JPH022384A - 部位特異的変異形成で修飾された糖蛋白質ホルモンおよびその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、−１１１１ｕにホルモン類に関し、より詳し
くは、脳下垂体の糖蛋白質を含む糖蛋白質ホルモン類に
関し、さらに部位特異的変異の手法によってホルモン類
縁体を製造する方法に関する。

（従来の技術） ｍＷ白質ホルモン、特に脳下垂体前葉から合成および分
泌されるホルモンは、代謝、体温調節、成長および生殖
等の種々の生体機能に重要な役目を果たす、脳下垂体糖
蛋白質、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン
（ＦＳＨ）、および甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）は、
胎盤性ゴナドトロピン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈ
ＣＧ）と構造が頻イ以する。各々の分子は実際、非共有
結合的にイオンの相互作用で保持される二つの蛋白質鎖
からなるダイマーである。これら各ホルモンのアルファ
鎖は同一である。ベータ鎮がダイマー部分においてホル
モン特異的である。

分泌に続いて、ホルモンは血流中を通って、膜に結合し
たりセブターを持つ標的細胞まで運ばれる。ホルモンは
このリセプターに結合し、細胞を刺激する。典型的には
、そのような刺激は、細胞内の特異的な調節酵素の活性
の上昇を伴い、これが細胞の反応に必須の生物学的反応
を触媒する。

ｈＣＧの場合には、卵巣内の構造である黄体に存在する
ｈＣＧリセプターへの結合が、アデニレート・サイクラ
ーゼ酵素の活性を刺激する。この酵素は細胞内でのＡＴ
ＰのサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）への転換を触媒す
る。ｃＡＭＰは卵巣のステロイドホルモン類、とくにプ
ロゲステロンの生産に関与する他の酵素の活性を刺激す
る。ｈｃＧにより刺激されたプロゲステロンの分泌は、
懐胎期の最初の３ケ月の妊娠を維持するために必要不可
欠である。

ｈＣＧのようなダイマー性糖蛋白質ホルモンが、例えば
アデニレート・サイクラーゼの活性化のようなりセブタ
ー後の現象を引き起こす正確なメカニズムは解明されて
いない。しかしながら、種々の実験操作により、炭水化
物の構造（各々ｈｃＧ分子に各アスパラギン残基でＮ−
結合している）がこの点に関して重要な役割を担ってい
ることが解明されている。ＬＨＳＦＳＨまたはｈＣＧの
ような糖蛋白質ホルモンを、弗化水素で処理すると、オ
リゴサツカライド＠鎖の約７０％が除去される。これに
より生じる部分膜グリコシル化分子は、そのリセプター
結合能力を保持しているが、しかしながらリセプター後
の現象を刺激することが出来ない。従って、糖蛋白質ホ
ルモンの糖部分は、直接にはリセプターとの結合に関与
しないものの、リセプター後の現象つまり生物学的活性
に重要な役割をはだすことは明らかである。

さらに、オリゴサツカライドはｉｎ　　ｖｉｔｒＯの生
物活性に重要な役割を果たすのみならず、循環系内での
分子の生存時間にとって重要な成分であることも知られ
ている。事実、血漿中での糖慣白質ホルモンの半減期は
、−Ｓにオリゴサツカライド鎮の最も遠方部分に存在す
る一つの特定の垢分子即ちシアル酸の量に直接関連する
。弗化水素処理による炭水化物部分の除去は、リセプタ
ーに結合はするが期待される生物学的反応の発揮出来な
いホルモンを生じるであろう。加えて、これらの分子は
極端に短い血漿中の半減期を有する、というのは、末端
シアル酸残基の欠損は、肝臓のアシアロ糖蛋白質リセプ
ターへの結合親和性を増大して、そのため全身の循環系
からの排泄時間も短縮するためである。

多くの臨床的内分泌障害は、刺激ホルモン類の過剰生産
の結果である（例えば、過剰Ｔ　Ｓ　Ｈ分泌は甲状腺機
能亢進症を引き起こす）。ホルモン過剰により引き起こ
される病気症状の従来の治療法は、ホルモン拮抗剤の投
与である。拮抗剤が効果を奏するためには、リセプター
に高い親和力で結合し、ただし、リセプター後には活性
を有してはならない。前記の説明から、弗化水素処理さ
れたホルモン（約７０％の炭水化物が除去されたもの）
は、有効な競合的拮抗剤であると予期されよう。事実、
ＨＦ処理されたホルモンは、生物学的リセプターにいく
ぶん強い親和力で結合し、天然のホルモンと効果的に競
合し、用量依存的に天然ホルモンの予期される生物学的
作用を減少させることが報告されている。

一見すると、上記のようなホルモン製剤は、競合的拮抗
作用による治療剤としての有力候補であると考えられる
かもしれない。しかしながら、そのような製剤の製造を
大規模で行うには４つの問題が挙げられる。第一に、全
ての脳下垂体ホルモン製剤は、一般に他のホルモンを夾
雑成分として含んでいる。従って、ホルモン製剤を調製
して、部分的に説グリコシル化することは可能であるが
、得られた製剤は他の脱グリコシル化ホルモンを夾雑成
分として含み、これが製剤の投与の後に不所望かつ許容
されざる副作用をもたらす恐れがある。第二に、部分精
製ホルモンには、その活性、物理化学的性質および純度
の点で大きなバラツキがある。従って、製造された各バ
ッチを注意深く分析する必要がある。バッチ間の変動の
可能性のため、各バッチ毎にその有効用量を決定するた
めに、繰り返し臨床検定を行うことが要求される。

第三に、脱グリコシル化に用いられる方法は不完全であ
り、そのため、充分なコントロールが不可能である。い
くつものバッチのホルモンの弗化水素処理の結果がどの
ように変動するかについては、従来知られていない。こ
の方法での変動のおそれがあるため、製造された各バッ
チ毎の充分な品質検査が必要であろう。第四に、炭水化
物側鎖はまた、分子の血漿中の半減期を決定するために
重要な役目を担っていることである。部分的に脱グリコ
シル化されたホルモンは、注射後に急速に循環系から排
出されることが報告されている。従って、所望の効果を
達成するためには、脱グリコシル化ホルモンを大用量で
繰り返し注射する必要がある。多量のホルモンを脱グリ
コシル化し投与する必要があることは、さらに別の問題
、即ちホルモン入手性の問題を新たに生じる。大量のホ
ルモンの入手は現在不可能であり、唯一の期待される方
法は、組み換えＤＮＡ技術のみであろう。

前記のとおり、脱グリコシル化ホルモンは、±ｎ　　ｖ
ｉｔｒｏでは所望の競合的拮抗作用を発揮するが、その
極端に短い血漿中での半減期のため、ｉｎ　　ｖｉｖｏ
での治療効果は少ないであろう。この矛盾に対する唯一
の可能な解決は、分子の生物学的作用を付与するために
必要な炭水化物残基のみを選択的に除去し、分子に長期
間の血漿半減期を付与する炭水化物残基を残すことであ
る。

しかしながら、従来の化学的または酵素学的方法では（
即ち、弗化水素処理または酵素消化では）、このような
結果を生じることは、化学処理の非特異的性質等のため
に不可能であった。

（発明が解決しようとする課題） 本発明の目的は、分子の生物学的作用を付与するために
必要な炭水化物のみを選択的に除去し、分子に長期間の
血漿半減期を付与する炭水化物を残すための方法を提供
することである。

本発明の他の目的は、非化学的処理によって、所望の拮
抗的性質を有し且つ長い半減期を有する分子を得る方法
を提供することである。

本発明の更に別の目的は、少なくとも１本のオリゴサツ
カライド鎖が完全に除かれることにより、部分的に脱グ
リコシル化されている、治療上有効な糖蛋白質ホルモン
を得るための組み換え技術を提供することである。

本発明の更に別の目的は、治療上の利用価値を有する新
規ホルモン競合的拮抗剤を提供することである。

本発明の更に別の目的は、実質的にバッチ間の均一性お
よび統一的活性を持つホルモン競合的拮抗剤を提供する
ことである。

（課題を解決する手段） 本発明の原理および目的によれば、通常は分子に存在す
る特異的グリコシル化部位を、部位特異的変異形成（ｓ
ｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　　ｍｕｔａｇｅｎｅｓ　ｉ
ｓ）と呼ばれる組み換えＤＮＡ技術によって除去するこ
とにより、拮抗剤分子を造成する方法が提供される。詳
細には、本発明の方法は、Ｎ−結合オリゴサツカライド
がホルモンの蛋白質部分のアスパラギン残基に、そのよ
うなアスパラギン残基が炭水化物の結合を指示する配列
（即ち、アスパラギン−任意アミノ酸−スレオニンもし
くはセリン）の中に存在する時にのみ結合するという事
実を利用する。本発明の方法は、ホルモンをコードする
遺伝子のヌクレオチド配列を変化させて、グリコシル化
部位を有利なように減少させる。このような減少は、ア
スパラギン残基のコドンを他のアミノ酸、好ましくは蛋
白質全体の荷電を変化させないアミノ酸のコドンに変化
させるか、あるいはスレオニンもしくはセリンコドンを
他のアミノ酸のコドンに変化させて、グリコシル化信号
を除去することにより、有利に行うことができる。こう
して得られた発現蛍白質ホルモンは、変化させる前のグ
リコシル化部位に通常は存在する糖を完全に欠損し、こ
うして競合的拮抗剤として作用するであろう。

有利には、本発明の方法は、リセプター後の生物学的活
性の誘発に不利な影響を及ぼすことなく、分子の血漿中
半減期を長期化させるため、他の炭水化物結合部位の特
異的存在は残しておく。従って、従来の方法に比較して
、本発明は、長い血漿半減期を持つ大量の均質な競合性
ホルモン拮抗剤を提供する。本発明はまたは、上記修飾
分子（その薬学的に許容される塩も含む）からなる治療
上有効な組成物にも関し、その組成物は、修飾分子を哺
乳類または他の動物に該分子も該動物にも悪影容を及ぼ
すこと無く投与するための助けとして適宜選択される担
体をも混合して含んでもよい。

本発明の成る特定のホルモンは、妊娠の最初の３ケ月に
おける安全かつ効果的な堕胎剤として都合よく使用でき
る。新たに排卵された卵は、卵管内で受精したのち子宮
に移動し、その最も内側の層である子宮内膜に移植され
る。移植のすぐ後に、その栄養外胚葉層（ｔｒｏｐｈｏ
ｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ　　１ａｙｅｒ）は、子宮内膜の
層の中に深く根を張っている指状の突起である絨毛（ｃ
ｈｏｒｉｏｎｉｃ　　ｖｉｌｌｉ）に分化する。絨毛が
成長すると、その中の一つのタイプの細胞が大量のｈＣ
Ｇを生産しはじめる。これらの絨毛が分化しそしてステ
ロイド形成能を有する胎盤へと増殖するまで、この分泌
されたｈＣＧは卵巣へ移動し黄体のステロイド生成能力
を維持することにより、さもなくば生じる死滅から保護
する。さらに、ｈＣＧはプロゲステロンの連続的分泌を
刺激し、このことは妊娠中止の原因となる子宮の収縮お
よび子宮内膜の剥離（月経）を防止する。これとは逆に
、血清中のプロゲステロンレベルを、胎盤が妊娠を維持
するために充分なプロゲステロンの供給を開始する妊娠
初期圧カ月を経過するまで充分に維持することに失敗す
ると、自然流産を引き起こす。従って、妊娠初期圧カ月
の間に、妊婦を本発明のｈＣＧ競合拮抗剤で処置すると
、内因生のｈＣＧによる黄体の維持が阻害され、そのた
めに血清プロゲステロンレベルの低下、ひいては流産を
もたらすであろう。

（発明を実施するための最良の態様） 部位特異的変異形成は、限定的な黒変Ｗを引き起こすた
めの非常に有用な技術を提供する。その−船釣方法は、
シラー（Ｚｏｌｌｅｒ）、Ｍ、Ｊ、およびスミス（Ｓｍ
４ｔｈ）、Ｍ、　　（１９８２）、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ
ｓ　　Ｒｅｓ、、１０．６４８７−６５００に記載され
ており、要約すると次の通りである。対象とされるＤＮ
ＡフラグメントをＭ１３から誘導されたベクターにクロ
ーン化し、シングル鎮ＤＮＡ　（ｓ　ｓ　ＤＮＡ）を調
製する。

合成オリゴヌクレオチド、通常は１８％２塩基の長さを
持ち、変異を指令するミスマツチ以外は５ｓＤＮＡの領
域に相補する合成オリゴヌクレオチドをプライマーとし
て使用する。テンプレートとブライマーをアニールする
。大型フラグメントの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■　（
フレノウ）、各デオキシリボヌクレオチド、およびＴ４
　　ＤＮＡリガーゼを添加し、閉鎖した輪状の二重７７
＜ＤＮＡ（ｃｃＤＮＡ）を合成して連結（ライゲート）
する。ｃｃＤＮＡの豊富化は何種かの方法のいずれか一
つで行う。豊富化されたｃｃＤＮＡはコンピテントなＪ
ＭＩＯＩ細胞に形質転換し、変異型および野性型の分子
の集団を得る。変異型および野性型の分子の識別のため
には、良く知られいてる種々のスクリーニング方法のい
ずれもが有利に用いられる。変異分子は単離して配列決
定で確認する。

この方法を採用するにあたり、考慮すべきいくつかの点
がある。所望部位での特異的な遺伝子操作（プライミン
グ）を確実にするためには、提唱されたオリゴヌクレオ
チドに関して、充分なコンピューター検索を行うことが
、非常に望ましい。

即ち、オリゴヌクレオチドは、Ｍ１３ベクターおよび変
異させるべきＤＮＡフラグメントに対して、ｊ内当であ
ることをチエツクすべきである。避けるべきことが好ま
しいもう一つの問題点の可能性は、単鎖ＤＮＡから二重
鎖ｃｃＤＮＡへの変換が不充分な場合に生じる野性タイ
プの分子のバックグランウドの増加である。シラー（Ｚ
ｏｌｌｅｒ）およびスミス（Ｓｍｉｔ、ｈ）は、この可
能性ある問題点の克服に用いられる何種かの方法を示し
ている。その中で彼ら自身が使用したのは、二重鎖ｃｃ
ＤＮＡの豊富化のためのアルカリ蔗糖勾配である。同様
に、Ｓ１ヌクレアーゼ処理を行うことも可能であろう。

変異オリゴヌクレオチドを設計するに当たり、可能であ
れば制限酵素部位を創設したり削除したりすることが好
ましい。そのようにして、前車な制限部位−フラグメン
トサイズの分析で、変異ＤＮＡのスクリーニングが非常
に効率的に行い得る。

適当な制限部位の創設または削除が不可能であるときは
、スクリーニングは変異オリゴヌクレオチドをプローブ
として用いるハイブリダイゼーションアッセイで行うこ
とができる。そのようなアッセイ法の利点は、変異部位
と無関係であり、そしてファージまたは単離ＤＮＡのい
ずれかを用いて行うことができる点である。ハイブリダ
イゼーションアッセイの原理は、変異オリゴヌクレオチ
ドは、ミスマツチ部分を持つ野性型ＤＮＡとの相補性は
若干低いが変異ＤＮＡとは完全に相補するためにより安
定な二重鎖を形成するという事実である。有利には、ハ
イブリダイゼーションは、先ず低ストリンジエンＩ・条
件で行い、変異型および野性型の両者が３２ｐ−標識オ
リゴヌクレオチドにハイブリダイズするようにする。次
にフィルターを洗浄し、その際、変異体のみがハイブリ
ダイズした状態に達するまで徐々に洗浄温度を高めて行
く。この方法は非常に迅速で、通常は１日で行うことが
できる。プローブに付す標識はアイソトープが提唱され
ているが、他の標識も可能である。

但し、他の標識は一般に非常に低濃度ではアイソトープ
標識はど検出が容易でないであろう。

実施例１　変異部位の選択 ヒトαサブユニットには、二つのグリコシル化部位が、
アミノ酸５２および７日に存在する。本発明はこれらの
部位のアミノ酸配列が、Ａｓｎ−Ｘ−ＴｈｒからＡｓｎ
−Ｘ−Ｖａｌ、Ａｓｎ−ＸＭｅｔまたはＧｌｎ−Ｘ−Ｔ
ｈｒに変化するように遺伝子操作で指令する（ここでＸ
は任意のアミノ酸である）。　α５２”については、上
記の変化に適合する数種の可能な変異が存在し、その全
ては２塩基のミスマツチによる。５４位のＴｈｒのコド
ンはＡＣＣである。ＶａｌのコドンはＧＴＴ、ＧＴＣ，
ＧＴＡおよびＣＴＣであり、ＭｅＬのコドンはＡＴＣで
ある。従って、可能性としてはＡＣＣ９ＧＴＣまたはＡ
ＣＣＳＡＴＧである（ここで＄はアミノ酸Ｘのコドンで
ある）。ＡＡＣはアミノ酸５２のＡｓｎをコードしそし
てこれをＧｉｎ（ＣＡＡまたはＣＡＧ）に変化させるに
も又、２塩基ミスマツチを必要とする。残念なことには
、上記の変異のいずれにも制限酵素部位が形成されない
。数種の部位は分解されるが、その分解は共通性が大き
いために、有用なスクリーニング用の情報を提供するこ
とができない。

α７８”に対しては、Ｔｈｒ　（ＡＣＣ；）の変異のた
めの二つの可能な選択が存在する。このコドンをＭｅ　
ｔ　（ＡＴＣ）に変化させるためには、１塩基置換が要
求される。Ｖａｌ（ＧＴＧ）への変化には二重変異が必
要である。ＡｓｎからＣ１ｎへの変換には、α５２の場
合と同じ変換が必要である。これらの場合も制限酵素部
位は形成されず、これらの部位での分解は生じない、し
かしながら、前記のとおり、２塩基ミスマツチ変異体は
、野性型よりも変異型オリゴヌクレオチドとのホモロジ
ーが大きいために変異のスクリーニングが容易である。

α７８のＴｈｒからＭｅｔへの変換の好ましい態様は次
のものである。

実施例２　材料 Ｍ１３ｍｐ１Ｂおよびｍｐ１９ＲＦ、ＩＰＴＧ（イソプ
ロピルチオ−β−ガラクトシダーゼ）、ＸＧａ　Ｉ　　
（５−プロモー４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ）およびフェノールは、ＢＲＬ　（Ｂ
ｅＬｈｅｓｄａ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ）から入手した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼ、全ての制限エンドヌクレ
アーゼおよびＥ、　　ｃ　ｏ　Ｉ　ｉ　Ｄ　Ｎ　Ａポリ
メラーゼ■大フラグメント（フレノウ）は、ニュー・イ
ングランド・バイオラッド（Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎｄ
　　Ｂｉｏｌａｂｓ）から購入した。ＡＴＰはシグマ社
から購入した。配列決定に用いたｒ　３２　Ｐ　−Ａ　
Ｔ　Ｐおよびオリゴヌクレオチドの標識に用いたα３２
Ｐ−ＡＴＰは、デュポン／ＮＥＮ　　メディカル・プロ
ダクツ（ＤｕＰｏｎｔ／ＮＥＮ　　Ｍｅｄｉｃａｌ　　
Ｐｒｏｄｕｃ　Ｌ　ｓ）から購入した。ＰＥ（、−６０
００はコダック（Ｄｏｄａｋ）から購入した。アクリル
アミド、ビス−アクリルアミドおよびＴＥＭ巳りは、バ
イオラッド（ＢｉｏＲａｄ）から購入した。Ｓ１ヌクレ
アーゼ、リボヌクレアーゼＡおよびＥ、ｃｏｌｉ　　ｔ
ＲＮＡはベーリンガーー？ンハイｌ、（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ　　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）から購入した。デオキシ
リボヌクレオチド・トリホスフェート、ｐ　ＵＣ１８お
よびｐＵｃＩ９プラスミドは、ＰＬ−ファルマシア（Ｐ
Ｌ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から購入した。ニトロセルロ
ース膜はシュライヒャー・アンド・シュエル（Ｓｃｈｌ
ｅｉｃｈｅｒ　　ａｎｄ　　５ｃｈｕｅｌｌ）から購入
した。

よびス　　り〜 次の緩衝液を調製した。

援五履 １０×キナーゼ　　５００！ＩＭ）リス−Ｃ１（７゜１
００ｍＭＭｇ　ＣＩ　２ １０藺ＭＤＴＴ １ｍＭスペルミジン ｌ諺ＭＥＤＴＡ １０×リガーゼ ０ＸＡＴＰ ５００ａ＋Ｍ）リス＝ＣＩ　　（７゜ １００ｍＭＭ　ｇ　Ｃｌ　　２ １　Ｏ艶ＭＤＴＴ １０ｓ＋ＭＡＴＰ、ｐＨ７，０ １０ＸｄＮＴＰ’　　Ｓ ２＋ｓＭｄＡＴＰ。

２ｍＭｄＣＴＰ。

２ｍＭｄＧＴＰ。

２ｎ＋ＭｄＴＴＰ。

ｐＨ７，０ Ｓｌ“停止” ５０ＩＩＩＭトリス塩基 ２０ｍＭＥＤＴＡ ｌ　ｐｇｌ旦体ｔ　　ＲＮＡ ５０　０ｍＭＮａ　　Ｃ１ １０驕ＭＤＴＴ ５０×デンハーツ １％フィコール １％ポリビニルピロリドン １％ＢＳＡ 　Ｘ５ＳＣ １５０ｍＭＮａ　Ｃ１ １５ｍＭクエン酸Ｎａ ＱＸｓ１ ３００ｍＭ　　Ｎａ０Ａｃ　　（４，５）５００ｍＭＮ
ａ　Ｃ１ ４５ｍＭＺ　ｎ　Ｓ　Ｏ４ ＸＴＥ １０１トリス−ｃ＋　　（８，０） １ｍＭＥＤＴＡ ｉ８液Ａ ２００ｍＭ）リス−ＣＩ　　（７，５）１００ｍＭＭ　
ｇ　Ｃ１２ 囲燗 ５×Ｍ９　ソルト　　１０．５ｇ＃２に２ＨＰＯ４４，
５ｇ／Ｉ！、ＫＨ２ＰＯ４ １、Ｏｇ＃２　　（ＮＨ，）２Ｓｏ。

０．５ｇ／ｉ！クエン酸Ｎａ 加圧滅菌し５５°Ｃに置いて、無菌技術で１　ｍｉのＩ
Ｍ　　ＭｇＳＯ４−７Ｈ２０；０゜１ｍＨの０．７％チ
アミン、１０ｍＮの２０％グルコースを加える。

呈Ａ」１皿ブ」ニーＬ １５ｇのバタトアガーを、８００ｍ１の２回蒸留水８０
０ｍ１に添加して高圧滅菌する。５５°Ｃに戻してから
２００ｍｆの５×Ｍ９ソルトを加えてプレートに注加す
る。

ＹＴ ８　ｇ　／　ｌ　　バクトドリプトン ５ｇ／２　イーストエキス ５ｇ／Ｉ！、　ＮａＣｌ 高圧滅菌 実施例３　単鎖ＤＮＡの調製 ヒト胎ｉ（Ｄｌ’Ｊ　Ａライブラリーをレディー（Ｒｅ
ｄｄｙ）ら、　　（１９８５）、Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ、
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８２．３６４４３６４８）
に記載された方法でスクリーニングして得られた、αサ
ブユニットをコードする所望ＤＮＡフラグメントを適当
な制限酵素で消化して、ポリアクリルアミドゲルで小勇
１１　シた。このフラグメントをＭ１３ベクターの適当
な部位に慣用技術でライゲートした。フラグメント約３
００ｎｇおよび消化Ｍ１３の３ｏｎｇを、全ｆｆｌ　５
０　ｐｉの１０×リガーゼ緩衝液、ｌ０ＸＡＴＰおよび
４００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ中で混合した。ライゲー
ション反応液を室温で４ないし６時間インキュベートす
るか、または１６°Ｃで２００時間インキュベートた。

この丘作でＭ１３への所望フラグメントのクローニング
が成功したことは、ＩＰＴＧ（イソプロピル千オーβ−
ガラクトシダーゼ）およびＸＧａ１（５−プロモー４−
クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）
を発色試薬として用い、Ｌａｃ　遺伝子の損失に伴う発
色の消失により確認した。

ＪＭＩＯＩ細胞の１白金耳をＭ９最小プレートから適当
な量のＹＴを含むフラスコへ取り、ＯＤ、＆。＝０．３
−０．４の細胞濃度になるまで３７°Ｃで通気培養した
。細胞をソーパル（Ｓｏｒｖａｌ　１）ＳＳ−３４型ロ
ーターで４°Ｃにて８０００ｒｍｐ、１０分間遠心分離
して集め、直ちにＯ６５倍量の氷冷した５０ｍＭ　　Ｃ
ａＣ１ｚに再懸濁し、２０分間氷上に保持した。細胞を
再度遠心分離し、冷却した５０ｍＭ　　ＣａＣ１ｚに最
初の遠心前の量の１／１０の量に再懸濁した。このコン
ピテント細胞を使用時まで氷上に保持した。

上記ライゲーション反応物の一定量をＪＭＩＯ１コンピ
テント細胞に添加して、メンシシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ
）、　　　Ｊ、　　　（１９Ｂ４）、　　Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　　Ｅｎｚｙｍ、１０１．２０に記載されたようにし
て形質転換した。単鎖ＤＮＡは、５０μＩの対数増殖期
ＪＭＩＯＩ細胞を含む５１！ＩｌのＹＴ培地を３７°Ｃ
で６ないし８時間培養して、各プラークから調製した。

細胞を３００Ｏｒｐｍで１０分間４°Ｃで遠心分離し、
その上清４ｍｌを清浄なコレソクスＣＣＯｒ　ｅ　ｘ）
管に移した。ＰＥＧ、ＮａｃＩおよびＲＮａ　ｓ　ｅＡ
を、それぞれ最終濃度４％、５００１およびｌ　Ｏ！！
ｇ／ｍｌとなるように添加した。この管を室温で１５分
間インキュベートした。この溶液をつづいて、Ｓ　Ｓ　
−３４０−ターで４°Ｃで８０００ｒｐｍ、１０−１５
分間遠心分離した。上清を傾斜法で除き、ペレットを３
００μ■の１　ｘＴＥに再！！濁して、小型遠心機用の
エッペンドルフチューブに移した。ＴＥ−飽和フェノー
ル、次いでエーテルでの抽出を行い、続いて、］／１０
ｆｆｉの３Ｍ　　Ｎａ０Ａｃ、ｐＨ５，２を含むエタノ
ールで沈澱させた。得られたペレットを乾燥した後、再
度ＴＥに懸濁した。続いて、所望オリエンテーションの
組み換え体を選択し、上記方法をスケールアップして単
ｔＮ　Ｄ　Ｎ　Ａの１リツトル培養物を調製した。この
単鎖ＤＮＡを全ての変異形成実験のテンプレート供給源
とした。

実施例４　オリゴヌクレオチドの５°ホスホリル化 変異形成のため：２μｌの１０×キナーゼ緩衝液、２μ
ｌのＡＴＰおよび４単位のポリヌクレオチドキナーゼを
全量２０μｍ中に含む溶液中で、１０００−３０００ｐ
庁ＯＩの実施例１に示したオリゴヌクレオチドをホスホ
リル化した。この反応は３７°Ｃで３０−６０分インキ
ュベートして行い、６５°Ｃで１０分間インキュベート
して停止した。

ハイブリダイゼーションを行うため：上記のようにして
、５０　１００ｕＣ４ｑ”Ｐ−ＡＴＰを唯一のＡＴＰ源
として、５０μＩの容量中で、オリゴヌクレオチドをホ
スホリル化した。取り込まれなかったヌクレオチドを除
去するため、この反応物を、１／２容量の７．５Ｍ　　
ＮＨ，ＯＡｃおよび３容量の冷エタノールで沈゛澱させ
た。沈５したペレットを冷７０％エタノールで数回洗浄
し乾燥し、そして５０μｌのＴＥ中に再２．４させた。

実施例５　オリゴヌクレオチドの指令による二重鎮閉１
ＤＮＡ（ｄｓ　　ｃｃＤＮＡ）の合成修復（アニーリン
グ）：約１３ｐｍｏ＋の単鎖ＤＮＡ、２６０ｐｍｏｌの
５°−ホスホリル化オリゴヌクレオチドおよび１μｌの
溶ＯＡを全量１０μｌ中で混合した。コントロールとし
て、オリゴヌクレオチドを含まない混合物も調製した。

これらの混合物を５５°Ｃで５分間、次いで２２°Ｃで
５分間インキュベートした。

伸長（エクステンション）：１．５μｌの１０×クレノ
ウ緩衝液、１，５μｌの１０ＸｄＮＴＰ類および５単位
のフレノウを、上記アニーリングされた反応物に添加し
て最終容量を１５μｍとした。これらの混合物を２２℃
で５分間インキュベートした。

連結（ライゲーション）二上記反応物に、１μｍの１０
×リガーゼ、２μｌのｌ０ＸＡＴＰおよび４００単位の
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを添加して、最終容量を２０μｌと
した。この反応物を１６℃で２０時間インキュベートし
た。

実施例６　　ｃｃＤＮＡの豊富化 上記ライゲーションされた反応物に、３μｍの１０ＸＳ
Ｉｉ７衝液および０．９単位のＳｌヌクレアーゼを加え
て、最終容量を３０μｌとした。その１５μｍ分を直ち
に、４０μｌの３１停止緩衝液を含む１．５ｍｌエッベ
ンドルフ管に移した。このＳｌヌクレアーゼ反応は室温
ヤ３分間進行させた。３分後に４０７１７１の停止緩衝
液を反応エッペンドルフに添加した。反応物をフェノー
ル：ＣＨＣｌ３で抽出し、そしてエタノールで沈澱させ
た。このペレットは続いてＴＥに再Ｑｉした。

実施例７　　ｃｃＤＮＡの形質転換 ライゲーション反応物の所定量を前記のようにしてコン
ピテントなＪＭＩＯＩ細胞の形質転換に用いた。

実施例８　スクリーニング 乾燥ニトロセルロースフィルターを、注意深く、各形質
転換プレート上に重ねて、４℃に１５−３０分間放置し
た。このフィルターをマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）
、Ｌ、、　　フリッシュ（ＦｒｉＬｓｃｈ）、Ｅ、Ｐ、
およびサムプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｊ、、　（
１９８２）、モレキュラークローニングニアラボラトリ
−マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ
：　　Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ）
、ｍｌ−ルドスブリングハーバ−（Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒ
ｉｎｇＨａｒｂｏｒ）に記載されたように処理した。焼
成したフィルターを２ＸＳＳＣで湿らせ、密封クツキン
グ・バッグ（ｃｏｏｋｉｎｇ　　ｂａｇ）中の、１５０
ｍＭトリス−ＣＩ　　（８，０）、７５０ｍＭＮａＣ１
，１０＋ｎＭＥＤＴＡ、５Ｘデンハート、Ｏ１％ＳＤＳ
およびＯ−１％ピロリン酸ナトリウムの溶液中で、室温
で２時間もしくはそれ以上予備ハイブリダイズした。こ
の予備ノ＼イブリダイゼーシラン溶液を除いて、１　ｍ
ｌ中にｌＸｌ０’　ｃｐｍの３ｚｐ−標識した実施例１
の　オリゴヌクレオチドを含む新たな溶液に取り代えた
。ハイブリダイゼーションを室温で２−２０時間行った
。次いで、このフィルターを６ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤ
Ｓおよび０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐｉ−１７，２
）で２０−３０分間温度を徐々に高めながら洗浄し、そ
の際、温度を変化させる毎に増悪スクリーン２枚を用い
て一８０°Ｃで１時間オートラジオグラフィーを行った
。最終的な洗浄温度は、ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）、
Ｄ、およびメゼ７１／７７（Ｍｅｓｅｌｓｏｎ）、Ｍ、
（１９８３）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　　Ｅｎｚｙｍ、１００
，３３３−３４２に従って、次の式：Ｔ、＝２”ＣＸ　
（Ａ−Ｔ塩基数）＋４℃ｘ（Ｇ−Ｃ塩基数）に基づき決
定した。

野性型は、通常Ｔ、−１０°Ｃの温度で洗浄により除去
されることが観察された。

実施例９　二重鎖ミュータントの単離 −つの充分に単離された陽性物を５ｍｉのＹＴ中に５０
ｐ１の対数増殖期のＪＭＩＯＩとともに移し、同時にＹ
ＴプレートにＪＭＩＯＩとともに画線接種した。培養物
を通気下に３７°Ｃで６〜８時間インキュベートし、そ
して４°Ｃで３．００Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離した
。二重鎖ＤＮＡは前記マニアチスらの［モレキュラー・
クローニングニア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）Ｊ　　（コールド・スプリング
・バーバー・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１８９２〕
に記載されているようにして単離した。可能な場合は、
制限消化により変異を確認する。制限消化による確認が
不可能な場合は、画線接種プレートでの操作を繰り返す
のが理想的である。提唱されたミュータントニ重鎮ＤＮ
Ａの大量培養は、マニアチスら（前記）の第９０頁に記
載された方法で調製された。

実施例１０　　ＤＮＡ配列 上で得られた二重鎖ミュークントＤＮＡは次いで、適当
な制限酵素で消化され、ポリアクリルアミドゲルから単
離された。これらのフラグメントを末端標識し、マキサ
ム（Ｍａ　ｘ　ａｍ）、ＡｌＭ、およびギルバート（Ｇ
ｉｌｂｅｒｔ）、Ｗ、（１９８０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　
　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６５，４９９−５６
０に記載された方法で配列決定した。別法として、フラ
グメントをＭ１３またはｐＵＣベクターにサブクローニ
ングし、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）、Ｊ、、ニコルン（
Ｎｉｃｋｌｎ）、Ｓ、およびコールソン（Ｃｏｕｌｓｏ
ｎ）、Ａ、Ｒ，，（１９７７）、Ｐｒ。

ｃ、　Ｎａ　ｔ　ｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、　ＵＳＡ
、　　７４５４６３−５４６７に記載されたジデオキシ
法で配列決定することもできる。

哺乳類細胞の形質転換および上記方法で製造された細胞
ラインの選択は、次の方法で形質転換して行うことがで
きる：変異二重鎖ＤＮＡをＢａｍリンカ−と連結して、
シウング（Ｈｓｉｕｎｇ）ら、　（１９８４）、Ｊ、Ｍ
ｏ１．ＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓ、２，４９７に
記載されているＢＰＶゲノム、マウスメタロチオネイン
プロモーターおよびＳＶ４０ポリ（Ａ）配列ならびにシ
ウング（Ｈｓｉｕｎｇ）ら、（１９８４）、ＤＮＡ、３
．９２に記載されているｈＣＧのβサブユニットを含む
ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）発現システム中へ挿
入することができる。次いでマウスの上皮細胞（Ｃ１２
７）をリン酸カルシウム沈θ法で形質転換することがで
きる。形質転換細胞は理想的には、形質転換の１０−１
４日後にその重なり合った外観からＲｊＥすることがで
きる。次に、細胞のフォーカスをサブクローニングして
、純粋な集団を得、２％ウシ胎児血清で強化したダルベ
ツコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養する。培養
培地に分泌された変異ｈＣＧは、トリスアクリルブルー
（Ｔｒｉｓ　　ＡｃｒｙｌＢｌｕｅ）クロマトグラフィ
ー、イオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィーを含
む３ステツプの精製工程で精製することが可能である。

精製工程を通じての活性は、セロノ・ラボラトリ−（Ｓ
ｅｒｏｎｏ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から入手可
能な、そのような目的のためのラジオイムノアッセイキ
ットで追跡することができる。

大量のミュータントｈＣＧを発現する細胞ラインは、ラ
イプ４７ヒ細胞（Ｌｅｙｄｉｇ　　ｃｅｌＩｓ）の懸濁
培養物からのテストステロンの分泌を刺激するであろう
。ライディッヒ細胞は、成長雄マウスの精巣から得るこ
とができる。約０．２５Ｘ１０６ライデイツヒ細胞を、
理想的には、天然ｈＣＧを数用量の内から選んだ一用量
を含む約１　ｍｉのＤＭＥＭ中でインキュベートする。

ｈＣＧの最大用量の半分量は容易に決定できる。次に第
二セットの懸濁培養をｈＣＧの最大用量の半分およびミ
ュータント組換えｈＣＧの次第に上昇する所定用量で処
理する。生物学的不活性型のｈＣＧは、ライディッヒ細
胞のリセプターへの結合に関して競合し、天然型により
引き起こされるテストステロン応答を減少させるであろ
う。

天然ｈＣＧにより誘発されるテストステロン応答を完全
に■止するために必要な天然およびミュータントｈｃｃ
の用量関係を決定した後、そのミュータント型について
、絨毛性ゴナドトロピンおよび本発明の原理に従って選
択された任意の拮抗ホルモンを分泌することが報告され
ている種々の動物種（アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ　　ｍ
ｏｎｋｅｙ）を含む）で堕胎を引き起こす能力を試験す
ることは容易である。

上記の説明から、本発明の精神および範囲を離れること
なく種々の修正および変更が可能であること（特に実施
例で具体的に説明した方法について）を、当業者は容易
に理解できるであろう６１Ｔ、’Ｌ　　１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、少なくとも１本のオリゴサッカライド鎖が修飾によ
   って完全に除去されており、且つ元の未修飾型ホルモン
   が持つ実質的に全てのリセプター結合能力を持つことを
   特徴とする、修飾された糖蛋白質ホルモン。 ２、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激
   ホルモン、およびヒト絨毛性ゴナドトロピンからなる群
   から選択される、請求項１記載の修飾された糖蛋白質ホ
   ルモン。 ３、天然リセプター分子に結合できるがリセプターへの
   結合以後の生物学的活性の刺激能力を持たない、部分的
   に脱グシコシル化された分子を持つ糖蛋白質ホルモン。 ４、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激
   ホルモン、およびヒト絨毛性ゴナドトロピンからなる群
   から選択される、請求項３記載のホルモン。 ５、ｈＣＧである請求項３記載のホルモン。 ６、リセプターとの結合に関して天然の糖蛋白質ホルモ
   ンと競合する能力を持つが、リセプターへの結合以後の
   生物学的活性を誘発することが実質的にできない、少な
   くとも１本のオリゴサッカライド鎖が完全に除去された
   糖蛋白質ホルモンよりなる組み換え分子。 ７、部位特異的な変異形成により、選択された部位で脱
   グリコシル化された結果生産された、請求項６記載の組
   み換え分子。 ８、少なくとも一つのシアル酸残基を持つ少なくとも１
   本のオリゴサッカライド鎖を保持している、請求項７記
   載の組み換え分子。 ９、変異形成部位が糖蛋白質ホルモンのαサブユニット
   上に選択される、請求項７記載の組み換え分子。 １０、分子がヒト糖蛋白質ホルモンであり、選択された
   部位がαサブユニットの第５２番および第７８番のアミ
   ノ酸位置である、請求項９記載の組み換え分子。 １１、リセプターとの結合に関して天然の黄体形成ホル
   モンと競合する能力を有するが、リセプターとの結合後
   の生物学的活性の刺激能を持たず、そして血漿中での半
   減期が天然の黄体形成ホルモンとほぼ同じである、組み
   換え黄体形成ホルモン。 １２、リセプターとの結合に関して天然の卵胞刺激ホル
   モンと競合する能力を有するが、リセプターとの結合後
   の生物学的活性の刺激能を持たず、そして血漿中での半
   減期が天然の卵胞刺激ホルモンとほぼ同じである、卵胞
   刺激ホルモン。 １３、リセプターとの結合に関して天然の甲状腺刺激ホ
   ルモンと競合する能力を有するが、リセプターとの結合
   後の生物学的活性の刺激能を持たず、そして血漿中での
   半減期が天然の甲状腺刺激ホルモンとほぼ同じである、
   甲状腺刺激ホルモン。 １４、リセプターとの結合に関して天然のヒト絨毛性ゴ
   ナドトロピンと競合する能力を有するが、リセプターと
   の結合後の生物学的活性の刺激能を持たず、そして血漿
   中での半減期が天然のヒト絨毛性ゴナドトロピンとほぼ
   同じである、ヒト絨毛性ゴナドトロピン。 １５、少なくとも１本のオリゴサッカライド鎖が完全に
   除去された、請求項１４記載の組み換えヒト絨毛性ゴナ
   ドトロピンの治療的有効量を投与することよりなる、受
   胎後３ケ月内に流産を行う方法。 １６、治療的有効量の請求項３記載の糖蛋白質ホルモン
   を投与することよりなる、刺激ホルモンの過剰分泌症状
   を治療する方法。