JPS62501680A - 組換えインヒビン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組換えインヒビン 本発明は特にホルモンインヒビ／の１部又は全部をコードするデオキシリボ核酸 （ＤＮＡ）配列を含有するクローニンブイフタ−の構築、該ベクターを含有する 細菌株の様な宿主細胞ならびにインヒビンの１部又は全部又はその前駆体を産生 ずる細菌株の様な宿主細胞に関するものである。更に本発明は、天然物も合成物 も含めて、該ベクターおよび菌株の発現産物の産生および用途ならびに該発現産 物およびベクターの断片の産生および用途に関するものである。

背景技術 生殖腺が下垂体機能のフィードバック調整に関与するイ／ヒビンと呼ばれる非ス テロイド系因子を生産するものであることが１９３２年に報告された（マツクラ −、Ｄ、Ｒ，（１９３２）す共に生殖腺の発育と機能を調節する少くとも２種の ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモンすなわち７オリトロビン（ＦＳＨ）および黄 体形成ホルモンすなわちルトロピン（ＬＨ）を生成することが昶られている。高 感度ラジオイムノアッセイによれば各ホルモンを正確に個々にモニターすること が可能であり、又これによす生殖腺によるこれらのホルモンのフィードバック調 整の様子を明らかＫすることも出来る。ＬＨのフィードバック調整は主としてス テロイドを介するものであると見られ、又一方、Ｆ’ＳＨのそれはステロイド０ の他にたん白質や糖たん白質因子およびインヒビンを介するものである。

現在インヒビンは卵巣中の顆粒膜細胞や精巣中のセルトリ細胞から分泌されるた ん白質又は糖たん白質として定義されている。これはＦ’ＳＨに応答して心泌さ れ、モしてＦ’ＳＨ合成および分泌のフィードバック抑制剤として下垂体に作用 するが、ＬＨの基底合成および分泌にはほとんど関与しない。インヒビン、その ｍ　ＲＮ　Ａ又は前駆体が他の細胞や組織中で生成されるかどうかについては未 だ不明である。

１９７０年代初期以来、精巣および卵巣の種々の生殖腺からインヒビンを精製す る種々の試みが成されて来たが、尚時の種々の生物学的定量法では下垂体細胞中 の生体内および生体外におけるＦＳＨの抑制はインヒビンが原因であると推定さ れしかも被検体の非特異性毒性作用について常にチェックが行なわれティたわけ ではな（（Ｂａｋｅｒ、　Ｈ，Ｗ、Ｇ等（１９８１年）ＪＩｎｔｔＦＬｇｏｎａ ｄａｌ　Ｒｅｇｕｌ、ａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｅｐｒｏｄ、ｕｃｔｉｏｎ（Ｆｒａ ｎｃｈｉｍｏｎｔ、　ＰおよびＣｈａｎｎｉｎｇ、　Ｃ，Ｐ、　４１ｉ１　）　 。

Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ８ｓ、　Ｌｏｎｄｏｎ、　１９３〜２２８頁；および Ｅａｋｅｒ、　ＨｌＷ、Ｇ、等（１９８２年）　、　Ａｎｎ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒ ｋＡｃａｄ、Ｓｃｉ、３８３，３２９−３４２）、この様な方法を使用したこと がある程度原因となって矛盾する結果となっていた（ａｅ　Ｊｏｎｇ、　Ｆ、Ｈ ，（１９７９年）　Ｍｏｌ、　Ｃｅ１１．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ。

１３．１−１０）。

近年、ウシ卵胞液Ｃ’ｂＰＦ）からのインヒビンを精製して均質物とすることが 行なわれた。（国際特許用ｉ％ＰＣＴ／ＡＵ８５１００１１９；およびＲｏｂｏ ｒｔｓｏｎ、　Ｄ、Ｍ、等（１９８５年）のＢｌｏｃｈｅｍ、Ｊ３１ｏｐｈｙｓ ＋Ｒａｌ３．Ｃｏｍｍ＋ｔｏ、　１２６　＊　２２０−２２６゜゛）この成功は 、被検体の細胞毒作用を測定する手段（Ｒｏｂｅｒｔａｏｎ、　Ｄｊ４．等（１ ９８２年）のＭｏｂ、　Ｃｅ１１゜Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、２６　＊　１１９− １２７　）を１組み入れた精密培養２ット下垂体細胞分析法（Ｓｃｏｔｔ、　Ｒ ，Ｓｌ等（１９８０年）のＥｎｄｏｃｒｉｎｓｌ、１０７，１５３６−１５４２ ）を使用したことに４　よるものであり、これにより測定細胞中のＦ’ＳＨ含有 量を低下させる非特異性毒性作用がインヒビ／の作用とは異なるものであること が同定された。使用した標準体は、ＩＵ／１ｎＩｉの任意の活性を与える前記ヒ ツジ精巣リンパ標準体に関して２ＱＵ／ｄのインヒビン活性を有するウシ卵胞液 製剤であった（Ｓｃｏｔｔ。

ｂＦＦ　からのインヒビンは約３５００回０製されて２００．０００年位／岬（ たん白質）の特異活性を有し、そしてこれはドデシルスルホン酸ナトリウムの存 在下のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により明らかにさ れたところによると、それぞれ約４３ｆｆｉＤおよび１５ｋＤの２個のジスルフ ィド結合すプユニツ）ＡおよびＢから成る５ＢｈＤのたん白質である。各サブユ ニットのＮＨ２−末端のアミノ酸配列は決定されている。この４１Ｎ物質は先に インヒビンの生理的性質として定義された、すなわち、ラット下垂体細胞からの 内在Ｆ’ＳＨの合成および放出を抑制するがＬＨプロラクチンおよび甲状腺刺激 ホルモンの合成および放出には関与しないという、生体外生理的性質を有してい る。

Ｆ’ＳＨは雌の排卵および雄の精子形成の発生および率の決定に重要であるので 、インヒビｙ１その類縁体又は相同体あるいはインヒビンに対する抗体を投与す ることは主として人間および家畜動物における生殖腺を抑制又は刺激することに なるであろうし、又生殖腺機能分析用の診断器材としても使用できるであろう。

インヒビンの生理作用を分析することを目的として、粗製の又は部分分画した生 殖腺抽出物又は分泌物を使用しての多くの生体内実験が行なわれて来た。これら の実験において、インヒビ／又はインヒビンに対する抗体による作用として以下 のものが明らかとなった。

１、生殖腺機能の抑制。（Ｍｏｕｉｇａｌ、　Ｎ、Ｒ，等（１９８５年）のＧｏ ｎａｄａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　Ｐθｐｔｉｄｅｓ　ａｔｉｄ　ｔｔｒ ｅｉｒＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　５１ｇｎ１ｆｉｅａｎｃｅ　（Ｓａｉｒａｍ、　 Ｍ、ＲおよびＡｔｋｉｎｓｏｎ、　ＬＪ、、編）　Ｗｏｒｌｄ　５ｃｉｅｎｔｉ ｆｉｃ　ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ−８ｉｎｇａｐｏｒｅ、　２１−３７ベージ ）。

２、排卵率の増加。　（０’５ｈｅａ、　Ｔ１等（１９８２年）の２２；および ）（ｅｎａｅｒｓｏｎ、　Ｋ、Ｍ、等（１９８４年）のＪ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ ｌ、１０２　、３０５−３０９　）。

３、思春期の始まりの促進。（Ａｌ−○ｂａｉｄｉ、Ｆ’、Ａ、Ｒ０等生体動物 におけるこれらの性質やあるいはさらにその他の生理学的研究を市場規模で開発 するためには、天然物又は合成物の大量の精製インヒビ／又はその分画物あるい はインヒビン作用薬および拮抗薬を必要とする。この様な大量を得ることは、そ の物質源が限られている（例えば、ヒト卵胞液から）ために現在の精製法だけで は不可能であり、例えば、５０朋のｂＦＦ’からの抽出ではわずか５−１０μｇ 　の精製物が得られるにすぎない。

本発明は、特に、インヒビンをコードする遺伝子又は遺伝子の部分の分子クロー ンを例えば大腸菌（ｇｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）の様な宿主に導入する ためにインヒビンをコードする遺伝子を同定しそして特定することにより、そし てそのサブユニットを含めこのインヒビン分子の全部又は１部又は前駆体を合成 することのできる宿主、例えばｍ菌株を創製するためＫそのクローン化遺伝子又 はその部分を操作することにより、前記した制限をとり除こうとするものである 。

発明の開示 本発明の第１の態様は、インヒビンの全部、１部又は前駆体のアミノ酸配列のコ ーＦ゛配列として作用する第１のＤＮＡ配列、ならびに該第１のＤＮＡ配列と交 雑するＤＮＡ配列を提供することＫあり、該配列は天然の又は合成の又は半合成 の原料を含めていかなる原料物質から得られろものであっても良く、又該配列は 突然変異関連配列を含み、又単−の又は複数の塩基置換、除去、導入および変換 を含み、かつインヒビ／のポリペプチド又はインヒビンと同様な免疫学的又生物 学的活性を有するポリペプチドの全部、１部又は前駆体あるいは相同体又は類縁 体をその発現の際にコート９しているＤＮＡ配列を含むものである。

本発明において好ましい配列は、以下本文において詳述しそして本文添付の第５ ．６．７および８図に示したウシおよびヒトインヒビンの４３　ｋＤおよびｔｓ ｌＬＤ（ＡおよびＢ）のサブユニットに相当するポリペプチドをコードする配列 である。

本発明のもう１つの好ましい態様は、本文後記するインヒビンの２０　ｋＤ（Ａ ｃ）サブユニットをコードするＤＮＡである。

本発明のＤＮＡ配列は、例えばを椎動物の細胞から常法によりその全ＤＮＡを抽 出しそしてその配列を単離することによって得ることができる。別法としてこの ＤＮＡは又生体外化学合成又は生合成により例えばｍＲＮＡ　鋳型を使用するこ とによって得ることもできる。

本発明は又、インヒビンのポリペブチＦ又はインヒビンと同様な免疫学的又生物 学的活性を有するポリペプチドの全部又は１部又は前駆体をコードするＤＮＡ又 はＲＮＡ配列を選択する方法も包含するものであり、そして該方法は、１種又は それ以上のＤＮＡ又はＲＮＡ配列を得て、そしてこれから上記した活性を有する ポリはプチドの１部又は全部又は前駆体をコードすることが仰られている公昶の ＤＮＡ又はＲＮＡと交雑、する配列を決定するか、あるいは、インヒビンに対す る抗血清又はその１部を得てそしてインヒビンの１部又は全部と発現する宿主− ベクター系を同定することから成る。

前記配列は天然物源からのものでも良いし、又、組換えＤＮＡ分子からのＲＮＡ 配列、合成配列又はＤＮＡ配列あるいはこれら配列の組合わせから成るものであ っても良い。

本発明の１つの好ましい態様として、たん白質インヒビンのめに使用する方法は 、イｙヒビン産生細胞からｍＲＮＡを抽出しこれを２本鎖ＤＮＡ　（相補性ＤＮ Ａ、すなわちＣＤＮＡ）Ｋ、変換しそしてこれらをプラスミドの様な自律複製因 子中に挿入することから収る。そして次に該因子で細菌株の様な宿主細胞を形質 転換し、そして他のたん白質をコート９することなくインヒビンだけをコードす るＤＮＡ　を含有するクローンを検出するためＫ。

インヒビン様ｍＲＮＡ又はＤＮＡに相補的な合成りＮＡプローブの産生ずるライ ブラリーをスクリーニングする。

従って本発明の態様は、インヒビン様ｍ　ＲＮ　Ａ又はＤＮＡの同定用の合成ポ リヌクレオチドプローブを提供するものであり、該プローブはポリヌクレオチド および標識物質から成り、そして該ポリヌクレオチドは下記から選択した配列を 有する。

プローブ３　５’　ＡＣＧＣＣＴＧＡＣＴＣＣＡＧＧＡ　３’プローブ４　ダ　 ＣＣＴＣＣＣＡＧＴＴＴＣＡＴＣＴ　３’プローブ６　５’　ＣＴＴＴＧＡＧＡ ＴＴＴＣＣＡＡＡＧＡＡＧＧＣ３’好ましくは標識物質は５′末端に結合した３ 　２　ｐ□、群であるか、あるいは他の標識物質であっても良い。

本発明の更に別の態様は、インヒビンの全部又は１部又は前駆体のアミノ酸配列 をコードする第１のＤＮＡ配列および該第１の配列と交雑するＤＮＡ配列とから 成るＤＮＡを挿入したことを特徴とする組換えＤＮＡ　分子を提供することであ り、該配列は天然の、合成の、生合成の又は半合成の物質を含むいかなる物質源 に由来するものでも良く、又該配列は突然変異、単一の又は複数の塩基置換、除 去、挿入および変換による関連体を含有し、そして更に、インヒビンのポリペプ チド又はイ／ヒビンと同様の免疫学的又は生物学的活性を有するポリペプチドの 全部又は１部あるいは前駆体、類縁体又は相同体をコードする配列を含有するも のである。

本発明の好ましい組換えＤＮＡ分子はその挿入ＤＮＡ　に効果的に結合する発現 抑制配列を含有する。本発明の１つの好ましい態様においては、該挿入ＤＮＡは 大腸菌（Ｅ、マリ）のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子と効果的に結合する。他の好 ましい抑制系としては、トリプトファン（ｔｒｐ）オペロン、ノＺクテリオファ ージλ（ＰＬ　）の左側プロモーターおよびｔａＱの様なハイブリッドプロモー ターあるいは長鎖末端反復モロネイ（ｍｏｌｏｎｅｙ）白血病ビールスのプロモ ーターの様なビールスプロモーターから成るものが挙げられる。

本発明の好ましい組換えＤＮＡ　分子は前記挿入ＤＮＡ　を含有するプラスミド である。本発明の好ましいプラスミドは本文後記において詳述するが、ｐＢＴＡ 　２２　、１）ＢＴＡ２３　、　ｐＢＴＡ２８　。

１）ＢＴＡ２９．ｐＢＴＡ３０．ＴＩＢＴＡ２９０およびｐＢＴＡ２９２−ｐＢ ＴＡ３０５が挙げられる。

これとは別に該組換えＤＮＡ分子は、バクテリオファージλの様な適当なバクテ リオファージのＤＮ’Ａあるいは生体外であるいはあらゆる有機体内で真核細胞 中において複製可能なビールスのＤＮＡ　に結合した前記挿入ＤＮＡ　から成る ものであっても良い。

本発明は又、プロモーター、翻訳開始シグナルおよびインヒビンのポリペプチド あるいはインヒビンと同様の免疫学的又は生物学的活性を有するポリペプチドの 全部、１部又は前駆体のアミノ酸配列に相当するかあるいは発現時にこれをコー ドする第１のＤＮＡ配列、あるいは該＠１の配列と交雑するＤＮＡ配列又は突然 変異、単一のあるいは複数の塩基置換、除去、挿入又は該第１のＤＮＡ配列への 変換による関連体のＤＮＡ配列から成る融合遺伝子を提供するものである。

本発明の好ましい組換えＤＮＡ分子は、本発明のＤＮＡから成るＤＮＡ配列を挿 入したプラスミドから成るものである。適当ナプラスｅ　）”トＬテハ、ｐＢＲ ３２２，ｐＵＲ２９０，ｐＵＲ２９１又はｐＵＲ２９２又はｐＢＴＡ２８６．ｐ Ｕｃ７．ｐＵＣ８又は、ＵＯ３又はｐＵｃ１３又はｐｔｒＰＬｘ又はｐＷＴＩＩ Ｉ、ｐＷＴ１２１又は］）ＷＴ１３１およびそれらの誘導体が挙げられる。又ビ ールスベクター、例えばｐＺ工Ｐ　ＮｓＯ５Ｖ（Ｘ）　１、ワクシニアビールス 、バクロビールスおよびそれらの誘導体も挙げることができる。

又本発明は、インヒビンのポリペプチド又はインヒビンと同様な免疫学的又は生 物学的活性を有するポリペプチドの全部、１部又は類縁体、相同体又は前駆体の アミノ酸配列に相当するかあるいは発現時にこれをコードする第１のＤＮＡ配列 、該第１の配列と交雑するＤＮＡ配列あるいは突然変異、単一の又は複数の塩基 置換、除去、挿入ならびに該第１のＤＮＡ配列あるいは交雑配列への変換による 関連体の配列から成る挿入ＭＡを作り、そしてこの挿入ＤＮＡ　をクローニング ベクターに導入することから成る、組換えＤＮＡ　分子の製造方法も包含するも のである。

好ましくは該ＤＮＡ配列はクローニングベクターの正しい位置に導入することで あり、そして正しい読み枠は発現抑制配列を持った主読み枠である。

更に他の態様として本発明は又、少なくとも１個の本発明の組換えＤＮＡ　分子 で形質転換されそしてホリハプチドインヒビン又はインヒビンと同様の免疫学的 又は生物学的活性を有するポリはプチドの全部、１部又は前駆体を発現可能な宿 主を提供するものである。

適当な宿主としては、細菌細胞、バクテリオファージ、酵母、他の真菌類、を推 動物細胞、昆虫細胞、植物細胞ならびにヒト細胞、ヒト組織およびあらゆる真核 有機体が挙げられる。

適当な細菌宿主はＢ、コリおよび他の腸管内機生物、シュードモナス（Ｐｓｅｕ ｄｏｍｏｎａｓ　）およびバチルス（Ｂａｃｉ　１ｌｕｅ　）である。好ましい 宿主培養体としてはＥ、コリＥＴＡ５４５．ＢＴＡ６３４゜ＢＴＡ５３７．ＢＴ Ａ５４７およびＢＴＡ６５２として同定されており、又宿主−はフタ−系として はＡＴＣＣ６７０５４−ＡＴＣＣ６７０５９およびＢＴＡ１３６１　として同定 されている。

本発明は又、適当な宿主を作り、そして本発明の組換えＤＮＡ分子を該宿主中の 正しい読み枠中に導入することから成る、宿主の形質転換方法をも包含する。

更に又本発明は、インヒビンのポリペプチド０又はインヒビンと同様の免疫学的 又は生物学的性質を有するポリペプチドの全部、１部又は前駆体から収る、本発 明の形質転換宿主の発現生成物を提供する。

本発明の好ましい態様においては、その発現生成物は、宿主と相同の第１のポリ はプチド配列と、インヒビンのポリはゾチド又はインヒビンと同様な免疫学的又 は生物学的性質を有するポリペプチド°の全部、１部又は前駆体、類縁体又は相 同体をコードするアミノ酸配列である第２のポリはプチド配列とから成る。

本発明の好ましい態様においては、該第１のアミノ酸配列はβ−ガラクトシダー ゼの１部又は全部であり、該宿主細胞はＥ。

コリである。本発明の更に好ましい態様においては、該第１の配列は発現生成物 のＮＦ２−末端配列である。

更に又本発明は別の態様として本発明は、適当な宿主を本発明の組換えＤＮＡ　 分子で形質転換してインヒビンの全部、１部又は前駆体であるポリはプチド又は インヒビンと同様の生物学的又は免疫学的活性を有するポリペプチドを含有する たん白質生成物を発現可能な宿主を作り、該宿主を培養して該発現生成物を得、 そして該ポリはプチドを採取することから成る、インヒビ／の全部、１部又は前 駆体から成る。ｌ　ＩＪはプチド又はインヒビンと同様な免疫学的又は生物学的 活性を有するポＩＪ＜プチドを生合成する方法を提供する。

好ましい態様として、該発現生成物は不活性封入体として生成され、そして可溶 性細胞たん白質からの遠心分離によって細胞抽出物から精製される。好ましい精 製方法としては、プロテオリシス抑制剤および膜崩壊剤を添加しそして密度勾配 遠心分離に付することである。必要に応じて、この精製封入体は可溶化されそし て放出されたたん白質は更に選択的分解および（または）付加的精製等の処理に 付することＫよって不用なたん白質を除去しても良い。　、 更に又本発明は、プラスミドｐＢＴＡ２８．ｐＢＴＡ２９．ｐＢＴＡ２９２およ びｐＢＴＡ２９６−ｐＢＴＡ３Ｑ５で形質転換された細菌によって発現されたイ ンヒビン様たん白質を提供しよう。

更に又本発明は、薬学的に許容される形態又はその等側合成体の形の、１種又は それ以上の本発明の発現生成物を含む薬剤組成物を提供する。

更に又本発明は、インヒビンの部分であり、そしてインヒビン作用薬又は拮抗薬 となり得るかあるいは抗原性応答を誘発することができそしてＦ’ＳＨ単位又は 生殖生理を左右するものとして使用することのできる、合成はプテドを包含する 。

組成物は経口投与あるいは注射剤の形であるのが適当であり、そして好ましくは 薬学的に許容されるアジュバントを含有している。本発明の薬剤組成物は又、徐 放性の形態、特に移植に適当でありそしてを推動物中で徐放効果のあるものをも 含有する。

この様な形態における組成物はを推動物中に移植し生殖腺機能に作用させそして 所望の効果が得られた後にこれを除去することができる。

本発明は又、薬学的に許容される形態にある、１種又はそれ以上の発現たん白質 を含有するワクチンを提供する。

本発明は又、本発明の薬剤組成物の有効量をを椎動物に投与することから伐る、 を椎動物の生殖腺機能を調整する方法を提供する。

本発明は又、１種又はそれ以上の本発明の発現生成物又は本発明の薬剤ｍ我物を を椎動物に投与する免疫学的操作の結果得られる抗体製剤を包含する。該抗体製 剤としてはポリクローナルおよびモノクローナル抗体製剤を挙げることができる 。

本文および請求の範囲における語句の「インヒビン」とは非検特異性なものであ り、従ってこれはウシ、ヒト、ヒツジ、ブタ、トリおよび魚等のインヒビン関連 種、特にヒトおよびウシインヒビンを包含するものである。又該語句は非グリコ ジル化およびグリコモル化インヒビン種も包含する。

「を椎動物」なる語句は魚類、両生類、爬虫類、鳥類およびヒトを含む哺乳類の 種を包含する。

インヒピンのサブユニット構造 本文中に記載の様に１ろ胞液中に分泌されるインヒビンは、２つのサブユニット 、即ち４３．ｋＤ　および５１１ｃＤ　のサブユニット（それぞれＡおよびＢ） から成る５８ＴｋＤ　のたん白質である。Ａ、すなわち４３°ｋＤ種は、あるイ ンヒビン種を他の種に投与した時に抗原として作用するであろう様に相違してい る種間における相同たん白質である。この様に、異種インヒビンは後記する用途 の抗インヒビ／抗体を生起せしめる様に使用することができると考えられる。

一方、Ｂサブユニットすなわち１５ｋＤサシユニツトは多くの種間において、例 えばヒトおよびウシ種においてアミノ酸配列が実質的に同一である。

ある状況下においては、全たん白質は分子量２０　ｋＤおよび１５　ｋＤ　の２ つのサブユニット（それぞれＡＣおよびＢ）から成る３１ｋＤ型に切断される場 合がある。この３１ｋＤ７はインヒビン活性を有しており、そして本発明の範囲 内に包含されるものである。５８ｋＤ型を３ｔｋＤ型に切断することによりＡＮ 断片と呼ばれるポリはプチド断片が生成するが、これ自身生殖腺機能に重要な作 用をするので、これも又本発明の範囲内に包含される。

前記した様に本発明は非常に広範囲な分野を包含するものであるが、尚本発明の 好ましい態様を下記の実施例および本文添付の図面に従って更に詳述する。

第１図はウシ顆粒層細胞ｃＤＮＡを含有する組換えプラスミドの合成法を示す。

第２図はウシ顆粒層細胞のメンセンジャーＲＮＡからの合成ｃＤＮＡ　の産物の ポリエチレンイミンセルロース上の薄層クロマトグラムである。

第３図は４３ｋＤ（Ａ）サブユニットおよび１５ｋＤ（Ｂ）サブユニットプロー ブの配列を示す。

第４図は制限酵素（Ｐ８ｔ　工）地図および７個のインヒビ／　。

ｃＤＮＡ　の配列方法を示す〇 第５図はウシインヒビンへサブユニットｃＤＮＡ　のヌクレオチド０配列ならび Ｋその予想されるアミノ酸配列を示す。これに選択した制限酵素部位はそのＤＮ Ａ配列の上に示した。

第６図はクシインヒビンＢサブユニットｃＤＮＡ　のヌクレオチド配列ならびに その予想されるアミノ酸配列を示す。これに選択した制限酵素部位はそのＤＮＡ 配列の上ンζ示した。

第７図はヒトインヒビンＡサブユニットＤＮＡ　のヌクレオチド配列ならびにそ の予想されるアミノ酸配列を示す。

第８図はヒトインヒビンＢサシユニットＤＮＡ　のヌクレオチド配列ならびにそ の予想されるアミノ酸配列を示す。

第９図は５ＤＳ−ＰＡＧＥ　ゲル上の分子量標漁（ＳはｋＤで示した大きさ）と しての５８ｋＤインヒビン（Ｉ）と３１ｋＤインヒビン（Ｕ）の構造（Ｎ；およ び非還元５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルからの切片中での放射能測定により測定した、去 勢ウシ血清（Ｓ３）およびヒトインヒビンの３１ｋＤ　型への変換の結果向を示 す。

第１０図は全長Ａサプユニツ）ｃＤＮＡ　を得る方法を示す。

第１１図はＡおよびＢ？ゾユニツ）ｃＤＮＡ　の発現のために使用するリンカ− を示す。

第１２図はプラスミドｐＢＴＡ３０２．　ｐＥＴＡ３０３およびｐＢＴＡ３０４ の地図を示す。

第１３図はＥ、コリ株中におけるインヒビンサブユニット融合たん白質およびβ −ガラクトシダーゼの発現を示す。

第１４図は全長ゾレプロＡサブユニットｃＤＮＡ　の構築法を示す。

第１５図は合成はプチビで免疫化したウサギの血清Ｆ’ＳＨ準位を示す。矢印は ワクチン注射の時期を示す。

本文においては下記の略語を使用した。

ＡＴＰ：　アデノシントリフオス７エートｂＦＦ：　ウシ卵胞液 ｂｐ：　塩基材 ｃ　ＤＮＡ　：相補ＤＮＡ ＣＧ：　絨毛ゴナドトロピン ａＡＴＰ：　２’　−デオキシアデノシントリフオス７エートａｃＴＰ＝２’　 −ｆオキシシチジントリ７オスフエートａＧＴＰ：２’　−デオキシグアノシン トリフオスフェートＤＮＡ：　デオキシリボ核酸 Ｄ’Ｔ’ｌ’：　ジチオスレイトール ａＴＴＰ：　２’−デオキシチミジントリ７オスフエートＥＤＴＡ：エチレンジ アミンテトラ酢酸ＥＬ工ＳＡ：エライザ（酵素結合免疫吸着分析）Ｆｌ：　７オ リトロビン又はろ泡刺激ホルモンＸＧ二　重さの〜倍の力 ｇ：　ダラム ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィーに：　（接頭語）キロ ｌ：　リットル Ｍ：　モル濃度 ｍ：　（接頭語）ミリ ｍ０１：　モル ｍＲＮＡ：メツセンジャーＲＮＡ ｐ：　（接頭語）ピコ ｎ：　（接頭語）ナノ ＰＡＧＥ　：　ポリアクリルアミドゲル電気泳動Ｐαω：　バラクロルメルクリ 安息香酸ＰＭＳ：　ヒト閉経後血清 ＰＭＳＦ　：　フェニルメチルスルホニルフルオライド９ＰＭＳＧ　：妊馬血渭 ゴナｒトロピン Ｒ工Ａ：　ラジオイムノアッセイ ＲＮＡ：　リボ核酸 ＲＰ−ＨＰＬＣ：　逆相　ＨＰＬＣ ３ＤＳ：　ドデシル硫酸ナトリウム ＳＳ：　去勢ウシ血清 Ｔｒｉθ：　トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンμ：　（接頭語）ミクロ 尚本文においては起源又はグリコジル化の状態に関係なく下記の通り用語を互換 可能に定義しこれを使用した。

Ａサブユニット−４３ｋＤ　サブユニット−５８ｋＤインヒビンの大サブユニッ ト二アミノ酸Ｈ１ｓ　１から工１ｅ３００（第５図）−７ミ）ｅＨＩＢ　１から １１ｅ３０６（第７図）。

Ａｃ　＋プユニットー　２０　ｋＤ　サプユニツ）　−３１ｋＤインヒビンの大 サブユニット−アミノ酸５ｅｒ１６７から工１θ３００（第５図）−アミノ酸５ ｅｒ１７２からＩｘｅ３０６（第７図）。

ＡＮ断片−大サブユニットのＮＨ２−末端部一アミノ酸Ｈｉｓ１からＡｒｇ１６ ６（第５図）−アミノ酸Ｈ１ｓ　１からＡｒｇｌ　７１（第７図）。

Ｂサブユニット−１５ｋＤ　サブユニット−５８ｋＤおよび３１ｋＤ　インヒビ ／の小サブユニットーアミノ酸Ｇｘｙ　１から５ｅｒｌ１６（第６および８図） 。

「同様な免疫学的活性を有する」とは、インヒビン又はその１部の充分に相同性 のあるたん白質であって、（１）　その受容菌の免疫系が生来のたん白質と同様 な反応性を有するか、あるいは（２）　これを投与した場合に内在インヒビ／を 認識可能な該たん白質に対する抗体を生成し得る様なたん白質を含めて意味する ものである。

又、「インヒビンの部分」とはインヒビンのサブユニットを含めて意味するもの であると理解すべきである。

本発明の方法および産生物を以下に実施例を挙げて詳述するが、当業者において はこれらを変更することが可能であり、本発明は当然それらの変法等も良く包含 するものであることは言うまでもない。

全精巣および全卵巣又は単離したセルトリ細胞および顆粒石細胞をイン上ビンｍ ＲＮＡ源として使用することができる。本例の場合単離した顆粒石細胞を使用し た。

針および注射器を使用して、地方畜殺場において新鮮なウシ卵巣の表面の大卵胞 から、顆粒石細胞を含むウシ卵胞液（ｂＦＦ）を採取した。この液は採取後すぐ に実験呈へ運ぶまでの間水冷保存した。７０〜１００ｄのｂＦ１ｉ″　からの細 胞を５分間５００Ｘ’Ｇで遠心分離して上ずみ液を除去して生来インヒビンの精 製をした。ＲＮＡを下記の様にして細胞から抽出した。

（ｂ）ＲＮＡ　の抽出と精製 採取後すぐに顆粒石細胞に２４１１Ｌｌの４．２Ｍグアニジウムインチオシアネ ート／１２０ｍＭ　メルカプトエタノール１５％（Ｖ／Ｖ）　サクロシルア１０ ｍＭ　トリス−ＨＣｆｉ　（ｐＨ７，４）（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、　Ｊ、Ｍｌ等（ １９７９年）のＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８；　５２９４−５２９９）を加え ゛（これを溶解した。この溶解産物をツルバール　オムニミックス（Ｓｏｒｖａ ｌｌ　Ｏｍｎｉｍｉｘ）中で速度４で３０秒間ホモジナイズし、次に１５分間２ ０ρ００ｘＧ　で遠心分離して細胞細片を除去した。上ずみ液に２．５コにつき ＩＩのｃｅ（４を加えた。この混合物を９ｔｘｔの５．ＶＭＣｓＣｊｊ／ｌＱｍ Ｍ　ＥＤＴＡ１５０ｍＭ　）リス−ＨＣＩ（ｐＨ７，８）のクッションの上に置 きそして６５時間１５℃で１２２，００　ｏｇＧで遠心分離した。

ＲＮＡ　はレットを５ｄの７０チェタノール／３０チＴ１：（１ｍＭ　ＥＤＴＡ ／　１０　ｍＭ　）す、＜−ＨＣｌ、ｐＨ７，５）で数回洗浄してＣｅＣ１を除 去した。これを最後に０．３ｍＪの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐｕ７．ｓ）と６ｄの エタノールを加えて３ｄのＴＥ　から析出させて次に一７０℃で凍結させてそし て１０分間２０，０００ＫＧで遠心分離した。このＲＮＡ　−？レットを１ｄの ＴＥ　中に再溶解し次で使用するまでの間−７０℃に保存した。

（ｃ）ｍＲＮＡの単離 オリゴａＴ　セルロースクロマトグラフィーにより全ＲＮＡからｍＲＮＡ　を抽 出した。（Ａｖｌｖ、　ＨおよびＬｅｄｅｒ、Ｐ　（１９７２年）によるＰｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａａ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、６９　ｚ　１４０８−１４ １２）。まずＲＮＡをＩ　Ｍ　Ｎａ（Ｊｌ　／　１　ｍ　Ｍ　ＥＤＴＡ／　２０ ｍＭトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）の溶液とし、２分間７０℃に加熱し、氷水中 に急冷しそしてオリゴａＴ　セルロース（ＢＲＬ）（Ｏカラｌ−（乾燥床重量０ ．５Ｊｉｌ）Ｋ供給した。両分からの流体を加熱し、冷却しそしてこの操作を２ 回くり返した。カラムを５−の負荷緩衝液で次で０．５　ＭＮａＣＪｌを加えた 同ＭＦＩ液５ａｅで順次洗浄した。ｍＲＮＡが６０℃でＴＥ　中に溶出した。面 分（０−２５Ｍ／）を集め、そのｍＲＮＡ含有分を酢酸ナトリウムおよびエタノ ール（上記参照）を使用して析出させ、そしてベレットを真空乾燥した。ｍＲＮ Ａを０．１ｄのＴＥ　中に再溶解して部分標本（アリクウオット）（２５μｉ） を−７０℃に凍結した。

これらの抽出および精製工程からのＲＮＡ　６分の全部をあわせ、その１〜２μ ｇ試料をアガロース−原票ゲル上の電気泳動により検査した。すなわち、５Ｍ尿 素と各０．０１％（−／ｖ）の１シラキング色素ブロモフェノールブルーとキシ レンシアツールＦＦ　とを含有する１０μｉ　のＴＥ中のＲＮＡ　試料を２分間 ７０℃に加熱し、そして５．６Ｍ尿累／１４ｍＭ　ヨード酢酸塩／１ｍＭ　ＥＤ ＴＡ／３６ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４７４３ｍＭ）リス−ＭａＯＨ（ｐＨ７，４）を 含有する１、５％アガロースゲルの電気泳動に付した。

ブロモフェノールブルー色素がゲルの底部に到達した時点で電気泳動を完了し、 そして臭化エチジウムの酸液を加えて着色後ＲＮＡ　を紫外線下に可視化した。

ＲＮＡ濃度をその２６０　ｎｍにおける吸光度により測定し、４０Ｐ９／ｌｄの ＲＮＡは１瀉の光路長を使用してのＡ２６０が１．０であった。具体的には、６ ０−１００−のｂＦＦ’からは１−３２湿重量のイレット化顆粒層細胞が得られ 、そしてこれから６００−９００μＩ　の全ＲＮＡおよび２０−６０μＩのｍＲ ＮＡが抽出された。

このｍ　ＲＮ　Ａ画分はインヒビン、そのサブユニット又はインヒビン様ポリイ プチドに特異性のあるｍＲＮＡ　を含有しているが、このｍＲＮＡ　画分はその 大部分が不用である種々の非常に多くの異なるｍＲＭＡ　種から成る混合物であ ることを理解すべきである。

次のｃＤＮＡ合成および尾部形成の工程中にこれらの各々はインヒビン、そのサ ブユニット又はインヒビン様ポリはプチドに特異性のあるｍＲＮＡ　と同様に機 能し、そしてこれらが存在する事が結局大量の不用クローンの生成の原因となり ために所望のクローン、すなわちインヒビンの全部、１部又はサブユニットをコ ードするｃＤＮＡ　配列を含有するクローンを同定するためのスクリーニング工 程が必要となる。

ｍ　ＲＮ　Ａ　からのｃＤＮＡの生成工程およびこれをベクターｐＢＲ３２２に 導入する工程を第４図に示しそして実施例２および３Ｖｃ更に詳述したが、これ は本発明の１例の例示にすぎないものである。

ｍＲＮＡからのコピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成ａＡＴＰ　の不足した反応混合 物を用意し、その小部分をとり出してα−３２Ｐ　ａＡ’ｒｐを加えることＫよ りｃ　Ｉ）ＮＡ　合成の様子をモニターした。次に過剰のｄＡＴＰ　を主反応混 合物に添加し直して第１鎖の完全合成をした。即ち、ｍＲＮＡ混合物の試料（２ μｓ）を水を加えて２７μ、ｅとし２分間７０℃に加熱し、そして氷水中に急冷 した。５００　ｎｇ　のオリ：／ｄＴ１０−１７プライマー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ ｅｒ）、各５０　ｎｍｏｌのｈ　ＣＴＰ　、　ａＴＴＰおよびｄＧＴＰ、５部ｍ ｏｌのａＡＴＰ、１００１００ｎのＤＴＴ、２０単位のＡＭ’Ｖ逆転写酵素（Ｌ ｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｏ）、２μｍｏｌのＫＣＪＩ。

４００ｎｍｏｌのＭｇＣｌ１２および２．５μｍｏ’ｌのトリ、ｔ、−ＨＣＱ（ ｐＨ８，５）から成る混合物２３．５μｌ　を加えて反応を開始した。

混合後直ちに２μｌの試料を０．５μにのα−３２Ｐ　ａＡ’ｒｐ（１８００Ｃ １／ｎｍｏｌ；　５μＣｔ／μｌ）を含有する別ノチューブに入れて分析反応を 行い、そして０．５μ！　０６０ｍＭｄＡＴＰを主反応系に添加し直してこれを ４２℃に６０分間保った。分析反応系から０．５μｌをとり出しエタノール−ド ライアイス浴中で急激に冷凍しこれを０時間のコントロール試料とした。

反応系の残りを４２℃に６０分間保ち、更にその０．５μｌを分析に供した。

各放射性試料を０．７５　Ｍ　ＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐ１５プ中ポ・リエチレン イミン（ＰＥＩ）セルロース（Ｍｅｒｃｋ）の薄層クロマトグラフィーに付した 。オートラジオグラフィーの結果を第２図に示した。こうして非結合ヌクレオチ ドを出発物中に残っている新たに合成した第１鎖（ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド ）から除去した。オートラジオグラフィー後に各スポットを切り出しそしてその 結合放射能を測定して結合能を評価した。総数の１０％の結合（評価　最大結合 ３３チ）又はそれ以上がｃＤＮＡの第２鎖合成に充分な量であった。放射性物の 残りを２Ｍ酢酸アンモニウム／６７％エタノールから２回析出させ、負荷緩責液 （上記参照）中で２分間沸騰させた後にアガロース−尿素ゲルの電気泳動に付し てＲＮＡ鎖とＤＮＡ鎖を分離した。このゲルを次にＸ−線フィルム（富士ＲＸ　 型）のオートラジオグラフィーに付した。この工程によりｃ　ＤｆＪＡ生成物の サイズが決定されるが、これによると代表的なものは１０００塩基以上から２０ ０塩基以下の範囲であった。

第１鎖合成は当業者に公知の他の方法によっても行うことができる。本例におい てはオリ：／ａＴ　をプライマーとして使用してボ１ハＡ）領域を有する全ｍＲ ＮＡ種からの第１ｃＤＮＡ鎖を合成した。ｍＲＮＡ　ａ！からｃＤＮＡ　を合成 するために任意のグラ１イマーを使用することもできる。又別法として、インヒ ビンｒｒｒ　ＲＮ　Ａ　の部分に相補性のある配列を有するプライマーを使用し てのインヒビンｃＤＮＡ　（７）特異的合成も可能である。オリビａＴ　又はイ ンヒビンｍ　ＲＮ　Ａ　の部分に相補性のある配列を有する他のプライマーを男 １鎖の合成用のプライマーとして使用することも出来る。

（ｂｌ　第２鎖の合成 第１　ｃＤＮＡ　鎖合成と同様にして、ａＡＴＰ　の不足した出発反応混合物か ら主反応および分析反応を行った。

すなわち、第１ストランｒ主反応系のｃＤＮＡ−ＲＮＡ　ハイブリット３分子を これに５０μｍ　の３Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ７，５）および２００μ見のエ タノールを加えることによって析出させ、−７０℃に冷却しそして１　ｓ、ｏ　 ｏ　ｏ　、ｘＧ　で５分間遠心分離した。

このペレットを５０μｌのＴＩ中に再けん濁し、再析出させ、これを乾燥しそし て最後に５０１’ｌ　の　ＴＩ　中に取った。

これに、各１６　ｎｍｏｌのａＣＴＰ、ａＴＴＰおよびａＧＴＰ、Ｉｎｍｏ１の ａＡＴＰ、３．５単位のＲＮＡアーゼＨ（ＢＲＬ）、９２単位（７）ＤＮＡポリ メラーゼＩ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、４ｏμＩのＢ　Ｓ　Ａ。

６部ｍｏｌ　のβ−ＮＡＤ、４０（Ｉｎｍｏｌ　の（ＮＨ４）ＳＯ２，４／Ｚｍ ｏ’１のＫＣｊ！、２００ｎｍｏｌ　のＭｅ；（Ｊｔ２および８００　ｎｍｏｌ 　のトリス−ＨＣＱ　から成る爵液（ＴＩＨ７，５）　（Ｇｕｂｘｅｒ、Ｖ、お よびＨｏｆｆｍｎ。

Ｂ、Ｊ、（１９８３年）のＧＧｎｅ　２５　；２６３−２６９　）の３５０μ℃ を加えた。

混合後直ちに２μｌ　の試料を０．５μ歪の　ａ３２ＰａＡＴＰ（１８００Ｃ１ ／ｎｍｏｌ；　５／’Ｃ１／μｍ）を含有する別のチューブに入れて分析反応を 行い、そして２μ旦　のＩＯＩＩＩＭ　ｄＡＴＰを主反応系に添加し直してこれ を１５℃に６０分間次いで２２℃に６０分間保った。０時間、１時間および２時 間目に分析反応系から０．５μｌ　の試料をとり出しエタノール−ドライアイス 浴中で急冷凍しそして第１鎖合成の場合（第２図）と同様にして薄層クロマトグ ラフィーにより分析した。この第２鎖合成の結果、総数の少（とも５％の結合（ 評価最大結合８％）が得られた。

第２鎖合成は当業者に公知の他の方法忙よっても行うことかできる。その例とし ては例えば次のようなものが挙げられる。

本例の場合は、ＤＮＡ／ＲＮＡ　ノ＼イブリッド中のＲＮＡに特異性ノするＲＮ Ａアーゼ（例えばＲＮＡアーゼＨ）をＤＮＡポリメラーゼと一緒に使用した。

別法として、第１鎖合成の際に生成したＤＮＡ／ＲＮＡ　ノ・イブリッド中のＲ ＮＡ　を化学的又は酵素的に分解しあるいはＤＮＡから単離し、ＤＮＡ　を自己 プライマーとしても良い。次にＤ１ｆＡポリメラーゼ又は逆転写酵素を使用して 第２鎖合成を行い、残存するヘヤーピンループを１重鎖特異性Ｒ因子例えばＳ１ ヌクレアーゼによって消化する。

第３の方法は、ｍＲＮＡ　の除去又は分解の後にオリゴヌクレオチド（例えばオ リゴａＣ）尾部を第１鎖ＤＮＡ生我物の３′末端に付加する方法である。相補オ リゴヌクレオチド（例えばオリゴ、ｉＧ）を尾部にアニーリングしそしてこれを ＤＮＡ　、ｐリメラーゼ又は逆転写酵素による第２鎖反応のプライマーとして使 用スる。インヒビンｃ　ＤＮＡ　に相補の又は同一の又は類似の配列を有する一 本鎖又は２本鎖ＤＮＡは又クローンの化学合成によっても作ることができる。

４０μ２　の３Ｍ　酢酸ナトリウム（ｐＨ７，５）および８００μｌのエタノー ルを加えることによって第２鎖合成で得られた２重鎖ｃＤＮＡ　を析出させ、こ れを−７０℃に冷却しそして２ｏ、ｏｏｏｘＧで５分間遠心分離した。このベレ ットを５０μρのＴＥ中に再溶解し、等容量の７エノール（ＴＥ　で予め平衡化 しておいた）で２回抽出し、１００μρ　のジエチルエーテル（ＴＥ　で予め平 衡化しておいた）で３回抽出し次で５０μゑの４Ｍ　酢酸アンモニウムと２００ μｌ　のエタノールを加えて析出させそして一７０℃に冷却した。この析出操作 とは別に、冷混合物を室温に戻し、１５、ＯＯ□ｘＧ　で５分間遠心分離した。

この操作は非結合ヌクレオチドを除去するためのものである。このベレットを５ ０７’ｆｉのＴＥ中に溶かしそして酢酸アンモニウムとエタノールを使用して析 出させた。ベレットを真空乾燥し３０μυのＴＥ　沖に再ゆん濁させた。

１５μｍ　１７ＪｃＤＮＡ　に３０　ｎｍｏ’ｌ　（７）ＣｏＣｊ１２．３ゴｍ ｏ１のＤＴＴ、１．５μｍｏｂのカコジル酸カリウム（ｐＨ７，２）、５μ９の ウシ血清アルブミンｓ３０ｐｍｏ１のａＣＴＰおよび１７単位の末端トランスフ ェラーゼ（ＢＲＬ）を含有する緩衝液の等容量を加えた。混合物を３７℃で３〜 ５分間培養し、エタノール−ドライアイス浴中で凍結し次で６５℃で５分間加熱 した。この尾部形成りＮＡ　な次に使用するまで一２０℃で保存した。Ｐｓｔ　 工制限酵素部位（ＢＲＬ　Ｃａｔ、４５３５５　ＳＡ）の３′突出末端上に約２ ４個のａＧ残基を有する市販のｐＢＲ３２２プラスミド分子（第１図；表２）中 へのアニーリングとして公知の方法によってｃＤＮＡ　ＩＦｆｌを結合した。こ のアニーリング処理により、ｃＤＮＡ　ｆ）　４０尾部はプラスミドのｃＬＧ　 尾部と安定なハイブリッドを形成する。Ｐｓｔ工部位はｐＢＲ３２２Ｂ−ラクタ マーゼ遺伝子中にあるので、生成したプラスミｒはアンピシリン感受性であるが 、テトラサイクリンには尚耐性がある。

アニーリング操作において、２．５μｌ　のａＣ尾部付ｃＤＮＡと約０．５μｓ 　のａＧ尾部付ｐＢＲ３２２とを０．ＩＭ　ＮａＣＪ２含有ＴＥの５０μｌ中で ６５℃に５分間加熱し、次で５７℃に２時間培養した。次に溶液を１時間以上か けて除々に室温に冷却しこれを次に使用するまでの間氷上に保存するか又は−２ ０℃で冷凍保存した。

ｃＤＮＡ　ｆｉのベクター分子中への挿入は当業者に公知の他の方法によっても 行うことができる。例えば、ティリングとして仰られている末端トランスフェラ ーゼ反応を使用してヌクレオチどをＤＮＡ分子の３′末端に付加することができ る。これらの分子を次に相補配列でティリングしたベクターＤＮＡ　分子でアニ ーリングすることができる。これとは別にｃＤＮＡ　分子は、制限酵素で切断し た時に１クローニングに好都合な配列を生成するＤＮＡ　リガーゼによって付加 された合成リンカ−を有していても良い。又別に、ｃＤＮＡ　は直接制限酵素又 はＤＮＡアーゼで切断して直接クローニングに供しても良い。又平滑末端ＤＮＡ 分子はベクター中に直接クローニングしても良く、この様なベクターとしてはプ ラスミド、コスミド、バクテリオファージおよび他のビールス等が挙げられる。

ｆｌ））　組換えプラスミドによるＥ、コリＥＤ８６５４の形質転換Ｅ、ココリ Ｄ８６５４（表２）をり、Ｈａｎａｈａｎ　の方法（１９８３年、ＪＪｏｌ、Ｂ ｉｏｌ、１６０　ｖ　５５７−５８０　）により処理して反応能を付与し、この 反応性細胞の０．２ｄを１０μ皇　のアニーリングしたｃＤＮＡ−ｐＢＲ３２２ ノ・イブリッドで形質転換しｔム形質転換後、細胞を２ｄのＳＯＣ（５ｇ／ｌの 酵素エキス７２０ｇ／ｌのトリプトン／１ｏｍＭ　のＮａ（Ｊｌ　’／　２．５ 　ｍＭ　のＫ（Ｊ／２０ｍＭのＭｇＣｊ、ｚ／　２０ＴＯＭのＪＳＯ４７２０ｍ Ｍ　のグルコース）中で２時間生長させ、次で２，０００　ｘＧで５分間遠心分 離しｓｏ、５ｒｌｌの０．８５％　ＮａＣｆ１中に再ゆん濁し、そして全けん濁 液と、ｐＢＲ３２２組換えプラスミドで形質転換した細胞を選択するために１１ ０μｙ／ｄのテトラサイクリン−Ｈ（Ｊを含有する２８０ｗのＬＢ（ｌｆｉにつ き５１の醇累エキス／１０ｇのトリプトン１５Ｊｉ’のＮａＣｊｌ）寒天（Ｉｋ につき１５ｇの寒天）板上に載置した。

こうして３７℃で４８時間培養した。この方法により、代表的な例としてこの形 質転換により組換えプラスミ）”Ｊ）ＢＲ３２２１μｙ　につき約５×１０３〜 ５Ｘ１０’個のコロニー、あるいはｃＤＮＡ　１μｌＶＣつき約１０４〜１０５ 個のコロニーが生成することになる。又１４個のテトラサイクリン耐性コロニー からのプラスミドの任意のスクリーニングにより測定したところ、形質転換体の ７８％μ上が組換えプラスミドを含有していた。

（Ｃ）　形質転換細胞の保存 各培養板からのコロニーを１０ｔｒｔｌのＬＢ中にかき落した。

推定２０００の独立した形質転換の結果生成した細胞を集め、１．５００ＸＧで ５分間遠心分離し、０．５ｄのＤＭＳＯを加えた５ｄのＬＢ（ｖ／ｖ）中へ再け ん凋した。この一部（０，４ゴ）を液体窒素中で凍結し、次に使用するまで一７ ０℃で保存した。

こうして、この様な５個のプールを作収した。

各原形質転換体はｍＲＮＡ画分中にあるｍＲＮＡ種の１個の完全又は部分コピー 由来の１個の組換えＤＮＡ種を含有しているので、これら形質転換体の集合体す なわちプールはライブラリーと呼ばれる。本例の場合、ウシ顆粒層細胞ｃＤＮＡ のライプラリーがＥ、コリ中に形成されたこと忙なろ。真核細胞は約１×１０〜 ２Ｘ１０　の別注のたん白質を生成することができるので、１０４個の独立の形 質転換体の集合体はそれ以上の多数のｍＲＮＡ　種の全部忙由来したものを含む ことになる。事実、これらのライブラリー中の極めて大量の細胞の大部分は本発 明には不用のｃＤＮＡ　を含有しており、その内のわずかのものがインヒビンｍ ＲＮＡ　９１の完全又は部分コピーを含有しているので、これらのコロニーを同 定し単離するために次の工程を行う。

冷凍細胞のチューブを解凍し５Ｘ１０５倍に希釈しその０．５−を１０μ９１− のテトラサイクリン−ＨＣ４を含有する２８０ｍのＬＢ寒天板の表面上に広げ、 １晩３７℃で培養した。こうしてｌ培養板あたり約１０４個のコロニーが生成し 、原ライブラリー中の各形質転換体は１〜５倍に増加した。転写レプリカをニト ロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ−８ｃｈｕｅ１１　）上に置き 、墨につけた針をフィルターを通して寒天中に突き刺すことＫよって定位マーク をつけた。母培養板を次に使用するまで４℃に保存し、一方レプリカフイルター を１０ｐｇ／ｒｔｔｌのテトラサイクリン−ＨＣ４を含有する新しいＩ、Ｂ寒天 板の上にかぶせて８時間培養した。次でこれを５０μｍ１／−のクロラムフェニ コールを含有するＬＢ　寒天板上に転写し、組換えプラスミドの細胞１個あたり のコピー数を増加させるために１晩培養した６　６７−６７６　；　Ｈａｎａｈ ａｎ、　ＤおよびＭｅｓｅｌａｏｎ、　Ｍ（１９８０年ンのＧｅＤｅ　１０ｐ６ ３−６７　）。このフィルターをＧｒｕｎｏｔｅｌｎ。

ＭおよびＨｏｇ；ｎθｇｓ、　Ｄ、Ｓらの方法（１９７５年、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７２．３９６１−３９６５　）の 変法で処理した。

細胞分解と一本鎖ＤＮＡ　の形成促進のために、このフィルターを、０．５　Ｍ 　ＮａＯＨ７１，５Ｍ　ＮａＣｌ１中で飽和したワットマン３ＭＭ　（Ｗｈ＆ｔ 、ｚａｎ　３ＭＭ　）紙上に１５分間かぶせて置き、次いで１．５　Ｍ　ＮａＣ ｆ１Ｉ　Ｏ，５Ｍ　）リス−Ｈ（Ｊ（ｐＨ７，５）中で飽和した紙ｔ２回交換し て１５分間中和した。これらを空気乾燥し、プワナーろう斗の上に置き、次いで ２０ゴのＣＨＣｆｆｉ３　で飽和して吸引した。次いでフィルターを８０℃で２ 時間真空オーブン中でインヒビンｃＤＮＡ　３１１伝子又はその１部を含有する クローンを同定するために、放射能標識したオリゴデオキシリボヌクレオチド（ オリゴヌクレオチド）プローブを使用した。これらは、各４３ｃＬ）および１５ ｋＤサシユニツトのＮ末端アミノ酸配列をコードするｍＲＮＡ　の部分に相補性 がある様にしたものである（プローブ１および５、第３図）。４３ｋＤ　および １５ｋＤサブユニツトのＮＨ２末端配夕１ｊは、完全５８ｋＤインヒビンおよび その単離サブユニットの配列のアミノ酸由来のものであり、それぞれの最初の１ ６個のアミノ酸は国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ８５１００１１９　に記載しである 。次いで、完全５ｇｋＤインヒビンのアミノ酸配列から４３ｋＤサブユニツトの アミノ酸配列（これはｐＢＴＡ２２およびｐＢＴＡ２３中の配列のｃＤＮＡ　に よって決定されたものである一実施例６Ａ参照ンを除去することにより、表１に 示した１５ｋＤ　サプユニツ）ｆｆ分析を改良し拡大することが出来た。この改 良罠よりオリゴヌクレオチドプローブの作成に有用な別の区域、２０〜２４個を 含めてのアミノ酸の区域が明らかとなった。第３図は作成したオリゴヌクレオチ ドプローブ（プローブ２）を示す。これは２４倍変性の１４ｆｔ体であり、ｐＢ ＴＡ２９３　およびｐｎＴＡ２９４　の単離用に使用した。各アミノ酸（メチオ ニンとトリシトファンを除くンはそれに特異性のある１個より多くのＤＮＡ　コ ドンを有しているので・プ０−プ中には可能なすべての組合わせのコドンを入っ ていることが好まＬい。こうして、インヒビンの大サブユニット用に選択したア ミノ酸配列の大部分をコードする６４個の可能なりＮＡ配列（プローブｌ、第３ 図）とインヒビンの小サブユニット用選択したアミノ酸配列の大部分をコードす る２４個の可能なりｌｉ配列（プローブ２、第３図）がある。これら配列の各々 の代表的な分子を得る可能性を最大とするために、５′末端から２および６位置 において、ｄＧおよびｄＡ又はａＴ　およびａＡ又はｄＧおよびａＧ又はａＴ　 およびａＧのどちらかを有する４個の独立の合成体から集めた。プローブ２は単 一バッチ中で合オリゴヌクレオチドプローブはＩ）ＨＡ　自動＠ｒ成装置（モデ ル３８０　Ａ、　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂ１０５ｙｓｔｅｎｓ工ｎａ、７５）を使用 して合成した。この装置は、最初にＭａｔｔｎｕｃｃｉ　、　Ｍ、Ｄ、およびＣ ａｒｕｌｈｅｒｓ、　Ｍ、Ｈｏにより開発された方法（１９８１年、Ｊ、Ａｍｅ ｒ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、１０３．３１８５−３１９１）　に従っテ、ｍ、ｔ ｐ　−ｖイソプロビルホスホルアミジトデオキシリボヌクレオチド９誘導体を派 生制御多孔性ガラス支持体に配列に従って結合する様に入力しておいた。

Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅ　Ｉｎｃ、社処方の方法を使用した。

ホスホルアミシトデオキシリボヌクレオチドを単一派生塩基で置き換えて、変性 オリゴヌクレオチドを生殴した。２０　％　（Ｗ／Ｖ）アクリルアミド／１．０ ％（ｗ　／　ｖ　）　Ｈ、Ｎ’−ビスアクリルアミ）’／　１ｔｎＭ　ＥＤＴＡ １５０ｍＭ　トリス−ＨＣ，７１（固体はう酸でｐＨ８，３に調整〕を含有する ゲル（２０ｃ＊Ｘ　２０ｃｒｒ、×１．５ｍ　）中の調製用電気泳動により、早 期に停止したオリゴヌクレオチド９からこのオリゴヌクレオチド”を精製した。

電気泳動は５００ｖで１．５時間行い、次でＵＶ光で検出可能な様にこのゲルを キーゼルゲルＦ　２５４　（Ｍｅｒｅｋ　）薄層クロマトグラフィー上に置いて 可視化した。オリゴヌクレオチドは暗バンドを示す。これらを切り取り、０．８ ｄの無菌水中で１晩ゲルから溶出した。溶出オリゴヌクレオチドの濃度は２６０ 　ｎｍ　の吸光度の測定により推定され、これは１ｍの光路長を使用してのＡ２ ６Ｑが１．０であることから、３５μｇ／ｒｔｄｌ（１１度の一本鎖ＤＮＡであ る。

（ｄ、＋　５’末端標識反応 ３２ｐ−標識りん酸塩基をその５′末端に付加することにより、精製オリゴヌク レオチド°を放射能活性にした。

すなわち、４０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドと４０　ｐｍｏｌのγ−３２Ｐ　 ＡＴＰ　（２０００Ｃ１／ｍｍｏｌ−；　５μＣｉ／μｌ）を凍結乾燥し次で溶 解しそして４単位のＴ４＃？リヌクレオチｒキナーゼ７１０ｍＶ　のＭｇＣｂ　 ／　１０　ｍ　ＭのＤＴＴ／１ｍＭ　のｘベルミジン１５０ｎＭ　のトリス−Ｈ ＣＩ（ｐＨ７，５）を含有するｌｌ衝Ｈの２０μ塁　中で９０分間３７℃で培養 した。

放射性オリゴヌクレオチドを上記の様にして精製しそして富士ＲＸ型Ｘ−線フイ ルム上で５分間オートラジオダラフイーにより可視化した。１．８−の無菌水中 で１晩溶出した。プローブ１も一緒に含む４個のオリゴヌクレオチド集合体（実 施例１ｂ参照）の各々をこの段階では別々に処理し次いでこれらを一緒にした。

５８ＫＤインヒビンを還元し、アルキル化しそして分離したサプユニツ）ｉＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥ　ゲルからの電気溶出によシ単離した。５８ＫＤインヒビン（８０ ｐｍｏｌ）、Ａサブユニット（］７ｐｍｏ１）およびＢサブユニット（６ｐｍｏ ｌ）をガス連続相中でエドマン分解した。

（Ｘａａ）−ｃＤＮＡ配列から決定したアミノ酸。

Ｘａａ　−５８ＫＤインヒビンの２重配列からＡサズユニット配列を除去するこ とにより同定したアミノ酸。

オリゴヌクレオチドプローブ型を作るのに使った領域に下線放射性プローブの各 組を４０ｍ１の５ＸＳＳＣ／ＩＯＸデンハルト溶液中にと９１各ライブラリーの 代表的な１つのフィルターを、ゆっくり横押しながら】晩この溶液中に浸した。

（尚、２０　Ｘ　ＳＳＣは３ＭのＮａＣ１／　０．３　Ｍのクエン酸トリナトリ ウＡ　（ＰＩ−１７，０＞Ｔｈり、ＳＯＸデ７ハ／ｌ／ト溶液は１％（Ｗ／Ｖ） フィコール／】％（、／Ｖ　）ポリビニルピロリドン／】％（Ｗ／Ｖ　）　ウシ 血清アルブミンでるる。） フィルターをｌＸ５ＳＣ１０，１％ＳＤＳ　（）デシル硫酸ナトリウム）で数回 室温下に洗浄しｇ±ＲＸ型Ｘ線フィルムおよびデュポンＣｒｏｎｅｘ　Ｈｌ　Ｐ ｌｕｓ強化スクリーンを使用して一７０℃で３〜５時間オートラジオグラフィー 処理した。フィルムを現像し、フィルターを再度１ｘＳＳＣ１０，１％８１）Ｓ で３７℃で洗浄し次いで１晩オートラジオグラフイーに付した。

室温における洗浄後に背景部よりも強度が強いかあるいは３７℃における洗浄後 に尚可視状態であシ、かつ母培養板上のコロニーの位置に相当する区域が潜在イ ンヒビンクローンであるとみなされた。

上記実施例はインヒビン又はインヒビン様ＤＮＡ配列を含有する細胞の製造手段 および方法のいくつかを例示したものであって、その変法を除外するものではな い。例えば、出発ＤＮＡとしてゲノムＤＮＡを使用しｃＤＮＡ合成を必要としな い場合もある（実施例８参照）。又、クローン化ＤＮＡ断片を発現させそして抗 インヒビン抗血清を使用しく実施例】０参照）あるいはインヒビン又はインヒビ ン様生物学的活性を直接検出することによシスクリーニング操作を行う様なりロ ーニングベクターでめっても良い。この様な方法は当業者に周知である。

オートラジオダラムによる暗色スポットに相当する区域を拾い出し、１０μｌ／ ｍｌのテトラサイクリン−ＨＣ／を含有するＬＢ板上で単一コロニーの筋をつけ ３７℃で１６時間培養した。

これら培養板のレプリカは次に使用するまで４℃に保存した。

フィルターをテトラサイクリン−ＨＣＪ含有ＬＢ寒天上に３〜６時間置き、５０ μ９７ａｔのクロラムフェニコール含有ＬＢ５１天に１６時間転写し、次でコロ ニーを上記の様にして分解し、再度放射性オリゴヌクレオチドプローブ型プロー ズスクリーニングした。これらのフィルターからオートダイアダラム上の最暗色 スポットに相当する単一コロニーを拾い出しこれに筋付けをして分析した。

（ｂ）　シラスミドＤＮＡの制限地図 各推定インヒビンの少くとも１個の単離体のプラスミドＤＮＡ含有量を、制限酵 素Ｐｅｔ■で抽出および消化することによシ分析した。この酵素はプラスミドか ら挿入ｃＤＮＡ　を放出しそして更に内部Ｐθｔ１部位において該ｃＤＮＡを切 断する。プラスミドＤＮＡ抽出はＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙの方法（１９ ７９年ｔＮｕｃ１．　Ａｃ１ｃｌｓ　Ｒｅｓ、　７　；１５１３−１５２３）に 従った。３ゴのＬＢ中で１晩培養した細胞を遠心分離し０．２１の分解緩衝液（ ５０ｍＭグルコース／１０ｍＭ　ＥＤＴＡｌｏ、２％リゾチーム／２５ｍＭ）リ ス−ＨＣ７ｊ、ｐＨｓ、ｏ）中に再けん濁しセして０℃で１０分間培養した。こ れに０．４　ｔｔｔｌのアルカリ性ＳＤＳ　（０，２ＭＮａＯＨ／　］％（ｗ／ ｖ）　ＳＤＳ　）を加え、セして０℃で１０分間保持後に０．３１の３Ｍ酢酸ナ トリウム（ｐＨ４，８）ｔ−加えた。０℃で１５〜３０分後に、生成した沈でん 物を遠心分離により除去した。０．７　ｒａｇのインプロパツールを加え、−７ ０℃に冷却しそして１５，０ＯＯｘＧで５分間遠心分離することにより０．８　 ｍｌの上ずみ液中のプラスミドを析出させた。このペレットｋ　０．４　ｍｌの ＴＥ中に再溶解し、次いで４０μｅの３Ｍ酢酸す）　ＩＪウム（ｐＨ７，５）と ０．８　ｔｔｌのエタノールとを加えそして上記の様にして冷却し遠心分離する ことによシ沈でんを析出させた・最終的に得られたペレットを真空乾燥して０． ２−のＴＥ中に溶解した。

】Ｏμｇ、るａのＲＮＡアーゼＡを含有する４０μｌ（最終容量）のＴＡ緩衝液 （５５ｍＭ酢酸カリウム／ｌＱｍＭ酢酸マグネシウＡ１０．５ｍＭ　ＤＴＴｌｏ 、１１Ｗ／ｍ／ＢＳＡ／３３ｍＭ　）リス−酢酸塩（ｐＨ７，９）中、３７℃で ６０分間試料（２０μＩｌ）を２０単位のＰｓｔ　ｌ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ 　）で消化し１次いでＴＢＥ緩衝液（２，５ｍＭ　ＥＤＴＡ／　１３３　ｔｏＭ 　）リス−ＨＣｌ／　ｆ３９　ｍＭはう酸）中でポリアクリルアミドゲル（１０ ％までのアクリルアミド１０．２７％ビスアクリルアミド）上で電気泳動した。

Ａｌｕｌ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）で消化したｐＢＲ３２２の試料を標準体とし て使用した。最初に同定されたクローンを表２に示した。

（Ｑ）　配列決定法 適当な制限酵素断片（１個又はそれ以上の酵素Ｐｓｔ１％Ｐｖｕｌ、Ｓａｕ　３ ＡＩ又はＳｍａ　ｌ由来のもの）を０．５Ｍ酢酸アンモニウム／］　Ｑ　ｍＭ酢 酢酸マグネタウＡ１０Ｉ　ＭＥＤＴＡｌｏ、１％　ＳＤＳ中、３７℃で１晩溶出 することによ＃）ポリアクリルアミドゲルから精製し、次いでエタノールで析出 させ、ＴＥ中に再溶解し、そしてこれをサブクローニングして、万能プライマー （］７量体；＃１２１１又は＃　１２１２　；　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂ１ ｏ１ａｂｓ製）又はｃＤＮＡ　１芽に相補性のあるオリゴヌクレオチドプライマ ーを使用するＳａｎｇｅｒ　Ｆ　、等のジブオキシ鎖末端法（１９７年、Ｐｒｏ ｃ　、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７４＋　５４６３〜５４６７）に よる配列決定用のバクテリオファースＭ１３ｍｐ８および’ｔＡ　１３ｍｐ９　 の複製型分子とした。前記オリゴヌクレオチドプライマーはとりわけ重複ｃｉ） ＮＡ　種の単離や重複ｃＤＮＡ種からの公知配列の抗張やあるいはａＧ／ａＣ尾 部からｃＤＮＡの中央部への配列決定に有用である。

配列決定、サブクローニングおよび発現操作（実施例１０参照）のすべてにわた って制限酵素はＴＡ（実施例５Ｂ参照）中で使用し、Ｔ４！ｊガーゼはそのメー カー処方に従って使用した。

（ａ）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｕ５ｔｒａｌｉａ　Ｐｔｙ、　Ｌｔａ 、　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎのコード名。

（ｂ）「サイズ」（記載がある場合において）とは、Ａｌｕ　ｌで消化したｐＢ Ｒ３２２標準体に対するポリアクリルアミドゲル上における電気泳動から推定し たｂｐ値を表わす。この値はＤＮＡ配列から得られる実際の大きさから少し違っ ている。

（ｃ）　Ｍｕｒｒａｙ、　Ｎ　、に、等（１９７７年）、ＭｏＬＧｅｎ、Ｇｅｎ ｅｔ。

（＝）　ＥＴＡ６４７＝Ｅ、：＋ν　Ｋ　１２＋　ｈｓｄ　Ｒｋ＋　ｓｕｐ　ｋ 　４４　＋　５ｕｐＦ’　５８　＋１ａｃＹ１．　ｇａｌＴ２２＋　ｑａｌ　Ｋ ２　＊　ｔｒｐ　Ｒ５５／Ｆ”１ａｃＩ９゜Δ（１ａｃＺ）Ｍｌ　５．１ａｃＹ 　Ａ　、　ｐｒｏＡ　Ｂ　、ｔｒａ　０（ｆ）　Ｒｕｔｈｅｒ　、　Ｕ＊よびＭ ｕｌｌｅｒ−Ｈｌｌｌ、　Ｅ　、　（１９８３年）のＥＭＢＯＪ、２；　１７９ １−１７９４゜（ｇｌ　Ｂ’ｌ°Ａ６３４＝ｈ：、コリ　Ｋ１２　Δ（ｌａｃ、 　ｐｒｏ）、　ｓｕｐＥ（ｇｌｎＶ）。

ｔｈｌ、　Ｉｏｎ−］、　ｚａｊ　：　：　Ｔｎ５／Ｆ　’　ｐｒｏＡ”Ｂ”、 　１ａｃ工ｑ、Δ（１ａｃＺ）Ｍｌ　５．　１ａｃＹ　Ａ　、　ｔｒａ　Ｉ）３ ６゜（ｈ）　１３ＴＡ２８６は、２３５５個の塩基対のＨｐａＩ−ＡｖａよりＮ Ａ断片が１ａｃＺ遺伝子のコード配列から除去きれてそのコード配列が枠内に残 るようにしたｐＵＲ２９１の誘導体である・（１１ＢＴＡ６５２ｉＥｔ　：ｌＩ すに１２Δ（ｌａｃ、ｐｒｏ）、ｔｈｉ−、ｓｕｐＥ（ｇｌｎＶ　）　４４　、 　ｈｓｄＰｋｌ　７　ｅｎｄＡ］、　ｇｙｒＡ９５　、　ｒｅｌＡｂ９′。

ｐｒｏＡ７．１ａｃＩｑ、Δ（１ａｃＺ）Ｊ　５　、１ａｃＹ”Ａ”　ｔｒａＤ ３６゜（ｊ）　Ｖｉｅｒａ、Ｊ、およびＭｅｓｓｉｎｇ、Ｊ　、　（１９８９年 ）のＧｏｎｅ　１９　＊２５９−２６８゜ （ｋ）　ＢＴＡ５４５＝ｌ、：Ｉすに１２　ｔｈｉ−、Δ（１ａｃ＋ａｒｇＦ’ ）　＊　Ｕｌ　６９Δ（１ｏｎ）１００ｔ　ｈｆｌ１５（Ｌ　ｚｊｅ／ｚｊｆ： ：　ＴｎｌＱ、ｒｐｓＬ。

ｈｓａＰｋ／Ｆ’　ｌａｃ工９．Δ（１ａｃＺ）Ｍ　］　５　＋　１ａｃＹ”Ａ ”、　ｐｒｏＡ”Ｉ３”。

ｔｒａ＋。

（：Ｌ）　ＢＴＡ６３７−ＢＴＡ６５２，１ｏｎ−１，ｚａｊ：：　Ｔｎ５゜４ ３−ｋＤサブユニットの部分をコードする２個のプラスミド１）ＢＴＡ２２およ びｐＢ’ｒＡ２３を、クローン】（第３図）と使用して最初に作った。これらの ｃＤＮＡの配列分析の結果これらは充分な長さではなかったので、ｐＢＴＡ２２ 　（クローン３）からの５′位およびｐ１３’ｌ’Ａ２３　（クローン４）から の３′位に伸びるｃＤＮｋ　ｆ単離するために特異性オリゴヌクレオテドフロー プｔ−作ッた。ｐＢＴＡ２９０はプローブ３を使用して単離し、一方ｐＢＴＡ３ ０とＰＢ’ｌ’Ａ２９５　はプローブ４を使用して単離した。

Ｐｓｔｌ地図およびプラスミドから挿入ｃＤＮＡの配列決定の方法を第４図に示 し、Ａサブユニットをコードする複合ヌクレオチド配列を第５図に示した。この 配列はプラスミドｐＢ’ｌ’Ａ２９０とｐＢＴＡ２９５からのｃＤＮＡ中に完全 に含ｌれる０ｐＢＴＡ３Ｑの４１０ｂｐ断片は停止コドンと、その次の、ｄＧ／ ａＣ尾部の前の３′−非翻訳区域の６塩基とを含む。ＡサブユニットのＨ１８１ をコードするＧＡＧはｐＥＴＡ２２．ｐＢＴＡ２３およびｐＢＴＡ２９０の５’ −Ｐｓｔ　Ｉ　ｃＤＮＡ断片中に存在するが、１８ノ（口Ｈ６２−５０１６８０ （１５）ｐＢＴＡ３Ｑの２４０又は３００塩基対Ｐｓｔ　ｌ　ｃＤＮＡ断片のど ちらかの中には存在しない。これら２つの断片は他のクローント同様に開放読み 枠又は配列を含有しないので、スプライシングしていないイントロンの部分中に 存在していても良い。

ｃＤＮＡ配列は１〜１１４０番目の塩基の開放読み枠を含有している。この読み 枠においては、第１のＡＴＧは６１査目塩基（Ｍｅｔ−６０）にありセしてＭｅ ｔ−６０に続くアミノ酸配列がシグナルペプチドを表わすものであるが、多くの シグナルペプチドと異なって、疎水性ロイシンのストリングの前にはアルギニン 又はリジンはない（Ｗａｔｓｏｎ、　Ｍ、Ｅ、Ｅ、（１９８４年）の１ｕｃｌ。

Ａｃ、１（ａｓ、１２．５１４５−５１６４）。このシグナルペプチドは、Ｈ２ Ｏ−１の前の約４０個はどのアミノ酸のプロペプチドを残してＧｌｙ−４４とＧ ｌｙ−４１の間で終るものと思われる。こうして、インヒビンのＡサグユニット は最初に、Ｍｅｔ−６０からｌ１ｅ−３００に伸びる３　８，８１０ダルトンの プレプロたん白質として合成される。

Ａサブユニットは、たん白質前駆体のたん白質分解用の共通シグナルである、ア ルギニン残基対（−２，−１）における切断によってその前ＩＫ本から得られる （　５ｔｅｉｎｅｒ、　Ｄ　、　Ｆ等（１９８０年）のＡｎｎ、　Ｎ、Ｙ、　Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、　３４３ｙ　１−１６）。この人サブユニットプロたん白質は 、　−６，−５，８，９および１６５．１６６位に３個の別のアルギニン残基対 を含有している。Ａサグユニットの１６５および１６６残基における切断によシ 、本文中ＡＮおよびＡｏとして示す同サイズの２個の断片が生成する！あろう。

Ａ０断片は３ｌ−ｋＤａウシインヒビンの２Ｑ−ｋＤａサブユニットから成る（ 冥施例９参照）。Ａサグユニットは】】個のシスティン残基を含有するものと思 わｎｌその内の４個はＨ２Ｏ２からＡｒｇ　１６６までのＡＭ断片中にある。こ れら４個の残基は内部結合しており、Ａ０サブユニットからＡＮ断片を除去する ことを可能にしていると思われる。Ａｃサブユニットは７個のシスティンを含有 しておシ、その内の少くとも１個はＢサブユニットとジスルフィド結合を形成す るものと思われる。

サプユニツ）Ａは、その認識配列Ａｓｎ−Ｘ−８θｒ／Ｔｈｒに基づきＡｓｎ　 ８０およびＡｓｎ２０２に２個の潜在Ｎ−グリコジル化部位を有してお、ｊ）　 （Ｗｏｇｈ、　ＰＪ、およびＢａｈｌ、Ｏ，Ｐ、　（１９８１年）のＣＲＣＣｒ １ｔ、Ｒｏｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、ＩＱ、３（１７−３７７）、セしてＡｓｎ２０ ２がＡｃサブユニット中に含まれる。サプユニツ）ＡおよびＡｃのたん白質鎖の 予想分子量は３２，２９８および１４，６２４でるり、これは天然インヒビンの ５ＤＳ−）’ＡＧＥによ＃）推定されるもの（それぞれ４３−ｋＤおよび２Ｏ− ｃＤ）よりも約り５％少ない。これは幾分、その分子重量および分子容量が両方 とも変化ｏＪ能であるもとの分子中の炭水化物含有量に起因するものであると思 われる。これらの違いから、　ＡＩｉおよびＡｏの画部分とも、たぶんＡｅｎ８ ＱおよびＡｓｎ２Ｑ２においてグリコジル化されていると思われるが、セリンお よびスレオニン残基の〇−結合グルコシル化があるかどうかについては不明であ る。

糖たん白質ホルモンのウシＬＨ，ヒ）ＣＧおよびＰＭＳＧの炭水化物含量はそれ ぞれ１６．２９−３１　および４５重ｉｉチでおるとされている（　Ｐｉｅｒｃ ｅ、　Ｊ、　ＧおよびＰｏｒｓｏｎ、　Ｔ、Ｆ’、　（１９８３発明においては これが見かけ分子重量の約２５％であることからその範囲の下限にあることにな る。

ｃＤＮＡ　配列から４２塩基のｍＲＮＡ中の３′−非翻訳領域が予測出来る。こ れはポリ（Ａ）尾部の前の典型的なポリアデニル化シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）１ ６塩基を含む（Ｎｅｗｉｎｓ、　Ｊ、Ｒ，（１９８３年）のＡｎｎ、　Ｒｅｖ、 　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５Ｌ４４１−４６６）。その３′−非翻訳領域は、コード 配列（６６，３％Ｇ＋Ｃ）および５′−非翻訳領域（７１，６％Ｇ＋Ｃ）と異な り、Ａ＋Ｔが多い（４０，４％５個の異なるクローンをプローブ２で検出し、そ の代表的な２つから成熟ＢサブユニットをコードするｃＤＮＡ　を第４図に示し た。他の３つのクローンは、ｐＢＴＡ２９３　と同様の制限型を有しているが、 但しその５’−Ｐａｔ　ｌ断片がより短いものであるｃＤＮＡ　を含有していた 。

ＢサブユニットｃＤＮＡ　のヌクレオチド配列はｐ’ＢＴＡ２９３およびｐＢＴ Ａ２９４配列に由来するものであった（第６図）。

Ｂサグユニットは少なくともプロ蛋白質として合成されるが、Ａｃサブユニット と同様に、その各プロ蛋白質のＣ末端である。

これは５個の連続するアルギニン残基だけその前節から分離される。これはＢ、 】４および１０２，１０３位に２対のリジン残基金含有しているが、反応部位は あシそうにもない（Ｓｔａｉｎθｒ。

ｆ）、Ｆ、等（１９８０年）の上記文献）。９個のシスティン残基がろシ、そし て奇数はその少なくとも１つがＡｃサブユニットと架橋可能であることを示して いる。このｃＤＮＡ配列から、Ｂすグユニットのたん白質鎖は１２，９７７ダル トンの分子ｆｉｔｌｃ有することが予想され、これは生素のＢサブユニットの５ ＤＳ−ＰＡＧＥから予測される見かけ分子量３４，９００に近い。成熟Ｂサブユ ニット中にははっきりし九Ｎ−グリコジル化配列はないが、そのプレ蛋白質中の 八〇ｎ−１４５はグリコジル化可能である。

Ｂサブユニットの３′−非翻訳領域は９４ヌクレオチドの長さでろｐ％Ａサブユ ニットをコードするｃＤＮＡ　の様なＡＡＴＡＡＡポリアデニル化シグナルはな い。ボ１バＡ）尾部の前の３′−非翻訳領域の最後の１２塩基は、同様にＡＡＴ ＡＡＡ配列を有していないエリスロボイエデン３′−非翻訳ｃＤＮＡ（ＡＣＴＧ ＡＡＡＣＣＡＣＣ）の１＆彼の１２塩基と良く調和する（　Ｊａｃｏｂｓ、　Ｋ 、等（１９８５年）のＮａｔｕｒｅ、３１３＋８０６−８１０）。　Ｂサブユニ ットコード領域（１５７〜５０４塩基）のＧ＋Ｃ含有量は５４．２％でありそし て３′−非Ｎ訳領域のそれと同じ位（５５，３チ）であり、これはＡサブユニッ トコード配列および３′−非ｒＩＡ訳領域においてみらｎた違いとは異なってい る。

ウシインヒビンの大（４３ｋＤ）および小（１５ｋＬｌ）　サブユニット七コー ドする遺伝子と同様か又は相同の配列ケ、ヒト、ヒツジ、フタ、魚およびトリゲ ノムＬ）ＮＡ中で同定した。

とｎは主として５ｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｌｏｔ　標準交雑法（Ｍａｎｉａｔｉａ　 ’ｌ’。

等（１９８２年）のＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ＊　Ｃｏ１ａ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　ｆｉａｒｂｏｕｒ）に従って行った。すなわち、ゲノム１）ＮＡを制限 酵素で消化し、得られた断片を７ガロースゲルの電気泳動によりその大きさ別に 分ける。ＤＮＡ１ニトロセルロース（又は他のものでも良い）膜上に転写し、次 いでこれを％４３ｋＤ又は１５ｃＤウシインヒビンサブユニツトの実質的な部分 をコードするＣ　Ｐ）−標識ｃＤＮＡで調べる。この結果、ヌクレオチド配列と 類似か又は同一のゲノムＤＮＡ断片が検出される。

具体的には次の様である。ゲノムＤＮＡ１ヒ゛トマイクロ７アージ細胞系Ｕ９３ ７（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５３９）からか、又はヒト血液、フタ血液およびトリ血 液からか、又はウシおよびヒツジ軟組織から作成した。軟組織およびヒト細胞系 からの作成にはｍａｎ　ｉ　ａｔ　ｉ　ｓ　ｈ　Ｔ　ｏ等の前記文献等に記載の 方法を使用した。血液からはＤＮＡは次の様にして作成した。１０〜１５ｍＪの 血液（０，６２５％のクエン酸塩添加）ｋｌ　０ｍＭ　ＥＤＴＡ／１０ｍＭトリ ス−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）　（ＴＥＩ　Ｏ−１０）の冷溶液で４０ｍ１に希釈 し、氷上に５分１′０１置いて血液細胞を分解した。４０００ＸＧで５分間遠心 分離した後に、はレツ）’ｋｌｏｄの冷ＴＥＩ　Ｏ−１０液中に再けん濁し、１ “Ｅｌｏ−】ｏで４０ｒｔｌに希釈しそして３ｏｏｏｘＧで５分間遠心分離した 。このベレット６１０ｍＭ）！Ｊスス−ｔｔｃｇ　（ｐＨ７，５）　／　５　ｍ Ｍ　ＥＤＴＡ　（出発血液と同容量）中で解こうした。】０％８１）Ｓ’ｉ加え て０．５ｆＩにし、プロテイナーゼＫを加えて５０μ９７ａｔにし、次いでこの 混合物をゆっくり振とうしながら】晩３７℃で培養した。０．１％８−ヒドロキ シキノリンを含有するＱ、ｌｎｏＭトリス−ＭＣ／で飽和したフェノールの１０ ゴ全加えて室温で５〜１０分間ゆっくりと混合した。ＣＨＣ／３：インアシルア ルコール（２４：］）の１０ｔｔｔｌを加えて５〜１０分間混合し、次いで室温 で１′０分間８０００ｘＧで遠心分離した。水相’ｔ１５ｘｔｌのＣＨＣＨ３： イソアシルアルコールで更に２回再抽出した。１ろ。倍量の５　Ｍ　ＮａＣ６と ２倍量のエタノールと全室温で加えて混合した。ＤＮＡをパスツールピペットで 取り出し、３０−６０秒間空気乾燥し、そして３時間３７℃でゆっくり攪拌する ことによって４ｄのＴＥ中に溶解した。このＤＮＡで上記の様にして再析出させ そして３ｄのＴＷ中に再溶解した。

このＤＮＡの試料（普通１０μｇ）ｔ−，５００単位／肩ｌまでの酵素全使用し １６時間培養して、４０〜５０μｉ／ｒｔｔｌの濃度でそのメーカー指示の処方 に従って、褌々の制限酵素で切断した。生成物を、前置のフェノールで抽出し次 いでクロロホルムで３回抽出して２．５倍量のエタノール含有０．２　Ｍ　Ｎａ １ｌ中で析出することによってたん白質の除去を行った。ＤＮＡベレットを水中 に溶解しそしてＴＡＥ緩衝液中１１×１４ｃｍの１％アガロースゲル上の電気泳 動（７５ボルト／４時間ンによりサイズ分画シタ。このゲルを１．５　Ｍ　Ｎａ （Ｊ　／　０．５　Ｍ　ＮａＯＨの溶液中に４５分間浸漬し次いで３．Ｑ　ＭＮ ａＣ１／　０．５　Ｍ　）リス−ＭＣＩ　（ｐＨ７）中で２×４５分間中和する ことによってＤＮＡ１変性した。

このＤＮＡを毛管作用によジニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈθｒ−５ｃ ｈｕｅｎ　）に転写し、真空中８０℃で２時間加熱して固定した。フィルターを ５０チホルムアミドと５倍のＳＳＰｌＪＭａｎｉａｔｉθ等の前記文献）と５倍 のデンハルト（Ｄθｎｈａｒｄｔ　）と２５μＩ！／−の音波処理したにしん精 子１）ＮＡとから成る溶液で２−４時間前交雑した。

又雑プローブは次の通りである。

（ａ）　ｐＢＴＡ２３のＡサグユニットｃＤＮＡ遺伝子からの７９０ｂｐＳｐｈ ニ−Ｓｍａ　Ｉ断片（第５図）。

（ｂ）　ウシＢサブユニットクローンＩＩＢＴＡ２９３から得た１１０９ｂｐの Ｓｐｈ　Ｉ−ｇｃｏＲ工断片（第４図）。これは３６１〜７１８位の塩基のＢサ ブユニットｃＤＮＡ　（第６図）ならびにｐＢＲ３２２のＰｓｔＩからＷｃｏＲ Ｉ　部位の７５１ｂｐの断片を含有している。

これらの断片會、電気泳動後に、低ゲル化温度のアガロースゲルから単離し次い でＦｅｉｎｂｅｒｇ、　Ａ　、　Ｐ　、およびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ。

Ｂの方法（１９８４年、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１３７．２６６−２６７ ）によってα−Ｐ　ｄＡＴＰで標識した。

約３０　ｎｇのＤＮＡ＊％ＤＮＡ】ｐｆ／につさ２×１０〜１０カウント／分（ ｅ！？Ｍ）の特異活性全有する様に標識し、そして１００℃に加熱後、３〜４Ｘ １０　ＣＰＭのプローブを１倍のデ７ハＡ／　ト／　５０％のホルムアミ）”１ ５倍の５ＳＰＥ／］倍のデンハルト／】０チの硫酸デキストラン／２５μｓ／ｌ ｔｔの音波処理したにしん梢ｇＤＮＡから成る溶液と混合した。フィルターの交 雑は４２℃で２０時間行った。フィルターを室温で２倍のＳＳＣおよび０．１％ のＳＤＳですすぎ、次いで各２倍の５ＳＣ１０，１チのＳＤＳ次に１倍の５Ｓｃ １０．１％のＳＤＳ次に０．２倍の５ＳＣ１０，１％のＳＤＳで順に３０分間５ ０℃で洗浄した。

文体ハ、その５！雑配列の少なくとも７０〜７５％が全体としてウシｃＤＮＡ配 列と相同体となる様な条件下で行った。少なくとも２４時間冨士ＲＸ型Ｘ−線フ イルムに露光後、交雑断片のサイズを、そのサイズがわかっているマーカーＤＮ Ａ断片’に基にして決定することができた。

Ａ又はＢサブユニット遺伝子プローブと強力に交雑した、・ヒト、ウシ、ヒツジ 、ブタおよびトリゲノムＤＮＡの断片の大体のサイズ（塩基対における）は次の とおりでおる。

ウシＰｓｔＩ　３４００．２７００，９６０．４８０　Ｐｖｕｌｌ　１７００　 ｆｌａｍＨＩ　１３０００ヒ　ト　Ｉ　２４５０，１２００，４８０　Ｉ　７０ ０　１　１８０００ヒツジ　ｌ　２６５０，９８０．４８０　１　Ｎｕ、）　＃ 　１１０００ブタ　＃　２２００，２０００，４８０　＃　ＮＤ　＃　２１５０ ト　リ　ｌ　（部分交雑）　、　ＮＤ　Ｉ　６６００ウシＥａｏＦｕ　５−６０ ００　Ｈｌｎｄｌ　５０００ヒ　ト　−１５０００’　２００００ ウシＥｃｏＲＩ７０００　Ｈｌｎｄｌ　３３００　Ｐｓｔｌ　ＮＤヒ　ト　９０ ００　ｌ　１１０００　＃　６５０ヒツジ　７０００　１　３９００　１　６８ ０フタ　７０００　＃　６０００　＃　１１００，６８０ト　リ　１４０００　 ＃　４３５０　１　１３］０サカナ（Ｍｅｌａｎｏｔａｅｎｉａ ｓｐｌｅｎｄｉｄａ）　ＮＤ　ＮＤ　Ｉ　３６００（ＮＤ−測定せず） 実験した各種の動物種からのＬ）Ｎａは、大または小つシインヒビンサプユニッ トｃＤＮＡプローブと交雑する限られた数（通常は１個であって、Ｐｓｔｌでの 消化により例外的に３個まで）の断片を有している。大すグユニツ）　ｃＤＮＡ で調べた全部の種に共通の約４８０　ｂｐのＰｓｔ　ｌ断片が特徴的なものでお った・これらの５ｅ雑断片は、ウシインヒビン遺伝子と類似した又は相同的であ るウシ以外の種の遺伝子中に存在することがわかる。

本例において選択使用したプローブ中に含まれないインヒビ／ｃＤＮＡ配列も又 、表３に示した断片中のもの以外のゲノムｃＤＮＡ　と交雑可能であることを除 外するものではない。

別の実験において、ウシサブユニットｃＤＮＡ　ｔ−プローブとして使用して、 ラット卵巣からのＲＮＡ中のＡおよびＢサブユニット前駆体ｍＲＮＡ　ｆｌＩを 調べた。これらｍＲＮＡ種は、ＰＭＳＧで処理したラットの卵巣中に大片にある ことがわかり、この結果、インヒビンｆ）ＮＡが診断用プローブとして有用であ ることがわかった。

従って、ウシＡおよびｂインヒビンサプユニツＩｔコート９するｃＤＮＡは、他 の種のゲノムおよび器官中のインヒビン分子をコードするＩ）ＮＡおよびｎＮＡ ２同定するために使用することができる。この理由から、それらのコードするイ ンヒビン分子はクシインヒビンと相同的なものでるり、同様に使用することがで きる。

クシインヒビンのＡおよびＢサブユニットをコードするｃＤＮＡ　ど類似の又は 相同性のあるヒ）ＤＮＡ配列を単離したＯこれは、クローン化ＤＮＡのヒトゲノ ムライブラリーをバクテリオファージλ中に構築し、次いでウシインヒビンのＡ 又はＢサグユニットのどちらかをコードするｃＤＮＡから作った（３２　Ｐ　） −標識Ｌ）ＮＡ断片でそのバクテリオファージプラークを調べることによって行 った。陽性プラークのファージＬ）ＮＡを単離し、制限＃素で切断し、次にイン ヒビン様ＤＮＡ含有断片（これは実施例７０プローブと方法を使用して、　５ｏ ｕｔｈｅｒｎＢ１ｏｔ交雑法により決定した）ｋＭ］３中でサブクロージングし てヌクレオチド配列を決定した。

具体的には次の通りでおる。ヒトゲノムライブラリーを、Ｍａｎｌａｔｉｓ等の 方法（前記文献）によりバクテリオファージλＥＭＢＬ３中で構築するか、ある いは同様なヒトゲノムライブラリーをスし、４７中で構築した（　Ｌｏｅｎｅｎ 、　Ｗ、Ａ、Ｍ、およびＢｒａｍｍａｒ、　Ｗ、Ｊ　、　（１９８０年）のＧｏ ｎｅ、２Ｑ、　２４９−２５９）。ヒトゲノムＤＮＡ（実施例７の様にして作っ た）を５ａｕ３Ａ工ｔ。

で部分消化して約５〜３　Ｑ　ｋｂｐの長さのサイズの範囲ｅｃする１）ＮＡ’ ｉ作った。これは、ＴＩおよび１ＭのＮａ（Ｊ’の傾斜液（Ｃｍ１ｘ　−１５％ 、　Ｃｒｍ　３１．５．　Ｖｍｓ−３４，４５，ａＫ＝２．１４７）を使用して 、Ｊ３ｅｃｋｍａｎ　ＳＷ　５０．１Ｍ回転装置中で】２．５μｇのｆ）ｌ（Ａ ′に５０．ＯＯＯＲＰＭで２時間遠心分離する、しよ糖傾斜遠心分離（ＭｃＣａ ｒｔｙ、に、Ｓ、等（１９７４年）のＡｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ｉＬ！１ ６５−１８３　）によって分°画したサイズである。

この傾斜分離によって約】５〜２５ｋｂｐのＤＮＡ１集め。

エタノールヲ担体としてのｔＲＮＡ３．５μｓで析出させそしてｈ：ＭＢＬ３λ ａｒｍｓにライゲートした。’ｈ：Ｍｋ３Ｌ３　ＤＮＡ　（Ｐｒｏｍｅｇａ］ｊ ｉＯｔｅｃ、　Ｍａｄｉｓｏｎ　ＷＩ、　ＵＳＡ）　’ｉ酵素Ｂａｍ　）Ｉ工お よびＥｃ。

ＲＩで消化し、フェノールとクロロホルムで脱たん白質し、そして０．３Ｍ酢酸 ナトリウムの存在下に０〜４℃で０．６倍量のイソプロパツールで析出させた。

その２．４μｇを、１０ｍＭ）リス−ＨＣＪ　（ｐＨ７，５）、Ｉ　ＯｍＭ　Ｍ ｇＣｌ２．１　ｍＭ　ＡＴＰ、　２０ｍＭジテオスレイトールおよび２単位のＴ 、ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｌｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）から成り全量 、ａ　ｏ　ｐｉの溶液中で１５−２５ｋｂｐのヒトＤΔＡの約１μｇと混合しそ して１５℃で２０時間培養した。９５μｊのパツカジーン（Ｐａｃｋａｇｅｎθ 。

Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ　）を加え、２２℃で２時間培養した。この混合 物を特別の宿主Ｎ　Ｍ　５３９　（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ社の処方参照 ）に与え、平板直径１４ｃｍにつきほぼ５０．０００個のプラークの濃度とした 。この反応混合物から８板の平板を作った。

バタテリオファージＬ４７中のヒトライブラリーも同様にＮＭ５３９に与えて、 同様のプラーク濃厘ヲ得た。

イ／ヒビンｃＤＮＡプローズで調べるために、このプラークｆ　Ｍａｎｉａｔｉ θ等の方法（１９８２年、前出文献）によりニトロセルロースフィルター（１枚 の平板につき２つのレプリカ）に転写した。標識グローブは次の通りでめる。ク シインヒビンのＡサブユニットに相当する配列には、７９０ｔ）ｐのＳｐｈ　Ｉ 　−８ｍａ　ｌ断片をλＬ４７ライブラリー用に使用し、Ａサグユニツ）ｃＤＮ ＡＣＤＮＡＣ表金参照するｐＢＴＡ２９７　からのＢａｍＨニーｆ（ｉｎｄｉｌ ｌ断片２ＥＭＢＬ３ライブラリー用に使用した。小サブユニット用のプローブは 実施例７に記載の５ｐｈＩ−ｈ：ｃ。

ＲＩｌ断片した。調製、標識および交雑の条件は実施例７に記載した５ｏｕｔｈ ｅｒｎ　ｆｓｌｏｔ　交雑方法と同じである。第１のプラークのスクリーニング には、１つの又離溶液中に測方のグローブを使用した。潜在陽性プラークを溶出 し、再度平板上に載置しそして純粋クローンが得られるまでプローブで調べた。

２つのクローンが特に重畳であり、その１つはＬ４７ライブラリーから得られた 犬（Ｎサブユニットと交雑するλＡ２　であシ、もう１つはＥＭＢＬ３ライズラ リ−から得られた小（Ｂ）サブユニットと交雑するλＢ□　である。このλＡ２ は約】１〜１２ｋｂｐのヒトＤＮＡが挿入してめった。Ｐｓｔｌで消化するとた くさんの断片が生成し、その内、ウシＡｆｉ伝子のＣＰ）−標識Ｓｐｈ　Ｉ　− Ｓｍａ工断片（前記したもの）と交雑した３個がみられた。Ｐｖｕｌで消化する と同じプローブと交雑するさらに２つの断片が生成する（表４）。

Ｐθｔ　ｌ　２５００　” １１６０　＋＋ ４８０　＋＋＋＋ Ｐｖｕ■　１３ＱＱ　＋＋＋ ４２０　＋＋ １１６０および４８０　ｂｐ断片（Ｐｓｔ工消化による）と８００　ｂｐ断片（ Ｐｖｕ　ｎ　（Ｐ４化による）とはそのサイズにおいて、実施例７に示したヒト ゲノムＤＮＡの５ｏｕｔｈｅｒｎ　Ｊ３１ｏｔ分析において同じプローブと９． 雑するＰａｔＩおよびＰｖｕ　ｌ断片にそれぞれ類似している。

同じλＡ２−リリ７７プロット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　’ｂ１０ｔ）と、ｐＢＴＡ ２９５からのＣＰ）−標識した５　００　ｂｐのＰｓｔＩ断片との交雑によると 、λＡ２のＰａｔＩによる消化の結果の１１６Ｑｂｐ断片のみが同定された。こ の様な又雑パターンは、クローン化ヒ）ＤＮＡ断片がウシインヒビンＤＮＡと類 似か又は相同的である配列を有するという仮説に一致するものである。λＡ２　 ′ｔ−Ｐｓｔｌで消化し１次いで低ゲル化温度のアガロースゲルから４８０．１ 】６０および２５００ｂｐ断片を切シ取シ％ＭＩａ中でサブクローニングしそし てそのヌクレオチド配列全決定（実施例５ｃ参照）した結果の配列を第７図に示 した。２７５と２７６査目の塩基の間の１．４−１．５　ｋｂｐのイントロンの ＤＮＡ配列は省略しである。誘導アミノ酸配列とウシインヒビンプレープロＡサ ブユニットの配列が類似していることがら、相同たん白質であることがわかシ、 又これはヒトインヒビンＡおよびＡｃサブユニットの前駆体である。ヒトインヒ ビンのＡａ断片はＨ１８１からＡｒｇ１７１のアミノ酸であ！ｌｌ、Ａｃサブユ ニットは５ｅｒ１７２から工１θ３０６のアミノ酸である。

λＢ１クローンは約２１〜２６ｋｂｐの挿入ＤＮＡ’（ｉ−有している。このＤ ＮＡｆ同様に制限酵素Ｐｓｔｌで切断し、１％アガロースゲル上の電気泳動でサ イズ分画しそしてニトロセルロースフィルターに転写した。ｐＢＴＡ２９３　か ら精製した１３６Ｊｌ又は５　］　Ｏｂｐのインヒビｙｐｓｔｌ断片（（”２Ｐ ）−標識シタ）　、での９：雑（第４図）Ｋよると、小さい方のプローブは長さ が約１３００ｂｐ　（１１００−１３５０ｂｐの範囲）のＤＮＡの断片に結合し 、大きい方のプローブは長さが約８００ｂｐ（７４０−８４０ｂＴ）の範囲）の 断片に結合した。ｓ　ｏ　ｏ　ｂｐの断片の部分のヌクレオチド配列は、λＢ５ ２Ｐｓｔｌ″″Ｃ消化し、約８００ｂｐのＰｓｔ　ｌ断片を低ゲル化温度のアガ ロースゲル上でｆ＃製しＭ１３ｍｐ９のＰｓｔ１部位中にクローニングし１次い でヌクレオチド配列を決定することによって決定された。配列決定のために８０ ０　ｂｐ断片（Ｐｓｔニー５ａｕ３ＡＩ　；　５ａｕ３ＡＩ−８ａｕ３Ａ工）の 小嘔い方の断片とＭ１３中にサブクローニングした結果得られたヌクレオチド配 列金弟８図に示した。ＤＮＡ配列の翻訳により決定されたアミノ酸配列によれは 、このＤＮＡはインヒビンのＢ鎖の全部をコードしそしてＧｌｙ　ｌからＳθｒ １１６　のヒトＢ鎖はウシＢ鎖と同一である。

ヒトイン上ビンＤＮＡ配列を有す雇これらのλクローンの断片ならびに類似の合 成断片は、真核生物又は原核生物発現系に挿入してヒトインヒビン又はその構造 がインヒビンに関連したポリペプチドを生成し得ることがわかる（実施例］０参 照）。

又、λクローン自体も適当な真核細胞系にトランスフェクトして発現させること が可能である。

ウシｃｌ）ＮＡｉプローブとして使用して棟々のを椎動物棟中のインヒビンサプ ユニット遺伝子を検出しく実施例７）、次いでアミノ酸配列中の広大な類似点を 明らかにするためにヒトインヒビンサプユニツ１−ｆｉ伝子のクローニングと配 列決定を行うことによシ、他のを椎動物インヒビンが国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ ８５１００１１９および第５および６図中に示したウシインヒビンたん白質と相 同的であるかまたはそうでなければ同一であることが明らかとなる。

本発明者らは多くのを椎動物種（例えは表５参照）からの卵胞液や卵巣抽出物中 のインヒビン活性を検出し、国際特許出願ＰＣ’ｆ’／ＡＵ　８５１００１９お よび実施例９の方法によジヒトＦＦおよびヒツジＦＦから生来のインヒビンを精 製し、そして両種ともにウシインヒビンと機能的に類似しておりかつウシ型と類 似したサブユニット構造の５８ｋＤおよび３１ｋＤ型全有している事奮発見した 。

又、ウサギ、ウシおよびヒトインヒビンは、国際特許出願ｐｃ’ｒ／ｌＪ８５１ ００１１９　Ｋ記載ノ、精製５８ｋＤウシインヒビンに対するウサギ抗血清によ り中和され、かつＲＩＡ中で又差反応して再度緊密な構造相同性を示す（表５） 。

しかしながら、生来のウシインヒビンはウサギ中での免疫応答誘発が可能である という事実は、ウサギ免疫系によって異質物として認識されるような、ウサギお よびウシインヒビンとの間の相違点がある事を意味するものであり、従って、あ る柚からのインヒビンは他の棟においては抗原として使用することが可能であり そして内因性インヒビンを認譚する抗体が生成される。

表５に示した全ての種が、下垂体細胞受答体と相互作用をする構造相同性を示す ラット下垂体細胞培養物中で活性であるとしても、ウサギの生成した抗体は、特 殊なエピトープ用の抗血清の％Ｊｌ＝ｔ＝示すヒツジやラットインヒピンと顕著 な父差反応はしない。

Ｂサブユニットはほとんどの種の中に充分に存在していてかつ多分同一のもので ろろうので、内因性インヒビンＢサブユニットと又差反応する抗体全誘発するた めに突然変異体Ｂサブユニットたん白質全抗原として使用することは多くの種に おいて広く可能で１かつ効果的であろうことは、すでに先に述べた記載からも明 らかである・この様な抗体は、ＤＩＪＡの生体外突然変異形成、実施例】０に記 載の様な新しい遺伝子の発現又はＢサブユニットたん白質の化学変性又は第６お よび８図記載のものとは同一ではないが類似しているＢサブユニットヲ有する種 からのＢサブユニット遺伝子の単離、および実施例】０の様にしてのこの遺伝子 の発現から成る様な手段により生成可能である。

表５ 卵胞液からのインヒビンとウサギ４７４抗ウシ５８ｋｌ））レーサー　３】ｋＤ トレーサーウ　シ　＋　１００　１００ ヒト＋２７２８ ヒツジ　−８，００，３ ラツト　−６，ＯＮ　Ｄ ウサギ　＋　ＮＤ　ＮＤ （本）実施例１６の参照。

ＮＤ−測定せず。

される。すでに報告されている様に（国際特許出願Ｐ　ＣＴ／Ａ　Ｕ３５１００ １１９）、これは最初は５ｇｋＤ型として存在する。

クシ卵胞液からインヒビンを精製する効率を改良することを目的とした研究から 、小さいインヒビンの別の型があることが明らかにされた。Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ 、　Ｄ、Ｍ、等（１９８５年、Ｂｉｏａｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎ、　１２６＊　２２０−２ ２６　；国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ８５１００］】９）の精製方法全使用して、 ｐＨ４，７５での沈澱工程′１に最初の中性および酸性緩衝液ゲルろ過クロマト グラフイ一工程の間に行った。この結果、酸性ゲルろ過工程による最初の生成物 から単離された、第２の生物活性種が生成している事が明らかとなった。この第 ２のｉｔ−逆相ｋｉＰＬＣおよび予備ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した 後、見かけ分子量が２０，０００と１５，０００の２つのサブユニットから成る 、見かけ分子量が３１，０００でろってかつもとの５８ｋＤ型と同様な生物学的 活性を有するたん白質が生成していることがわかった。

これら２つのインヒビン種の小さい方のサブユニットの見かけの分子量は非常に 似ている（約１５ｃＤ）ことから、この２つのインヒビン種の見かけの分子量の 違いは、４３ｋＤサブユニツトが約２０ｋＤに小さくなった事に主として起因す ると思われる。

又、純粋５８ｋｌ）インヒビンは、去勢ウシ血清（ＳＳ）又はヒト閉経後血清（ ＥＭＳ）中での培養中に３１ｋＤ型に変化する。

この分解はｂＢ’Ｆでの同様の培養中には起らない（第９図）。

従って、インヒビンの小さい方の（３１ｋＤ）型、特にその大きい方ｏ（２０ｋ Ｄ）サブユニットは１国際特許出願Ｐ　ＣＴ／Ａ　Ｕ３５１００１１９およびＲ ｏｂｅｒｔｓｏｎ、　Ｄ、Ｍ、等（３９８５年）の＠Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ ｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｍ、　１２６．２２０−２２６”に記載のイ ンヒビンの５８ｋＤ型の直接誘導体でアフ、かつ本明細書に記載のサブユニット 遺伝子から誘導可能であると考えられる。

又、天然インヒビンを含有しない血清（ＳＳおよびＰＭＳ　）は組換えインヒビ ン又はそのサプユニツ）を処理するのに使用することができ、かつ罹災な酵素を 血清又はこの反応を行う細胞型から精製しそして同様な目的に使用することがで きるのは明らかである。この酵素反応はプロテアーゼ抑制剤に関して特徴的であ る。ｂＳ又はＰＭＳの存在下に３０℃で１７時間血血清上う素化５８ｋＤインヒ ビンで培養した後で５３ｍＭのパラクロルメルクリ安息香酸塩又は１０ｍＭのＩ ＤＴＡ　を加えることによって５８ｋＤ　から３１ｋＤインヒビンへの変化は２ ４％から４．５％へ減少した。バシトラシ／およびベゾスタチンＡ（各Ｑ、３ｍ Ｍ）は効果がなかった。このプロテアーゼ抑制のパターンは作用′＃素の特徴Ｔ ６５　（１，ａｚｕｒｅ、　Ｃ，等（１９８３年）のＵａｕ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、　Ｃｅ１１Ｊ：１ｉＯＩＩ６］　１５０！　−５１５）であシ、本反応 で使用されるＡ′＋ｊ′ズユニット（第５図）中にＳｅｒ】６７の前の標準的な 反応部位（Ａｒｇ　−Ａｒｇ　）があるという発見とも合玖するものである。

血清中への放出の際のインヒビン分解により２分子、すなわちインヒビンの３１ ｋＤ型およびＡＭ断片（大すツユニットのアミノ９ｌ−１６６）が生成する。こ の３１ｋＤ型は下垂体細胞によるＦＳＨの合成および放出を抑制することが知ら れているが、又一方、１方の又は両方の分子は生殖腺にもどりそして直接生殖腺 機能全調節することもでき、あるいはインヒビン自体又はインヒビンの断片やそ の前駆体分子、例えばＡＭがＦ’ＳＨの下垂体調整以外の別の生物学的機能を有 していることでも良い。これらはウサギ６９９をペプチドｌで免疫することによ りＦＳＩ（力価が突然０に落ちたという事実からもうががえる（実施例１５参照 ）。

インヒビンの両サブユニットはプレプロ分子として生成し。

そして各サブユニットからのプロペプチドは細胞生長および抑制を含めてそれら 自身の生物活性を持つことができる。インヒビン自Ｈの３１ｋＤ型は形質転換生 長因子−β（Ｄθｒｙｎｃｋ、Ｒ。

等（１９８５年）のＮａｔｕｒｅ　３］６．７０１−７０５）と高い相同性を示 し、下垂体細胞によるＦＳＨ合成におけるすでに知られた作用に加えて、細胞調 整における生来の分子の作用を有することもうかがえる。

りｏ−ｙｂ’ｆ’Ａ４０５　（表２）はインヒビンの大すツユニットノ部分をコ ードするｃＤＮＡ　ｆ含有しているが、これがインヒビンの部分を生成する事は 期待できない。なぜならば、そのｃＤＮＡはａＣ尾部を有しく実施例３ａ参照） 、かつその配列中にリボース結合部位や開始ＡＴ（Ｊ（ｆ−Ｍｅｔ）コドンがな いからでろる。インヒビン遺伝子の部分を発現させるためには、ｐＢＴＡ２３中 のｃＤＮＡの最大（約４８０ｂｐ）Ｐｓｔｌ断片をｐＵＲ２９２のＰｓｔ１部位 中にクローニングすることによって融合ベグチド葡作った。これ全定位におくこ とによって、Ｅ９コリたん白質β−ガラクトシダーゼの大部分とそれに続くイン 上ピンの４３ｋＤサブユニツトの２７〜】８３アミノ酸とから成るたん白質が生 成する。プラスミド構成Ｆｉ、Ｅ、コリＢＴＡ　。

６４７（表２）中に形質転換した。

これらクローンを同定するために、免疫学的スクリーニング法を使用した。形質 転換後、形質転換体を選択するために、細胞に５０μ９／ｍｅのアンピシリンナ トリウム含有ＬＢ寒天板上に３７℃で１６時時間−た。コロニーをニトロセルロ ース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ−８ｃｈｕｅｌ）上に転写し、そして墨にひたし た針全寒天から膜中に突き刺すことによって定位印をつけた。母培養板は次にこ れを使用するまで４℃で保存し、一方Ｌプリカフイルターは、５０μ＆／ｌｄの アンピシリンナトリウム含有の新しいＬＢ采天板の上にのせて３時間項培養した 。９．５ｍＭのイソプロピルβ−クーチオガラクトシド（工ＰＴＧ）含有ＬＢ塞 天上に３７℃で２時間で融合たん白質が誘発された。フィルターｆ　０．２　Ｍ 　ＮａＯＨ／　３％（ｗ／ｖ）　Ｓ　Ｄ　Ｓで飽和したワットマン３　Ｍ　Ｍ　 （Ｗｈａｔｍａｎ　３ＭＭ　）紙のシート上に５分間おき、次いＴｏ、５Ｍ）リ ス−ｆ（Ｃｌ（ｐＨ７，５）で飽和した紙の上で中和した。

コロニーから放出されたたん白質はその場でニトロセルロースに結合する。フィ ルターを、更に０．５％（ｖ／ｖ　）のトウィーン２０　（Ｔｗｅｅｕ　２０＊ 　Ｓｉｇｎａ社）を含有するＴＳＴ（１５０ｍＭＮａＣ１１０，０５％（Ｖ／Ｖ ））ウィーン２０／］ＯｍＭ）リス−１−ＩＣｉｆ）Ｈ８，Ｏ）　）中に１時間 ゆっくり攪拌しながら浸漬することによって、ニトロセルロース上に残っている たん白質結合部位をブロックした。このフィルターを、ウサギ抗−ウシ５８ｋＤ インヒビン抗血清（国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ８５１０００１９）を含有し、Ｔ ＳＴで１：５０に希釈した溶液で室温で１晩処理し、次いで残った抗体を除去す るためにＴＳＴ中で数回洗浄した。

フィルターを、ブタ抗ウサギ免疫グロブリンー西洋ワサビペルオキシダーゼ共役 化合物（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ　）　ｆ　Ｔ　Ｓ　Ｔ中で１：２００に希釈した溶 液で室温で１時間処理し、次いでＴＳＴ中で洗浄した。最後に、これらを２Ｑｍ Ｍのトリス−Ｈ（Ｊ（ｐＨ７，５）中で洗浄しそして０．５１１１ｉ／ｗｄの４ −クロルナフトール７０．０３％（Ｖ／Ｖ　）のＨ２０□／２０ｍＭのトリス− ｋｉｃｌ　（ｐＨ７，５）　’に含有する溶液で着色した。

融合ペプチド含有コロニーは、フィルター上において、コントロール菌株ＢＴＡ ６４７（１）Ｕｌ（２９２）が生長した区域よりもよシ強く着色した区域から同 定された。その上で誘発Ｅ、ココリＴＡ６４７（ｐＵＲ２９２）のローンが生長 しそして分解したフィルターで、ウサギ抗インヒビン抗血清の希釈体を前培養す ることによって該抗血清の抗Ｅ、コリ抗体力価全減少させようとする試みをした にもかかわらず、別のコロニーが着色した背景がいくつか児らＣた。

この様なコロニーを３つ精製し、そのシラスミド内容＠を分析した。全部が定位 にある予想されたｃＤＮＡ断片を有するｐＵＲ２９２’を含んでおり、これら菌 株の１つ＠ＢＴＡ４１０としそしてそのプラスミドｔｐＢＴＡ２８とした（表２ ）。融合被プテドの同定は、たん白質をドデシル硫醒ナトリウムで変性し、ポリ アクリルアミドゲル電気泳動によｐサイズごとに分け、次いで横向きにニトロセ ルロースシート上に転写するという、Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ法（Ｔｏｗｂｉ ｎ、　ｋｉ　、等（１９７９年）のＰｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．　Ｕ、Ｓ、Ａ、ユ６，４３５０−４３５４） によって行った。ニトロセルロースは次いで、どのたん白質バンドがインヒビン 抗原決定群を含有しているか決定するために、前記の様にして処理する。たん白 質試料は次のようにして作った。

ＬＢ中で３７℃に１晩培養したＢＴＡ６４７（ｐＵＲ２９２）およびＢＴＡ４Ｊ Ｑの培養物を新たな培地中に１：１００に希釈し、濁度がＡ６００　＝　０．４ になるまで培養し、次いでＩＰＴＧ中で０．５ｍＭにしそして更に２時間培養し てから採取した。この細胞ペレットを０．１倍量の負荷緩衝液（３０％ｔＷ／Ｖ ）Ｉ、、よ糖／】％（ｗ／ｖ）ＳＤＳｌｏ、１　Ｍβ−メルカプトエタノール７ ０．０１％ブロモフェノールグルー含有電気泳動緩衝液）中に直ちに再けん濁し 、次いで５分間那とり水浴中で加熱した。試料（］０−３０μＪ）ｉポリアクリ ルアミドゲル（Ｌａｅｍｍ’ｌｉ、　Ｕ、に、（１９７０年）のＮａｔｕｒθ＋ 　２２７＋　６８０−６８５　ｐ　ＭａｔｔｉＣ’ｋｌ　Ｊ　、Ｓ、等（１９８ ０年）のＥｕｒ、Ｊ、　ｆ３１ｏｃｈｅｍ、　１１４６４３−６５１　）に供給 し、電気泳動を、プロモフェノールズルー色累がゲルの底部に到達するまで行っ た。Ｍｏｅｆｆθｒ　Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ装置を使用して、１５．６ｍＭのトリ ス−塩基／１２ＱｍＭのグリシン中で１時間、１アンペアで側面転写を行った。

フィルターの抗血清でのブロッキングおよび処理は前記した通りでるる。ポリア クリルアミドゲル中のたん白質を直接可視化するために、ゲルを脱色液（］０チ （ｖ／ｖ）メタノール１５％（Ｖ／Ｖ　）氷酢酸）中に３０分間漬け、次いで同 溶液に仕上げた０、５％（ｗ／ｖ　）クーマシーブリリアントプＡ／　−（Ｃｏ ｏｍａｓｓｔｅ　Ｂｒ１ｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ）Ｒ２５０で１時間着色した。

ゲルを、数回脱色溶液をとり換えながらゆつくシ授押して脱色し、そしてたん白 質バンドをＷｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔおよび免疫検出によシ検出したものと比較 した。

株ＢＴＡ４１０は少なくとも２個のたん白質を含有しておハこれらは全細胞たん 白質の約５−】０％に当り、これらはＩＰＴＧによｔ）誘発され、そして抗イン ヒビン抗血清（第１３図、トラック］０）により検出され、かつこれらは株ＢＴ Ａ６４７（ｐＵＲ２９２）（第１３図、トラック１］）中には存在しないことが 明らかとなった。これらは生来のβ−ガラクトシダーゼ（］１６ｋＤ）よりも大 きく（約１３０および１１７ｋＤ）、従って、β−ガラクトシダーゼーインヒビ ン融合たん白質である。この融合たん白質の大きい方はＤΔＡ分析から予想され たもの（約１３２ｋＤ）に匹敵するものでろる。

同様の方法で、ｐＢＴＡ３０の４１ｏｂｐＰｓｔｌ断片がｐＵＲ２９１中に発現 した。得らＩしたプラスミドをｐＢＴＡ２９２　（表２）とし、再度、融合たん 白質が抗インヒビン抗血清（第１３図、トラック９）を使用して検出可能であっ た。

完全サブユニット全発現させるために、ｐＢＴＡ２９０とｐＢＴＡ３０からのｃ ＤＮＡ　ｔスプライシングし、その方法？第１０図に示した。これを簡単に説明 すると、まず各クローンから５ａｕ３Ａ工断片を鞘製し、これらを特異のＲｓａ 工部位で切断しそしてライゲートしたものでるる。ライゲートした生成物の混合 物１ｓａｕ３Ａ工で切断し、その生成物ｔ−ｐＵＲ２９０中にライゲートした。

次いＴｐＢＴＡ２９０の５’−Ｓａｕ　３Ａニ−ＲｓａＩ断片とｐ：ｓ’ｒＡ３ ０の３’−Ｒｓａニー５ａｕ３Ａ工断片の両方ｆｔｔｒｌｏ−ｙを同定するため に、クローンとプローブ３と４（第３図）でスクローニンクシタ。ｐＵＲ２９０ がＡｓｐ−１０から工ＩＪ−３０００正しい読み枠を与えるので、その挿入が定 位である場合にβ。

ガラクトシダーゼーインヒビン融合たん白質の生産が確実となる。４８０および ４３０　’ｂｐ　ＰｓｔＩ部位における正しい発現を、ｐｆｓＴＡ２８とｐＢＴ Ａ２９２の融合生成物（実施例９参照）を含有するカラムから単離した特異性抗 体を使用することによって別々にチェックすることができる。得られたプラスミ ドをｐＢＴＡ２９６　（ｆｉ２　）と命名した。この完全Ａサブユニット遺伝子 を又、５ａｕ３ＡＩ−８ａｕ３ＡＩ断片としてｐＵＣ７のＢａｗ　ｋｌ工部位中 でクローニングし、得られたプラスミド（ｐＢＴＡ３０２；＋第１２図）全ＢＴ Ａ６５２中へ導入してＢＴＡ４２６（ＡＴＣＣ６７０５７）を得た。５ａｕ３Ａ Ｉ部位の配列Ａｓｐ−Ｐｒｏは、コレかぎ酸中で可変的であるので、融合たん白 質の上流からそのインヒビン部分を切断するのに使用することができる（Ｎ１１ ｓθｏｎ。

Ｂ２等（１９８５年）のＮｕｃｌ、　Ａｃ、　Ｒｅｓ、　１３＋　１１５１−１ １６２）。

株ＢＴＡ４］９からのβ−ガラクトシダーゼに融合した４３ｋＤサノユニツトの 全長（アミノｌ＆Ａｓｐ−１０から工１θ−３００）の発現を第１３図、トラッ ク８に示した。全長β−ガラクトシダーゼ−イン、上ピンたん白質に加えて更に 、生来のβ−ガラクトシダーゼの分子量とほぼ同じ分子量であるよシ小さいサイ ズの少くとも３本の別のバンドがろ９、これはおそらくその全長生成物のたん白 質分解か又は転写又は翻訳の成熟前停止によるものでろろう。融合たん白質のか たまりは可溶性である。ｐＢＴＡ２９６からインヒビンＤＮＡと側面のβ−ガラ クトシダーゼＤＮＡをＥａｏＲ工切断断片として切り出し、ｐＢＴＡ２８６　（ 表２；第１３図、トラック４）中に挿入してｐＢＴＡ２９７　（表２）を生成し 、ｐＢＴＡ２８６　から短縮したβ−ガラクトシダーゼたん白質のＣ−末端にお いてインヒビンＤＮＡ’ｉ発現するクローンを、前記したコロニー免疫交雑法に よシ選択した＠この様なりローンを位相差顕微鏡によって調べてみると（例えば 。

ＢＴＡ４２０　；表２）、これらが封入体と呼ばれる不溶性生成物としての融合 たん白質を生成しているのがわかった。この封入体は細胞中のたん白質分解を防 ぐ様な機能を有しかつ抗原生成のための精製を非常に簡素化するものである（実 施例１２および１３）。株Ｊ３ＴＡ４２０をＡＴＣＣ６７０５４と命名し、ＢＴ Ａ４２０の精製封入体からのたん白質を第１３図のトラック３に示した。ｊ３Ｔ Ａ４２５中のＡサブユニットの発現を第１３図に示し、そしてこのたん白質は特 に封入体として生成される。

ＢＴＡ４２０中の融合たん白質と異なり、ＢＴＡ４２６中の最長融合たん白質は 、　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ分析において最も顕著でありかつ最も反応性が高 く、従ってこれはイ／ヒビン様たん白質の産生用の特にすぐれた宿主−ベクター 系であることがわかる。

前記したところから、他の制限酵素部位も又Ａサブユニットの発現に有用である ことは明らかである。その第１はコドンを８１Ｂ１につなぐ荷異Ｓｐｈ　１部位 でアシ、そして、オリゴヌクレオチド　リンカ−を、種々の宿主やベクター中の へサブユニット又はＡＩ断片を融合生成物として、あるいは新たなｆ−Ｍθｔコ ドン１Ｈ１ａｌをコードするＧＡＧの直前に導入するか又はシグナルペプチドを Ｈ１８１の前に与えた様々構造の非融合たん白質として発現させ得るように作る こともできる。この様々構造は当業者には周知であり、その１例を第１１図に示 した０この発現リンカ−は、Ｃ１ａ　１部位を使用して、ｔｒｐプロモータープ ラスミド例えばｐｔｒｐＬ工（Ｅｄｍａｎ、　、Ｔ、Ｃ，等（１９８１年）のＮ ａｔｕｒｅ　２９］　ｒ　５０３−５０６　）中への挿入後に新しいＮ−末端メ チオニンを介して４３ｋＤたん白質を発現きせるか、るるいは、ｆ５ａｍＨＩを 使用してｐＵＣ７、ｐＵｃ］３又はｐＵＲ２９０中への挿入によりβ−ガラクト シダーゼーインヒビン融合たん白質として、又は、ｐＷＴ　］　Ｂ２１　（Ｔａ １ｃｏｎ、　ｗ、等（１９８０年）のＭｏ１ｅｃ、Ｇｅｍ、Ｇｅｎｅｔ、１７７ ｅ　４２７−４３８　）中への挿入後のｔｒｐＥ−インヒビン融合たん白質とし て発現が可能であるように作られるものである。

全長プレプロＡサブユニット前駆体の構築法紮第１２図に示した。この方法は基 本的には、ｐＢＴＡ２９５からＰｖｕ　ｌ−Ｐｖｕｌ断片を年離し次いで第１１ 図（Ａｉｉ）に示したリンカ−（りん酸化されていない）を付加することから成 り、これによりシグナルペプチドの５′−位の最初の４つのアミンｌ￥４！（Ｍ ｏｔ−６０からＧｌｎ−５７）　’ｃ最初のＰｖｕ１部位に再構築して５′−末 端にＢａｍＨＩ部位を与えることになる。リンカ−結合分子ｋ　Ｓｐｈ　ｌで切 断しＢａｍＨＩと５ｐｈｌとで切断したｐＢＴＡ２９７　中ヘライゲートしてｐ ＢＴＡ３０５　’！！”得る。この中間体は融合たん白質としてプレプロＡサプ ユニットヲ発現する。イン上ビンＤＮＡ断片をＢｉｎｄｌｌ　−ＨＬｎｄｌ　断 片として又はＥｃｏＲニー１ｃｏＲＩ断片として切り出し、次の工程で使用する 。特に、このＥｃｏＲニーＥｃ。

Ｒ工断片はｐＵｃＢ又はｐＵＣＱ中で丈プクローニングして、そのインヒビｙｃ ＤＮＡ配列と、ベクターｐＺＩＰ　ｒｊｅｏＳＶ（Ｘ月（Ｃｏｐｋｏ、Ｃ，Ｌｏ 等（１９８４年）のＣｅｌ’１．３ユ、１０５３−１０６２）を使用する真核細 胞中での発現用のＢａｍＨＩ　−ＢａｍＨ工断片として切り出すこともできる。

この発現系は、前記した原核生物系の場合と異なシ１分泌されたグリコジル化型 の４３ｋＤたん白質を生成するものと思われる。

この様に５’Ｐｖｕｌ、８ａｕ　３　Ａ　ＩおよびＳｐｈ　１部位はすべて４３ ｋｌＪ　たん白質の発現に都合の良いリンカ一部位である。

７３４番塩基から出発するＨａｅ　１１部位は、アルギニン１６５から出発する ＡサブユニットのＡｃ部分の発現に好都合な部位である。

第１１図（／ｕｉｔ）に記載のＨａθ…部位リンカ−の使用によυ、ｐＬＩＲ２ ９０，ｐｇＴＡ２８６およびｐＵＣ】３中にβ−ガラクトシダーゼが融合生成物 が発現していた。これを達成するためにｐｆ３ＴＡ３０からの所望のＭａｅ　ｌ 　−８ａｕ　３Ａ１：断片を精製し、リンカ−を付加した。得られた構築物６Ｓ ａｕ３ＡＩ　で切断し、次いでＪＪＮＡ＝ｉ、太りへＡ断片全効率的に析出する が、リンカ−の様な小ＬＩＩＮＡ断片全充分に析出しない、インプロパツールで ２回析出δせた。析出したＤ　Ｎ　Ａ　ｆ　’ｉ’　Ｍ中に再溶解し、Ｉ）Ｕｎ （２９０申にライゲートした。このプラスミド−ＩＢＴＡ６：＋４に形質転換し た。得られたクローンと複写フィルター上に複写し、次いで６対の一方のフィル ター’に、ＬＰ）−標識Ｍａｅｌ　リンカ−（第１１図（４ｔ１）に示したＬＡ ＭＡ対の先端鎖）を使って、又他方をプローブ４（第３図を使って、実施例４く ようにしてスクリーニングした。両プローズから検出されたクローンをとり出し Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｊｊｌｏｔ分析により発現用の試験をした。この１方のりロー ンを第１３図、トラック７に示し、これ＝＜ＢＴＡ４ｚｌ（表２）と命名した。

イン上ビンＡｃサブユニットとその側鎖のβ−ガラクトシダーゼＤＮＡ配列をコ ート１するＬ）ＮＡ断片も又ＥｃｏＲ工断片として切り出し、融合たん白質とし ての発現用のｐＢＴＡ２８６中にライゲートした。この融合たん白質は再度不溶 性であり、従って精製および分解防止に都合が良い。この株’１ＢＴＡ４２２　 、！：命名し＊　（ＡＴＣＣ６７０５９、表２；第１３図、トラック２）。

Ａｃサズユニット全コードする耕しいＢａｍＨニー５ａｕ３ＡＩ断片も又］）Ｂ ＴＡ２１８から切９出され、短鎖融合たん白質生成のためにｐＵＵ１３中にサブ クローニングされる。株ＢＴＡ　４２７（ＡＴＣＣ６７０５６；表２）はこのた ん白質を封入体として生成し、これｔゲル分子Ｔ（第１３図、トラック１５）す ると、再度ＢＴＡ４２６と一緒になって、その最長融合たん白質がＷｅｓｔｅｒ ｎ、ｌ：１１ｏｔ分析において再び最も顕著でめりそして最もにりきジと見られ ることがわかる。これはＢＴＡ４２７がインヒビン様たん白質の産生のｌこめの 丁ぐれた宿主−ベクター結合系であることを示している。

第１１図に示した谷リンカ−の顕著な特徴は、ＤｆｌｌＡがＢａｎＨＩ部位から 正しく発現された時には、そのアミノ酸配列Ａθｐ−Ｐｒｏが融合たん白質中に 導入てれている。前記した様に、この配列はぎ酸中で易変性でめり、Ａサブユニ ットたん白質中にＡｓｐ−Ｐｒｏ配列を持たないたん白質の上流（Ｎ１１ｓｓｏ ｎ、Ｂ０等Ｌ１９８５年）のＮｕｃｌ、　Ａｃ、　Ｒｅａｌ　ｌ　３　ｐ　１　 ］　５１−１１６２）からインヒビンたん白質を切断するために使うことができ る。融合たん白質から所望の配列を切断するその他の方法も組合わせて使用する ことができる。例としては、プロテアーゼ認識配列、例えはＸａ−因子認識配列 （Ｎａｇａｉ、におよびＴｈｏｇｅｒｓｏｒｉ。

Ｈ，Ｃ，（１９８４年）のＮａｔｕｒｅ　３０９＋　８１０−８１２）又はコラ ゲナーゼ認識配列（Ｓｅｒｍｉｎｏ＋　Ｊ、およびＢａ５ｔｉａ、Ｄ　Ｃ１９８ ４年）のＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　８ｃｉ、　ＵＳＡ　８１　＋　 ４６９２−４６９６）を導入する方法である。アルギニン対残基を認識する酵素 の使用可能性については先に述ベア’（（実施例９）。インヒビン配列の前にそ の上にメチオニンを導入することによシ、臭化シアンで融合生成物を切断してβ −カラクトシダーゼを含有しないインヒビン断片を得ることができる。インヒビ ン配列中のメチオニン残基は、ｃＤＮＡの生体外突然変異によって別のアミノ酸 に変えることができ、従って、全長インヒビン様たん白質は融合たん白質前駆体 を含有しないものでりろうから、これによりこの臭化シアン切断法の利用性が増 大する。内部メチオニン残基？変えることにより、更には、より好ましい抗原性 又はインヒビン様作動性又は拮抗性を有する分子とすゐこともできる。

＋１））　１５ｋＤサメユニツトの発現ｐＢＴＡ２９３　（第４図）の５１０　 ｂｐ　Ｐｓｔ）　ｃｌ）ＮＡ断片をＰｓｔ１部位にライゲートし、次いでこのプ ラスミ）”！ｉＥ、コリＪコリＴＡ６３４中に形質転換した。得らγしたクロー ン全、最初に１）ＢＴＡ２９３およびｐ：ＢＴＡ２９４　（プローブ２、第３図 ）の単離に使用した。２４回変性した】４−量体オリゴヌクレオチドを使用して スクリーニングして形質転換プラスミドの存在を確認した。次いで数個のプラス ミドを、制限酵素Ｈ１ｎｄＩ［’ｅ使用して地図を作り、そして定位に挿入部を 有する２つのプラスミドをポリアクリルアミドゲル上での発現用に分析した。こ の、１個の株をＢ’ｒＡ４２３（表２）と命名した。

ｐＢＴＡ２］３　の５１０ｂｐＰ日ｔ　Ｉ　ｃＤＮＡ断片を直接ｐＢＴＡ２８６ のＰｓｔ１部位中にクローニングし、融合たん白質発現のためにＢＴＡ６３４中 へ形質転換した。ｐＢＴＡ２８６　はｐＵＲ２９１由来でめり、従ってそのＰｓ ｔ１部位を横切る読み枠の改にこの直接クローニングが可能である。得られた株 ｉ　ＢＴＡ４２４（ＡＴＣＣ６７０５８；　表２）と命名し、これは封入体とし て融合たん白質を生成する。

ｐＢＴＡ２９３の５　］　０ｂｐＰｓｔｌ　ｃＤＮＡ断片を同様にｐｕｃＢのＰ ｅｔ１票位中にクローニングし、そして不溶性短鎖融合たん白質の発現用にＪ３ ’ｆ’Ａ６３７中に形質転換して株ｆｓＴＡ４３６０（八゛１°ＣＣ６７（１５ ５；裏２）を作った。

ＡおよびＡｃサブユニットがそれぞれるるにもががわらず、ＢＴＡ４２３、ＢＴ Ａ４２４およびＢＴＡ１３６０からの融合たん白質はいずれもウサギ抗インヒビ ン抗血清によっては検出されなかった（８１４１３図、トラック１．６および］ ６）。これにより、】５ｋＤたん白質に対する抗体の準位が非常に低いが又は０ であることがわかり、従ってインヒビンに対する免疫性に関連した生物学的作用 はＡ又はＡｃサグユニットの使用によってのみ達成可能であろうと思われる（実 施例１７〜２０′４：、参照のこと）。

又、１５ｋｌ）配列の発現は、１５ｋＤ配列の全部およびアルギニン−５から− １に及びＨＩＬθ■断片と単離することにより、そして第３１　（Ａｉｉｉ）図 に示したＨａｅ１部位リンカ−を付加することにより達成される。得られた融合 コード鉱、第１１ＣＢ＋）に示しそして上記した様に、ＢａｍＨＩ部位を使用し たｐＵＲ２９０／ｐＵＣ７／ｐＵＣＩ３中のβ−ガラクトシダーゼ融合の発現に 有用であり、かつＡｓｐ−Ｐｒｏ配列における融合全ぎ酸で切断し得る機能も有 している。面、Ｕｌａ　１部位は、ＡＴＧが新しい翻訳開始部位として機能して いるｐｔｒｐＬｌ　（Ｅｄｍａｎ　、　Ｊ　、　Ｃ１等（１９８１年）の上記又 献）中に３ける発現用にも使用可能である。

発現のために可能な第３の手段に、特異Ｈ１ｎ４１部位全使用し、そして、＠１ １　（ｂｉ）図に示すように、所望のリンカ−とＭｏ２−］配列と？有するアミ ノ酸１〜８をコードするＬＪＮＡ配列を合成することである。

こうして、Ｐｓｔｌ、Ｈａθ■およびＨｌｎｄ　１部位は全て発現リンカ−付加 用に好都合な部位である。又、５１０　ｂｐ　Ｐｓｔｌ断片のＨａｅ■による部 分消化の後で、アミノ酸１および２をつなぐＨａｅ１部位（ＧＧｅｅ）ｙ使用す ることもできる。尚、発現系ｔＳ々変えることは当業者に周知の技術であり、Ａ およびＡｃサグユニットに関して前記した可能性はいずれもＢサグユニットに通 用される。

又、それぞれの機能全研究する目的で、サブユニット前駆体の部分ｔインヒビン ＡｃおよびＢサブユニット配列についてそγしそれ独立に発現きせることかでき ることは明らかである。例えば、両末端２１１ａｍＨＩ部位に変えるために、Ａ Ｎ断片ＤＮＡ全Ｓｐｈ　工Ｊ（ａｅ　１１（部分）断片として単離しそして、第 １１（Ａ１）および１１（Ａｌｌｉ）図に示したリンカ−を使用してｐＵＣ７又 はｐＵｃ１３中で発現烙せることができる。

更に又、インヒビンたん白質又はインヒビン様たん白質又はペプチドの発現は本 文に開示しｆｃ実施例の方法のみに駆足されるものではない事と理解すべきであ る。真核細胞および原核細胞に有用な当業者に周知のたくさんのいろいろな発現 系があり、これらはいずれも本発明の配列の発現に適用可能である。

ウシおよびヒトＢサブユニットのアミノ酸配列は同じであり、従って、ウシＢサ ブユニットヲコードするｃＤＮＡ　ｆ発現させた場合、その生成物はヒ）ＤＮＡ 配列を罠って同様に発現させて得た生成物と同一である。従って、株ＢＴＡ４２ ３．ＢＴＡ４２４およびＢＴＡ１３６０　も又ヒトインヒビンのＢサブユニット を生成すると考えるべきである。

ＢＴＡ４１０およびＢＴＡ４１５からのβ−ガラクトシダ−ゼーインヒビン融合 たん白５１含有するたん白質両分金、カルボニルジイミダゾール法（Ｂｅｔｈｅ ｌｌ、Ｇ、Ｓｏ等（１９７９）年のＪ、Ｂ１０１゜−５Ｂに結合し、谷融合たん 白質に対する抗体をアフイニテイ梢製によ＃）】！ＩＬｌのウサギ抗インヒビン 抗血清から単離した。吸着した抗体ｉ３ＭのＭｇＣｌ２でカラムから溶出し、１ ０ｍＭのトリス−ＨＣＪ／１５０ｍＭのＮａＣｅ（ＰＨ７，５）に対して透析シ た。

溶出された抗体を各融合たん白質のＷθ６ｔθｒｎ　Ｂ１ｏｔ分析に使用したと ころ、これらは、それが単離された融合たん白ＩＪＫヲのみ結合することが明ら かとなった。すなわち、交差結合性はなく、かつ抗インヒビン抗体に比べて抗β −ガラクトシダーゼ抗体の量は無視し得る程度であった。株ＢＴＡ４２５．４２ ０．４２２および４２４からの融合たん白質についても同様の実験全行ったＯ これらの笑峡の結果、組換えインヒビン又はインヒビン様たん白質は、抗インヒ ビン抗体の精製や抗インヒビン抗体用のモノクローナル又はポリクローナル抗体 製剤のスクリーニングならびにインヒビン分析系、例えばＥＬ工ＳＡ−？Ｒ工Ａ 等における標準体として使用することができる。

真核細胞および原核細胞中でのインヒビン様たん白質の産生の代替法は、インヒ ビンの１部又は全部を化学的に合成することでらる。この様な合成ペプチドは、 インヒビンの類縁体、作用剤および拮抗剤として使用することができ、実施例】 ０および】】に記載の様な用途を有しているＯ合成ペプチドの合成、精製および 特性決定は次の様な方法で行った。４３０Ａ型ペプチド合成装＠　（Ａｐｐ’１ ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ工ｎｃ、）　ｆ使用した。１．０００版ソフトフ ェア変更することなくメーカーの処方通りに使用した。すべての使用薬剤はＡｐ ｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙａｔｅｍｓ社供給のものを使用した。ＰＡＭ樹脂と共有 結合して供給されたＣ末端アミノ酸（０，５ｍｍｏｌ　）ｔ−反応容器に装填し た。合成の様子は、各樹脂のカップリング後のニンヒドリン反応でモニターした 。ペプチドに結合した樹脂の総収量は約７５％であった。

Ｒプテド結合樹脂を、スカベンジャークレゾール（０，５ｄ）とチオクレゾール （０，５ｄ）の存在下に０℃で１時間ぶつ化水素１１２（１０ｄ）で処理するこ とによって樹脂からのベプチゝの切断と脱保藤ヲ行った。この切断と脱保護は、 テア０ンＨＦ’−型反応装置ｉ　（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕ ｎａａｉｉｏｎ、大阪）中で行った。反応生成物をエーテル（３Ｘ５０ｉｍｔ） 中でナシつぶし、ろ過し、次いで、このペプチド全酢酸（１０％）中に溶解し、 ろ過し、ぞしてろ液上凍結乾燥した。

残留物をアセトニトリ／１／（１０チ）を含有するトリフルオル酢ｆｆ／（０， １％）中に溶解した。ペプチド會逆相高圧液体クロマトグラフィーによって精製 して均質物とした。トリフルオル酢酸（０，１％）と１０〜８０％に直線的に増 加するアセトニトリルと全使用して傾斜溶出した。アルテックス（ＡｌｔｅＸ　 ）　Ｃ８カラムを分町クロマトグラフィーに使い、溶出液を連続的にＬ１／分の 流速で２２０　ｎｍでモニターした。予備ＲＰ−１−ＩＰＬｃを。

Ｖｙｄａｃ　ＰｒｏｔｅｉｎおよびＰｅｐｔｌｅｓ　Ｃ□８カラム（Ｃａｔ、　 Ａ　２１８ＴＰＩＯ１０）を使って２〜４ｒｘｌ１分で操作して行った。溶離液 傾斜は谷はブテドの最適謂製と々る様に調節した。アセトニトリル全蒸発式せて 精製はブテドを回収し次いで水相を凍結乾燥しｆｃＯ Ｗａｔｅｒｓ　Ｐｉｃｏ−ｔａｇ　Ｓｙｓｔｅｍ　’ｉ使用して合成ペプチド′ のアミノ酸分Ｉした。メーカー処方に従って行い、系２ＰＴＣアミノ改で目盛っ た。各ペプチドのアミノ酸組成は各アミノ酸の予想割合と一致した。

ｃＤＮＡ配列由来のＡサブユニットアミノ酸配列の２つの領域を最初に合成ペプ チドの生成に使用した。第１はＢ１８】からＡｌａ２６ｔででｌ、第２は５ｅｒ １６７からＡ８ｐ１９５までであり、これはインヒビンの４３ｋＤ（Ａ）および ２０ｋＤ（Ａｃ）サブユニットのＮ末端を含むものである。ペプチド】の全配列 を以下に示した。ここで谷数字は第５図のアミノ酸配列に従って表ｉｚａ　４　 ｓ　６　７　ａｓ Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−工１ｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ１ ９　２０　２１　２２　２３　２４　２５　２にの配列は最後の１個のアミノ酸 コードを使用して（ＨニーＡ２６）Ｋと省略することができ、ここｒこかつこ中 のアミノ酸は第５図に挙げたインヒビン配列を示す。

ペプチド２ｄ、Ｙ（Ｈ□−Ａ２６）Ｋでおる。これはペプチド１にＭｎ２　末端 チロシンを付加して得られる。合成法としてはリジンから出発して行った。樹脂 の部分（７５％）を除去しくペプチド１）、次いでイブテド２全生成するためｒ こ、チロシン残基を残りの２５−のペプチドに加えたｏ９ジン残基はノーブテン の製造に３易にするために加えたものであり、チロシンは放射性よう素化の部位 を作るために加えたものである。

株Ｂ’ｌ’Ａ４２０とＢＴＡ４２２とＢＴＡ４２４は融合生成物としてインヒビ ン様たん白質を生成する。これら３種の株からのたん白質はいずれも封入体と呼 ばれる不治性塊状物として生体内に見ら（Ｌ、これは次の工程により生成しそし て精製される。

１晩培養した培養物Ｔｈ２Ｊのじゃま板付フラスコ中で２Ｘ１１の新鮮なＬＢ（ ］０９のトリプトン１５ｇの酵母エキス１５ｇのＮａＣ６；　１１につき）中に 】：５０に希釈し、これを１培養物濃度が０Ｄ＝０．３−０．４になるまで３７ ℃で振とうした。

イソプロピル−１３−Ｄ−チオガラクトシダーゼ（ＩＰＴＧ：最終濃度０．］ｍ Ｍ）’ｉ加えて２〜７時間培ａｔ続けた。封入体は最初２時間後に明相顆粒状に 可視となり次いで７時間後に実験的に最大のサイズおよび量になった。

細胞を集め、便利のためにこのペレットを１晩−８０℃に冷凍した。細胞ケもと の培養物】ｌにつき２０ｒＩＬｌ！のＨ２Ｏ中に再けん濁し、フレンチプレス（ Ｆｒｅｎｃｈ　Ｐｒｅｓｓ）　ｆ使用して破砕した。けん濁液を臭化フェニルメ チルスルホニル（ＰＭｓＦ）と５チの）！ｊ　）ンＸ−１００中Ｔｏ、３ｍＭに し、次いで１，２００　ｘＧで１０分間遠心分離しｆｃ。

上ずみ液を捨て、ペレツ）１−超音波処理により、５０ｄのＩＭ　ＮａＣＪ　／ 　５％トリ）ｙＸ−１００中に再けん濁し次いで遠心分離した。この洗浄工程ｔ くり返し、ベレン）１−最終的に超音波処理により、もとの培養物１ノにつき２ ．５−の１ＭＮａＣＪ１５チドリトンＸ−１００中に再けん濁した。

仁のけん濁液ｔベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＳＷ２Ｂ回転器中、５９％（ｗ／ ｖ）のしよ糖密度勾配上に層を作５％３２，０ＯＯＸＣ＋で６０分間遠心分離し た。封入体はしよ糖クッション’に通してペレットとなり、細胞砕片から単離し た。これらｇＨ２０テ洗い、少なくとも３か月間、ポリアクリルアミドゲル上に 見られるたん白質物質として何の変化も危く一８０℃で冷凍保存できる。

精製した封入体’（２ｑ／　ｍｌの濃度に８Ｍ尿素／　０．　Ｉ　Ｍ　Ｄ’ｌ’ Ｔ１０．１Ｍ）リス−〇〇〇ｐＨ８，０）中に、Ｎ２雰囲気下３７℃で２時間溶 解した。溶液ｋ１２．ＯＯＯｒｐｍで１５分間遠心分離し、上ずみ液ｔ】晩４℃ で少くとも２Ｘｓｚ交換して５ＱｍＭＮａＨｚ”０４／　］　５０　ｍＭ　Ｎａ Ｃ１（ｐＨ７，５）　（Ｐ　ＢＳ）に対シテ透析した。透析バッグ中のたん白質 は白色のフロックとなり、これは更に精製することなく使用した。その】■ｔマ ウスに腹腔内注射したところ、この物質は発熱物質やリボ多糖類を含まないこと がわかった。このフロックけん濁液を、同量の油性アジュバント、すなわちＭａ ｒｃｏ１５２　：　Ｍｏｎｔａｎｉｅ　８８８　（９：　］　）で乳化し、最終 的にＩＩＩＬｅにつき抗原１００−２５０μＩ　の濃度にした。２種又はそれ以 上の出発物からの抗原がある揚台に灯、各抗原の濃度に１００−２ｓ□μ９／ｄ とした＾合成ペプチドをグルタルアルデヒド法に従ってキーホールリンベットヘ モシアニン（ＫｓｙｈＯ１θｌｉｍｐｅｔ　ｈａｅｍｏｃｙａｎｌｎｅ。

ＫＬＨ）　と結合させ（Ｂｒ１ａｄ、　Ｊ’、、Ｐ、等（１９８５年）のＪ。

ニーｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓｙ　７８　＊　５６−５９　）、そしてこの共 役物を前記した様に乳化した＠ 抗原を製造するのにたくさんの他の手段が６９、又免疫性付与についても他のた くさんの方法ややシ方があることに留意すヘキである。抗原製造の別法としては 、例えに、フロイントの完全又は不完全アジュバント中への乳化、アンヒドロゲ ル又はサポニン中への乳化又は抗原含有ポリアクリルアミド１ゲル切片の温浸等 がある。又こｒしとは別に、抗原はアジバ／トヲ使用することなく投与しても良 い。投与形態としては、経口投与、粘膜を通しての投与、筋肉内投与、腹腔的投 与あるいは皮下投与等がある。又、ペプチド又はたん白質の抗原性増強にもたく さんの方法がめり、例えば自分自材との架橋、他のたん白質との架橋あるいは残 基の変性や配列の変更等が孕げられる。

下記の動物についてまず第１図の注射をしく０週目）、次に４過間後に促進剤を 注射した。谷フロック抗原の投与賞は下記の通りである。

ウサギ　１００　μｇ／回 ヒツジ　２５０ ブ　タ　２００−２５０　＃ ラット　１００ 尚、キーホールリンイツトヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合した合成ペプチド（ペ プチド］、実施例】０）は、１回につき１００μｇの接合体全ウサギに投与して 使った。

血液試料を規則的に採取する。代表的な放血法は次の通りである。第１回目の注 射の前に】回放血し、ブースター投与前に１回またはそれ以上放血し、更にブー スター投与時および投与後に毎週放血する。この血液を一晩４℃で凝血させ、そ して遠心分離後に血清を除く。血清上整除数個に分けて、抗体およびＦＳＨ力価 の分析中に一２０℃に冷凍して保存した。

血清は３種の違った実験条件下で試験した。

（ａ）トレーサー結合 よう素化した５ＢｋＤおよび３１ｋＤインヒビンとの抗体結合性を測定し、これ により抗体が在来のウシインヒビンを認識可能かどうかを調べた。トレーサー抗 体錯化合物を第２抗体を使用して沈でんさせ、ペレット中の放射性ｔ１反応系中 の全カウント数のパーセントで表わした。

よう素化工程は次の通りである。精製し７ｔ５８ｋＤ又は３１ｋＤインヒビン（ ２５μｊの電気溶出緩衝液中に１〜２μｌＣＬｍ際特許出願ＰＣ’ｌｌ’／ＡＵ 　８５１００１１９　）を２５μｌの０，５Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７，２）に加 えた。Ｎａ　工（０，５ｍＣ１，５μＪ　ＩＡｍｓｒｅｈａｍ、　Ｂｕｃｋｓ、 　ＵＫ　）　Ｉ！−加えた。クロラミｙＴ（４０μｌ）をクロラミｙＴ：ポルモ ン＝８：１の割合で加え六〇反応′に攪拌下に室温で６０秒間行い、２０μｊの メタ重亜硫酸ナトリクムｔ３Ｗ／ｗｔｌ）ｋ加えて反応を停止した。反応混合物 ｋ　２０　ｍＭりん酸緩衝液１０．１％Ｊ１３ＳＡ又は０．５％ＰＯ１’ｌｐ＠ ｐ（ＰＨ６，０）で５００μＥとし、セファデックス０２５カラム（ＰＤＩＯ。

Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）上でゲルろ過して遊 離の１２５工、除いた。不活性画分を果め２０１１Ｌ７！にし、２００μ！のＭ ａｔｒｅｘ　Ｒｅｄ　Ａ　（Ａｍ１ｃｏｎ、　Ｄａｎｖｅｒｓ、　Ｍａｓｓ、　 、ＩＪｓＡ　）　Ｋ供給し、次いで４００　ｍＭ　ＫＣＩ　ｔ−含有するシん酸 緩衝液で洗浄し、浴出物音除去した。　■−インヒビンをシんＷ緩衝液中の１． ＭＫＣ６７４Ｍ尿素で溶出した。このよう素化インヒビン’に更に適当なＲＩＡ 緩衝液（下記参照）？有するセファデックス０２５カラム上でゲルろ過し、ＫＣ ｌ／尿素を除去した。

５８ｋＤおよび３１ｋＤインヒビンのよう素化に続き、セファデックスＧ２５上 でのゲルクロマトグラフィー後の不活性体積画分中のそれぞれ６０μＣ１および ２５μＣ１２回収した。約３０俤が】ＭＫＣ１／４ＭＫＣｌ／尿素溶出された。

５ＤＳ−ＦＡＩにおける分子量から決定した　エーインヒビンはこの画分中に見 出された。

よう素化製剤の特異活性に、基準体のよう素化に使ったホルモンを使用する自己 置換法（Ｍａｒａｎａ等（１９７９年）のＡｃｔａＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（Ｋｂ ｈ、）　９Ｌ　５８５−５９８）によるラジオイムノアッセイ（［Ａ）により決 定δれた。　■−５８ｋＤインヒビンの特異活性は５０−６０μＣ１／μｇで、 Ｉ−３］ｋＤインヒビンのそれは２４μＣ１／μｙ’ｔ’あり、それぞれの回収 率は５−２５チでめった。

在米５８ｋｌ＋インヒビンで免疫したウサギ４７４からの抗インヒビン抗血清は 生来のインヒビンの生物活性を矢ってオリ。

よう素化５８および３】ｋＤインヒビンと強力に結合するが、谷インヒビンの分 離したサブユニットとはほとんど結合しない。

この事は、よう素化はその分子にそれほど重大変化を与えていないことがわかる 。従って被検抗血清のよう素化インヒビンとの結合能は、該抗血清の在来インヒ ビンヲ認識する能力であるとみなされる。

（１））　生体外生物学約定ｆ（バイオアッセイ）。

前記したバイオアッセイ（国際特許出願ＰｃＴ／ＡＵ８５１００１１９）におい て、抗血：Ｆｔは在来インヒビンの生物活性を抑制する能力を有するのであるか ら、中和抗体が存在するものと認められる。

（ｃ）　ＦＳＨ。

ヒツジＦ’ＳＨの血清準位を、ウサギ抗ヒツジＦＳｉ（血清トドレーサーとして のよう素化ヒツジＦＳＭとを使用するラジオイムノアッセイ法により決定した。

又ウサギＦＳＨの血清準位をモルモット抗ウサギに″Ｓｋｉ血清とトレーサーと してのよう素化ウサギに’　Ｓ　ｆ（と全使用するラジオイムノアッセイ法によ り決定した。ｋ’　ＳＭ力価１／（−シ・ける増加は、組換え体に対して生起し た抗体循還からの内因性インヒビンの除去の際に認められると思９匹の動物のグ ループ（白めん羊、実験中発情期にないものを選ん７；ｉ）’ｔ−１表４に示し た１つの又は１対の７０ツク抗体で免疫し１．その血清を実施例】６の様にして 分析した。

（ａ）トレーサー結合実験。

１９匹から顕著なトレーサー結合能（表６）を有する血清（ブースター投与後２ 迦間目）が採取された。これらの動物はすべて、ブラシーボコントロール群（Ａ 群）お！びＰＢＴＡ３０１からの１５ｋＤサブユニット融合たん白質で免疫した 群（０群）以外の群のものであった。最高の応答は６７３番の動物（Ｄ群）にみ られ、これは１：］ＯＯＯの希釈条件下で３１ｋＤ　）レーサーとの１０チ結合 能および５８ｋｆ）　）レーサーとの３．１％結合能を示した。

蜀 Ａ　′ＢＴＡ４２５ ＣｂＴＡ４２４　１５ｋＬ） ６６３１．７ 表中に記載のない動物はすべて１チより少ない結合度で６つ７’？。

この様に、組換えインヒビンサプユニットは、これを抗原として使用した時に、 生来のインヒビンをｄａし得る抗血清をヒツジ中に生起せしめる能力を有する。

尚、（１）これらの実験により血清中の遊離の抗体が検出され、かつヒツジイン ヒビンに対してｆ＆高の親和性を有する抗体は実際にヒツジインヒビンと結合し ておりこの丸鉄の分析では検出されなく、そして（１）スクリーニングは、弱陽 性血清の希釈力１１ＩＩＩ全多分超えた］：］０００の希釈度で行った点に留意 すべきである。

（ｂ）　生体外バイオアッセイによるデータ本実鉄条ｆ′＋（２ｖインヒビンに つき１μｌの抗血清）下において灯、いずれの血清も、下垂体絹胞培養バイオア ッセイでの生体外インヒビン活性甲相を示さなかった。

（ｃ）　Ｂ″８１−１力価 各動物群の血清ＦＳＭ準位を表７に示した。コントロール群（Ａ）とは顕著な違 いが見ら１しなかったが、１時的ではあっても顕著々増加が被検群全部（］肝を 除き）に見られた。

この様に１組換えインヒビンは奴畜動物におけるＦＳｈ力価を増加する抗峙、と して使用することができる。ＦＳＨは排卵率を増加することが矧られているので 、従って組換えインヒビンに対する免疫は排卵率を増加するものであると期待出 来、かつこれは生殖能改、善のための生殖能増強剤としての使用が期待される。

更に又、Ｆ　Ｓ　ｆｌは雄における精子生成および雌における卵子生成を調節す る作用伊有しているので、生物活性組換えインヒビンの投与によってＦＳＨ準位 を低下させ、従って雄および雌の両方用の避妊薬としてこれを使用することも出 来る。

（開始時）　（ブースター） Ａ　８．７＊１．５　１０．３＊３３　９．６±３．７　３０．９＊３．６　］ ０．６＊５．２Ｂ　７．８±３．６　８．Ｏ＊２５　１３．２＊６．Ｏ＊１ｏ、 ５±ｓ、２　６．９±２．８Ｇ　５．５＊２．４　７．２＊３．６　１１．６＊ ６．７　１２．４＊６．５＊１１．Ｏｆ４．７＊Ｄ　８．５＊３．６　７．９＊ ２．５　９．７４４．８　１２．７±４．ｓ”　］ｏ、７土４．２に＝　８．８ ＊２．４　９．８＊３．９　１０．５＋２．６　１０．８＊３．１　９．３＊３ ．５１”　８．４＋３．１　９．７＋５．０　８．４±５．７　１１．６＊６． ４＊９．６±３．５上記データは、群平均上標準偏差でおる。被検群は表４と同 じである。第４透口のデータとその後の週のデータとの間の統計的な比較を、同 じ群の動物間の１対のｔ−試敗において行なった。

Ｌ＊）　Ｉ）＜０．０５ （＊＊）　ｐ＜０．０１ ウサギ実験 在来５１３ｋｌ）又は３１ｋｉ）インヒビンで、又はプラスミドｐＢＴＡ２９７ ，２９９又は３０１　を有する細胞からの融合たん白質で、又は合成ペプチド】 （実施例１０）を含有する接合たん白質で免疫した、去勢していない雄ウサギか らの抗血清ｒ１　トレーサー結合系で分析した。結果を表８に示した。

表８ 動物番号４７４の血清は１：２０００に希釈したものを使用し、他は全部］：］ ０００に希釈して使用したりこれらのデータから又、組換えインヒビンサズユニ ットおよび合成ペプチドば、在米インヒビンを認識しかつこれを結合し得る抗体 を含めての抗体応答′に誘発し得ることがわかる。応答は動物によって変るが、 組変え１５ｋｆ）抗原（ＨＴＡ４２４由来〕はすべての被検ウサギにおいて順著 な応答全誘発しない事から、４７４番ウサギからの血清中のすべての抗体（これ は在来５８ｋＤインヒビンに対して生起されたものである）は本実験に関する限 ！＋４３ｋＤ　インヒビンに対する抗体であると思われ、従って】５ｋＤサブユ ニツトはウサギにおいてはほとんど抗原性を有しないと認められる。しかしこの 事実は、このサブユニットが他の釉において有用でないだろう事を意味するもの ではない。これらの結果から又、１５ｋＤサブユニツトに対する充分な抗原性応 答を達成するためには、その構造、配列又は構成に何らかの変更を与える事が必 要であろうと思われる。又同様に、２０ｋＬ）サブユニットもウサギにおいては 貧抗原である。

６９９番ウサギの血清準位は、イプテド１−ＫＬＨ接合抗原（第１５図）での強 化免疫後に突然減少して０になジ、又６９８査ウサギでは除々に減少することが わかる。各動物の応答は。

５８ｋＬ＋　）レーサーに対するその抗血清力価と相互関係がある。

又、合成ペプチド自体又はそれに対する抗血清は生体外ラット下垂体＃ｌＩＩ胞 バイオアッセイにおいて作用せず、これらはインヒビン受容体に対して直接作用 をしない。従って、ＦＳＨＨ精子形成および卵子形成に関与する（実施例１９診 参照ので、このペプチドおよびその誘導体は、雄および雄の両方に対して避妊薬 として使用可能なものである。更に又、これはＡＮ断片のＮ１（２−末端部でめ るので、ＡＮ断片自材又はウシ、ヒト又はその他のを稚動物徨のＡＮ断片由来の その他の合成ペプチドも又。

ここに銭祭芒れた応答が抗体を介するものであるとするならば、同様な用−４を 有するものと屹めらγＬる。又、生物活性Ａ、断片又にその部分を抵原としてで はなぐ投与する場合には」゛ＳＨ準位が増加することか予想され、従って、これ らは生殖能改善のための生殖増強剤として作用することが予想される（実施例］ ９も参照）。

ブタ実験 本実験の方法は前記の例の場合とは異なる。

未経産の雌ゲタ（２２−２３週令）を、ＢＴＡ４２５　由来β−ガラクトシダー ゼフロック抗原７５０μｇで（１６匹、コント０−１４．）、又１ｒｉ　ＢＴＡ ４２２　、　Ｂ’ｌ°Ａ４２４お！びＥ’ｌ’Ａ４２６由ｆｆｉの各サブユニッ トフロック抗原の各２５０μｇｔ−含有する混合物で（１６匹、テスト群）それ ぞれ免疫した。初回免疫後２５日目と更に４７日目に同様のブースターを投与し た。初回免疫後６０日目に血清を採取し、トレーサー結合法により抗インヒビン 抗体を分析した。これらの雌ブタは発情を示し、６０日後の第１回発情期に交尾 させた。

】５匹の被検動物からのｆｉＮを、］：］ＯＯの希釈条件下にトレーサー結合能 を分析したところ、これらの内の】０匹の血清は１．７〜９，０％（Ｘ＝４．９ ±２．５）の部、囲の　ｌ−５ｓｋＤインヒビンとの結合能を示した＠史に、Ｉ −５ｇｋＤ　インヒビンに対して２．０％の結合能を有する１例は　Ｉ−ａｕｃ Ｄ　インヒビンに対しても６．４％の結合能を示した・コントロール血清の６例 はいずれも両トレーサーに対してはつきりした結合性を示さず、これよりｇｌ換 えインヒビンサプユニットはフタ１７）抗原性応答酵発が可能であり、従って在 来インヒビン′に認識する抗体となり得ることが明らかとなった。

フタ（乙・；コニ古則に、６０日目の採血の後に２１〜２７日周期であり、本実 験の被検動物に全て発性を示し従って交尾するものと予測された。表９はコント ロール群およびテスト群の交尾データを示す。しかし、下記分析の結果から、こ の実数処理により多くのテスト群の動物は交尾しなかったことがわかる。

コントロール群　１４　２　１６ テスト群　６　１０　１６ 計　２０　１２　３２ Ｘ　＝６．５　；　ｐ＜ｏ、ｏ　２　（Ｙａｔｅｓ訂正ヲ適用）抗５８ｋＤイン ヒビン抗体？有する１０例の血清の内９例は１：］ＯＯの希釈条件下において３ 】ｋＤインヒビンを検出しなかったので、上記のデータは５８ｋＤ　インヒビン のＡＮ断片に対する抗体作用を示すものでアリ、この抗体の大部分はＡＮ特異性 であると考えられる。この仮説はウサギ実験において、すなわち、ペプチド】を 抗原として投与した場合に、ＦＳＨ準位が低下しく実施例】８）そしてその】つ の結果として、雌のを椎動物において発情期周期と卵胞形成が停止することにな ることによって裏付けらｎている。５８ｋＤインヒビンよりも３１ｋＤインヒビ ンに対してよシ萬い抗体力価を持つ血：ａを生成した】例は本実験の期間中に正 常に交尾した。又次の様に説明することもできる。例えば、４３ｋＤ抗原はプレ プロＡサズユニットのアミノ酸−】０から−１を持っており、この配列が前記作 用奮もたらすものである。しかしこの逆説的な結果が生体内で達成されたという いかなる作用機能によっても、そのデータ１ｄＦＳＭと従って生殖機能およびそ の過程の調整剤としてのインヒビンの作用を強調するものであり、かつこれは雄 および雌の避妊薬としてそして雌の発情期を抑制する分子としての組換えインヒ ビンの作用を実証するものである。

ラットの被検群をヒツジの場合と同様にして免疫した。その血清全よう素化トレ ーサー結合分析によ！＋１　：５００の希釈条件下に分併し、各群の結合データ （％）を平均埴土標準偏差の値で表】０に示した。ｔ［Ａ−Ｆ’）で使用した抗 原は表６と同じも群　性　数　トレーサー ５Ｂ　ｋＤ　３１　ｋＤ これらのデータにおいて、（ＡＪ群と（Ｅ）および（Ｅ）又はｑ群のトレーサー 結合能を比較すると、Ａ（４３ｋＤ）サブユニットの方がＡｃ（２０ｋＤ）サブ ユニットよりもすぐれた抗原であることがわかる。トレーサー結合試験の結果か らみると、Ｂサブユニットは抗原としての作用は有していなかった。これらの結 果は、５８ｋＤ在来インヒビンは４７４番ウサギにおいてすぐれた抗体応答性と 中和抗体を生成し、一方４６】蕾ウサギと３１ｋＤ在来インヒビンで免疫した他 の２匹においては中和抗体は生成されず又抗原応答性もほとんどなかったという 観察結果をうら付は強調するものである。

他の種（ヒツジ、ウサギ、ブタ）に関しては、組み換えインヒビンサブユニット で免疫した動物のどれにも中和抗体に検出されなかった。又、はとんどの種にお いて、抗原のβ−ガラクトシダーゼ部分に対する独者な免疫応答が見られた。こ れらの政祭結果から、立体配座エピトープが重要でめり、かつｆ３ＴＡ４２６、 ＢＴＡ４２７ＲよびＢＴＡ１３６０由来の又１ｄｔｒｐベクター（実施例］０） 由来の抗原の様な抗原が高価値であることがうかがわれる。なぜならば、融合部 のβ−ガラクトシダーゼ部分は夾員的に減少している（第１２図）かりるいは欠 失しており、そして実験に立体配座エピトープ全生成するためにかつ抗原生成金 改善するために行うことができるからである。

しかしながら、本発明における動物実験によｎは％組換えインヒビン、サブユニ ット、断片およびその合成類似体又は相同体は次のように使用することができる ことが明らかにとれた。

（ａ）　在来インヒビンｋ　ａ５　ｋｌ、する抗体の産生。

（ｂ）　Ｆ’　ＳＨ準位の変更〇 （Ｃ１生殖増強剤又は避妊薬としての用途。

実施例２１ インヒビンの製造方法 インヒビン産生の遺伝情報を有する組み換えプラスミドを持つ宿主細胞を産生培 養集合体中で凍結乾燥したバイアルとして保存する。保存バイアルからの細胞を 再生し、特定の培地上に植え、そしてこの培地からの細胞を使用して発酵用接種 材料を調整する。この接梅材料は適当な成長培地を含有する発醇材料金作るのに 使用し、発酵はインヒビンたん白質産生に適当な条件下で行う。発酵終了後に、 細胞を採取し、産生物を細胞から単離しそして精製する。生成物を分併し品質調 整し、そしてその安定性のために充分な保存条件下に保存する。きびしい衛生条 件下で生成物を他の成分と組合わせて用途に応じて組成する。

インヒビンの用途 本発明によシ生成されるインヒビン又はその部分は抗原としてるるいは生理活性 物質として使用することができる。ある１つの使用法による効果は他の使用方法 による効果と逆である場合があゐ〇 １つの形態として、本発明により生成され、そして（まｆｃは）ひきつづき変性 処理されたインヒビン又はその部分は抗原として使用することができ、従って生 殖能力を調節するために使用することができる。ヒトヲ含めてのを椎動物におけ る排卵率の上昇は生殖能力を改善し従って繁殖性を増太し、すなわち生殖効率を 改善する。本発明の生成物は、排卵率の増加のために使用することができ、従っ て例えば家畜やヒト用の生体内での受精のプログラミングに利用することができ る。又、家畜以外の動物にも、例えば動物園において又配を容易にするためにも 使用することができる。又本発明の生成物は、生殖可能期を長くするために性的 成熟および思春期の到来を早めたり、および（まｆｃは）交尾と分べんの間の期 間を短かくするために畜産動物にかける発情期を長＜１．＊り、および（°まだ Ｕ）季節的な又は分べん後の非発情期を短かくするために使用することができる 。雄の場合には、本発明の化合物は精子形成刺倣のために使用することができる 。

従って畜産業種例えばウシ、ヒツジ、フタ、ヤギ、シカ、ウマ、サカナおよびト リ等の＠育において、インヒビタの投与は益のあるものである。

又インヒビタは活性物質として雌における排卵を抑制し又は雄における精子形成 能全低下させる手段として使用することができ、従って避妊薬としてや排卵の同 時性を持たせるための手段として使用することができる。

インヒビタの部分、例えば合成ペプチド又はＡＮ断片はＦＳＨ早位を下げるため の抗原として使用することがでさ、ヤして避妊薬として又は発情期を抑制するた めの薬剤として作用する。

本発明の生成物は抗体産生用に使用することができ、この抗体も又本発明の一部 に包含されるものである。又抗インヒビン抗体は診断剤として使用することが出 来る。例えばこの様な用途としては、ヒトヲ含めてのを椎動物における生殖周期 の状態をモニターする手段等がある。この様にして、排卵の時期や排卵した卵の 数を予測することが可能でお夕、従って生殖周期の調整に使う治療法を決定する ことも出来る。

この抗体は雌の顆粒層細胞機能を検矧し、あるいは雄のセルトリ細胞機能のマー カーとして、あるいはおそらく繁殖能の高い家畜の遺伝的選択用のマーカーとし て使用することができる。

この様に、先に記載した組み換えたん白質やその訪導体、相同体および類似体は 多くの種々の例えば次の様な用途を有している。

（ａ）　生体内において、在来インヒビタ又はその前駆体に起因する生理的作用 の１部又は全部を抑制しあるいは禁止するための抗原又はインヒビタ拮抗薬とし ての用途。

（１））　モノクローナル又はポリクローナル抗体生成用の抗原としての用途。

（Ｃ）　生体内又は生体外における生理的活性組換えインヒビタの生成のための 前駆体としての用途。

（（Ｌ）　インヒビタラジオイムノアッセイ（Ｒ工Ａ）および酵素結合イムノソ ルベントアラ七イ（ＥＬ工ＳＡ）やあるいは他の検出系例えば化学発光体や螢光 発光体を使用する分析法における標準体としての用途。

（ｅ）　モノクローナル又はポリクローナル抗体製剤のスクリーニングにおける 用途。

（ｆ）　インヒビタ又はインヒビタ様アミノ酸配列（実施例９参照）會認識する 抗体の精製における用途。

（ｇ）　生成内における在来インヒビタ又はその前駆体に起因する生理的作用の １部又は全部を可能にするためのインヒビン作用薬としての用途。生物活性組換 えインヒビタは同一細胞内で両サブユニット又はその前駆体を同時に発現させる か、又は個々のサブユニット又はその前駆体、類似体、相同体又は誘機体を生体 外で正しく再構築することにより生成することができる。

インヒビンｃＤＮＡ配列ハ種々の用途を有しているが、その例を次に路げる。

（１）　原核又は真核細胞中でのたん白質合成のｃＤＮＡ　鋳型としての用途（ 実施例８参照）。

（２）放射性標識インヒビタｃＤＮＡ　プローブの製造用のＤＮＡ鋳型としての 用途。これらのプローブは色々な種のゲノムＤＮＡ中やあるいはインヒビタ又は インヒビタ様ペプチドを作る細胞のｍＲＮＡ　中のインヒビタ又はイ／ヒビン様 配列を検出し単離するために使用することができる（実施例７および８参照）。

従ってこ八らば、ヒトおよび家畜動物におけるインヒビタ合成３よび調節全診断 的に検出する能力、ろるいはインヒビタ遺伝子のクローニングおよび処理におけ る使用可能性會有している。

（３）前記（２）と同様な用途の放射性標ｆ＃ｃＲＮＡプローブの製造のための ＤＮＡ鋳型としての用途。

（４）放射性標瞳インヒビンの製造のためのＤＮＡ鋳型としての用途。

口〉四　Ｆ／Ｃｙ、２ ｍ 甚壬　Ｈ■！　割り　■ｒ Ｑ２　ＶｊＦ　Ｕ、ｍ　ｂａ　ｓｈａ　’３卦す、；ＵＵ　Ｍ５　ＵＵ　６５　 Ｈｆｆ　４Ｂ？　眠ｔｄキ目ぎ：８　＃　３　ｇ　Ｕ　Ｕ　慕５　ド諌茨　目！ ＝＋’＞’、Ｅ；　Ｉ＃　ｌ’：ｉ　”６５　１＝５　ｕｆｆ　蒔眠ｉ）と　リ ジ　属ぎ　捷ぶりさ ｉ；　３３　耳？１１と　÷！防　ヨ５　ｉ！　、、Ｍ　−＋Ｘ？ｌ玉　邦　ジ 誕　ｉ３　畦ｉ　耳三　と３ＵＵ　ｉｊＵ　吋　と！−肛　リ４　目コ畦λＴＭ 　（ｉ　〒ＩＣ，，ａ　ａ　Ａ　８５　Ｍ＃　Ｍ　Ｂ　ｈ−：　９３０ｒ　■　 ３母　トｉ　旧　ｕｊ：韮　リジロＳ　ロＮｊヨ　し！　計　コシ　Ｉλ　肛１ ：Ｅ　ａ：：ｙ　ｕ：　！ｉ；陣、；　’ｊｒ３　Ｇ：：　ＩＡ、Ｆ’ｆ：、’ 、ｉ’ｔ’＝”　’ｉ：Ｈ−’Ｆ、ａ　’ｒ：、”：；　’＝ａ”、ＵＨ旧旧Ｈ １，ＢＨ７，２ＨＦ、ｃｓ、、韮ＦＮ　ｆ厖ド　ド　苧肛　０ジ　３云　耳５　 Ｄ　１ｔＯＥ　ｉ（５１＞Ｅ　目、：　ｉ３５　Ｑ　１ｊ２０１３Ｕ旧旺５　ｉ ｊ：　６５　Ｂａ　３言　９ｒ　Ｈ■３　肛”　Ｒミ　ｉ５３話　睦封＜ｉ　ｊ Ｊり：　ｆ、ｆ、　２　８　Ｆ、Ｆ　Ｅ　Ｍ　ＨＩＥＪ、　ｒ　ｇ　Ｍ　ｂ　Ｅ 　Ｐ　３とＥ　Ｋル　Ｖ５　とｊ３３Ｈ口　属ぎ　貯ロ　翻　６Ｕ　Ｂａ　旧　 ｕ３ ｕ３　Ｈとｊ＝旧　９ジ　■ ３；　リ夏　■　ト酷と　訂 Ｌ３　眠　Ｈ３ＵＥ　目ジ　ｉλ イと　防　シａ　２Ｆｉ：、Ｄａ　リｉ捉三　ｋ２　旧ｋ　ＣＨド ｌ！λ　閤財！　ｉジ　Ｕり　眠 １１ｊ　眠　Ｈ■３　防　貯 ’２’、Ｅ’；ｊ、５　ｕＵ　ｕＵ　［韮＼　川 １１表昭６２−５０１６８０　（３３）円Ｉ７′１　円　Ｖ％　円の ：ｎ　；　’；”ＩＬＩ”Ｉ　−訊 ｔｎ　、ｌＬＩ　ｕ　Ｇ　翌とりに ウサキ″　き６９ε 手叙ε主ｒｌｒ正告 １、明細書３頁２４行目のｒＬＨＪをｒＬＨｌ」と補正する。

２、同書第９頁１行目の「が」の前にｒｐＢＴＡ３０６−ｐＢＴＡ３１０．ｐＢ ＴＡ４７２及びｐＢＴＡ４１５−ｐＢＴＡ４１８Ｊを挿入する。

３、同省第１２頁１０行目のｒ　ｐＢＴＡ２９６−ｐＢＴＡ３０５」をＩＩ）Ｂ ＴＡ２９６　ｐＢＴＡ３１０．ｐＢＴＡ４７２及びｐＢＴＡ４１５−ｐＢＴＡ４ １８Ｊと補正する、４、同書４５頁５行目の「プレ」を「プレプロ」と補正する 。

５、同書第１０頁１０行目の［を持った主読み枠〒ある」を「を有する」と補正 する。

＆　同書第１０頁１７行目の「を推動物」を「を推動物」と補正する。

７、同書第１２頁２３行目、同第１３頁４．７および１５行目の「を椎」を「を 椎」と袖正する。

８、同書第１５頁４〜５行目の「これに・・・・・・示した。」の記載を削除す る。

９　同艦、第１６頁２行目以降に次の記載を挿入する。

「第１６図は牛ＡＮ断片発現のためのベクターの構成を示す。

第１７図はプレプロＢサブユニット遺伝子の構成を示す。

第１８図はｐＢＴＡ４１８のプレプロＢサブユニット遺伝子の構造を示す。

第１９図はｐＢＴＡ３０６およびｐＢＴＡ６０７の制限酵素（ＰｓｔＩ）地図お よび塩基配列法を示す。

第２０図は、完全長生イニヒビンプレプロＢサブユニットｃＤＮＡのヌクレオチ ド配列とその予見されるアミノ酸配列を示す。

第２１図は完全長ヒトインヒビンプレプロＢサブユニットコーディングＤＮＡ配 列とその予見されるアミノ酸配列を示す。

第２２図は、プラスミドｐＢＴＡ３０３　、　ｐＥ３ＴＡ３０８゜ｐＢＴＡ３０ ９およびｐＢＴＡ４７２によってコードされるインヒビン融合蛋白質の配列を示 す。合成リンカ−により製造された塩基は各配列の小文字畑されている。」 １０、同省第３９頁末行以降に下記を挿入する〇１１、明細書第４１頁５行目の 後に（（（”）Ｃｅｐｋｏ　ｅｔａｌ　（１９８４）Ｃｅｌｌ　３７．１０５３ −１０６２Ｊを挿入する。

１２、同書第４４頁１２行目の「２つ」の後にｒ（ｐＢＴＡ２９３およびｐＢＴ Ａ２９４　Ｊを挿入する。

１３、同省第４４頁１６行目の「ＣＤＮＡＪの後に「（第６図）」を挿入する。

１４、同書第４４頁１７行目の「配列Ｋ」の後に「原初的に」を挿入する。

１５、同上第４４頁１７行目の「（第６図）」を削除する。

１６、同層第４４頁１７行目の「あった。」を「あり、また、プローブ６（第３ 図Ｂ）を用いてｐＢ’ｌ”Ａ３０６およびｐＢＴＡ３０７　Ｃ第１９図）のそれ に重ね合５ＣＤＮＡ７５１得られた。」と補正する。

１′７．同省第４４頁１８行目の「少なくとも」を削除する。

１８、同書第４４頁１８行目の「プロ蛋白質」を１「４２５アミノ酸（第２０図 ）からなるシレープロ蛋白質」と袖正する。

１９、同書第４５頁６行目の「Ｂサブユニット」の前に以下の記載を挿入する。

「シグナルペプチドの長さは確実には分らないが、Ｇｌｙ−２８２がシグナルペ プチドの最後のアミノ酸であると考えられる。これらペプチドの生理活性能力を 示すブロー蛋白質には、可能な蛋白質加水分解開裂部位が幾つかある。」 ２０、同書第４５頁１２行目の「Ｂサブユニットコード領域（１５７〜５０４塩 基）」を「Ｂサブユニットの５′−非翻訳領のＧ＋Ｃ含有量は５０係であるが、 プレブロＢサブユニットコード領域」と補正する０ ２１、同書第４５頁１３行目の「５４．２％」を「５６．８係」と補正する、 ２２、同省第５５頁８行目に下記を挿入する。

「これらλクローンから決定されたヒトプレブロＢサブユニットの活性なコーデ ィグ配列を第２１図に示す。このコーディング配列は６８８塩基間のイントロに よって妨害される。」 ２３、同店第６８頁５行目の「たん白質」を「蛋白質またはＡＮ断片」と補正す る。

゛２４０回書第６フ頁１２行目に下記を挿入する。

「、嶽断片を発現するクローンの構築方法は第１７図に示した。概略的に説明す れば、ＢａｍＨＩおよびｓｐｈ　ＩでｐＢＴＡ２９７　を消化し、次いで第１１ 図への１．に記載のリンカ−を挿入した。第１６図に示したように、完全長Ａサ ブユニット遺伝子を５ａｕ３ＡＩ断片として単離し、Ｈａｅｎ部分消化をした。

双頭のナンセンスコドンを含むストップリンカ−をＨ，ｄｅ　１１部位に付加し た反応生成物をＢａｍ　ＨＩで切断し、得られた断片をｐＵｃ１３に挿入した。

組換えシラスミドは、アミノ酸１２８／１３０をコード化するＨａｅ１１部位に 及ぶオリゴヌクレオチドプローブＴＣＣＴＧＧＣＧＣＴＣＣＴＧＣを用いてスク リーニングし、小Ｈａｅｆｆ断片が正しい方向妊存在することを確認する。陽性 クローンを取り、これを精製する。次いで、それら挿入部を固定するため配列決 定した。２８ｒの各々のクローンから、一つは正しい挿入部を含み、他の一つは 異なる起源のものを含ん〒いた。この正しい挿入部を精製し、ＦＵＣｔｘにリク ローニングし、次いでＥ、コリに導入され、原初的発現のためのＢＴＡ１３６５ を提供する。該分子の両端の３つの制限部位によって、上記したイＬｌのベクタ ーにサブクローニングすることができる。

ＢＴＡ４３６５によって製造される組換え蛋白質は封入体として排出され、明ら かにＭＷ２？ｆｙ。５にダルトンを有し、ＢＴＡ４２６およびＢＴＡ４２７（第 １６図）からの融合蛋白質と類似し、予見されるように血清４７４によるウェス タンプロットで検出される。」 ２５、同書第６７頁１２行目の「前駆体」「を「遺伝子」と補正する。

２６、同書第６７頁１２行目の「１２」を「１４」と補正する。

２Ｚ同劉、第６７頁２４行目のｒｐＵｃ８又は」を削除し、同行の「して、」を 「する。」と補正する。

２８、同’！ｊ４？、６７頁末行の「と、ｊを「はＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片 として切り出され、」と補正する。

２９、同店第６８頁の１行目の「１０６２」　の後に「にリクローニングし、ｐ ＢＴＡ４１７を提供する。」を挿入する。

３０、同書第６８頁２〜５行目の「を使用する・・・・・・と思われる。」を削 除する。

６０ｒ同沓第６９頁１８行目の「いる。」の後に下記を挿入する。

ｒ　Ｉ）ＵＣｌ　３におけるヒトＡＣサブユニット遺伝子の発現は、ヒトゲノＡ ＤＮＡの４５６ｂｐのｐｖｕＩｌ−Ｂａｍ　ＨＩ断片を単離することによりなさ れるが、こノ断片はλＡ２（セクション８）から誘導されるが、λＡｃサブユニ ットのコーディング領域を含有するものである。

Ｉ−Ｉ　ｇ　ａ　Ｉ消化後、 を付加し、生成物をＢａｍｆ（Ｉで開裂し、その後、ｐＵｃ１３のＢａｍ　ＨＩ 　部位にライゲーションする。

シラスミド調製物はＥ、コリＢＴＡ６５２を形質転換し、融合生成物としてｈＡ ｃサブユニットを発現するクローンを単離した。このクローンはＢＴＡｌ　３６ ７（＝ＢＴＡ６５２　＜　Ｉ）ＢＴＡ４７２　＞）−１’あり、融合ベクターの 配列を第２２図に示す。この融合蛋白質と同等であるようなものは、ウェスタン プロットテ抗血清４７４により検出されるが、最大バンドは最も顕著である。Ｊ ３１、同１）第６９頁１９行目の「第１１図」の後に「および上記のリンカ−１ 」を挿入する。

３２、回書第７１頁２２行の「２０」を「２１」と補正する。

３３、同書第７２頁２０行目から第７３頁１２行目ま〒の記載を下記と差し換え る。

「プレゾロＡサブユニットおよびプロＢサブユニツ）　ｃＤＮＡに基ずくプレゾ ロＢサブユニットの構成を第１７図に示す。インヒビンのｉＢサブユニットを５ １０ｂｐ　Ｐｓｔ　Ｉ断片（第４図）としてｐＢＴＡ２９３から単離した。Ｈａ ｅｌｌで該ＰｓｔＩ断片を消化した後、分離した３６５ｂｐＨａｅＩＩ断片をＨ ｅａ１１部位リンカ−（第１１図Ｂｌ）に結合させることにより）３ａｍ　ＨＩ 断片に転換する。得られたＢａｍ　ＨＩ断片をｐＺｉｐＺｅｏ　ＳＶ（Ｘ）１０ ＢａｍＨＩｉ位に結合させ、次いフ、Ｅ、コリを形質転換してＢＴＡＩ　４１９ （＝ＥＤ８６５４　ｐＢＴＡ４１６）を得た。ｐＺｉｐＮｅｏの合成プレゾロ遺 伝子を構築するため、Ａサブユニットのシグナル配列をｐＢＴＡから１６０ｂｐ ＢａｍＨＩ−８ａｕ　３ＡＩ断片として単離した。これを下流Ｂａｍ　ＨＩ　ｍ 位が削除されたｐ１３ＴＡ４１６ｉＡ導体の１３ａｔｎＨＩ部位に結合して、ｐ Ｅ３ＴＡ４１８である合かプレゾロＢベクターを得た。この構築を第１８図に示 す。アミノ酸−６１〜−１の配列゛はシグナルベゾチドにたった１個のシスティ ン残基を含有する。従って、真核細胞中での発現の間、正しいジスルフィドの形 成によって、Ｂサブユニットの折りたたみが起こることが予想され、かつその合 成前駆体からのＢサブユニットのプロセッシングは、Ｇｌｙｌ前の５個のアルギ ニン残基に起こることがなお予想される。

確実かつ完全なゾレプロＢサブユニット遺伝子は、真核細胞による発現のために ｐＢＴｌ　０６、ｐＢＴＡ２９４およびｐＢ１’Ａ３０８からのセグメントをス プライシングすることにより再構成され、かつサブユニット前駆体の部分はそれ ら各々の機能を研究するためインビビンＡＣおよびＢサシユニット配列を独立に 前核細胞又は真核細胞に発現されることは明白である。

牛とヒトのＢサブユニットのアミノ酸配列は同一であるので、ウシＢサブユニッ トをコードするｃＤＮＡを発現させた場合、その生成物はヒトＤＮＡ配列を使っ て同様に発現させて得た生成物と同−雫ある。従って、株ＢＴＡ４２３、ＢＴＡ ４２４およびＢＴＡ１３６０　も又ヒトインヒビンのＢサブユニットを生成する と考えるべきである。完全長プレプロＢサブユニツ）ｍＲＮＡをコードするＤＮ Ａは特別なＳａｃ　Ｉ部位（７６７〜７７０塩基、第２０図）のプラスミドｐＢ ＴＡ２９４およびｐＢＴ１０６からのｃＤＮＡをスプライシングすることにより 作られる。

Ｃ６真核細胞における発現 ベクターｐ１３１Ａ４１７およびｐＢＴＡｄ　１８をＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入す ることにより真核細胞におけるインヒビンサブユニットの発現を下記の操作によ って独立に、又は同時に行なった、 トランスフェクションの前日、約２Ｘ１０５個のＮＩＨ３Ｔ３細胞を培地５　ｍ ｌ　Ｏ）　’１”　２５フラスコにまいた。

ＤＮＡ（レトロウィルスまたはバタテリオファージラムダＤＮＡ）　１００　ｎ 、！ｉ’−１μｇをＩ’ａ　ｒ　ｋｅ　ｒ、　Ｂ、　Ａ、と５ｔａｒｋ、　Ｇ＋ 　Ｒ，（１９７９，Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　３１．３６０−６６９）によって改変 されたＧｒａｈａｍ＋　Ｆ、　Ｌ、とＶａｎｄｅｒＥｂ、Ａ、Ｊ、　（１９７３ ，Ｖｉｒｏｌ、　５２．４５６−４６７）のリン酸カルシウム法によるトラスフ ェウションに用いた。４時間後、グリセロール↑刺激し、その後７２時間たって 、該細胞をＴ７５フラスコに一分取するが、このフラスコには、１　ｍｌ当だり 　０４１８を２００μＩ含有する完全培地を入れておく。培地を含む０４１８で 細胞を３〜４日ごとに洗浄し、集密的生長が完成するまで１４〜２１日間分裂さ せる。

ＮＩＨ３Ｔ３細胞は牛胎児血清１０％（ｖ／ｖ　）、グルタミン、ペニシリンお よびストレプトマイシン〒補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅ ａｇｌｅ培地（完全培地）に維持された、 形負転換された細胞および上清は、細胞が集密的生長に達した時、即ち分取後約 ３日後インヒビンの発現を１目定した。細胞溶解物は、約２Ｘ１０７細胞をトリ プシン処理し、ＰＢ８１０−で洗浄し。

５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液１ｒＩＬｌで再懸濁し、−２０°Ｃ〒凍結したも のから調製される。

ＲＮＡを調製するため、細胞（２Ｘ１０７）を遠心分離により集め、９５℃下〒 ２ｍｌの２ＸＮＥＴＳ／フエノール（２ＸＮＥＴＳ＝２００ｍＭＮａＣ１，２ｍ ＭＥＤＴＡ、　２０　ｍＭ　’ｆ’ｒ　ｉｓ　−ＨＣｌ　ｐＨ７，５，１，０％ ＳＤＳ　）にただちに再懸濁した。激しく攪拌した後、混合物は相が遠心分離に より分離する前に室温まで冷却された。

水相はフェノールにより再抽出され、ＲＮＡは最終水相から沈殿されるが、この 時−容量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２容量のエタノールを添加した。

ドライア４２１１１０分後、ＲＮＡを１１，０００，９．１０分、４℃↑遠心分 離しペレット化した。ＲＮＡを水に溶解し、ＤＮＡとｔＲＮＡを全核酸からＬｉ Ｃ１を２．５Ｍま↑添加することによって分離した。該水溶液を４℃−晩装置し 、ＬｉＣｌ−沈殿ＲＮＡ５は、１０分間１１，０００ｇ、４℃下、等容量３　Ｍ 　Ｌ　ｉ　（：　１クツシヨンを通して遠心することにより８分離した。

最終ＲＮＡべｔ／ノット水から再沈殿し、７０％エタノールｆ洗浄し、乾燥し、 滅菌蒸留水和溶解した。

２６０１１ｍの吸光度〒濃没を測定後、ＲＮＡを使用に供するまで一８０℃に貯 蔵した。

ノザーンプロット及びドツトプロット分析をベクターに起因するｍ　ＲＮＡ転写 物の茸とサイズを見積るために用いた。ＲＮＡ（５μｉを’［ｈｏｍａ　Ｓｌ　 ｐ、　Ｓ、＋１９８０、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ Ａ　７７＋５２０１−５２０５に記載されているようなグリオキシレージョン後 、１％アガロースゲゲル分離シタ。

ＲＮＡを直接、２０ＸＳＳＣ存在下ニトロセルロースに移し、室温〒１晩置いた 。次いで、減圧下８０℃〒２時間加熱した。フィルターを４２℃で４時間、５０ ％フォルムアミド、５ｘｓｓｃ、１０ｍＭ酢酸ナトリウムＩ）Ｈ６，５，２５０ μＪｉ１ｍ７−Ｉ　ＤＮＡ　’Ｃ１，０：２％ＰＶＰ２５．０．０２％Ｆｉｃ・ ｏｌ　１４００中でプレハイブリダイズし、次いで、ハイプリダイゼイションを Ａ２℃で１晩行なったが、この時、プ１／ハイブリダイゼーション緩衝液に硫酸 デキストラン１０％まで、および１　ｔ４ＤＮＡプローゾ当た。ｊ）　２Ｘ　１ ０９ｃｐｍを１０６〜１１０７Ｃｐ含む緩衝液中１行なった。Ａｃサブユニット のプローブは７８８〜１１１９塩基（第５図）を含む３６５ｂｐ　ｃＤＮＡ断片 であり％Ｂザブユニットのプローブは５０４〜８７２塩基（第６図）を含む３６ ９　ｂｐ　ｃＤＮＡ断片〒ある。フィルターを６５℃、Ｌ］、Ｉ　Ｘ５ＳＣ，０ ，１％ＳＤＳで洗浄し、次いで−８０“Ｃでオートラジオグラフィーを実施した 。

ゲノムＤＮｋＯ）調製のため、集めた細胞（２×１０７）をＴＨＥバッファー（ １０ｍＭ　’ｌ’ｒｉｓ　ＨＣＬＡ　ＯＯｍＭＮａＣ，１，２ｍｋｌ　ＥＤＴＡ 、ｐＨ８，２）および最終濃度０．５％まで添加され１こＳＤＳに再懸濁された 。混合後、プロティナーゼＫを２０μｉｍｌ’添加し、３７°Ｃ１１晩インキニ ーベートした。ＤＮＡを等容量のフェノールで２度各々１５分間抽出し、次い１ １度クロロフォルム：イソアミルアルコール（２！：１）−１％抽出した。

ＤＮＡを最終水相からエタノール沈殿により回収、巻き取り、次いでＴＥ　（１ ０ｍＭＴｒｉｓＨＣ１，１ｍＭＥＤＴＡ　ｐＨ７，５）に再溶解した。熱処理さ れたＲＮａｓｅを４００μｇｍ／１添加し、６７℃、３０分間インキュベートし た後、ＳＤＳを０．５％ま↑添加した。プロテイナーゼＫを２０　Ａｇｖｔｌ− ’ま〒添加し、インキュベーションを更に２時間続行した。ＤＮＡを２度のフェ ノール処理と１度のクロロフォルム：インアミルアルコール処理の後、エタノー ル沈殿により分離した。巻き取ったＤＮＡを利用に供するま一’ＱＴＥに溶解し 、４℃に保存した。

サザーンプロット分析はベクターなゲノム内への組込みを検知するため用いられ たが、それは、組込まれたコピーの数を見積る能力もある。ＤＮＡ（１０μｙ） をＤＮＡ１μｙ当たり８〜１０単位の酵素フ消化するが、この時、通常、提供者 の推奨する条件下〒６７℃、１晩笑施される。試料をフエノ−ル抽出し、エタノ ール〒沈殿され、ＡＯｍＭＴｒｉｓアセテート、１７ｒｔＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ ８，２を含有する０、７％アガロースゲルで電気泳動される、ＵＶ下、可視化の 後、変成および中和し、ＤＮＡはサザーン（１９７５）によって述べられている ように通常２０×ＳＳＣ存在下のニトロセルロースへゲルカラ移される。−晩移 行の後、フィルターを５ＸＳＳＣで軽く洗浄し、８０℃、２時間、減圧下加熱す る。

プレハイブリダイゼーションを最低４時間、５０％フォルムアミド、Ｉ　Ｘ　Ｄ ｅｎｈａ　ｒｄ　ｔ　Ｓｔ　２５１４　ｍｌ−’ＤＮＡ、５ＸＳＳＰＥ（ＳＳＰ Ｅ；ｉＢＯｍＭＮａＣｌ、ｔＯｍＭＮａＨ２ＰＯ４，ｉｍＭＥＤＴＡ）中で実施 し、ハイブリダイゼーションを４２°Ｃ１１晩、１０％硫酸デキストリンおよび １０６〜１０７ｃｐｍプローブ（１μｙＤＮＡ当たりの比活性２Ｘ　ｉ　Ｄ９ｃ ｐｍ　）を含有するプレハイブリダイゼーションノ々ソファ中で実施する。

プローブは上述したものである。フィルターを６５℃、０．ｌＸ５ＳＣ５０，１ ％ＳＤＳで洗浄し、−８０℃↑オートラジオグラフィーを行なった。

ＲＩＡはほとんどＭｃＬａｃｈ　ｔａｎ、　Ｒ，１，ｅｔａｌ　（１９８６；　 Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　４６，１７５−１８５　）に記載 されているが、トレーサーとして■１２５−ラベル化３１　ＫＤ牛インヒビンを 使用するものフある。

この検定法は、変成サブユニットエリむしろ形態的に正確なインヒビ７あるいは サブユニットを検知する。使用される標準は、ＨＰ　Ｌ　Ｃ精製３ｉＫＤインヒ ビンで、０．４０Ｂ／Ｉ比を有し、１．００Ｂ／Ｉ比を有するｂＦＦと対比され る。

分散されたラットの脳下垂体細胞培養は、国際特許公開ＷＯ３６１０００７８に 記載されているように、羊の網状組織液がスタンダードに用いられＴこ。

全ての場合、正しいＤＮＡがゲノム中に観察され、形質転換させるベクターの組 込みを示していた。

またｍＲＮＡはこれらの細胞中〒生成されていた。

しかしながら、組込みコピー数、ｍＲＮＡレベルおよび発現蛋白質間の明確な関 係はなかった。

一方、新しい細胞培養培地はバイオアッセイおよびＲＩＡにおいてインヒビ７を 検知するのは不可能であった、ベクターｐＢＴＡｊ１９により形質転換された細 胞からの経過培地はノ々イオアツセイにおいて、ＦＳ）（抑制を低ｌ／ベルに与 えるが、これは、非特異的抑制効果（第６図）と思われる。

対照的に、ｐＩ３ＴＡル１７のＡサブユニット遺伝子は、発現シ、バイオアッセ イおよびＲＩＡ両者に検知可能な物質を与えるように分泌される。この拳ハブｌ ／ゾロＡサブユニット遺伝子単独からの１種又は複数の蛋白質はインヒビン様生 物活性を有していると思われるが、以前は単にＡＢまたはＡｃｌ３のサブユニッ トの組合せをインヒビ７として分類していたもの〒ある。

生産された免疫活性物質の量は、培養培地の細胞数に比例する〔Ｂサブユニット プロット〕。しかしながら、宿主細胞自体が低レベルのＢサシユニットを作って いるということを今だ除外することはフきない。トランスフェクション３からの 試料の１３／Ｉ比は天然のインヒビ７と接近しているので、この組換え物質は生 物活性が要請されているところ、例えば避妊剤の開発など、どこへでも、天然の インヒビ７と代替可能〒あることを示している。生物活性物質はまた。　ｐＢ’ ｌ”Ａ４１７と４１８によるコトランスフエウションされた細胞からの上清また は各々のベクターを別々にトランスフェクションした後混合された集合体からの 上清に見もれるがインヒビ７の再構成を表わしている。

表６　真核細胞における発現の概要 実験例 形質転換された　１　２　６ ベク’　ＢＩＢＩＢＩ ｐＢＴＡ４１７　２．０４　３１．２ ＊ ｐＢＴＡ１７　１，３　６５，３　２．７　＆０．７２．６　１０２．５　１４ ．３　３４．３１５．４３１．２ １７．５　３４．２ ｐＢＴＡ４１７　２．８　４６．９ ＋ ｐＢＴＡ、ｉｉ８　３．０　４１．ｄ ｐＢＴＡ１８　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤｐＢＴＡ１９　１．６　ＮＤ　１．２　 ＮＤＭＥＤＩＵＭ　ＮＤ　ＮＤＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤデータはノぐイオアツセ イ（Ｂ　）−ｉたはＲＩＡ（Ｉ）において決定されたが、単位／ｍｌＡ培養土清 ）として与えている。

ＮＤ：検知以下のレベルをふす。

傘：　純化細胞コロニーから得られたデータを示す。残りのものは、細胞を混合 した集合体を含有する形質転換上清から得られたものである。

＋：各々のベクターを独豆に形質転換し、その後それらを混合した培養細胞を示 す。

／：各々のベクターを同時にコトランヌフエウションした細胞を示す〇 ヒト、牛および他の動物種（実施例７）間の類似性から、上述と類似の構成はヒ トを含む任意の種から生物活性のある分子を発現するために用いられることがフ きる。しかしながら、インヒビン蛋白質またはインヒビン様蛋白質またはにプチ ドの発現は上述の実施例に限定されない。

本発明における配列の発現は、従来公知の前核細胞および真核細胞に用いられて いる多くの異なる発現に対しても適用マきるもの〒ある。」３４、同書第８２頁 ２０行目の「４」を「７」と補正する。

３５、同、書箱８２頁２３行目の「６」を「７」と補正する。

３６、同書第８３頁６行目の「６」を「７」と補正する０ ６７、同書第８４頁１６行目の「７」を「８」と補正する。

６８、同店第８５頁６行目の「７」を「８」と補正する。

６９、同書第８５頁２４行目の「８」を「９」と補正する。

４０、同書第８６頁１行目の「８」を「９」と補正する・ ４１、同書第８８頁２４行目の「９」を「１０」と補正する。

４２、同書第８９頁２行目の「９」を「１０」と補正する０・ ４６、同書第９０頁８行目の「１０」を「１１」と、同行「６」を「７」と補正 する。

Ａ４１回書第９０頁１０行目の「１０」を「１１」と補正する＠ Ａ５．　同書第９１頁末行に下記を補正する。

ｐＢＴＡ３０３．ｐＢＴＡ３０　Ｂ、ｐＢＴＡ３０９　ｂ　ヨびｐＢＴＡ４７２ からのｐＵＣ−由来短鎖融合蛋白質の優れた免疫原性がＢＴＡｄ２７様由来の封 入由来らの牛Ａｃ生成物で免疫された羊の抗体を中和することにより得られるも のによって例示される。

コ０）蛋白質は封入体をＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８，０（８Ｍ尿素および０，１ ＭＤＴＴ含有）、３７℃、２時間溶解することにより調製される。この溶液は氷 酢酸を添加してｐＨ５にし、次いで、遠心し、その後濃縮し、０．１Ｍ酢酸ｆセ ファデックス×０５０または０７５カラムでクロマトグラフィーを実施した。組 換え蛋白を含む画分はＳＤＳ　ｐＡＧＥにより固定され、プールされ、逆相クロ マトグラフィーカラム（■ｙｄａｃＣ４またはＤｙ　ｎａｍａ　ｘ　Ｃ１８）で 実施した、各々の場合、蛋白質は０．１％ＴＩ”Ａ含有アセトニトリル勾配を用 いてカラムから溶出した。

溶出された蛋白質は、再びＳＤＳ　−１）ＡＧＥ　？固定され、必要な画分なプ ール、濃縮し、１〜１０　ｍｇ／ｍｌとし、？ＢＳ〒透析した。蛋白質の固定は ＮＨ２−末端配列決定法により確認された。

４頭の羊は３００μｇＫＬＨで免疫され、等数の羊ハＡＣ融合蛋白質６０μｇ、 ｉ−、Ｃび３００　ｔｔｉ　ＫＬＨ結合Ａｃを含む混ｉ４（１０７：　１モル比 ）をグルタル７′ルデヒド法（Ｂｒｉａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５ｉｂｉ ｄ）により各々免反された〇 第１次免疫感体は０臼ではフロインドの完全アジュパントフ、ブースターは２１ 日と５０日にマＡ／−１−／ｌ／　Ｂｖｌａｒｃｏｌ　）　５２　：モンタニド （Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）８８８（９：１）で実施した。２６日の血清は、ＲＩＡ により天然の牛３１ＫＤＩ−レーサーを認識する能力をテストし、その結果な％ （カウント）で表１２に示した。

表１２　３１ＫＤ）レーサーに対する血清の結合１：４００　１：２０００　１ ：１０．０００１　ＫＬＨ００，４０，５ ２ＫＬＨＯ，２０，５０，７ ３ＫＬＨＯ，３０，４０，６ ４ＫＬＨＯ０２０−６０・６ ５　ｂＡｃ　１５．４　９．１　２．８６　ｂＡｃ　３６．８　４６．８　２３ ．４７　ｂＡｃ　２８．８　１９．１　５．９８　ｂＡｃ　３９．５　２３．２ 　６．５９　ｂＡｃ　−ＫＬＨ１０，５５，２１，８１０ｂＡｃ　−ＫＬＨ３６ ，１４４，８２１，０１１ｂＡｃ　−ＫＬＨ７，４６，１１，７１２ｂＡｃ　− ＫＬＨ１１，５４，８１，７天然３１ＫＤインヒビンへの意味ある結合は、形態 的に正しいインヒビンを認識する抗体が作られたことを示している。更に、羊６ ，７，８および１０からの抗体を主体内、６イオアツセイでテストした力ζそれ らはインヒビン生物活性を中和した。

羊５〜１２は混成されない免疫原（モンタニ１８８８：マルコール５２中に１０ ０μｇ）で９３日に再免疫し、次い〒排卵応答を調べるため、プロゲストーゲン 発情周期同時施療を実施した。組換えインヒビンを受容しているこれらのグルー プはＫＬＨ−免疫コントロールまたは非処理コントロール（Ｃ１〜Ｃ５：表１３ ）より顕著に高い排卵率を有し、単独で、またはキャリア分子との混成されたも のを使いる時、免疫原としての短鎖融合蛋白質の優れた特性が確認され、インヒ ビンの単独サブユニットに対する抗体が生体内および生体外でインヒビンの生物 活性を中和することが可能なことが証明された。１頭（９）は腹腔鏡で、オパレ クトマイズド（ｏｖａｒｅｃｔｍｉ　５ｔｄ）Ｌ、ていることが分かった。

表１３　組換えインヒビンサブユニットの免疫に対する排卵率応答 Ｃ５１９０ＶＸ これらの方法がヒトおよび家畜、例えば、ブタ、犬、馬、牛、羊やヤイなどに、 ｐＢＴＡ３０３　、　ｐＢＴＡ３０８　、　ｐＢＴＡ３０９　、およびｐＢＴＡ ４７２からの蛋白白質を単独あるいは混合して用いることがで・きることは明白 である。」 ４６、同書第９２頁１行目の「２１」を「２２」　と補正する。

■、第１２７５−Ｈを別紙の通り補正し、第１６図から第２２図を別紙の通り追 加補正する。

幻 （ご 、＼ 」」 ｐ、’ｉ！；ＴＡ　４１．Ｓ’　＋ｔＡ・ｉｊ　ｂ　９へ゛Ｐ註−匹ｏ（３す７ 五ニー７トリ端□□□−＝□ Ｂと乞工Ｈ１ｎｄＩ工Ｉ　乙雪エエ ５ａｕ３ＡＩ　Ｃ１ａ工　）ｌａｅｘ工Ｈａｅエエ　Ｃ１ａＴ　５ａｕ３Ａ工 １頁の続き ９１ｎｔ、ＣＩ、４　識別記号　庁内整理番号で失権主張　０１９８坪９月６日 ［相］オーストラリア（ＡＵ）■ＰＨ２３２０［相］１９８５？１１０月２９日 ［相］オーストラリア（ＡＵ）■ＰＨ３１５７０１９８昨１２月円日［相］オー ストラリア（ＡＵ）■ＰＨ３９６０■’ｙ１９８ジ「１２月２０日［相］オース トラリア（ＡＵ）■ＰＨ３９６１杏　明　者　スチワート、アンドリュー・ジ　 オーストラリア国ヨージ　ル、ロビン・ヘッド ６　明　者　ロバートソン、デイヴイット・　オーストラリア国マーク　−、フ ロリート・コ 杏　明　者　デ・クレッツアー、デイヴイッ　オーストラリア国ド・モリツツ　 ラ・ストリート　Ｉ ＪＪ願人　モナシュ・ユニバージティー　オーストラリア国し） 」　願　人　プリンス・ヘンリーズ・ホスピ　オーストラリア国タル　ルダ・ロ ード　（届 」願人　セント・ヴインセンツ・インス　オーストラリア国テイチュート・オブ ・メゾイカ　リア・パーク　４１１８衣昭６２−５０１６８０　（４７）ニュー ・サウス・ウェールズ　２０７人ピンブＪ・ロード　２６ ヴイクトリア　３１５０、グレン・ウェイヴアーリコ ヴイクトリア　３１２７、サリー・ヒルズ、リューし つ°イクトリア　３１６本　クレイトン　（番地なヴイクトリア　３００屯メル ボルン、セント・キー地なし） ヴイクトリア　３０６飄フイツツロイ、ヴイクト

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．インヒビンの全部、１部、類縁体又は前駆体のアミノ酸配列のコード配列と して作用する第１のポリヌクレオチド配列、該第１の配列と交雑するポリヌクレ オチド配列、単一の又は複数の塩基置換、除去、挿入および転換を含めての前記 第１の配列又は交雑配列への変異関連のポリヌクレオチド配列、又はインヒビン であるポリペプチド又はインヒビンと同様の免疫学的又は生物学的活性を有する ポリペプチドの全部、１部、類縁体、相同体又は前駆体を発現の除にコードする ポリヌクレオチド配列から成る、ポリヌクレオチド配列。 ２．実質的に純粋な形である、前記請求の範囲第１項のポリヌクレオチド配列。 ３．発現の際にインヒビンの４３ｋＤサブユニットをコードする、前記請求の範 囲第１又は第２項のポリヌクレオチド配列。 ４．インヒビンの２０ｋＤサブユニットをコードする、前記請求の範囲第１又は 第２項のポリヌクレオチド配列。 ５．インヒビンの１５ｋＤサブユニットをコードする、前記請求の範囲第１又は 第２項に記載のポリヌクレオチド配列。 ６．該インヒビンがヒト又はウシインヒビンから選択したものである、前記請求 の範囲第１〜４項のいずれかのポリヌクレオチド配列。 ７．第５図の−６０から１６６のアミノ酸配列、第５図の−１０から１６６のア ミノ酸配列、第７図の１から１６６のアミノ酸配列、第７図のー６１から１７１ のアミノ酸配列、第７図の−１０から１．７１のアミノ酸配列、第７図の１から １７１のアミノ酸配列又はその生物学的等価体をコードする、前記請求の範囲第 １又は第２項のポリヌクレオチド配列。 ８．添付の第５，６，７および８図のいずれかに関連して実質的に本文中に記載 のＤＮＡ配列。 ９．１個又はそれ以上のＤＮＡ又はＲＮＡ配列を用意し、そしてそのどちらの配 列がその様な活性を有するたん白質の１部、全部又は前駆体をコードすることが 知られているＤＮＡ又はＲＮＡ配列と交雑するかを決定することから成るか、あ るいはインヒビン又はその部分に対する抗血清を用意し、そしてインヒビンの部 分又は全部を発現する宿主−ベクター組合わせ体を同定することから成る、イン ヒビンであるか又はインヒビンと同様の免疫学的又は生物学的活性を有するたん 白質の全部、１部又は前駆体をコードするＲＮＡ又はＤＮＡ配列を選択する方法 。 １０．該複数の配列がウシ又はヒトゲノムＤＮＡである、前記請求の範囲第９項 の方法。 １１．（ａ）その１個又はそれ以上がインヒビンの全部、１部、類縁体、相同体 文は前駆体から成るアミノ酸配列あるいはインヒビンと同様の免疫学的又は生物 学的活性を有するポリペプチドをコードする、複数のＲＮＡ配列を用意し、（ｂ ）該ＲＮＡ配列に相当するＤＮＡ配列を合成してＤＮＡ配列のライプラリーを形 成し、 （ｃ）該ＤＮＡ配列を自律複製クローニングベクター中に挿入して組換えクロー ニングベクターを形成し、（ｄ）前記工程（ｃ）の組換えクローニングベクター で宿主細胞を形質転換し、 （ｅ）その挿入されたＤＮＡ配列がインヒビンの全部、１部、類縁体、相同体又 は前駆体、あるいは類似のポリペプチドをコードする、形質転換宿主細胞を選択 し、そして（ｆ）前記工程（ｅ）の該形質転換宿主のクローニングベクター中に 含有される、挿入ＤＮＡ配列を同定する、工程から成る前記請求の範囲第９又は 第１０項の方法。 １２．該複数のＲＮＡ配列がヒト又はウシＲＮＡ配列から成る、前記請求の範囲 第１１項の方法。 １３．実質的に実施例に関連して前記本文記載の、インヒビンであるたん白質か あるいはインヒビンと同様の免疫学的又は生物学的活性を有するたん白質の全部 、１部又は前駆体をコードするＲＮＡ又はＤＮＡ配列を選択する方法。 １４．たん白質インヒビン又はそのサブユニットあるいは類似の免疫学的又は生 物学的活性を有するたん白質の少なくとも１部のアミノ酸配列のコード配列とし て作用するポリヌクレオチド配列、又は該配列と交雑する配列、および標識体か ら成るインヒビン様ＲＮＡ又はＤＮＡの固定のために使用可能なプローブ。 １５．該標識体が放射性標識体である、前記請求の範囲第１４項のプローブ。 １６．該ポリヌクレオチド配列が下記から選択されたものである、前記請求の範 囲第１４又は１５項のプローブ。 【配列があります】 １７．工程（ｅ）に前記請求の範囲第１６項のプローブの少なくとも１つを使用 する、前記請求の範囲第１１項の方法。 １８．インヒビンの全部、１部、類縁体、相同体又は前駆体のアミノ酸配列をコ ードする第１のＤＮＡ配列、該第１の配列と交雑するＤＮＡ配列、単一の又は複 数の塩基置換除去、付加又は転換を含めての前記第１のＤＮＡ配列又は交雑配列 への変異関連のＤＮＡ配列、又はインヒビンであるポリペプチド又はインヒビン と同様の免疫学的又は生物学的活性を有するポリペプチドの全部、１部、前駆体 、類縁体又は相同体を発現の際にコードするＤＮＡ配列から成る挿入ＤＮＡ、お よびベクターＤＮＡを特徴とする組換えＤＮＡ分子。 １９．該ベクターＤＮＡがプラスミド、ビールス又はバクテリオフアージＤＮＡ から成るものである、前記請求の範囲第１８項の組換えＤＮＡ分子。 ２０．ｐＢＲ３２２，ｐＵＲ２９０，ｐＵＲ２９１，ｐＵＲ２９２，ＰＢＴＡ２ ８６，ｐＵＣ７，ｐＵＣ８，ｐＵＣ９，ｐＵＣ１３，ｐｔｒｐＬ１，ｐＷＴ１１ １，ｐＷＴ１２１又はｐＷＴ１３１から選択したプラスミドから成り、かつ該プ ラスミド中には前記挿入ＤＮＡが挿入してあるものである、前記請求の範囲第１ ８項の組換えＤＮＡ分子。 ２１．発現調節配列が該挿入ＤＮＡと有効に結合している、前記請求の範囲第１ ８，１９又は２０項の組換えＤＮＡ分子。 ２２．該発現調節配列がＥ．コリのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、ｔｒｐオペロ ン、バクテリオフアージλの左側プロモーター又はモロニー白血病ビールスの長 鎖末端くり返し単位から選択したものである、前記請求の範囲第２１項の組換え ＤＮＡ分子。 ２３．該発現調節配列がプロモーターと翻訳開始シグナルとから成る、前記請求 の範囲第２１又は２１項の組換えＤＮＡ分子。 ２４．本文中記載のプラスミドであって、ｐＢＴＡ２２，ｐＢＴＡ２３，ｐＢＴ Ａ２８，ｐＢＡ２９，ｐＢＴＡ３０，ｐＢＴＡ２９０，ＰＢＴＡ２９２−ｐＢＴ Ａ３０５と命名されたプラスミドから選択された組換えＤＮＡ分子。 ２５．本文中の実施例および（または）本文添付の図面に実質的に記載されたも のである、組換えＤＮＡ分子。 ２６．インヒビンであるか又はインヒビンと同様の免疫学的又は生物学的活性を 有するポリペプチドの全部、１部、類縁体、相同体又は前駆体のアミノ酸配列に 相当するがあるいは発現の際にこれをコードする第１のＤＮＡ配列、該第１の配 列と交雑するＤＮＡ配列、又は単一の又は複数の塩基置換、除去、転換および挿 入を含めての前記第１のＤＮＡ配列又は交雑配列への変異関連の配列から成る挿 入ＥＮＡを用意し、次いでこの挿入ＤＮＡをクローニングベクター中に導入する ことから成る、組換えＤＮＡ分子の製造方法。 ２７．該クローニングベクターが細菌性プラスミド、バクテリオファージ又は生 体外文はあらゆる生物体内において真核細胞中で複製可能なプラスミド又はビー ルスから選択したものである、前記請求の範囲第２６項の方法。 ２８．該挿入ＤＮＡを発現調節配列を持つた正しい読み枠中に導入するものであ る、前記請求の範囲第２６又は２７項の方法。 ２９．該挿入ＤＮＡをＥ．コリのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子中に導入す、前記 請求の範囲第２８項の方法。 ３０．前記請求の範囲第１８〜２５項のいずれかの組換えＤＮＡ分子で形質転換 したものである、形質転換宿主。 ３１．該宿主が細菌細胞、バクテリオフアージ、酵母、真菌類、脊稚動物を含め ての真核生物細胞および植物細胞から選択したものであわ、前記請求の範囲第１ ７〜２０項のいずれか付けかえた、前記請求の範囲第２１項の形質転換宿主。 ３２．ポリペプチドインヒビン又はインヒビンと同様の免疫学的又は生物学的活 性を有するポリペプチドの全部、１部、類似体、相同体又は前駆体を発現可能な ものである、前記請求の範囲第３０又は３１項の形質転換宿主。 ３３．インヒビンの４３ｋＤ，２０ｋＤ又は１５ｋＤサブユニツトを非グリコシ ル化形として発現可能なものである、前記請求の範囲第３２項の宿主。 ３４．該インヒビンの４３ｋＤ，２０ｋＤおよび１５ｋＤサブユニツトが配列に おいてヒト又はウシ型インヒビンに相当するものである、前記請求の範囲第３３ 項の形質転換宿主。 ３５．第５図の−６０から１６６のアミノ酸配列、第５図の−１０から１６６の アミノ酸配列、第７図の１から１６６のアミノ酸配列、第７図の−６１から１７ １のアミノ酸配列、第７図の−１０から１７１のアミノ酸配列、第７図の１から １７１のアミノ酸配列又はその生物学的等価体を発現可能である、前記請求の範 囲第３０又は３１項の形質転換宿主。 ３６．ＡＴＣＣ６７０５４，ＡＴＣＣ６７０５５，ＡＴＣＣ６７０５６，ＡＴＣ Ｃ６７０５７，ＡＴＣＣ６７０５８又はＡＴＣＣ６７０５９と命名された、形質 転換微生物の培養体。 ３７．適当な宿主を用意し、そして該宿主に前記請求の範囲第１８〜２５項のい ずれかの組み変えＤＮＡ分子を正しい読み枠中に導入することから成る、インヒ ビン又は同様の生物学的又は免疫学的活性を有するポリペプチドの全部、１部、 前駆体、類縁体又は相同体を産生可能な様にした宿主の形質転換方法。 ３８．該宿主が細菌細胞、酵母、バクテリオフアージ、脊稚動物を含めての真核 生物細胞および植物細胞から選択したものである、前記請求の範囲第３７項の方 法。 ３９．インヒビン又に同様な免疫学的又は生物学的活性を有するポリペプチドの 全部、１部、類縁体、相同体又は前駆体から成る、前記請求の範囲第３０〜３６ 項のいずれかの形質転換宿主の発現生成物。 ４０．実質的に純粋な形の前記請求の範囲第３９項の発現生成物。 ４１．宿主と相同的な第１のポリペプチド配列と、インヒビン又に同様な免疫学 的又は生物学的活性を有するポリペプチドの全部、１部、類縁体、相同体又は前 駆体のアミノ酸配列である第２のポリペプチド配列とから成る、前記請求の範囲 第３９または４０項の発現生成物。 ４２．該第１のアミノ酸配列がβ−ガラクトシダーゼの１部又は全部でありそし て宿主細胞がた、コリである前記請求の範囲第４１項の発現生成物。 ４３．インヒビンの４３ｋＤ，２０ｋＤ又は１５ｋＤサブユニット、インヒビン の４３ｋＤおよび１５ｋＤサブユニットの組合わせ、インヒビンの２０ｋＤおよ び１５ｋＤサブユニットの組合わせあるいはその生物学的等価体を含有する、前 記請求の範囲第４０，４１又は４２項の発現生成物。 ４４．該インヒビンの４３ｋＤ，２０ｋＤ又は１５ｋＤサブユニットが配列にお いてウシ又はヒトインヒビンのそれに相当するものである、前記請求の範囲第４ ３項の発現生成物。 ４５．第５図の−６０から１６６のアミノ酸配列、第５図の−１０から１６６の アミノ酸配列、第５図の１から１６６のアミノ酸配列、第７図の−６１から１７ １のアミノ酸配列、第７図の−１０から１７１のアミノ酸配列、第７図の１から １７１のアミノ酸配列又はその生物学的等価体を含有する、前記請求の範囲第３ ８，３９又は４０項の発現生成物。 ４６．インヒビン又は同様の免疫学的又は生物学的活性を有するポリペプチドの 全部、１部、類似体、相同体又は前駆体から成るポリペプチドを生合成する方法 であって、インヒビンの全部、１部、類似体、相同体又は前駆体のアミノ酸配列 に相当するかあるいは発現の際にこれとコードする第１のＤＮＡ配列、該第１の 配列と交雑するＤＮＡ配列、単一の又は複数の塩基置換、転換、除去および挿入 を含めての前記第１の配列又は交雑配列への変異関連のＤＮＡ配列、又はインヒ ビン又は同様の免疫学的又は生物学的活性を有するポリペプチドの全部、１部、 類似体、相同外文は前駆体を発現の際にコードするＤＮＡ配列から成る挿入ＤＮ Ａを有することを特徴とする組換えＤＮＡ分子を用意し、 該組換えＤＮＡ分子て宿主を形質転換して、該宿主がインヒビン又はインヒビン に類似の生物学的又は免疫学的活性を有するポリペプチドの全部、１部又は前駆 体から成るポリペプチドを含有するたん白質生成物を発現可能である様にし、該 宿主を培養して発現生成物を生成させ、そして該たん白質生成物を採取すること からなる、該方法。 ４７．該たん白質生成物が封入体として生成される、前記請求の範囲第４６項の 方法。 ４８．該たん白質生成物がウシ又はヒトインヒビンの４３ｋＤ，２０ｋＤ又は１ ５ｋＤサブユニット又はその実質的な部分から成るものである、前記請求の範囲 第４６又は４７項の方法。 ４９．該たん白質生成物が第５図の−６０から１６６のアミノ酸配列、第５図の −１０から１６６のアミノ酸配列、第７図の１から１６６のアミノ酸配列、第７ 図の−１０から１７１のアミノ酸配列、第７図の１から１７１のアミノ酸配列又 はその生物学的等価体から成るものである、前記請求の範囲第４６又は４７項の 方法。 ５０．インヒビンの全部、１部．類縁体、相同体又は前駆体から成るポリペプチ ド又は同様の免疫学的又は生物学的活性を有するポリペプチドてある、前記請求 の範囲第４６〜４９項のいずれかの方法による生成物。 ５１．インヒビン又は同様の免疫学的又は生物学的活性を有するポリペプチドの 全部、１部、類縁体、相同体又は前駆体から成るポリペプチドである、組換えＤ ＮＡ技術により生成されたポリペプチド。 ５２．ウシ又はヒトインヒビンの４３ｋＤ，２０ｋＤ又は１５ｋＤサブユニット 又はその実質的な部分から成る、前記請求の範囲第５１項のポリペプチド。 ５４．前記請求の範囲第３９〜４５項のいずれかの発現生成物又は前記訴求の範 囲第５１〜５３項のいずれかのポリペプチドを、薬学的に許容される希釈剤又は 担体との混合物の形で含有してなる、薬剤組成物。 ５５．経口投与型、注射剤型又は徐放性製剤型である、前記請求の範囲第５４項 の薬剤組成物。 ５６．インヒビンの少なくとも１部のアミノ酸配列を有しかつインヒビン分子又 はその一部に帰する免疫学的又は生物学的活性を有するポリペプチドから成る合 成ペプチド。 ５７．実質的に純粋な形の、前記請求の範囲第５６項の合成ペプチド。 ５８．下記式の配列および所望によつてはこれにカルボキシル−又はアミノ−末 端テロシン残基を付加して成る、前記請求の範囲第５６又は５７項の合成ペプチ ド。 【配列があります】 ５９．本文添付の第５，６，７又は８図に記載の配列の全部又は１部に相当する アミノ酸配列を有する、前記請求の範囲第５６又は５７項の合成ペプチド。 ６０．インヒビン作用薬又は拮抗薬としての用途又は生殖腺機能又は生殖生理機 能を調節する抗原応答を誘発するための用途に使用する、前記請求の範囲第５６ 〜５９項のいずれかの合成ペプチド。 ６１．前記請求の範囲第３９〜４５項のいずれかに記載の発現生成物又は前記第 ５１〜５３項のいずれかに記載のポリペプチド、又は前記第５６〜５９項のいず れかに記載の合成ペプチドを、脊稚動物に投与することから成る、生殖腺機能又 は生殖生理機能を調節する方法。 ６２．前記請求の範囲第３９〜４５項のいずれかの発現生成物、又は前記請求の 範囲第５１〜５３項のいずれかのポリペプチド、又は前記請求の範囲第５６〜５ ９項のいずれかの合成ペプチドの用途であって、該生成物、ポリペプチド又は合 成ペプチドに対する抗体を生起させるように脊椎動物を免疫学的に挑発すること から成る前記用途。 ６３．前記請求の範囲第６２項に従った脊稚動物の免疫学的挑発の結果として生 成された抗体調製物。 ６４．実施例および（または）添付図面について実質的に本文記載の、インヒビ ン又はこれと同様の免疫学的又は生物学的活性を有するポリペプチドの全部、１ 部、類似体、相同体又は前駆体から成る発現生成物。 ６５．実施例および（または）添付図面について実質的に本文記載の、インヒビ ンであるか又はインヒビンと同様の免疫学的又は生物学的活性を有するポリペプ チドの全部、１部、類縁体、相同体又は前駆体に相当するポリペプチドを発現可 能な形質転換宿主。 ６６．前記請求の範囲第３９〜４５又は５１〜５３項のいずれかの組換えインヒ ビン又はその部分、類縁体、相同体又は前駆体、あるいは前記請求の範囲第５６ 〜５９項のいずれかの合成ペプチドの、診断剤又は医薬としての用途。 ６７．前記請求の範囲第３９〜４５又は５１〜５３項のいずれかの組換えインヒ ビン又はその部分、類縁体、相同体又は前駆体、あるいは前記請求の範囲第５６ 〜５９項のいずれかの合成ペプチドの、脊椎動物における避妊薬としての用途。 ６８．前記請求の範囲第６３項の抗体調製物を脊稚動物に投与することによつて 脊椎動物における生殖能力を増強せしめることである、該抗体調製物の用途。 ６９．脊稚動物をその内因性インヒビンに対して免疫してその生殖能力を増強さ せることである、前記請求の範囲第３９〜４５又は５１および５３項のいずれか の組換えインヒビン又はその部分、類似体、相同体又は前駆体又は前記請求の範 囲第５１および５９項のいずれかの合成ペプチドの用途。 ７０．脊椎動物において、その性的成熟までの期間を短縮しあるいは非発情期の 時期を短縮するか又は全くなくするためのものである、前記請求の範囲第３９〜 ４５又は５１および５３のいずれかの組換えインヒビン又はその部分、類縁体、 相同体又に前駆体、又は前記請求の範囲第５１および５９項のいずれかの合成ペ プチドの用途。 ７１．脊椎動物において、その繁殖能抑制が望ましい場合にその非発情期を誘発 させるためのものである、前記請求の範囲第３９〜４５又は５１および５３のい ずれかの組換えインヒビン又はその部分、類縁体、相同体又は前駆体、又は前記 請求の範囲第５１および５９項のいずれかの合成ペプチドの用途。 ７２．脊椎動物において、ＦＳＨ準位を低下させ又は完全に０にして繁殖能抑制 、ヒトの避妊又は有害生物の撲滅の手段としての避妊効果を達成するためのもの である、前記請求の範囲第３９〜４５又は５１および５３のいずれかの組換えイ ンヒビン又はその部分、類縁体、相同体又は前駆体、又は前記請求の範囲第５１ および５９項のいずれかの合成ペプチドの用途。 ７３．ヒト特に男性における避妊薬としての、前記請求の範囲第３９〜４５又は ５１および５３のいずれかの組換えインヒビン又はその部分、類縁体、相同体又 は前駆体、又は前記請求の範囲５１および５９項のいずれかの合成ペプチドの用 途。 ７４．脊椎動物におけるインヒビン又はその誘導体の準位の診断的測定において そしてその様な診断的測定系用の標準体として有用である、モノクローナルおよ びポリクローナルの両抗体を生成するための反応剤としてのものである、前記請 求の範囲第３９〜４５又は５１および５３のいずれかの組換えインヒビン又はそ の部分、類縁体、相同体又に前駆体、又は前記請求の範囲５１および５９項のい ずれかの合成ペプチドの用途。