして次に１０　ＯｎＰ／ｍ／のＴＰＡ　Ｔｈ補充 したＤＭＥ中で１６時間保持する。記載されているようにして（１３）　、細胞 溶解緩衝液を細胞単層に直接適用して、全Ｉ（ＮＡヲ抽出する。Ｎａｇａｍｉｎ ｅ等（１４）の方法に従って、ポＩＪ　（Ａ）−富化配列金全ＲＮＡから単離す る。

ＳＷ　−４１０−ターを装着したベックマン超遠心機中でシＷ−クロースグラジ ェント遠心分離を行う。

２００　ｔｔＡ　ノＨ２０中１００μｊｉ＋−ノボ！ｊ　（Ａ）　ＲＮＡ　Ｔｈ 、０、０２　Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈｅ２（ｐＩ（７，４）　ｐ　０．１　（＋　ＳＤ Ｓ　ｓ　Ｏ，０１Ｍ　ＥＤＴＡ　ｖ　０．０４　Ｍ　ＮａＣ４中１５−３０％’ ／ニークロースグラジェント金通して１８℃にて１２時間遠心分離する。このグ ラジェント’を底部から３６画分に分画し、そして０．２ＭのＮａＣ２及び２． ５容量のＥｔＯＨを添加することによってＲＮＡ　を沈澱せしめる。−２０℃に て一夜インキーペートした後、ＲＮＡ１遠心分離によシ回収し、そして２０μ！ のＨ２Ｏに溶解する。

ステージ６の卵母細胞を視覚観察によシ選択し、改変Ｂａｒｔｈ培地に保持し、 そして本質上（１５）に記載されているようにして、シュークロースグラジェン トからのｍＲＮＡ　ｆ注射する。注射された母卵細胞によるプラスミノーグンア クチベーターの分泌を、Ｎａｇａｍｉ　ｎｅ等（１４）によシ記載されているよ うにして放射カゼイン分解（ｒａｄｉａｌ　ｃａｓｅｉｎｏｌｙｇｉｓ　）によ り証明する。２１〜２３Ｓ画分を注射した卵母細胞において最大のＴＰＡ分泌が 見られる。

ｂ）　ｃＤＮＡ合成及び分子クローニングＴＰＡ　ｍＲＮＡについて濃縮された ＨｅＬａポリ（Ａ）　ＲＮＡｆ　ｃＤＮＡにコピーする。８μｍの５０　ｍＭ　 Ｔｒｉｓ・Ｈｅ４（ｐＩ（８，３）　、７５　ｒｎＷＩ　ＫＣＬ　＃　８　ｍＭ 　ＭｇＣｔ２ｚ　１　ｖ／ｖ％エタノール、　０．２　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　２ ５　ｐｆ／ｍｌオリゴｄＴｔ２−１８１０、５　ｍＭずりのｄＮＴＰ及び１２μ Ｃｉの〔α　Ｐ：］ｄＣＴＰにューイングランドニュクレア）。溶液を０℃に冷 却しそして３ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭＤＴＴ及び１４４ユニツトの逆 転写酵素（ライフサイエンス社）を加える。３９℃にて６０分分間−た後、追加 の３２ユニツトの逆転写酵素金加える。１００分間のインキュベーションの後、 ＳＯ３’（ｉ−０，２％にそしてＥＤＴＡ　ｋ　１５　ｍＭに加えることにより 反応を停止する。ｃ　ＤＮＡへの〔α３２Ｐ〕ｄＣＴＰの導入を、反応混合物の アリコートのトリクロロ酢酸沈澱により測定する。

８μｍのＲＮＡから１．１５μｍのｃＤＮＡを合成する（１４．４−のコピー） 。クロロホルム−イソアミルアルコール（２４：　１　ｖ／ｖ　）による２回の 抽出の後、水相を、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｔ（ｐＨ９）　、　１００ｍＭＮａ Ｃｔ、　１ｍＭ　ＥＤＴＡ中で遠心することによりセファデックスＧ５０フアイ ンの４−カラム（５Ｘ　Ｏ，５ｃｍ　）上で脱塩する。？イドボリウム画分をプ ールし、そしてＮａ０Ｈｋ　Ｏ，３Ｎに添加する。２０℃にて１２時間の後、Ｈ Ｃｌ　全０．３　Ｎに加え、そして３容量のエタノールを添加することによって 核酸を沈澱せしめる。第２鎖の合成を２００ｍＭのＮ−（２−ヒドロキシエチル ）−ヒヘラジンーＮ′−エタンー２−スルホン酸（ヘペス）　（Ｐ）ｌ　６．９ 　）　、　３０　ｍｙｔ　Ｋｃｔ　、　１０　ｍＰｒＩ　ＤＴＴ　、　１０ｍＭ Ｎ１ｒＣ２ｚ　−０，５ｍＭずつのｄＡＴＰ　、　ｄｃＴＰ　、　ｄＴＴＰ　。

並びに２５　ユニ、７トのＫｌｅｎｏｗ断片／μｍのｃＤＮＡ　ｆ含有する２０ ０μｊの溶液中で行う。２５℃にて２時間のインキュベーションの後、ＳＤＳ’ ｉ０．１％に加えることによって反応を停止し、そして溶液ｉ、３０醍酢酸ナト リウム（ｐｉ（４，５）　、　０．２　ｍＮａｃｌ　、　３ｒｎＮｉ　ＺｎＣｔ ｚ　ｖ　０．１　％　ＳＤＳ中で遠心することによりセファデックスＧ５０フア インの４ｔｎｔカラム上で脱塩する。２．５ユニット／−のヌクレアーゼＳｌ’ ｉ、ｔ’イドがリウム両分に加え、そして溶液金３７℃にて３０分間インキュベ ートする。溶液をフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（２４：２ ４：１ｖ／Ｖ　）で抽出し、そして水相中の核酸’ｋ　０．３　ＭＮａＣｌ及び ３容景のエタノールで沈澱せしめる。第１鎖に導入された［α　Ｐ］ｄＣＴＰの ７６％が８１消化後トリクロロ酢酸によシ沈澱し得る状態にあシ、そしてアルカ リ性アガロースダル上での分析（１６）は２末鎖ｃＤＮＡが５００〜約３０００ 　ｂｐＯサイズ範囲にあることを示す。ｄｓ　ｃＤＮＡ　ｆｔ１０　ｍＭ　Ｔｒ ｉｓ−ＨＣｊ　（ｐ）１７．４　）。

１００　ｍＭＮａＣｔ、　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　０．１１　ＳＤＳ中５〜２ ０チシェークロースグラジエント上でサイズ分画する。歴４１０−ター中で１２ ℃にて１０時間３９にで遠心した後、最大サイズのｃＤＮＡ　（全サンプルの４ ３チ）を含有する両分をプールし、そして０．３ＭへのＮａＣｔ、　５μシーＢ ｓＡ及び３容量のエタノールの添加によって沈澱せしめる。２５　ｎｆＦのサイ ズ画分したｃＤＮＡ　ｆ　（１７）に記載されているようにして、４５０ユニッ ト／−のターミナルトランスフェラーゼ。

０、ＩＭカコゾル酸カリ゛ウム（ＰＩ（７６５）　＊　２　ｒｎＭｉ　ＣｏＣ２ ２ｅ１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｔ　Ｏｌｌ　ｍＭ　ＤＴＴ及び５μＭの〔α　Ｐ）ｄ ＣＴＰ（２０μＣｉ）全含有する８５μの反応混合物中でｄａによりラベル形成 する。３０℃にて３分間置いた後、ＥＤＴＡ　ｋ　１０　ｍＭに、ＳＤＳ　ｆ　 ０．２　ｗ／ｖ　％に、そしてｔＲＮＡ　ｆ　１００μ？／ｍ／に添加すること によシ反応を停止する。溶液全クロロホルム−インアミルアルコールで２回抽出 し、そして２０　ｍＭ　Ｔｒｔｇ−ＨＣｔ（ｐＨ９）　。

１００　ｍＭ　ＮａＣｔ、　Ｚ　ｍＭ　ＥＤＴＡ中セフアセファデックスＧ５０ フアインカラム上で脱塩する。ポイドピリウム画分金プールし、そして０．３　 ＭへのＮａＣｔｅ　２５μシーのｔＲＮＡ及び３容量のＥｔＯＨの添加によシ核 酸を沈澱せしめる。２０ｎ１のラベル形成されたｄｓｃＤＮＡを、２０μ！の０ ．４　Ｍ　ＮａＣ４，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ：ＣＡ　（ｐＨ７、５）　、　ｌ 　ｍＭ　ＥＤＴＡ中で、６５℃にて１０分間、４５℃にて２時間、２２℃にて２ 時間そして次に４℃に徐々に一夜冷却して、Ｐｓｔ１部位においてｄＤによシテ イル形成された６０ｎ１のｐＢＲ３２２（１８）にアニールせしめる。アニール されたｃＤＮＡｆ：、、０℃にてコンピテントＥ、コリＨＢＩＯＩ／ＬＭ１０３ ５の懸濁液１．　ＯＯμ！と混合する（１９）。

０℃にて１５分間及び３７℃にて５分間インキュベートした後、細菌懸濁液に１ ．９−のＬＢを加え、そして３７℃にて２時間インキュベーションヲ続ケる。

１０μに賃のテトラサイクリンを含有するり、Ｂ寒天プレート上に細胞をプレー トする。１３％の再ア＝−ルしたベクターのバックグラウンド頻度を伴って１、 　Ｏ０個の形質転換体／ｎＬ？ベクターが得られる。

５４００個の形質転換体音コロニーから楊枝により〜２００μｌのＬＢ及び１０ μｖ讐のテトラサイクリン全収容する９６ウエルミクロタイターグレートに移し 、３７℃にて一夜増殖せしめ、そしてグリセリン全５０　ｖ／ｖ　％に添加した 後−８０℃で凍結保存する。

次の配列： ｄ５’　−ＧＧＣＡＡＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＡＧ−３’　及びｄ５’ 　−ＧＣＴＧＴＡＣＴＧＴＣＴＣＡＧＧＣＣＧＣＡＧ−３’を有する、ヒト組織 ゾラスミノーグンアクチベータ−ｃＤＮＡ　（２０）の２種類のオリゴヌクレオ チドを改変されたトリーエステル法（２１）により合成し、逆相ＨＰＬＣ及び調 製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動によシ精製する。このオリゴヌクレオチド ｉ　１　Ｘ　１０１０６ｃｐチエレンコフ）　／　ｐｍｏｌｅの比活性のＴ４キ ナーゼを用いて５′末端において（ｒ　Ｐ）ＡＴＰ　にエーイングランドニエク レア〕によりラベルする。

ミクロタイタープレートを解凍し、そして形質転換体培養物全６×８グリツドア レイ中の８２問ミリ、）？　７１（ＡＴＦニトロセルロースフィルターに移Ｌ、 １０μＰ／、ｄのテトラサイクリン全含有するＬＢ寒天プレート上で１８時間増 殖せしめ、そしてグラスミドを、１０　ｍＱｉ−のテトラサイクリン、１０μＰ ／ｍｇのクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天プレート上で１２時時間幅す る。１０％ＳＤＳで３分間：　０．５　Ｎ　ＮａＯＨｅｌ、　５　Ｍ　ＮａＣ１ で５分間：　０．５　Ｍ　Ｍｒｉｓ・ＨＣｌ　（ｐＨ８）　。

１、５　Ｍ　ＮａＣｔで５分間；そして２　Ｘ　５ＳＰＥ　（５ＳＰＥ　：０、 １５　Ｍ　ＮａＣｔ、　１０　ｍＭ　ＮａＨ，、ＰＯ４（ｐＨ７，４）　、　１ ｍＭ　ＥＤＴＡ　）で５分間、これらにより飽和されたワットマン３Ｍｋ−パー 上で各フィルターをプロットスることによ、！ｌ）　ＤＮＡ、　ｉフィルターに 固定する（７）。フィルターを空気乾燥し、次に真空中８０℃にて２時間加熱（ ｂａｋｅ　）する。加熱したフィルターヲ５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ（ｐＨ７ ，５）　、　１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　１ＭＮａＣ４１１ＳＤＳ中で３７℃に て２時間洗浄して付着している細胞破片を除去する。ハイブリダイゼーション及 び洗浄はＮａｇａｍｉｎｅ等（１，４）Ｋよシ記載されたようにして、ヌクレオ チドの長さ、ＧｔＣ含量、及ヒｓｕｇｇｓ等（２２）及びＳｍ１ｔｈ　（２３） によシ決定されているＴｍの実験的関係を用いて行う。フィルターを、ｘ、６ｍ ｔ／フ（ルターの９００　ｍＭ　ＮａＣ６＊　６０　ｍＭ　ＮＩＬＨ２ＰＯ４（ ＦＪ１７．４）、７．２　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　（６Ｘ　５ＳＰＥ　）　ｅ　０． 　ＩＷ／Ｖ％ずつのＢＳＡ　、ポリビニルピロリドン、フィコール４００（５ｘ デンハート溶液）、２００μシーｔＲＮＡ及び０．１　ｗ／ｖ％ＳＤＳ中で６０ ℃にて前ハイブリダイゼーション（２時間）及びハイブリダイブージョン（１２ 時間）金行う。　Ｐ−ラベルされた両オリゴヌクレオチドの混合物’ｅ　０．３ 　ｐｍｏｌ／＋１７！にて前ハイブリダイゼーション溶液に加える。ハイブリダ イゼーションの後、フィルターを６　Ｘ　ＳＳＣ（ＳＳＣ：０、１５　ｍＭ　Ｎ ａＣＬ　ｅ　１５　ｍＭクエン酸三ナトリウム）中で４℃にて３×１０分間及び ６０℃にて３×１０分間洗浄する。乾燥したフィルターをコダックＸＢ５　Ｘ− 線フィルムにデーポン強化スクリーンを用いて一７０℃にて３６時間露出する。

陽性のハイブリダイゼーションシグナル全生成するミクロタイターウェル全同定 し、そしてこれらの培養物からの個々のコロニーを上記のようにして、２重フィ ルターを各プローブに別々にハイブリダイブせしめ、そしてハイブリダイゼーシ ョン及びフィルターの洗浄に６３℃を用いて再スクリーニングする。両プローブ に陽性シグナルを示すコロニーをマスターフィルターかう拾い上げ、そして１０ μに−のテトラサイクリンを含有スルＬＢ中で３７℃にて一夜増殖せしめる。こ れらのコロニーの１つｉ　ｐＷ３４９Ｆと称する。改変したアルカリ溶菌法（２ ４〕及びこれに続（ＣｓＣ１平衡遠心を用いて！ラスミド調製物を得る。

シラスミドｐＷ３４９　ＦのＤＮＡ　全制限エンドヌクレアーゼＰｓｔ　ｌ及び Ｂｇｌ　ＩＩ　’ｊｃ用いて消化することにより分析する。制限断片は予想され たサイズのものである。

従って、プラスミドｐＷ３４９Ｆ　（７，１ｋｂ　）はヒト組織ノラスミノーダ ンアクチペーターの完全な構造遺伝子を含有すると結論される。

ＰＩ（０５ｆロモーター及びＰＨ０５シグナル配列を成熟ＴＰＡのコード配列に フレームを合わせて連結する。

ＰＨ０５転写停止シグナルもこの造成物中〈含まれる。

２μ２のｐＢＲ３２２／ＰＨ０５Ｂａｍ−８ａ）（第３図を参照のこと〕を制限 エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＳａミノ（いずれもビオラプス製）にょシ供 給者にょシ指示された条件下で切断することによって、ニプロモーターを含有す る６２３ｂｐ　ＢａｍＨＩ−８ａミノ断片を得る。単鎖ファージベクターＭ１３ ｍｐ９（１１）の複製型（ＲＦ）　２　ｐＰを同じ酵素で消化する。例Ｂに記載 したようＫして、両ＤＮＡ調製物を０．６％軟寒天グルに負荷する。グラスミド ｐＢＲ３２２／旦ＨＯ５Ｂａｍ−８ａノ由来の６２３　ｂｐ断片、及びＭ１３ｍ ｐ９由来の７．２ｋｂバンドを例Ｂｃに記載したようにして抽出する。１５０ｎ ｊＥの６２３　ｂｐ断片及び１５０１Ｆの７．２　ｋｂ　Ｍ１３ｍｐ９　ＤＮＡ 断片を２００−Ｌニラ）ＯＴ４ＤＮＡリガーゼ（ビオラプス）で１５℃にて４時 間、６ｏｍＭＴｒＩｓ−ＨＣｌ（ｐｉ−１７，５）、１０　ｍＭ　Ｍｇ　Ｃ１０ ，１０ｍＭ　ＤＴＴ及びｌ　ｍＭ　ＡＴＰ中で連結する。

Ｍｅｓｓｉｎｇ（１１）により記載されたようにしてＥ、コリ株ＪＭＩＯＩを形 質転換し、そして１２個の白色ノラークを拾い、そしてＲＦプラスミドの制限分 析（２５）により分析する。分析されたクローンのすべてがＭ１３ｍｐ９のＢａ ｍ−５μノ部位に挿入された６２３ｂｐ断片を含有する。

単一の分離体を選択し、そしてＭ１３ｍｐ９／ＰＨ０５Ｂａｍ−８ＩＬｉと称す る（第１１図参照のこと）。

２μノのプラスミドｐＷ３４９Ｆ　（例りを参照のこと）をＢａ■エンドヌクレ アーゼにニーイングランドビオラプス）によシ、供給者により与えられた条件下 で消化する。ＤＮＡをエタノール沈澱し、そして６ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ（Ｊ（ｐｉ （７，５）、５０　ｍＭ　ＮａＣノ、６　ｍＭ　ＭｇＣノ２中に再懸濁する。Ｄ ＮＡの３′の欠けた末端をＥ、コＩＪ　ＤＮＡポリメラーゼのに、ｌｅｎｏｗ断 片を用いて満たす。反応は５０μｌの合計容量中、２ユニットの酵素を用いて、 ８０μＭのｄＡＴＰ　、　ｄＧＴＰ　、　ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰの存在下で３７ ℃にて３０分間行う。フェノール抽出によりインキュページジンを停止し、そし てＤＮＡをエタノールで沈澱せしめる。

２μノのＲＦグラスミドＭ１３ｍｐ９／ＰＨＯＢａｍ−３ａＪを制限エンドヌク レアーゼＫｐｎＩ（ビオラプス）により供給者の指示の通りに消化する。ＤＮＡ をエタノールで沈澱せしめ、そして１０　μｌの２００　ｍＭ　ＮａＣノ、１　 ｍＭＺ　ｎ　ＳＯ４及び６０　ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐ）１４．６）中に再懸濁 スる。１ユニツトの８１エキソヌクレアーゼを加え、そして混合物を３７℃にて ６０分間、次に６５℃にて６０分間インキュベートする。ＤＮＡ　ｆ、ＤＥ５２ （ワットマン）イオン交換クロマトグラフィーにより精製し、そして次にエタノ ールにより沈澱せしめる。

１．５ｔｔｐのＢｇノ■消化され、Ｋｌｅｎｗ　ＤＮＡポリメラーゼ（上記参照 のこと）で処理されたｐＷ３４９Ｆを、１０μｊの容積中で、４　ｍＭ　ＡＴＰ を用いた他上記と同じ緩衝液中９００ユニツトのＴ　４　ＤＮＡ　ＩＪガーゼを 用いて、０．５μノのＫｐｎＩ切断されそしてＳ１消化されそしてホスファター ゼ処理されたＭ１３ｍｐ９／ＰＨ０５Ｂａｍ−８ａＪに連結し、そして室温にて １８時間インキーベーションを行う。Ｅ、コＩＪＪＭＩＯＩ　細胞を形質転換し 、６個の白色プラーグを選択し、そして（２５）に記載されているようにして単 鎖ファージ鋳型を調製する。２．ＯｋｈのＢμ■断片とＭＢｍｐ９ベクターとの 間の連結部のＤＮＡ配列の決定を、ジデオキシチェインターミネーション法（２ ６）を使用して行う。次のオリゴヌクレオチドプライマー： ５’　ＡＧＴＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＣＴＣＴＣ３’を用いる。

オリゴデオキシヌクレオチドはホスホトリエステル法により合成される。これは ニグロモーター内でハイブリダイズし、そしてＥ、コリＤＮＡポリメラーゼのＫ ｌｅｎｏｗ断片による、目的とするＤＮＡ連結点にわたる延長を可能にする。次 のＤＮＡ配列配置（亜亜蛋白質コード配列のＡＴＧから始まる）ニー　ＰＨ０５ 蛋白質コ一ド配列 −−−−−−ＴＰＡ蛋白質コード配列 を有する１つの正しい単離体が得られる。

この造成物をＭ１３ｍｐ９／ＰＨ０５−ＴＰＡと称する（第１１図を参照のこと ）。

１０μノのｐ３１Ｒ７’ラヌミドＤ、ＮＡ　悌７図を参照のこと）を制限酵素Ｓ ｍａ　ｌで消化し、ＤＮＡをフェノールで抽出し、そしてエタノール沈澱する。

ＤＮＡを１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣノ（ｐ’１８．０）中に０．５　ｍ９／ｍｔ！ の濃度で再懸濁する。

１０μノのＳａｍ　ｌ開裂したＤＮＡを２０のエンドヌクレアーゼＢａＪ　３１ 　（ＢＲＬ）により１ｏ　ｏ　ｔｔｌｌの２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐｌｔ８．０ 　）１　０　０　ｍＭ　ＮａＣノ、　１　２　ｍＭ　ＭｇＣＪ２、１　２　ｍＭ 　ＣａＣ！、及び１ｍＭ　ＥＤＴＡ中で消化する。３μノずつのＤＮＡのアリコ ートを、３０℃でのインキュベーションの９０秒、１２０秒及び１５０秒得に取 や出し、そしてすぐに５０μｌの７エノール及び６０μｌのＴＮＥと混合する。

フェノール／クロロホルムで抽出し、そしてエタノール沈澱した後、ＤＮＡを１ ０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣノ（ｒ’！８．０）に１００μｙ／ｒｎＩ！の濃度で 再懸濁する。Ｂａミノ３のエキソヌクレアーゼ消化を分析するため、各時間から のＤＮＡの０．７μノのアリコートをＨｉｎｄＩ［Ｉで消化し、そしてアガロー スゲル電気泳動により分析する。さらに分析するため、９０秒時点からのＤＮＡ を使用する。２．２μ）のプラスミドＤＮＡを３７℃にて１時間２．８ＵのＫｌ ｅｎｏｗ　ＤＮＡポリメラーゼ（ポリメラーゼＩの大断片、ＢＲＬ　）と共に、 ３５　μｌの６０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣノ（ｐＨ７，５）、ｌ　Ｑ　ｍＭ　Ｍ ｇＣノ２及び０．１　ｍＭ　ｄＮＴＰ中でインキュベートする。

３μりのＸｈｏＩリンカ−（５’−ＣＣＴＣＧＡＧＧ−３’、コラゴラティプ・ リサーチ）を５０μｌの６　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　＊ＨＣ！（ｐＨ７，５）、１０　 ｍＭ　ＭｇＣＪ２．４　ｍＭ　ＤＴＴ　、　０．５　ｍＭ　ＡＴＰ及び３５Ｕの Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ペーリンガー）中で３７℃にて３０分間キナー ゼ処理する。

０．６７μ２のキナーゼ処理されたＸｈｏＩ’Ｊンカー及び０．４μノのプラス ミドｐ３１ＲのＢａミノ３工理された平滑末端ＤＮＡを室温にて一夜２５　ｔｔ ｌの６０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ７，５）１０　ｍＭ　ＭｇＣノ２．５　ｍＭ 　ＤＴＴ　、　３．５　ｍＭ　ＡＴＰ及び４５０ＵのＴ４　ＤＮＡ　ＩＪガーゼ 中で連結する。連結されたＤＮＡを、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　０．３　Ｍ酢酸 ナトリウム（ｐＨ６，０）及び０．５４容量のイングロノ４ノール存在下でイン グロパノール沈澱によシ過剰のリンカ−から分離する。室温にて３５分間インキ −ベートした後、ＤＮＡを遠心分離により沈降せしめる。ペレットを空気乾燥し 、そして１７μｌの６　ｍＭＴｆｌｓ（ｐＩ（７，９）、１５０ｍＭＮａＣノ、 ６ｍＭＭｇＣノ、及び６ｍＭメルカプトエタノール中に再懸濁する。ＤＮＡに連 結されたＸｈｏＩリンカ−をＸｈｏＩによ）開裂せしめ、ＤＮＡを前記のように してイングロΔノールで沈澱せしめ、そして連結によシ環化する。５０μでの６ ０ｍＭＴｒｉｌＩ−ＨＣノ（ｐＩ（７，５）、１０　ｍＭＭｇＣＪ２．１０ｍＭ ＤＴＴ　、　１　ｍＭ　ＡＴＰ及び６００ＵのＴ４ＤＮＡアーゼ中１５℃での６ 時間の連結の後、１０μｌの各連結混合物を１００μｊのカルシウム処理された 形質転換コンビテン）Ｅ、コ！Ｊ　ＨＢＩＯＩ細胞に加える（例Ａａを参照のこ と）。

２４個のａｍｐＲコロニーを１００　ｍ９／ｌのアンピシリンを含有するＬＢ培 地中で別々に増殖せしめる。プラスミドＤＮＡ　Ｃｐ３１Ｒ（ＸｈｏＩ））を単 離し、そしてＨａｓ　ｍ消化により分析する。２個のシラスミドを選択し、そし てターミネータ断片中のＸｈｏＩ部位に隣接するヌクレオチド配列をＭａｘａｍ 及びＧ１１ｂｅｒｔ（１２）の方法によシ決定する。

ｄ）酵母ベクターｐＪＤＢ２０７への皿四−ＴＰＡバイブリド遺伝子の移行 Ｍｌ　３ｍｐ　９７ＰＨ０５−ＴＰＡのＲＦグラスミドの調製を上記のようにし て行う、２μりのこのＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ（ビオラプス ）及び５ａｉＩ（ビオラプス）で消化し、そして２．６ｋｂ断片を低融点アガロ ースゲル上での電気泳動により単離する（例Ｂｅを参照のこと）。同様にして、 ＰＨ０５ターミネータ−を含有するシラスミドｐ３１Ｒ（Ｘｈｏ　Ｉ　）の１３ ４　ｂｐ　Ｈｉｎｄ　ｍ　−ＸｈｏＩ断片１００　ｎ９を調製する。さらに、１ μノの！ラスミドｐＪＤＢ２０７（２９）をＢａｍ　ＨＩ及びＨｉｎｄ　ＩＩＩ により消化し、そして６．５ｋｂ断片を低融点アガロースゲル上での電気泳動に よシ単離する。

０．５μｙずつの３種の断片を２０　μｌｌの６０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣノ（ ｐＨ７，５）　、　１０　ｍＭ　ＭｇＣノ２、１０　ｍＭ　ＤＴＴ　、ｌ　ｍＭ 　ＡＴＰ中で２００ユニツトのＴ４　ＤＮＡ　ＩＪガーゼ（ビオラプス）により １５℃にて一夜連結する。例Ａａに記載したのと同様にしてＥ、コ’Ｊ　ＨＢＩ Ｑｌの形質転換を行いアンピシリン耐性コロニーをスクリーニングする。４個の コロニーを拾い、グラスミドＤＮＡを調製しくＭａｎｉａｔｉｓ等、参照文献７ ．９２頁ン、そしてＤＮＡを次の制限部位、標識として：　ＢａｍＨＩ、　Ｈｉ ｎｄｌ［ｌ、ＢｓｔＥＵを用いて分析する。すべての単離体が正しいことが見出 される。グラスミドの１つをｐＪＤＢ２０７カ１匹−ＴＰＡ（ＩＡ）Ｈａｔｔｏ ｒｉ等（３４）により記載されているフイデルム・ボリセファルムのｒ　ＤＮＡ の２．１ｋｂＳａノ１制限断片制限法を用いてｐＢＲ３２２にクローン化する。

得られるシラスミドｐＢＲ３２２／ｒＤＮＡ　２．１はｒＤＮＡ挿入部内に１個 のＳｍａ　］制限部位を有する。従って、このグラスミドをＳｍａ　Ｉで切断し 、そしてＰＨ０５プロモーター、ＴＰＡ構造遺伝子及びＰＨ０５ターミネータノ を含有する第２図に記載されている２、７　ｋｂ　ＢａｍＨＩ制限断片を挿入す る。

Ｓｍａ１部位へのＢａｍＨＩ断片のクローニングを可能にするため、ＢａｍＨＩ 部位の欠けた３′末端をＥ、コリポリメラーゼ１のＫｌｅｎｏｗ断片を用いて満 たす。今やＴＰＡ遺伝子はｒＩ５ＮＡ配列を両端に有し、そして自己複製ｒＤＮ Ａ配列を含有する酵母株中に導入される。形質転換体の検出を促進するため、Ｈ ｉｃｋｓ等（３２）の同時形質転換技法を使用する。同時形質転換グラスミドは Ｂ　ｒｏａｃｈ等（３３）により記載されているＹａｐ　１３である。

この方法はまた、形質転換された酵母株から単離することができそして次に他の 細胞、例えば植物細胞、又は哺乳動物細胞に導入することができる他のｒ　ＤＮ Ａ　／外来性遺伝子バイブリドのインビボ造成のためにも適用することができる 。

例９　Ｐ、稈、のｒＤＮＡによるニコチアナ・タバクムｅ、Ｖ、ベチト・ハバナ ＳＲＩの細胞の形質転換 形質転換のため次のサンプルを使用した：サンプル１：１０μノのｐ、ｐ、のｒ ＤＮＡ＋１０μノのプラスミドｐＡＢＤＩ＋３０μノのウシ胸腺キャリヤーＤＮ Ａ０サンプル２：　１０１１９のＰ、ｐ、のｒＤＮＡ　＋　４０　／１Ｆのウシ 胸腺キャリヤーＤＮＡ　。

サンプル３　：　１０ｔｔ９のＰ、ｐ、のｒＤＮＡ　。

ａ）　ｐＡＢＤＩプラスミドの造成（第１４図）自由に入手可能なプラスミドｐ Ｋｍ　２１及びｐＫｍ２４４（Ｂｅｃｋ、　Ｂ、等、Ｇａｍｅ　１９，３２７− ３３６（１９８２））　をＰｓｔ　ｌ制限エンドヌクレアーゼで切断する。組換 のために使用されるグラスミドの断片を０．８％アガロースゲル中電気泳動によ シ精製する。この断片の組合わせから生ずるグラスミドｐＫｍ２１２４４は、１ ３ｓｃｋ等、Ｇｅｍｅ　１９．３２７−３３６（１９８２）　Ｋ記載されている ように、ＮＰＴ　ＩＩ遺伝子の５′−及び３’　−Ｂａミノ３欠失の組合わせを 含有する。グラ２ミドｐＫｍ２１２４４のＨｉｎｄ’［ｌ断片へのカリフラワー モザイクウィルスのプロモーターシグナルの連結を、リンカ−プラスミドｐ　Ｊ ＰＡＸを造成することにより行う。このカップリンググラスミドｐＪＰＡＸはシ ラスミドｐＵＣ８及びｐＵＣ９［Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ。

及びＪ、　ＶｉｅｉｒａＳＧｅｎｅ　１１９　、２６９−２７６（１９８２）か ら得られる。プラスミドｐＵＣ９のリンカ−配列の１０塩基対をＨｉｎｄ　ｍ部 位及び５μノ１部位における制限にょジ除去し、そして生ずる接着末端を、ポリ メラーゼＩＫｌｅｎｏｗ断片で処理することによシフイル−インし（Ｊａｃｏｂ ｓｏｎ　、　Ｈ，等、Ｅａｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、旦、６２３（１９７４ ））そしてヌクレオチド鎖を連結し、こうしてＨｊｎｄ［１部位を回復する。８ 塩基対の合成Ｘｈｏｌ　ＩＪンカーをこの除去されたリンカ−配列のＳｍａ　１ 部位に挿入する。プラスミドｐｔｒｃｓ及び変形されたグラスミドｐＵＣ９の適 切なＸｏｒ　Ｊ及びＨｉｎｄ　ＩＩＩ断片の組換えが、制限部位の次の配列：　 ＥｃｏＲＩ　、　ＳＭａ　Ｉ、Ｂａｍ　ＨＩ、Ｓａ）■、Ｐｓｔ　Ｉ　、　Ｈｉ ｎｄ　ＩＩＩ、Ｂａｍ　Ｈｌ　、　Ｘｈｏ　Ｉ及びＥｃｏＲＩを含有する部分的 に非対称のリンカ−配列を有するグラスミドｐＪＰＡＸヲもたらす。ＣａＭＶ遺 伝子ｖｒの５′発現シグナルとＮＰ’ｒ　Ｉｔ遺伝子のＷｉｎｄｙ断片との連結 を、シラスミドｐＪＰＡＸ上で、Ｐｓｔｌ及びＨｊｎｄ　ＩＩＩ部位間Ｋ　Ｃａ ＭＹ　ＶＩ遺伝子のプロモーター領域を挿入することによシ行う。こうして得ら れたプラスミドをその１個のＨｉｎｄ　ｍ部位において制限切断し、そしてグラ スミドｐＫｍ　２１２４４の！（ｉｎｄｌｌｌ断片をこの制限部位に、両方向に 挿入してグラスミドｐＪＰＡＪＸ　ＣａＫｍ＋及びｐＪＰＡＸ　ＣａＫｍ−を得 る。ＮＰＴ　ｆｆ−”イブリド遺伝子の３′−末端領域の近傍にＥｃｏＲＶ部位 を設けるため、プラスミドｐ　ＪＰＡＸ　ＣａＸｍ＋のＢａｍＨＩ断片をプラス ミドｐＢＲ３２７（Ｓｏｂｅｒｏｍ、　Ｘ、等、Ｇｅｎｅ旦、２８７−３０５（ １９８０））のＢａｍＨ１部位に挿入し、グラスミドｐＢＲ３２７ＣａＫｍを得 る。新しいＤＮＡ構成を含有する、プラスミドｐＢＲ３２７ＣａＫｍのＥｃｏＲ Ｖ断片を用いてＣａＭＶ遺伝子ＶＩＯＥｃｏＲＶ部域と置き換え、これをプラス ミドｐＵＣ８中の５ａＪ１１部位においてクローン化し、こうしてＮＰＴ　ＩＩ 遺伝子の蛋白質コードＤＮＡ配列をカリフラワーモザイク遺伝子ＶＩの５′及び ３′発現シグナルの制御のもとに置く。こうして得られたグラスミドをそれぞれ ｐＡＢＤ　Ｉ及びｐＡＢＤ■と称する（第１図を参照のこチアナ・タバクムｃ、 ｖ、ベチト・ハパナＳＲＩの原形質体の形質転換 ２Ｘ１０９家の集団濃度のタバコの原形質体を、０．１ｍ９／ＩＩ）２．４−ツ クｏｏ７ｘ／キシ酢酸、１．０　ｍ９／１１の１−ナフチル酢酸及び０．２　ｍ ９／ｌの６−ペンノルアミノプリンを含有するｌ　ｍｌのに２培地（：Ｚ　、　 Ｐｆ　ｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏ−１ｏｇｊｅ７８．４５３−４５５　（１９７ ６）　：　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ旦（１９８１）１６５−１７５ ）に懸濁する。この原形質体は、ｐ）１５．８の０．６Ｍシー−クロースに浮遊 せしめ、そして次にｐＨ５，８の０．１７Ｍ塩化力ルシクム中で沈澱せしめる（ ｉｏｏｐ、ｓ分間）ことによシ酵素懸濁液からあらかじめ得たものである。この 懸濁液に、改変した（オートクレーブ処理後再びｐＨ５，８に調整した）Ｆ−培 地（Ｎａｔｕｒｅ　２９６．７２−７４（１９８２））中４０チのポリエチレン グリコール（ＰＥＧ）（分子量６０００）Ｑ、　５　ｒＲｌ　、及びサングル１ を含有する水性液６５μｌを次々に加える。この混合物を、時々攪拌し、そして 次に段階的にＦ培地で稀釈しながら２６℃にて３０分間培養する。原形質体を遠 心分離（１００ＰＫて５分間）にて単離し、そして３ｏｍｌの新たなに３培地に 再懸濁する。追加のインキーベーションを、１０ｍ／ずつにわけて、直径１０ｃ ｒｎのベトリ皿中で２４℃にてそして暗中で行う。集団の濃度は６．３Ｘ１０’ 原形質体／ｍｌである。３日後、各皿中の培地を０．３容量部の新たなに、培地 で稀釈し、そして２４℃及び３０００ルクスにてさらに４日間インキュベートす る。合計４日間の後、原形質体から生じたクローンを、１チのアガロースを有し そして５０ｍ９／ｌのカナマイシンを含有する固化した培地中に埋め込み、そし て２４℃にて暗中でビーズ型培養法（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ、 　２゜２４４−２４７（１９８３））によシ培養する。培地を５日ごとに同じ種 類の新鮮な培地と取υ替える。１個のカナマイシン耐性クローンを回収し、そし てカルス系として増殖せしめ、そしてｒＤＮＡの存在について分例９ｈ　に記載 したようにして形質転換を行った。

カナマイシンの選択圧を伴わないでカルスクローンを増殖せしめた。ｒＤＮＡの 存在についてさらに分析するため、各処理からの５種類のクローンを無作為に選 択した。

ｄ）タバコ植物の再生 カナマイシン含有培地（サンプル１）中での３〜４週間の連続培養の後、直径２ 〜３ｎの耐性カルスを、０．０５ｍ９７１の２，４−ノクロロフェノキシ酢酸、 ２ｍ９／ｌ　ｔｖ　１−す７チル酢酸、ｏ、　ｉ　ｍｑ７ｚの６−ベンジルアミ ツノリン、０．１ｉｎ９／７３０カイネチン及び７５ｍ９／１のカナマイシンを 含有する寒天固化ＬＳ培地（Ｐｈｙｓｉｏｌ。

Ｐｌａｎｔ　１８．１００−１２７（１９６５））に移す。ｉｓｏ＋ｘのカナマ イシン及び０．２　ｍ９／ｌの６−ベンジルアミノプリンを含有するＬＳ培地上 で新芽を誘導し、そして次にＴ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ　１６３．８５−８７（１ ９６９））上で発根せしめることによシ、カナマイシン耐性のニコサンプル２及 び３のクローンはカナマイシン無しで再生した。

ｅ）カルスクローン及び葉組織からのＤＮＡの単離０．５Ｆのカルス又は葉組織 のサングルを、１５チシユークロース、５０　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　０．２５　 Ｍ　ＮａＣ！、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣノ（ｐＩ（８，０）を含有する緩衝液３ 　ｍｌ中、ダウンスホモソナイデー中でホモジナイズした。このホモジネートを １０００Ｐにて５分間遠心分離することによす粗核ペレットを得、これを、１５ チシュークロ−ス、５０　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＩＣノ （ｐＨ８，０）を含有する２　ｍｌの緩衝液に再懸濁した。ＳＤＳを０．２　ｗ ／ｖ　％の最終濃度に加えた。サンプルを７０′ｃＫて１０分間加熱した。室温 に冷却した後、酢酸カリウムを０．５Ｍの最終濃度に加えた。０℃にて１時間の インキーヘーションの後、生成した沈澱をエラ槓ンドルフ遠心機中で４℃にて１ ５分間沈降せしめた。上清中のＤＮＡを室温にで２．５容量のエタノールで沈澱 せしめた。例２においてＳ、セレビシェ−について記載したのと同様にして、ｒ ＤＮＡの存在についてＤＮＡをさらに分析した。この結果はＰ、ｅ、のｒＤＮＡ の存在を示した。

前記の方法と同様にして、構造遺伝子を含有するｒＤＮＡを用いてニコチアナ・ タバクムを形質転換することができる。

第１〜１４図の説明 第１図：フィザルム・ポリセ７アルムの゛線状染色体外ｒ　ＲＮＡの部分制限地 図、及びフィデルム・ポリセファルムのＢｇｊ！■消化されたｒ　ＤＮＡへのＢ ａｍＨＩ／Ｂｇノ■連結を伴う、Ｂａｍ　ＨＩ制限部位を両端に有する２、７ｋ ｂ　ＰＨ０５−ＴＰＡ断片の連結。

第２図：　ＢａｍＨＩ制限部位を両端に有する２、７　ｋｂ　ＰＨ０５−ＴＰＡ バイブリドの造成。

第３図：　ＤＮＡ配列決定及びシラスミド造成のための出発グラスミドｐＪＤＢ 　２０７／ＰＨ０５、ＰＨ０３、及びｐＢＲ３２２７ＰＨ０５Ｂａｍ　−ＳａＪ 。

第４図ニブラスミドル３０の造成。

第５図：発現プラスミド３１の造成。

第６図：　Ｓａｕ　３Ａ−Ｐｓｔ　Ｉ　ＰＨ０５転写停止断片のヌクレオチド配 列。

第８図：矢印の位置にＥｃｏＲＩ　！Ｊンカーを有する、ＰＨ０５領域中のＢａ ミノ３除去の集合。

第９図：ＰＨ０５Ｒプロモーター領域を含有するＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ制限断 片のヌクレオチド配列。

第１０図：　ＰＨ０５Ｙ　ｆ　ｏモーター領域を含有するＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲ Ｉ制限断片のヌクレオチド配列。

第１１図：　Ｍｌ　３ｍｐ　９／ＰＨ０５−ＴＰＡの造成。

第１２図：第２図において使用される出発シラスミドであるｐＪＤＢ　２０７／ ＰＨ０５−ＴＰＡ（Ｉａ）の造成。

第１３図：　ｒＤＮＡ／ＴＰＡセグメントの造成及びＰ、ｐ、のｒＤＮＡへのイ ンビデ挿入。

第１４図：ＮＰＴ−１１構造遺伝子を含有するプラスミドＰＡＢＤ　ｌの造成。

添付図面の図中で使用されている記号は次の意味を有する。

：　ｐ　ＢＲ３２２配列 ［■■■コ　即用、ＰＨ０５領域に由来する酵母染色体ＤＮＡ／／／／／　酵母 ２μシラスミドＤＮＡミ＝ミ、ＬＥＵ２領域由来の酵母染色体ＤＮＡａｍｐＲア ンピシリン耐性遺伝子 ｔｅｔＲテトラサイクリン耐性遺伝子 ＝に）Ｈ＝　制限部位の欠失 −ＴＰＡ遺伝子 ２工♀２エ　ｐＢＲ３２２中の欠失 ↓　制限部位 ：＝＝＝　転写の方向 ＝ロエ　リンカ−ＤＮＡストレッチ 参照文献 １、　Ｂｒａｕｎ、Ｒ，及び５ｅｅｂｅｃｋ、Ｔ、　（１９７９）。リボゾーム ＤＮＡ　：フィデルムの染色体外遺伝子、Ａｌｆｒｅｄ　Ｂｅｎｚｏｎ　Ｓｙｍ ｐ、　ＩＬ３０６−３２０゜ ２、　Ｌｏｎｇ、　Ｅ、Ｏ，及びＤａｗｉｄ、１．Ｂ、（１９８０）。真核細胞 中の反復遺伝子。Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　４９．７２７−７６ ４゜３、Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌ、２７（１）、　１９８０．３７−５８゜４、　Ｄ ａｎｉｅｌ、　ＪＷ、及びＢａｌｄｗｉｎ、　Ｈ，Ｈ，（１９６４）。Ｐｒｅａ ｃｏｔｔ、　Ｄ、Ｍ。

編。グラスモディアルミキ″！；ミセーテスの培養方法。

Ｍｅｔｈ、　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｊｏｌ、　Ｖｏｌ　ｌ、　９−４１゜５、　Ｂ ｅｈｒｅｎａ、　Ｋ、、　５ｅｅｂｅｃｋ、　Ｔ、及びＢｒａｕｎ、　Ｒ，（１ ９８２）　ｏ　Ａｌｄｒｉｃｈ。

Ｈ，Ｃ，及びＤａｎｉｅｌ、　Ｊ、Ｗ、編。リボゾームＤＮＡの調製。

Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｐｈｙａａｒｕｍ　ａｎｄ　Ｄｉｄｙｍｉｕ ｍ　Ｖｏｌ　ＩＩ、　３０１−３０６゜６、　Ｂｅａｃｈ及びＮｕｒｓｅ、　Ｎ ａｔｕｒｅ　２９０．１４０．（１９８１）。

７、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍ ａｎｕａｌ　（編集Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ。

Ｅ、Ｆ、Ｆｒｉｔｇｃｈ、　Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ。

１９８２、　ｐ、１７７゜ ８、　Ｂ　、　Ｍｅｙｈａｃｋ等、ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ上、　６７５（１９ ８２）。

９、　Ｍ、　Ｒａｎｂｙ、　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　’Ｂｅｔｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ 　７０４．　４６１（１９８２）。

１０、　Ｍ、　Ｍａｎｄｅｌ等、　Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　５３．１５９（ １９７０）。

１１、　Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　ｔｈｅ　３ｒｄ　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ　Ｓｙ ｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅ−ｃｕｌｅｓ：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａ ｎｔ　ＤＮＡ　（編Ａ、Ｗａｌｔｏｎ）　、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ。

Ａｍｓｔｅｒｄａｍ　１９８１　、　ｐ、　１４３゜１２、　Ａ、Ｍ、　Ｍａｘ ａｍ等Ｓ”Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ’。Ｖｏｌ、　６５゜ ｐ、４９９．ニューヨーク　１９８０゜１３．　Ｐ、Ｍ、　Ｌｉｚａｒｄｉ等、 Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、９６．　１１６（１９７９）。

１４、　Ｙ、　Ｎａｇａｍｉｎｅ等、Ｃｅ１ｌ　３２．　１１８１（１９８３） 。

１５、　Ｊ　、　Ｂ　、　Ｇｕｒｄｏｎ等、Ｊ、　Ｅｍｂｒｙｏｌ、　Ｅｘｐ、 　Ｍｏｒｐｈｏｌ、　３６　、５２３（１９７６）。

１６、　Ｍ、Ｗ、ＭｃＤｏｎｎｅ＋等、Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１１０．　 １１９（１９７７）。

１７、　Ｇ、Ｄｅｎｇ等、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、旦、　４１７３（ １９８１）。

１８、　Ｌ、Ｖｉｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａ ｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　７５゜３７２７（１９７８）。

１９、　Ｄ、Ａ、　Ｍｏｒｒｊｓｏｎ、　”Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ ｏｌｏｇｙ’、ｖｏｌ、　６８゜３２６（１９７９）。

２０、　Ｔ、　Ｅｄｌｕｎｄ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ 、　ＵＳＡ８０，３４９（１９８３１２１、Ｈ，Ｉｔｏ等、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ ｓ　Ｒｅｓ、　１０．　１７５５（１９８２）。

２２、　Ｓ　、　Ｖ＋Ｓｕｇｇｓ等、’Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｂｉｏｌ ｏｇｙ　ｕｓｉｎｇ　ｐｕｒｉＨｅｄｇｅｎｅｓ’、　ＩＣＮ−ＵＣＬＡ　ｓｙ ｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　ｃｅｌｌｕｌａｒｂｊｏ ｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、　２３（ｅｄ、　Ｄ−Ｄ、　Ｂｒｏｗｎ及びり、　Ｆ、　Ｆ ａｘ）、　ｐ、６８３（１９８１）。

２３、　Ｍ、Ｓｍｊｔｈ、　”ＭｅＬｈｏｄｓ　ｏｆ　ＲＮＡ　ａｎｄ　ＤＮＡ 　ｓｅｑｕｅｎｃｆｎｇ’（編Ｓ、Ｍ。

Ｗｉｓ８ｍａｎｎ　）　、　Ｐｒａｅｇｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ニューヨ ーク１９８３゜２４、　Ｈ，Ｃ，Ｂｉｒｎｂｏｉｍ等、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅｓ、ヱ、１５１３（１９７９）。

２５、　Ｊ　、　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　”Ｍ１３　ｅｌｏｎｉｎｇ／Ｉ）ｉｄｅｏ ｘｙ　Ｓｅｑｕｅｎｅｔｎｇ”（ＥＭＢＯ−ｃｏｕｒｓｅ　ｍａｎｕａｌ）　、 １９８１゜２６、マニュアル”Ｍ１３　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ＤＮＡ　ｓｅ ｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ’。

ニューイングランドビオラプス。

２７、　Ｋ、　Ｉ　ｔａｋｕｒａ等、Ｊ、Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓａｃ、　９７ ．７３２７（１９７５）。

２８、　Ｊ、Ｆ、Ｍ、ｄｅ　Ｒｏｏｉｊ等、Ｒｅｅｌ、　Ｔｒａｙ、　Ｃｈｉｍ 、Ｐａｙｓ−Ｂａｓ　９８゜５３７（１９７９）。

２９、　Ｊ、Ｄ、Ｂｅｇｇｓ、　”Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、 　Ｖｏｌ、　２．　ｐ、１７５゜ニューヨーク　１９８１゜ ３０、　Ａ、Ｈｉｎｎｅｎ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ　 、　ＵＳＡ　７５　、１９２９（１９７８）。

３１、Ｆｅｒｒｉｓ及びＶｏｇｔ、　Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１５９．３５ ９（１８２）。

３２、　Ｈｉｃｋｓ、　Ｈｉｎｎｅｎ、　Ｆｉｎｋ、　ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ 　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎ　Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ　Ｂｉｏ ｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、　ＸＬＩＩＩ、１３０５．（１９７９）。

３３、　Ｂｒｏａｃｈ等、Ｇｅｎｅ　８　、１２１−１３３（１９７９）。

３４、　Ｍ、Ｈａｔｔｏｒｉ、　Ａ、Ｌｊｌｊａｎａ及びＹ、　５ａｋａｋｉ、 　Ｎｕａｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲａｓ、　１２．　２０４７−２０５３（１９８ ４）。

３５、　Ｊ、Ｗ、５ｈｏｓｔａｋ、　Ｅ、Ｈ，Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ、　（１９８ ２）、Ｃｅ１ｌ　２９゜２４５−２５５゜ Ｆ４二”２　Ｐ、ｐ／ｌ　ｙＤＮＡへｔｒ＋ｙ、１ｋｂ　ＰＨ０５−ＴＰＡ　Ｑ Ｍ　’連４ＢＢａｎｉＨＬ　Ｚ＋ｇ　Ｂ！１１π／ｌ　ｔ−７′Ａｒ；よ、ｔ４ 　ｔ’Ｊｉ’３Ｈｌｙ：侶−’４ｉ　１２、’ｌｋｂ凸乙万“Ｊｌδ逆Ｊ旬テ＋ ｓ％、イ中べ了３二とｑ−て°“テる二ｉｇ−２二　ＢａｍＨＸ　ｆＪｌ’ｌｊ 音７１立と内を島１−局Ｔ！　ｐＨｏｓ　−ＴＰ八へへア・νＦ・のし ｐＢｒ　３２２と−ＴＰム（Ｂａａｌｌｌｌ二　ＤＮＡ白珠シ侯及“ひ・毫■９ −７・う又ミド一つｊＬＪ〜、ｔｎｒ＝ノつ丙七傘シアーラスミド”虫」とでμ 二丘二」八−− Ｅｋ　・　乱フΦラスミｌ−＋　３１の１戊Ｆｉｇ、６　、：　Ｐｓａｕ３Ａ　 −ＰｓｔＩ　玉！＝’ｒ（Ｉよ−７７し７＋ト−品乙判（：ＡＴＣＣＥＧＴＡＣ ＧττＣＣＴＣＡＡＣＧＴＣＣＴＣＣτＧＴＣＴＡＣ，〜ＣＣＣＡＡＡＡＡτＴ ＣＣＡ）、ＴＣττＣＴＡＡＣ（：ＡＣＡＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＡτＡＣＧＴＣ ＡＴＴＡＡＣＣ：ＡＴＧＣＴ（：ＴＴＧＴＴＣＣＡＡＴＴＣＡＡＡＣＣτＧＴＴ ＣＣＡＣＴＧにＴＣＣＡＧＧＧＴＴＣＴＣＴＴＧＴＧＡＡＡＴＣＡＡＴＣＡＣＴ ＴＣＴＡＣＧＡＣＴＡＴＧＣＴ（：ＡＡＡＡＧＡＣＡＧＴＡＣＣＣＯＧｒＡＣＴ ＧＡＣＴＴＣＣＴＡＡＡＧＧＴＣＴＧＴＡＡＣＧＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＴ ＡＡＣＴＣＴＡＣＴＧＡＡＴＴにＡＣＣＴ患ＣＡτＴＡＡＡＡＴＣτＣＣｋ 、口１ユ１　、　突５県７・ラス２ミドＰ３岬　ＰＨ０Ｈシフ゛ナルＯ乙ｌ−に 礼式　−特衣昭６１−５０２３７７　（２７） シ巳り旦７’ｏＨ７７’−鉤、繊ｌ肩口８２−）（Ｌ−ＥζｏＲ’Ｌ蓬ＪＰ艮断 りのスフし才＋μ″θ己ゲづ ＣＡＡＡｎｃｃＴｃＡｃｃｒｒＡｃｎｃ＋χＡＡＧＧＣＡＴＡＴＡＣＣＣＡｍＧ ＧＧＡＴＡＡＣＥＴＡＡＡＣＡＴＣＴ１ズＣＴτＣＡＴＣＴＣτＣ人τＣＡＣ人 ＡＴＡＡＧＡＡＣＡＪＣＡＡＣλＡＡＴＡＧＡＧＣＡＡにＣλλＡＴＴＣＧＣＧ ジ□ヨ旦、ＰＨＯ！ｒＹ　７’０Ｌ−９−４９，ｊＡｔ含７ｉ＋　ｆ　３　Ｂａ ｒｙ＋Ｈ１−ＥｃｏＲｌ、　＋’ｆ’ｌｌ’ｉＭＭの２７Ｌｆ− Ｑμλττ ＣＴＴＣＡＴＣＴＣＴＣＡＴＧＡＧＡＡＴＡＡＧＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡτＡ ＧＡＧＣＡＡＧＣＡＡ、ＡττＣにＡＣＡＴＴＡＧＧＦｉｌｌ　１１：　ＭＩＪ ｍｐ９／ＰＨ０５−丁ＰＡＭｉＥｓｔ。

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Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. １．染色体外ｒＤＮＡ又はその機能的断片及びポリペプチドをコードする外来性 構造遺伝子を含んで成る真核性ハイブリドベクター。
2. ２．前記染色体外ｒＤＮＡが２つの門サコロマスチゴフェラ（Ｓａｃｏｒｏｍａ ｓｔｉｇｏｐｈｅｒａ）及びシリオフェラ（Ｃｉｌｉｏｐｈｅｒａ）の、例えば 目ジクチオステリイダ（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｉｄａ）、フィザリダ（Ｐｈｙ ｓａｒｉｄａ）、テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎｉｎａ）、ペニクリナ（ Ｐｅｎｉｃｕｌｉｎａ）、及びスポラドトリチナ（Ｓｐｏｒａｄｏ−ｔｒｉｃｈ ｉｎａ）の原生動物に由来する請求の範囲第１項記載の真核性ハイブリドベクタ ー。
3. ３．前記染色体外ｒＤＮＡがジクチオステリウム・ジスコイデウム（Ｄｉｃｔｙ ｏｓｔｅｌｉｕｍ　ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）、テトラヒメナ・スペシス（Ｔｅｔ ｒａｈｙｍｅｎａ　ｓｐｅｃｉｅｓ）、パラメジウム・スペシス（Ｐａｒａｍｅ ｃｉｕｍ　ｓｐｅｃｉｅｓ）、オキシトリカ・スペシス（Ｏｘｙｔｒｉｃｈａ　 ｓｐｅｃｉｅｓ）、又はスチロリヒア・スペシス（Ｓｔｙｌｏｒｉｃｈｉａ　ｓ ｐｅｓｉｅｓ）に由来する請求の範囲第１項記載の真核性ハイブリドベクター。
4. ４．前記染色体外ｒＤＮＡがフィザルム・ポリセファルム（Ｐｈｙｓａｒｕｍ　 ｐｏｌｙｃｅｐｈａｌｕｍ）に由来する請求の範囲第１項に記載の真核性ハイブ リドベクタ。
5. ５．ＢａｌＩＩ消化によって得られるフィザルム・ポリセファルムの染色体外ｒ ＤＮＡの機能的断片が使用される請求の範囲第１項に記載の真核性ハイブリドベ クター。
6. ６．前記構造遺伝子が酵素をコードしている請求の範囲第１項に記載の真核性ハ イブリドベクター。
7. ７．前記構造遺伝子がポリペプチドホルモンをコードしている請求の範囲第１項 に記載の真核性ハイブリドベクター。
8. ８．前記構造遺伝子が免疫調節ポリペプチドをコードしている請求の範囲第１項 に記載の真核性ハイブリドベクター。
9. ９．前記構造遺伝子が抗−ウイルス性又は抗−腫瘍性ポリペプチドをコードして いる請求の範囲第１項に記載の真核性ハイブリドベクター。
10. １０．前記構造遺伝子が抗体をコードしている請求の範囲第１項に記載の真核性 ハイブリドベクター。
11. １１．前記構造遺伝子がウイルス抗原をコードしている請求の範囲第１項に記載 の真核性ハイブリドベクター。
12. １２．前記構造遺伝子がワクチンをコードしている請求の範囲第１項に記載の真 核性ハイブリドベクター。
13. １３．前記構造遺伝子が凝固因子をコードしている請求の範囲第１項に記載の真 核性ハイブリドベクター。
14. １４．前記構造遺伝子がヒトＴＰＡをコードしている請求の範囲第１項に記載の 真核性ハイブリドベクター。
15. １５．前記構造遺伝子が植物病害虫に対する耐性をもたらすポリペプチドをコー ドしている請求の範囲第１項に記載の真核性ハイブリドベクター。
16. １６．前記構造遺伝子が高温に対する耐性をもたらすポリペプチドをコードして いる請求の範囲第１項に記載の真核性ハイブリドベクター。
17. １７．前記構造遺伝子が乾燥に対する耐性をもたらすポリペプチドをコードして いる請求の範囲第１項記載の真核性ハイブリドベクター。
18. １８．前記構造遺伝子が全植物体又はその部分の生長を促進するポリペプチドを コードしている請求の範囲第１項記載の真核性ハイブリドベクター。
19. １９．前記構造遺伝子がプロモーター及び／又は他の制御配列にリンクしている 請求の範囲第１項に記載の真核性ハイブリドベクター。
20. ２０．前記構造遺伝子が酵母ＰＨ０５プロモーターにリンクしている請求の範囲 第１項に記載の真核性ハイブリドベクター。
21. ２１．遺伝的マーカー配列をさらに含んで成る請求の範囲第１項に記載の真核性 ハイブリドベクター。
22. ２２．請求の範囲第１〜２１項のいずれか１項に記載の真核性ハイブリドベクタ ーの製造方法であって、ポリペプチドをコードする外来性構造遺伝子及び場合に よっては追加のＤＮＡ配列をインビトロ又はインビボブ染色体外ｒＤＮＡ又はそ の機能的断片に導入することを特徴とする方法。
23. ２３．請求の範囲第１〜２２項のいずれか１項に記載のハイブリドベクターによ り形質転換された真核細胞。
24. ２４．真核性菌類から選択される請求の範囲第２３項に記載の形質転換された真 核細胞。
25. ２５．酵母、アスペルギルスｓｐ・（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｐ・）、ニュ ーロスポラｓｐ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｓｐ・）、ポドスポラｓｐ．（Ｐｏｄ ｏｓｐｏｒａ　ｓｐ．）、ペニシリウムｓｐ．（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｓｐ ．）、セファロスポリウムｓｐ．（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｓｐ．）、 ムコールｓｐ．（Ｍｕｃｏｒ　ｓｐ．）、特にサッカロミセス・セレビシエー（ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シッオサッカロミセス ・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）、アスペメ ギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）、ニューロスポラ・ク ラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ）、ポドスペラ・アンセリナ（Ｐ ｏｄｏｓｐｅｒａａｎｓｅｒｉｎａ）、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉ ｃｉｌｌｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）又はセファロスポリウム・アクレモニウ ム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ　ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）から選択される請 求の範囲第２３項に記載の形質転換された真核細胞。
26. ２６．植物細胞から選択される請求の範囲第２３項記載の形質転換された真核細 胞。
27. ２７．ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆａｒａｅ） 、キク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）、ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）、ブドウ科 （Ｖｉｔａｃｅａｅ）、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）、ミカン科 （Ｒｕｔａｃｅａｅ）、パイナップル科（Ｂｒｏｍｅｌｉａｃｅａｅ）、アカネ 科（Ｒｕｂｉａｃｅａｅ）、ツバキ科（Ｔｈｅａｃｅａｅ）、バショウ科（Ｍｕ ｓａｃｅａｅ）、又はイネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）の、及びマメ科（Ｌｅｇｍ ｉｎｏｓａｅ）の植物から選択される請求の範囲第２３項に記載の形質転換され た真核細胞。
28. ２８．グラミネア（Ｇｒａｍｉｎｅａ）、ソラナセー（Ｓｏｌａｎａｃｅａ）、 コンポジター（Ｃｏｍｐｓｉｔａｅ）、クルシフェラ（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ） 科及びレグミノサー（Ｒｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）目から選択される請求の範囲第 ２３項に記載の形質転換された真核細胞。
29. ２９．無脊椎動物から選択される請求の範囲第２３項に記載の形質転換された真 核細胞。
30. ３０．脊椎動物から選択される請求の範囲第２３項に記載の形質転換された真核 細胞。
31. ３１．サッカロミセス・セレビシュー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ）である請求の範囲第２３項記載の形質転換された真核細胞。
32. ３２．ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ）である請 求の範囲第２３項に記載の形質転換された真核細胞。
33. ３３．請求の範囲第２３〜３０項のいずれか１項に記載の形質転換された真核細 胞の製造方法であって、形質転換可能の真核細胞を形質転換条件下で真核性ハイ ブリドベクターにより処理することを特徴とする方法。
34. ３４．ａ）細胞壁を有する真核細胞の形質転換のために、細胞壁を除去し、そし て得られた細胞壁を有しないスフェロプラスト又は原形質体を、例えばポリエチ レングリコール（ＰＥＧ）及びＣａ２＋イオンの存在下で、真核性ハイブリドベ クターにより処理し；又はｂ）細胞壁を有しない真核細胞の形質転換のために、 受容体細胞上へのベクターＤＮＡのリン酸カルシウム沈澱により、真核細胞を真 核性ハイブリドベクターで処理し；そして 必要であれば、細胞壁を再生せしめそして形質転換された細胞を選択又はスクリ ーニングする；ことを特徴とする請求の範囲第３３項に記載の方法。
35. ３５．ポリペプチドの製造方法であって、請求の範囲第１〜２１項のいずれか１ 項に記載の前記ポリペプチドをコードする真核性ハイブリドベクターにより形質 転換された請求の範囲第２３〜３１項のいずれか１項に記載の真核細胞を培養し 、そして所望により前記ポリペプチドを単離することを特徴とする方法。
36. ３６．請求の範囲第３５項の方法に従って製造されたポリペプチド。
37. ３７．請求の範囲第３５項の方法に従って得られるポリペプチド。
38. ３８．例に記載されている真核性ハイブリドベクター、形質転換された真核細胞 及びこれらの製造方法並びにポリペプチドの製造方法。
39. ３９．真核細胞に外来性遺伝子を導入するベクターとしての染色体外ｒＤＮＡの 使用。