JPH02238893A - 甲状腺癌特異抗原に対するモノクローナル抗体 - Google Patents
甲状腺癌特異抗原に対するモノクローナル抗体Info
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- JPH02238893A JPH02238893A JP1293671A JP29367189A JPH02238893A JP H02238893 A JPH02238893 A JP H02238893A JP 1293671 A JP1293671 A JP 1293671A JP 29367189 A JP29367189 A JP 29367189A JP H02238893 A JPH02238893 A JP H02238893A
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- cancer
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ＬｉＬ上二月』遣１
本発明はヒト甲状腺癌組織に特異的に反応するモノクロ
ーナル抗体に関するものである．疋困立鼓オ 従来、甲状腺癌の診断に使用できるモノクローナル抗体
に関する技術は我々が先に開示した特開昭６３−１２２
９５号があるが、染色強度においてまだ弱いという問題
点があった． その他にはわずかに腺癌のｐ断に使用するモノクローナ
ル抗体に関して特開昭６０−１８７６５号があるが、こ
の抗体は腺癌に特異的なものであり、甲状腺癌を他の腺
癌から区別することはできなかった． 本 明が解決しようとする課題 甲状腺腫瘤はその発生部位から一般に、比較的早期に発
見可能な腫瘤である。しかし甲状腺癌と甲状腺の良性腫
瘍とを区別することは臨床医には不可能に近い。生検材
料を得て病理組織切片を顕微鏡下で検討して初めて診断
可能である．病理診断に際しては熟練した甲状腺専門の
病理学者（医師）においてのみ正しい診断が可能であり
、現在わが国にはこの診断を下せる医師は数えるほどし
か存在していない． 課題を解決するための手段 本発明者らは、甲状腺癌特異的モノクロナール抗体につ
いて鋭意検討した結果、簡単な手技で甲状腺癌のみを他
の良性腫瘍や正常甲状腺と区別して染色でき、一般の病
理学者（医師》でも甲状腺癌の診断が簡単に行なえ、本
疾患の治療方針を有効に決定できるモノクロナール抗体
を見出し、本発明を完成した。
ーナル抗体に関するものである．疋困立鼓オ 従来、甲状腺癌の診断に使用できるモノクローナル抗体
に関する技術は我々が先に開示した特開昭６３−１２２
９５号があるが、染色強度においてまだ弱いという問題
点があった． その他にはわずかに腺癌のｐ断に使用するモノクローナ
ル抗体に関して特開昭６０−１８７６５号があるが、こ
の抗体は腺癌に特異的なものであり、甲状腺癌を他の腺
癌から区別することはできなかった． 本 明が解決しようとする課題 甲状腺腫瘤はその発生部位から一般に、比較的早期に発
見可能な腫瘤である。しかし甲状腺癌と甲状腺の良性腫
瘍とを区別することは臨床医には不可能に近い。生検材
料を得て病理組織切片を顕微鏡下で検討して初めて診断
可能である．病理診断に際しては熟練した甲状腺専門の
病理学者（医師）においてのみ正しい診断が可能であり
、現在わが国にはこの診断を下せる医師は数えるほどし
か存在していない． 課題を解決するための手段 本発明者らは、甲状腺癌特異的モノクロナール抗体につ
いて鋭意検討した結果、簡単な手技で甲状腺癌のみを他
の良性腫瘍や正常甲状腺と区別して染色でき、一般の病
理学者（医師》でも甲状腺癌の診断が簡単に行なえ、本
疾患の治療方針を有効に決定できるモノクロナール抗体
を見出し、本発明を完成した。
本発明は、
（１）分子量が約９０万であり、クラスがＩｇＭである
ヒト甲状腺癌特異抗原を認識するモノクローナル抗体 （２》分子量が還元条件で約２５万のタンパク性分を含
むヒト甲状腺癌特異抗原を認識する請求項（１〉記戦の
モノクローナル抗体 （３》微工研条寄第２０６０号として寄託きれたハイブ
リドーマから得られる請求項＜１）記載のモノクロナー
ル抗体 （４）ヒト甲状腺癌細胞をホモジナイズした細砕混合物
を遠心分離し、その上澄を不連続シヨ糖密度勾配液中遠
心分離し、密度勾配の不連続面に集まった分画を採集し
た後、これを連統ショ糖密度勾配液に重層し、超遠心分
離を行なって密度１．１９１ρ〜１．２１０ρの癌特異
的抗原に富んだ分画を分離し、これを抗原として動物を
免疫し、その免疫牌細泊と骨ｍ腫細胞との融合細胞を作
り、目的とする抗体を産生ずるハイプリドーマをスクリ
ーニングし、クローニングを行ない、次いで培養するこ
とにより得られる請求項（１〉記載のモノクローナル抗
体である．本発明につき以下に具体的に説明する．灸疲
灰久１ｌ ヒトの甲状腺癌組織を水冷下で切り刻み、適当な緩衝液
、例えば５％シゴ糖含有トリス塩ｌｖ緩衝液を、ゆっく
り加えながらホモジナイズする，次に約６５０Ｘ ｇか
ら約１，５００Ｘ ｇ ．約１０分間で遠心分離してペ
レットを除いた上澄を１００．０００Ｘ ｇ ，１０分
間程度遠心分離し、核小体、ミトコンドリア等を沈殿せ
しめる。次いで２０％〜２８％、通常は約２５％シヨ糖
含有緩衝液と、４５％〜６０％、通常は約５０％シヨ糖
含有緩衝液の不連統密度勾配上に、上記上澄を重層し、
約６０．０００Ｘ ｇ〜約２００．０００Ｘ ｇ約６０
分間以上、通常は約９０分間遠心分離を行なう．密度勾
配の不連続面に、目的免疫原を含む分画が集まる。この
分画を採取し、約２０％シヨ糖濃度に緩衝液で調製し、
次に緩衝液、例えば、トリス塩酸緩衝液を用いた約２０
％〜約５０％の連続シヨ糖密度勾配に３１７！ｌ．，、
約６０．０００Ｘ ｇ〜約２００． ０００Ｘｇ，４時
間以上遠心分離を行なう．目的とする免疫原は、水溶液
の密度１． １９１ρ〜１．２１０ρの分画にある《糖
濃度としては４１．６％〜４５．２％に換算される）． この分画を集め、塩酸緩衝液で、糖濃度約２０％以下に
なるように薄め． ６０． ＯＯＯＸ ｇ 〜２００，
ＯＯＯＸ ｇ ，約６０分間以上、通常は９０分間遠
心分離を行なうと、本発明の製造に使用する免疫原がペ
レットとして得られる。
ヒト甲状腺癌特異抗原を認識するモノクローナル抗体 （２》分子量が還元条件で約２５万のタンパク性分を含
むヒト甲状腺癌特異抗原を認識する請求項（１〉記戦の
モノクローナル抗体 （３》微工研条寄第２０６０号として寄託きれたハイブ
リドーマから得られる請求項＜１）記載のモノクロナー
ル抗体 （４）ヒト甲状腺癌細胞をホモジナイズした細砕混合物
を遠心分離し、その上澄を不連続シヨ糖密度勾配液中遠
心分離し、密度勾配の不連続面に集まった分画を採集し
た後、これを連統ショ糖密度勾配液に重層し、超遠心分
離を行なって密度１．１９１ρ〜１．２１０ρの癌特異
的抗原に富んだ分画を分離し、これを抗原として動物を
免疫し、その免疫牌細泊と骨ｍ腫細胞との融合細胞を作
り、目的とする抗体を産生ずるハイプリドーマをスクリ
ーニングし、クローニングを行ない、次いで培養するこ
とにより得られる請求項（１〉記載のモノクローナル抗
体である．本発明につき以下に具体的に説明する．灸疲
灰久１ｌ ヒトの甲状腺癌組織を水冷下で切り刻み、適当な緩衝液
、例えば５％シゴ糖含有トリス塩ｌｖ緩衝液を、ゆっく
り加えながらホモジナイズする，次に約６５０Ｘ ｇか
ら約１，５００Ｘ ｇ ．約１０分間で遠心分離してペ
レットを除いた上澄を１００．０００Ｘ ｇ ，１０分
間程度遠心分離し、核小体、ミトコンドリア等を沈殿せ
しめる。次いで２０％〜２８％、通常は約２５％シヨ糖
含有緩衝液と、４５％〜６０％、通常は約５０％シヨ糖
含有緩衝液の不連統密度勾配上に、上記上澄を重層し、
約６０．０００Ｘ ｇ〜約２００．０００Ｘ ｇ約６０
分間以上、通常は約９０分間遠心分離を行なう．密度勾
配の不連続面に、目的免疫原を含む分画が集まる。この
分画を採取し、約２０％シヨ糖濃度に緩衝液で調製し、
次に緩衝液、例えば、トリス塩酸緩衝液を用いた約２０
％〜約５０％の連続シヨ糖密度勾配に３１７！ｌ．，、
約６０．０００Ｘ ｇ〜約２００． ０００Ｘｇ，４時
間以上遠心分離を行なう．目的とする免疫原は、水溶液
の密度１． １９１ρ〜１．２１０ρの分画にある《糖
濃度としては４１．６％〜４５．２％に換算される）． この分画を集め、塩酸緩衝液で、糖濃度約２０％以下に
なるように薄め． ６０． ＯＯＯＸ ｇ 〜２００，
ＯＯＯＸ ｇ ，約６０分間以上、通常は９０分間遠
心分離を行なうと、本発明の製造に使用する免疫原がペ
レットとして得られる。
モノクローナル抗体の調製
まず動物に、適当なアジュバント、例えばフロイント完
全アジュバントと共に本発明の免疫原を数回投与するこ
とにより免疫抗体を産生させる．例えばＢ Ａ Ｌ Ｂ
／Ｃマウスに、本発明免疫原を１匹当り１〜６０尾を腹
腔又は皮下投与し、１〜２週間後に、アジュバントを抜
いた免疫原を１〜２０題静脈投与すれば、動物は免疫さ
れる． 免疫動物から抗体産生ｍ胞を得るには、通常、胛細胞を
利用するのが実際的である．例えば前記ＢＡＬＢ／Ｃマ
ウスの胛臓を、アジュバント抜き免疫原投与の３日後に
摘出し、冷却しなからＲＰＭ Ｉ − １６４０あるい
はＰＢＳＩＩ衝液中で細かく刻み、次いでステンレスメ
ッシュで濾し、前記緩衝液で適当な細胞数に調製する。
全アジュバントと共に本発明の免疫原を数回投与するこ
とにより免疫抗体を産生させる．例えばＢ Ａ Ｌ Ｂ
／Ｃマウスに、本発明免疫原を１匹当り１〜６０尾を腹
腔又は皮下投与し、１〜２週間後に、アジュバントを抜
いた免疫原を１〜２０題静脈投与すれば、動物は免疫さ
れる． 免疫動物から抗体産生ｍ胞を得るには、通常、胛細胞を
利用するのが実際的である．例えば前記ＢＡＬＢ／Ｃマ
ウスの胛臓を、アジュバント抜き免疫原投与の３日後に
摘出し、冷却しなからＲＰＭ Ｉ − １６４０あるい
はＰＢＳＩＩ衝液中で細かく刻み、次いでステンレスメ
ッシュで濾し、前記緩衝液で適当な細胞数に調製する。
細胞融合に使用する骨１１ｉ１腫細胞系は、例えばＫｏ
ｈｌｅｒ等により、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６
２９２〜２９５（１９７６）に記載されている、Ｐ３
−ＮＳ Ｉ／１−Ａｇ４−Ｎ一般にＮＳ−１と呼ばれて
いる）の如き、Ｂ Ａ Ｌ Ｂ／ＣマウスＭＯＰＣ２１
由来の骨髄腫を使用する。この種の細胞系は８−アザグ
アニン耐性であり、ヒボキサンチン・グアニンホスホノ
ボシルトランスフェラーゼを欠くために、ＨＡＴ培地《
ヒボキサンチンーアミノブテリンーチミジン含有培地》
中で生存できない。
ｈｌｅｒ等により、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６
２９２〜２９５（１９７６）に記載されている、Ｐ３
−ＮＳ Ｉ／１−Ａｇ４−Ｎ一般にＮＳ−１と呼ばれて
いる）の如き、Ｂ Ａ Ｌ Ｂ／ＣマウスＭＯＰＣ２１
由来の骨髄腫を使用する。この種の細胞系は８−アザグ
アニン耐性であり、ヒボキサンチン・グアニンホスホノ
ボシルトランスフェラーゼを欠くために、ＨＡＴ培地《
ヒボキサンチンーアミノブテリンーチミジン含有培地》
中で生存できない。
細胞融合剤としては、平均分子１１０００〜６０００の
ポリエチレングリフールがよく、とくにポリエチレング
リフール１５００が望ましい．濃度は分子量に従い４０
％〜５０％が使用され、ポリエチレングリコール１５０
０使用の場合は、Ｒ ＰＭ Ｉ −１６４０で５０％に
調製して使用する．細砲融合は、まず前記の如き抗体産
生細胞と骨髄腫細胞を、Ｒ ＰＭ Ｉ −１６４０で洗
い、前者と後者とを１１−１０７１の比率で混合し、８
００Ｘ ｇ ， ５分間程遠心分離を行ない沈殿させ、
培地をデカン卜する．このペレットに前記細胸融合剤を
１〜２Ｘ１０＠細泊数当り１ｍＱ（３７℃》位１分間に
わたりゆっくり攪拌しながら滴下し、更に攪拌を続けな
がら５〜１０分間かけて、徐々にＲ Ｐ Ｍ Ｉ −
１６４０（３７℃，５〜１０ｍＱ）で懸濁する．４００
〜６００Ｘ ｇ ， ５分間遠心分離後、上澄をデカン
トし、１５％ウマ血清含有Ｒ ＰＭ Ｉ−１６４０で、
細胞数１〜２Ｘ１０’個／ＴＩＩＱに調製する．ハイブ
リドーマの分離は、ＨＡＴ培地中での培養によるのが適
当である（ＨＡＴセレクション）．まず、９６穴の組織
培養用のプレートの各穴に、前記融合の完了した細胞液
を０．１ｄずつ入れ、３７℃、２４時間培養し、０．
１ｍｌｌのＨＡＴ培地を加える．以後、１〜４日間隔で
、半量の培養液をＨＡＴ培地で置換しながら３週間程培
養を続ける．親細胞は全て死滅し、融合細胞のみ生育し
てくるので、以後は１５％ウマ血清添加Ｒ ＰＭ Ｉ−
１６４０で培養し、抗体を産生させる．次にこれらのハ
イプリドーマより、目的とする抗体を産生じているか否
かを、適当な方法例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳ
Ａｓｓａｙ）で調べる． 九体のスクリーニング 甲状腺癌特異的モノクローナル抗体のスクリーニングに
は、ヒト甲状腺癌組織、甲状腺癌のリンパ節転移癌組織
並びにセルライン３Ｔ３（マウス正常細泊由来のセルラ
イン、ＡＴＣＣにＣＣＬ９２として寄託されている）、
セルラインＴ−４７Ｄ（ヒト乳癌より分離確立されたセ
ルライン、ＡＴＣＣにＨＴＢ− １ ３ ３として寄託
されている》及びセルラインＫＡＴＯＩｌ［（ヒト胃癌
より分離確立されたセルライン、新潟大学渡辺教授より
入手）の培養細胞等を前記免疫原の調製法に従い調製し
たものを抗原として用い、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳ
Ａｓｓａｙ）によりスクリーニングする． まず上記抗原を調製し、適当な緩衝液例えば、炭酸ソー
ダ緩衝液（ｐＨ９．５＞で３〜５題／ｍＱに希釈し、９
６穴のマイクロタイタープレートの各穴にコートする。
ポリエチレングリフールがよく、とくにポリエチレング
リフール１５００が望ましい．濃度は分子量に従い４０
％〜５０％が使用され、ポリエチレングリコール１５０
０使用の場合は、Ｒ ＰＭ Ｉ −１６４０で５０％に
調製して使用する．細砲融合は、まず前記の如き抗体産
生細胞と骨髄腫細胞を、Ｒ ＰＭ Ｉ −１６４０で洗
い、前者と後者とを１１−１０７１の比率で混合し、８
００Ｘ ｇ ， ５分間程遠心分離を行ない沈殿させ、
培地をデカン卜する．このペレットに前記細胸融合剤を
１〜２Ｘ１０＠細泊数当り１ｍＱ（３７℃》位１分間に
わたりゆっくり攪拌しながら滴下し、更に攪拌を続けな
がら５〜１０分間かけて、徐々にＲ Ｐ Ｍ Ｉ −
１６４０（３７℃，５〜１０ｍＱ）で懸濁する．４００
〜６００Ｘ ｇ ， ５分間遠心分離後、上澄をデカン
トし、１５％ウマ血清含有Ｒ ＰＭ Ｉ−１６４０で、
細胞数１〜２Ｘ１０’個／ＴＩＩＱに調製する．ハイブ
リドーマの分離は、ＨＡＴ培地中での培養によるのが適
当である（ＨＡＴセレクション）．まず、９６穴の組織
培養用のプレートの各穴に、前記融合の完了した細胞液
を０．１ｄずつ入れ、３７℃、２４時間培養し、０．
１ｍｌｌのＨＡＴ培地を加える．以後、１〜４日間隔で
、半量の培養液をＨＡＴ培地で置換しながら３週間程培
養を続ける．親細胞は全て死滅し、融合細胞のみ生育し
てくるので、以後は１５％ウマ血清添加Ｒ ＰＭ Ｉ−
１６４０で培養し、抗体を産生させる．次にこれらのハ
イプリドーマより、目的とする抗体を産生じているか否
かを、適当な方法例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳ
Ａｓｓａｙ）で調べる． 九体のスクリーニング 甲状腺癌特異的モノクローナル抗体のスクリーニングに
は、ヒト甲状腺癌組織、甲状腺癌のリンパ節転移癌組織
並びにセルライン３Ｔ３（マウス正常細泊由来のセルラ
イン、ＡＴＣＣにＣＣＬ９２として寄託されている）、
セルラインＴ−４７Ｄ（ヒト乳癌より分離確立されたセ
ルライン、ＡＴＣＣにＨＴＢ− １ ３ ３として寄託
されている》及びセルラインＫＡＴＯＩｌ［（ヒト胃癌
より分離確立されたセルライン、新潟大学渡辺教授より
入手）の培養細胞等を前記免疫原の調製法に従い調製し
たものを抗原として用い、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳ
Ａｓｓａｙ）によりスクリーニングする． まず上記抗原を調製し、適当な緩衝液例えば、炭酸ソー
ダ緩衝液（ｐＨ９．５＞で３〜５題／ｍＱに希釈し、９
６穴のマイクロタイタープレートの各穴にコートする。
４℃で一夜放置後、ボリ才キシエチレンソルビタンモノ
ラウレート《ツィーン２０）含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ
）でよく洗い、例えばウマ血清によるプロッキング操作
後、前記ハイプリドーマ培養液を０．１ｍｌずつ加え、
３７℃で５〜６時間放置する． 次に培養液をデカントし、前記ＰＢＳＩＩ！Ｌ衝液でよ
く洗った後、１％ノーマルヤギ血清を加え、３７゜Ｃ，
１時間程静置し、非特異的吸着をプロックする．次いで
前記ＰＢＳ緩衝液で洗浄後、ヤギ抗マウスグロプリンの
べルオキシダーゼ結合ＩｇＧを加え、３７℃，４時間程
インキュベート後、前記ＰＢＳ緩衝液でよく洗う． 基質のオルトフェニレンジアミンジヒドロクロライド及
び過酸化水素含有クエン酸ソーダ緩衝液を加え、３０分
後に吸光度を測定する．抗体を産生じないｍ泊の培養液
をコントロールとして、各穴の吸光度との差により有意
の色素反応を呈したものを陽性とする． 目的とする抗体は、ヒト甲状腺癌及び、甲状腺癌のリン
パ節転移癌由来抗原に陽性であり、セルライン３Ｔ３，
Ｔ−４７Ｄ及びＫＡＴＯＩＩ［由来抗原には陰性のもの
とし、更に病理切片に対する特異性があることを確認し
、それを産生ずるハイプリドーマを得る． 理切片の染色法 病理切片は、ヒト癌組織のホルマリン固定パラフィン切
片より調製する， キシレンにより脱パラフィン後、１００％エタノールよ
り７０％エタノールまで段階的処理を行ない、終りにＰ
ＢＳ緩衝液でよく洗う．切片にヒアルロニダーゼを３７
℃，１時間作用させＰＢＳ緩衝液で洗浄後、トラジロー
ル添加ノーマルヤギ血清で３７℃，１０分間インキユベ
ートする。ＰＢＳ緩衝液で洗浄後、前記スクリーニング
後のモノクローナル抗体を３７℃，２０分間反応させる
．又ＰＢＳ緩衝液で洗浄後、ヤギ抗マウスグロプリンの
べル才キシダーゼ結合１ｇＧフラクションを加え、３０
分間室温でインキユベートする．更にＰＢＳ緩衝液で洗
浄後、過酸化水素を添加したＤＡＢ（３．３’−ジアミ
ノベンジダイン〉飽和ＰＢＳ緩衝液中に１０分間浸漬す
る．ＰＢＳ緩衝液で洗浄した切片を、定法に従いメチレ
ンプルー染色し、エタノールにて脱水後、キシレンで洗
い病理切片とし、顕微鏡観察を行なう． 抗体産土細 のスクリーニング 目的とする癌特異的抗体産生ハイプリドーマは、適当な
方法で分別・培養し、単一細胞から由来する単一クロー
ン細胞株とする（クローニング）．リミテイングダイリ
ューション法（限界希釈法》が一般的である． 例えば、Ｂ Ａ Ｌ Ｂ／Ｃマウスの胸腺細胞または牌
細胞をフィーダーとして１〜５ Ｘ １０’／ｍＱにな
るように調製し、９６穴組織培養用プレートの各穴に０
． ＩＴＩＩＩＩずつ分注しておく．次に前記のスクリ
ーニングした抗体産生ハイプリドーマのうすい懸濁液を
作り、前記プレートの各穴に分注する．フィーダー及び
ハイプリドーマの懸濁は、ＨＡＴ培地又はウマもしくは
胎児仔牛血清添加ＲＰＭＩ − １６４０培地で行ない
、ハイブリドーマは各穴に１個ずつ入るように調製する
。フィーダーは必ずしも加えなくともよい．次いで、５
％ＣＯ８培養装置にて３７゜Ｃで培養すると、１〜２週
間後にクローンが生育してくる．顕微鏡で１つの穴に１
個のクローンのみ生育しているものを選び、前記スクリ
ーニングの方法で分析し、目的とする抗体を産生じてい
るクローンを選択する。
ラウレート《ツィーン２０）含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ
）でよく洗い、例えばウマ血清によるプロッキング操作
後、前記ハイプリドーマ培養液を０．１ｍｌずつ加え、
３７℃で５〜６時間放置する． 次に培養液をデカントし、前記ＰＢＳＩＩ！Ｌ衝液でよ
く洗った後、１％ノーマルヤギ血清を加え、３７゜Ｃ，
１時間程静置し、非特異的吸着をプロックする．次いで
前記ＰＢＳ緩衝液で洗浄後、ヤギ抗マウスグロプリンの
べルオキシダーゼ結合ＩｇＧを加え、３７℃，４時間程
インキュベート後、前記ＰＢＳ緩衝液でよく洗う． 基質のオルトフェニレンジアミンジヒドロクロライド及
び過酸化水素含有クエン酸ソーダ緩衝液を加え、３０分
後に吸光度を測定する．抗体を産生じないｍ泊の培養液
をコントロールとして、各穴の吸光度との差により有意
の色素反応を呈したものを陽性とする． 目的とする抗体は、ヒト甲状腺癌及び、甲状腺癌のリン
パ節転移癌由来抗原に陽性であり、セルライン３Ｔ３，
Ｔ−４７Ｄ及びＫＡＴＯＩＩ［由来抗原には陰性のもの
とし、更に病理切片に対する特異性があることを確認し
、それを産生ずるハイプリドーマを得る． 理切片の染色法 病理切片は、ヒト癌組織のホルマリン固定パラフィン切
片より調製する， キシレンにより脱パラフィン後、１００％エタノールよ
り７０％エタノールまで段階的処理を行ない、終りにＰ
ＢＳ緩衝液でよく洗う．切片にヒアルロニダーゼを３７
℃，１時間作用させＰＢＳ緩衝液で洗浄後、トラジロー
ル添加ノーマルヤギ血清で３７℃，１０分間インキユベ
ートする。ＰＢＳ緩衝液で洗浄後、前記スクリーニング
後のモノクローナル抗体を３７℃，２０分間反応させる
．又ＰＢＳ緩衝液で洗浄後、ヤギ抗マウスグロプリンの
べル才キシダーゼ結合１ｇＧフラクションを加え、３０
分間室温でインキユベートする．更にＰＢＳ緩衝液で洗
浄後、過酸化水素を添加したＤＡＢ（３．３’−ジアミ
ノベンジダイン〉飽和ＰＢＳ緩衝液中に１０分間浸漬す
る．ＰＢＳ緩衝液で洗浄した切片を、定法に従いメチレ
ンプルー染色し、エタノールにて脱水後、キシレンで洗
い病理切片とし、顕微鏡観察を行なう． 抗体産土細 のスクリーニング 目的とする癌特異的抗体産生ハイプリドーマは、適当な
方法で分別・培養し、単一細胞から由来する単一クロー
ン細胞株とする（クローニング）．リミテイングダイリ
ューション法（限界希釈法》が一般的である． 例えば、Ｂ Ａ Ｌ Ｂ／Ｃマウスの胸腺細胞または牌
細胞をフィーダーとして１〜５ Ｘ １０’／ｍＱにな
るように調製し、９６穴組織培養用プレートの各穴に０
． ＩＴＩＩＩＩずつ分注しておく．次に前記のスクリ
ーニングした抗体産生ハイプリドーマのうすい懸濁液を
作り、前記プレートの各穴に分注する．フィーダー及び
ハイプリドーマの懸濁は、ＨＡＴ培地又はウマもしくは
胎児仔牛血清添加ＲＰＭＩ − １６４０培地で行ない
、ハイブリドーマは各穴に１個ずつ入るように調製する
。フィーダーは必ずしも加えなくともよい．次いで、５
％ＣＯ８培養装置にて３７゜Ｃで培養すると、１〜２週
間後にクローンが生育してくる．顕微鏡で１つの穴に１
個のクローンのみ生育しているものを選び、前記スクリ
ーニングの方法で分析し、目的とする抗体を産生じてい
るクローンを選択する。
Ｌ生卑太１羞進
スクリーニングされたハイブリドーマは、生体外培養ま
たは生体内培養のいずれにおいても、抗体産生せしめる
ことが可能である． 生体外培養は、ハイブリドーマを適当な栄養培地、例え
ば、胎児仔牛血清あるいはウマ血清を補充したＲ ＰＭ
Ｉ −１６４０培地中で適当時間培養すればよく、他
の免疫グロブリンを含まない純粋なモノクローナル抗体
を得るのに適している。多量のモノクローナル抗体を得
るには、生体内培養が好都合である． 例えば、以下に示す方法で行なう。ＢＡＬＢ／Ｃマウス
に２ ． ６ ，１０．１４−テトラメチルペンタデカ
ン（ブリスタン》を０．５ｍＱａ腔内投与し、２〜２０
日経過後、スクリーニングされたハイプリドーマを腹腔
内に１〜５Ｘ１０’個投与する．２〜３週間後に増殖、
定着したハイブリドーマは腹水癌化した株であるので、
必要四数のマウスに腹腔内投与することにより、２〜３
週間後より連続して、目的とするモノクローナル抗体を
含む腹水を得ることができる．適当な方法により特異的
な抗体活性より確認し、適当な精製手段、例えば、硫安
による塩析法、ＤＥＡＥセルロース等によるイオン交換
法、ゲル濾過法、アフィニティクロマトグラフィー等に
より、高純度の標品が得られる．モノクローナル抗体の
，性 このようにして得られる甲状腺癌に特異的反応を示すモ
ノクローナル抗体の特性は次の通りである． （１）分子量 約９０万（２》クラス
ＩｇＭ （３）認識する抗原物質 分子量約２５万の（還元
条件で） 高分子物質 （４》反応特異性 （４）−１ 甲状腺癌組織及び甲状腺癌のリンパ節転
移組織並びにセルライン３Ｔ３，Ｔ−４７Ｄ及びＫＡＴ
ＯＩ［［培養細胞から調製された抗原に対する反応特異
性を抗体のスクリーニングに使用した酵素免疫測定法（
ＥＬＩＳ Ａｓｓａｙ）によって検討した結果、第１
図の如く甲状腺癌組織及び甲状腺癌のリンパ節転移組織
より調製した抗原にのみ強く反応し、マウス正常細胞３
Ｔ３やヒト乳癌細胞株Ｔ−４７Ｄさらにヒト胃癌細胞株
ＫＡＴＯＩＩ［から調製した抗′原には全く反応性を示
さなかった． ＜４）−２ 甲状腺癌８１例について病理切片の染色
法でしめした免疫組織酵素抗体法によって染色した結果
、８１例中７７例が陽性であった《陽性率９５％》．染
色強度は特開昭６３−１２２９５号で開示された抗体よ
りも甲状腺癌特異的染色が強く、陽性、陰性の鑑定がつ
きやすかった．一方同一組織切片の正常甲状腺部分には
全く反応が見られなかった。
たは生体内培養のいずれにおいても、抗体産生せしめる
ことが可能である． 生体外培養は、ハイブリドーマを適当な栄養培地、例え
ば、胎児仔牛血清あるいはウマ血清を補充したＲ ＰＭ
Ｉ −１６４０培地中で適当時間培養すればよく、他
の免疫グロブリンを含まない純粋なモノクローナル抗体
を得るのに適している。多量のモノクローナル抗体を得
るには、生体内培養が好都合である． 例えば、以下に示す方法で行なう。ＢＡＬＢ／Ｃマウス
に２ ． ６ ，１０．１４−テトラメチルペンタデカ
ン（ブリスタン》を０．５ｍＱａ腔内投与し、２〜２０
日経過後、スクリーニングされたハイプリドーマを腹腔
内に１〜５Ｘ１０’個投与する．２〜３週間後に増殖、
定着したハイブリドーマは腹水癌化した株であるので、
必要四数のマウスに腹腔内投与することにより、２〜３
週間後より連続して、目的とするモノクローナル抗体を
含む腹水を得ることができる．適当な方法により特異的
な抗体活性より確認し、適当な精製手段、例えば、硫安
による塩析法、ＤＥＡＥセルロース等によるイオン交換
法、ゲル濾過法、アフィニティクロマトグラフィー等に
より、高純度の標品が得られる．モノクローナル抗体の
，性 このようにして得られる甲状腺癌に特異的反応を示すモ
ノクローナル抗体の特性は次の通りである． （１）分子量 約９０万（２》クラス
ＩｇＭ （３）認識する抗原物質 分子量約２５万の（還元
条件で） 高分子物質 （４》反応特異性 （４）−１ 甲状腺癌組織及び甲状腺癌のリンパ節転
移組織並びにセルライン３Ｔ３，Ｔ−４７Ｄ及びＫＡＴ
ＯＩ［［培養細胞から調製された抗原に対する反応特異
性を抗体のスクリーニングに使用した酵素免疫測定法（
ＥＬＩＳ Ａｓｓａｙ）によって検討した結果、第１
図の如く甲状腺癌組織及び甲状腺癌のリンパ節転移組織
より調製した抗原にのみ強く反応し、マウス正常細胞３
Ｔ３やヒト乳癌細胞株Ｔ−４７Ｄさらにヒト胃癌細胞株
ＫＡＴＯＩＩ［から調製した抗′原には全く反応性を示
さなかった． ＜４）−２ 甲状腺癌８１例について病理切片の染色
法でしめした免疫組織酵素抗体法によって染色した結果
、８１例中７７例が陽性であった《陽性率９５％》．染
色強度は特開昭６３−１２２９５号で開示された抗体よ
りも甲状腺癌特異的染色が強く、陽性、陰性の鑑定がつ
きやすかった．一方同一組織切片の正常甲状腺部分には
全く反応が見られなかった。
第１表
甲状腺癌組織 ８１ ７７ ９
５（４）−３ 甲状腺腫（Ａｄｅｎｏｍａ）、甲状腺
腫隣接正常甲状腺、慢性甲状腺炎（Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｔ
ｈｙｒｏｉｄｉｔｉｓ）、甲状腺機能九進症（Ｈｙｐｅ
ｒ Ｔｈｙｒｏｉｄｉｓｍｕｓ）及び腺腫性甲状腺Ｐａ
（Ａｄｃｎｏｍａｔｏｕｓ Ｇｏｉｔｅｒ）の組織に
ついて、上記と同じ方法で染色した結果第２表の如く腺
腫性甲状腺腫の１例を除き陰性であった。
５（４）−３ 甲状腺腫（Ａｄｅｎｏｍａ）、甲状腺
腫隣接正常甲状腺、慢性甲状腺炎（Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｔ
ｈｙｒｏｉｄｉｔｉｓ）、甲状腺機能九進症（Ｈｙｐｅ
ｒ Ｔｈｙｒｏｉｄｉｓｍｕｓ）及び腺腫性甲状腺Ｐａ
（Ａｄｃｎｏｍａｔｏｕｓ Ｇｏｉｔｅｒ）の組織に
ついて、上記と同じ方法で染色した結果第２表の如く腺
腫性甲状腺腫の１例を除き陰性であった。
第２表
組 織 染色例 陽性甲状腺Ｊ
ｉｍ ３９ ０甲状腺
腫隣接 正常甲状腺 ８１ ０慢性甲
暢炎 ２ｏ 甲状腺機能九進症 ８ｏ 腺腫性甲状腺＠ ２ｏ １（４）
−４ 甲状腺癌以外の癌組織に対する反応性を上記方
法に従い調べた結果、第３表に示す如く、咽頭、食道、
肺、乳腺、胃、膵臓、胆嚢、卵巣、子宮及び精巣の癌並
びに神経膠腫に対して全く反応しなかった． 第３表 咽 頭 食 道 肺 乳 腺 胃 牌 臓 胆 嚢 卵 巣 子 宮 精 巣 神経膠腫 計 Ｏ 上記の如く、本発明のモノクローナル抗体は甲状腺癌に
のみ特異的に反応性を示し、良性の各種甲状腺疾患には
反応せず、更に甲状腺癌以外の癌にも反応しないので甲
状腺癌の診断に極めて有用なものである． 火」１例 次に実施例を挙げて説明する． 実施例 モノクローナル抗体の製造 ９」」１良仄ムｌ】 ヒトの甲状腺癌組織を水冷下で細切し、５％シヨ糖（Ｗ
／Ｗ）含有ＴＮＥ緩衝液（０．０１Ｍ ｝リスー塩酸
（ｐＨ７．５）、０． １５Ｍ ＮａＣ１ ， ０．
００３Ｍ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ（ｐＨ８．０＞）中で細砲破
砕装置を用いホモジナイズした．その際、上記トリス塩
酸緩衝液は、癌組織１ｇ当り４ｍｌの割合で加え、１５
秒破砕後３０秒冷却する操作を４回繰り返した．次いで
６５０Ｘ ｇで１０分間遠心分離すると、核小体，ミト
コンドリア等は沈殿し、目的とする免疫原成分を含む上
ｆｆｌ（ｓｕｐ−２）が得られた． 次に２０％シａｌｌ（ｗ／ｗ）含有ＴＮＥ緩衝液８ｒｄ
と５０％シヨ糖（ｗ／Ｗ）含有ＴＮＥ緩衝液６ｍＱの不
連続密度勾配を作り上記上澄（８ｕｐ−２）２５ｍＱを
重層し、ｓｗ２７のスインギングパケットで１００．０
００Ｘ ｇ ， ９０分間遠心分離を行なった．目的免
疫原を含む分画け、密度の異なる両緩衝液の界にて得ら
れた。次いで１５ｍＱずつの２０％（Ｗ／％＃）シヨ糖
含有ＴＨＥ緩衝液と、５０％（賀／％４）シヨ糖含有Ｔ
ＮＥ緩衝液を用い、連続密度勾配を作り、その上に２０
％シヨ糖濃度になるように、ＴＮＥ緩衝液で調製した上
記の不連続密度勾配遠心で密度界面に得られた試料１０
ｍｌを重層し、１００．０００Ｘ ｇ ， １ ２時間
ｓｗ２ ７にて遠心分離を行なった。遠心分離後スイン
ギングパケットの底より１．２ｍｌｌずつ３２〜３３分
画に分けた。糖の密度を測定し、１．１９１ρ〜１．２
１０ρ（４１． ６％〜４５．２％糖濃度）密度の分画
を集め、ＴＮＥＩＩ衝液で糖濃度が２０％以下になるよ
うに調製し．１００．０００Ｘ ｇ ．９０分間遠心分
離を行ないペレットを採取することにより目的とする免
疫原が得られた． ２ マウス 細 の免疫化 ６週齢のＢ Ａ Ｌ Ｂ／Ｃ又はＮＺＢマウスの腹腔に
、当量のフロイント完全アジュバントを含むＰＢＳ緩衝
液０． ３ｍＱに溶解した前記［１］にて調製した免疫
原５０｛を投与し、１週間後に、当量のフロイント完全
アジュバントを含むＰＢＳ緩衝液０．３ｍｌに溶解した
上記免疫原２５題を腹腔内投与した．更に１週間後に、
ＰＢＳ緩衝液０． ３ｍｌｌに溶解した上記免疫原５題
を尾静脈投与した．次いで３日後にＩＩＩＩ！臓を摘出
し、ＰＢＳ緩衝液で洗い、ステンレスメッシュで濾して
単一細砲の懸濁液とし、次いでＰＢＳ緩衝液にて細胞数
を２Ｘ１０’個／Ｔｌｌｌ！になるように調製した。
ｉｍ ３９ ０甲状腺
腫隣接 正常甲状腺 ８１ ０慢性甲
暢炎 ２ｏ 甲状腺機能九進症 ８ｏ 腺腫性甲状腺＠ ２ｏ １（４）
−４ 甲状腺癌以外の癌組織に対する反応性を上記方
法に従い調べた結果、第３表に示す如く、咽頭、食道、
肺、乳腺、胃、膵臓、胆嚢、卵巣、子宮及び精巣の癌並
びに神経膠腫に対して全く反応しなかった． 第３表 咽 頭 食 道 肺 乳 腺 胃 牌 臓 胆 嚢 卵 巣 子 宮 精 巣 神経膠腫 計 Ｏ 上記の如く、本発明のモノクローナル抗体は甲状腺癌に
のみ特異的に反応性を示し、良性の各種甲状腺疾患には
反応せず、更に甲状腺癌以外の癌にも反応しないので甲
状腺癌の診断に極めて有用なものである． 火」１例 次に実施例を挙げて説明する． 実施例 モノクローナル抗体の製造 ９」」１良仄ムｌ】 ヒトの甲状腺癌組織を水冷下で細切し、５％シヨ糖（Ｗ
／Ｗ）含有ＴＮＥ緩衝液（０．０１Ｍ ｝リスー塩酸
（ｐＨ７．５）、０． １５Ｍ ＮａＣ１ ， ０．
００３Ｍ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ（ｐＨ８．０＞）中で細砲破
砕装置を用いホモジナイズした．その際、上記トリス塩
酸緩衝液は、癌組織１ｇ当り４ｍｌの割合で加え、１５
秒破砕後３０秒冷却する操作を４回繰り返した．次いで
６５０Ｘ ｇで１０分間遠心分離すると、核小体，ミト
コンドリア等は沈殿し、目的とする免疫原成分を含む上
ｆｆｌ（ｓｕｐ−２）が得られた． 次に２０％シａｌｌ（ｗ／ｗ）含有ＴＮＥ緩衝液８ｒｄ
と５０％シヨ糖（ｗ／Ｗ）含有ＴＮＥ緩衝液６ｍＱの不
連続密度勾配を作り上記上澄（８ｕｐ−２）２５ｍＱを
重層し、ｓｗ２７のスインギングパケットで１００．０
００Ｘ ｇ ， ９０分間遠心分離を行なった．目的免
疫原を含む分画け、密度の異なる両緩衝液の界にて得ら
れた。次いで１５ｍＱずつの２０％（Ｗ／％＃）シヨ糖
含有ＴＨＥ緩衝液と、５０％（賀／％４）シヨ糖含有Ｔ
ＮＥ緩衝液を用い、連続密度勾配を作り、その上に２０
％シヨ糖濃度になるように、ＴＮＥ緩衝液で調製した上
記の不連続密度勾配遠心で密度界面に得られた試料１０
ｍｌを重層し、１００．０００Ｘ ｇ ， １ ２時間
ｓｗ２ ７にて遠心分離を行なった。遠心分離後スイン
ギングパケットの底より１．２ｍｌｌずつ３２〜３３分
画に分けた。糖の密度を測定し、１．１９１ρ〜１．２
１０ρ（４１． ６％〜４５．２％糖濃度）密度の分画
を集め、ＴＮＥＩＩ衝液で糖濃度が２０％以下になるよ
うに調製し．１００．０００Ｘ ｇ ．９０分間遠心分
離を行ないペレットを採取することにより目的とする免
疫原が得られた． ２ マウス 細 の免疫化 ６週齢のＢ Ａ Ｌ Ｂ／Ｃ又はＮＺＢマウスの腹腔に
、当量のフロイント完全アジュバントを含むＰＢＳ緩衝
液０． ３ｍＱに溶解した前記［１］にて調製した免疫
原５０｛を投与し、１週間後に、当量のフロイント完全
アジュバントを含むＰＢＳ緩衝液０．３ｍｌに溶解した
上記免疫原２５題を腹腔内投与した．更に１週間後に、
ＰＢＳ緩衝液０． ３ｍｌｌに溶解した上記免疫原５題
を尾静脈投与した．次いで３日後にＩＩＩＩ！臓を摘出
し、ＰＢＳ緩衝液で洗い、ステンレスメッシュで濾して
単一細砲の懸濁液とし、次いでＰＢＳ緩衝液にて細胞数
を２Ｘ１０’個／Ｔｌｌｌ！になるように調製した。
３ 免疫化胛細砲とマウス骨ｗｒＦ！！細胞との使用し
たマウス骨髄腫細胞は、例えばＫｏｈｌｅｒ等によって
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６ ２９２〜２９５（１
９７６）に記載されているように、ＢＡＬＢ／Ｃマウス
ＭＯＰＣ２１から誘導きれたもので、マウス骨髄腫ＮＳ
−１と呼ばれている．まず、Ｒ ＰＭ Ｉ −１６４０
完全培地《グルタミン２ｍＭ，ピルピン酸ソーダ１ｍＭ
，フンギゾン０．２５７ａｇ／ｍＱ，ストレプトマイシ
ン５０尾，ペニシリン５０ ｕｎｉｔ／ ｙｎＱ ．ウ
マ血清１５％》で培養した対数増殖期のマウス骨１１ｉ
１Ｉ！！細胞を、ウマ血清不合のＲ ＰＭ Ｉ−１６４
０の培地で洗い、細砲数５×１０６個／ｍＱになるよう
に、ウマ血清不含ＲＰＭＩ − １６４０培地で調製し
た。次に前記［２］で調製した免疫化マウス牌細泊懸濁
液４０ｍｌｌと、上記マウス骨髄腫細胞懸濁液１０ＴＩ
ＩＱを混合し、８００Ｘ ｇで５分間遠心分離してペレ
ットを形成させ、上澄はデカントにより完全に除いた．
このペレットに、３７℃に加温したポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ−１５００）溶液（ウマ血清不含Ｒ ＰＭ
Ｉ −１６４０で５０％濃度に調製したＰ Ｅ Ｇ
− １５００溶液）ｌｙｄを、攪拌しながら徐々に加え
、１分間攪拌を読けた．次に、ウマ血清不含ＲＰＭＩ−
１６４０６ｙｄを、攪拌を続けながら６〜７分間にわた
り徐々に加えた．６００Ｘｇ，５分間遠心分離し、ウマ
血清不含ＲＰＭＩ− １６４ｆｌを除いた後、Ｒ ＰＭ
Ｉ−１６４０を加えて、細胸数２Ｘ１０”個／ＴＩＩ
Ｑの懸濁液とした．４ ＨＡＴセレクション 前記［３］で調製した細胞懸濁液を、９６大の組織培養
用プレートの各穴に０． ｌｍｌｌずつ分注し、５％Ｃ
Ｏ，培養装置中で３７℃で培養した．２４時間後、各穴
の培養液に０． １ｍｌｌのＨＡＴ培地（ヒボキサンチ
ン，アミノプテリン及びチミジン含有ＲＰＭＩ−１６４
０（Ｌｉｔｔｌｅｆｉｅｌｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １４５
７０９＝７１０．１９６４）を加え、次にｏ． １ｍ
ｌＬずつ培養液を除き、培養を続けた．更に培養開始よ
り２日，３日，５日，８日，１１日，１４日，１７日，
２１日毎に、上記の如く、培養液の半量をＨＡＴ培地で
置換する操作を繰り返した．このＨＡＴセレクションに
より骨１′ｌ１腫細胞は死滅し、融合細胞のみ生育して
きた．生育してきたハイプリドーマをウマ血清添加Ｒ
ＰＭ Ｉ −１６４０で培養し、その培養液を酵素免疫
測定法（ＥＬＩＳ Ａｓｓａｙ）の分析試料とした．
前記［１コの方法に従って、ヒト甲状腺癌組織、甲状腺
癌のリンパ節転移組織並びにセルライン３Ｔ３、セルラ
インＴ−４７Ｄ及びセルラインＫＡＴＯ■の培養細胞か
ら調製したものを抗原とし酵素免疫測定法（ＥＬＩＳ
Ａｓｓａｙ）を行なった．これらの抗原を炭酸ソーダ
緩衝液（０． ０５ＭＮａＨＣＯｓ ． ０． ０５Ｍ
ＮａｔＣＯｍ ， ｐＨ９． ５）にて４趨／ｍｌ濃
度に希釈した．次に９６穴のマイクロタイタープレート
の各穴に、それぞれ０． １ｍＱずつ分注し、プレート
の表面をシールした後、４゜Ｃ一夜放置した．翌朝０．
０５％ボリ才キシエチレンソルビタンモノラウレート（
ツィーン２０）を含むＰＢＳＩＩ衝液でよく洗った後、
前記［４］で調製したハイブリドーマの培養液０． ｌ
ｍｌｌずつを各穴に加え、３７℃にて６時間放置した．
″ｌ２ントロールとして、抗体産生じていない細砲の培
養液を使用した。
たマウス骨髄腫細胞は、例えばＫｏｈｌｅｒ等によって
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６ ２９２〜２９５（１
９７６）に記載されているように、ＢＡＬＢ／Ｃマウス
ＭＯＰＣ２１から誘導きれたもので、マウス骨髄腫ＮＳ
−１と呼ばれている．まず、Ｒ ＰＭ Ｉ −１６４０
完全培地《グルタミン２ｍＭ，ピルピン酸ソーダ１ｍＭ
，フンギゾン０．２５７ａｇ／ｍＱ，ストレプトマイシ
ン５０尾，ペニシリン５０ ｕｎｉｔ／ ｙｎＱ ．ウ
マ血清１５％》で培養した対数増殖期のマウス骨１１ｉ
１Ｉ！！細胞を、ウマ血清不合のＲ ＰＭ Ｉ−１６４
０の培地で洗い、細砲数５×１０６個／ｍＱになるよう
に、ウマ血清不含ＲＰＭＩ − １６４０培地で調製し
た。次に前記［２］で調製した免疫化マウス牌細泊懸濁
液４０ｍｌｌと、上記マウス骨髄腫細胞懸濁液１０ＴＩ
ＩＱを混合し、８００Ｘ ｇで５分間遠心分離してペレ
ットを形成させ、上澄はデカントにより完全に除いた．
このペレットに、３７℃に加温したポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ−１５００）溶液（ウマ血清不含Ｒ ＰＭ
Ｉ −１６４０で５０％濃度に調製したＰ Ｅ Ｇ
− １５００溶液）ｌｙｄを、攪拌しながら徐々に加え
、１分間攪拌を読けた．次に、ウマ血清不含ＲＰＭＩ−
１６４０６ｙｄを、攪拌を続けながら６〜７分間にわた
り徐々に加えた．６００Ｘｇ，５分間遠心分離し、ウマ
血清不含ＲＰＭＩ− １６４ｆｌを除いた後、Ｒ ＰＭ
Ｉ−１６４０を加えて、細胸数２Ｘ１０”個／ＴＩＩ
Ｑの懸濁液とした．４ ＨＡＴセレクション 前記［３］で調製した細胞懸濁液を、９６大の組織培養
用プレートの各穴に０． ｌｍｌｌずつ分注し、５％Ｃ
Ｏ，培養装置中で３７℃で培養した．２４時間後、各穴
の培養液に０． １ｍｌｌのＨＡＴ培地（ヒボキサンチ
ン，アミノプテリン及びチミジン含有ＲＰＭＩ−１６４
０（Ｌｉｔｔｌｅｆｉｅｌｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １４５
７０９＝７１０．１９６４）を加え、次にｏ． １ｍ
ｌＬずつ培養液を除き、培養を続けた．更に培養開始よ
り２日，３日，５日，８日，１１日，１４日，１７日，
２１日毎に、上記の如く、培養液の半量をＨＡＴ培地で
置換する操作を繰り返した．このＨＡＴセレクションに
より骨１′ｌ１腫細胞は死滅し、融合細胞のみ生育して
きた．生育してきたハイプリドーマをウマ血清添加Ｒ
ＰＭ Ｉ −１６４０で培養し、その培養液を酵素免疫
測定法（ＥＬＩＳ Ａｓｓａｙ）の分析試料とした．
前記［１コの方法に従って、ヒト甲状腺癌組織、甲状腺
癌のリンパ節転移組織並びにセルライン３Ｔ３、セルラ
インＴ−４７Ｄ及びセルラインＫＡＴＯ■の培養細胞か
ら調製したものを抗原とし酵素免疫測定法（ＥＬＩＳ
Ａｓｓａｙ）を行なった．これらの抗原を炭酸ソーダ
緩衝液（０． ０５ＭＮａＨＣＯｓ ． ０． ０５Ｍ
ＮａｔＣＯｍ ， ｐＨ９． ５）にて４趨／ｍｌ濃
度に希釈した．次に９６穴のマイクロタイタープレート
の各穴に、それぞれ０． １ｍＱずつ分注し、プレート
の表面をシールした後、４゜Ｃ一夜放置した．翌朝０．
０５％ボリ才キシエチレンソルビタンモノラウレート（
ツィーン２０）を含むＰＢＳＩＩ衝液でよく洗った後、
前記［４］で調製したハイブリドーマの培養液０． ｌ
ｍｌｌずつを各穴に加え、３７℃にて６時間放置した．
″ｌ２ントロールとして、抗体産生じていない細砲の培
養液を使用した。
次に培養液をデカントし、０．０５％ツィーン２０添加
ＰＢＳ緩衝液で５回洗い、１％ノーマルヤギ血清添加Ｐ
ＢＳ緩衝液０．１ｍｌずつを加え、３７°Ｃ，１時間放
置後、ツィーン２０添加ＰＢＳ緩衝液でよく洗った． 次に、冷凍ストックからの１＝３０にＰＢＳ緩衝液で希
釈したヤギ抗マウスグロプリンのワサビペル才キシダー
ゼ結合１ｇＧフラクションを０．１ｍｌずつ加え、３７
゜Ｃ，４時間インキユベートした。
ＰＢＳ緩衝液で５回洗い、１％ノーマルヤギ血清添加Ｐ
ＢＳ緩衝液０．１ｍｌずつを加え、３７°Ｃ，１時間放
置後、ツィーン２０添加ＰＢＳ緩衝液でよく洗った． 次に、冷凍ストックからの１＝３０にＰＢＳ緩衝液で希
釈したヤギ抗マウスグロプリンのワサビペル才キシダー
ゼ結合１ｇＧフラクションを０．１ｍｌずつ加え、３７
゜Ｃ，４時間インキユベートした。
各穴をツィーン２０添加ＰＢＳＩｉ！！衝液で４回洗い
、基質として１／ｌｏｏ容の４０ｍＭ ＡＢＴＳ［ ２
，２゛−アジノージー《３−エチルベンゾチアゾリン
》スルホン酸ジアンモニウム塩］及び１／１００容の３
０％過酸化水素を含む０．５％クエン酸リン酸ソーダ緩
衝液（ｐＨ５． ｓ）を加えた。３０分後に各穴の吸光
度を測定した．コントロールより有意の色素反応を呈し
たものを陽性とし、甲状腺癌及び甲状腺癌のリンパ節転
移癌組織から調製した抗原に反応し、セルライン３ＴＣ
，Ｔ−４７Ｄ及びＫＡＴＯ■から調製した抗原に反応し
ないものを選び出した．更に病理組織切片に対する反応
特異性があることを確認し、限界希釈法によるクローニ
ングを行なった． ６ 組織切片の 色法 ヒト甲状腺癌及び、甲状腺癌のリンパ節転移組織のホル
マリン固定バラフィン切片をまず、キシレンに浸し、バ
ラフィンを溶出させ、次いで１００％〜７０％エタノー
ル溶液に段階的に浸し、終りにＰＢＳ緩衝液でよく洗浄
した。
、基質として１／ｌｏｏ容の４０ｍＭ ＡＢＴＳ［ ２
，２゛−アジノージー《３−エチルベンゾチアゾリン
》スルホン酸ジアンモニウム塩］及び１／１００容の３
０％過酸化水素を含む０．５％クエン酸リン酸ソーダ緩
衝液（ｐＨ５． ｓ）を加えた。３０分後に各穴の吸光
度を測定した．コントロールより有意の色素反応を呈し
たものを陽性とし、甲状腺癌及び甲状腺癌のリンパ節転
移癌組織から調製した抗原に反応し、セルライン３ＴＣ
，Ｔ−４７Ｄ及びＫＡＴＯ■から調製した抗原に反応し
ないものを選び出した．更に病理組織切片に対する反応
特異性があることを確認し、限界希釈法によるクローニ
ングを行なった． ６ 組織切片の 色法 ヒト甲状腺癌及び、甲状腺癌のリンパ節転移組織のホル
マリン固定バラフィン切片をまず、キシレンに浸し、バ
ラフィンを溶出させ、次いで１００％〜７０％エタノー
ル溶液に段階的に浸し、終りにＰＢＳ緩衝液でよく洗浄
した。
つぎニヒアルロニダーゼ（６００ ｕｎｉｔ／ ｍＱＯ
． ＯＩＭＰＢＳＩｌ衝液ｐｔｔａ． ５）０． １５
ｍｌｌを、切片に３７℃，１時間作用させた。ＰＢＳ緩
衝液で洗浄後、蛋白分解酵素阻害剤のトラジロール０．
５ ｕｎｉｔ／ ｍＱを添加したノーマルヤギ血清（
ＰＢＳ緩衝液にて５０％濃度に調製）で、３７゜Ｃ，１
０分間インキユベートし、組織への非特異的な吸着をプ
ロックした。ＰＢＳ緩衝液で静かに洗浄後、前記［５］
でスクリーニングしたモノクローナル抗体で、３７℃，
２０分間インキユベートした，ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄
後、ヤギ抗マウスグロプリンのワサビペル才キシダーゼ
結合ＩｇＧフラクション（ＰＢＳ緩衝液で全ヤギ血清に
対し１００ＭｈＩ ｇ Ｇ ／ ＴｒＩ！ｌに調製）を
室温にて３０分間作用させた．更にＰＢＳ緩衝液で洗浄
後、過酸化水素３０％を添加したＤＡＢ（３ ，３ ’
−ジアミノベンジダイン）飽和ＰＢＳＩＩ衝液中に、室
温にて１０分間浸した．次いでＰＢＳ緩衝液中にて洗浄
、メチレンブルーで染色し、７０％〜１００％のエタノ
ールで、段階的に脱水を行ない、終りにキシレンで洗い
、病理切片とした． ［叡尽韮 前記［５］でスクリーニングしたハイプリドーマをウマ
血清添加Ｒ ＰＭ Ｉ−１６４０で培養し、次いで、細
遡数１００個／ｍＱ，５０個／＋ｎＱ ， １０個／ｍ
Ｑ及び５個／ｍＱに、ウマ血清添加Ｒ ＰＭ Ｉ −１
６４０で希釈した．次に、各々の懸濁液を９６穴組織培
養用プレートに０． １ｍＱずつ分注し培養した。細胞
増殖の認められた穴の培養液を、前記［５］の酵素免疫
測定法（ＥＬＩＳ Ａｓｓａｙ）に従い、抗体産生の
有無を調べた．この操作を２度繰り返して、単一クロー
ン細胸を得た． 得られたハイプリドーマは、工業技術院微生物工業技術
研究所（茨城県》に微工研条寄第２０６０号として寄託
された． ８ 抗体の 量生 ＢＡＬＢ／Ｃ７ウスに、ブリスタン０． ５ｍＱを腹腔
内投与し、２０日後に前記［７］で得た単一クローン化
ハイプリドーマを２Ｘ１０’個接種した．１０〜２０日
後に腹水癌が現われ、腹水癌株が得られた．この腹水癌
株を、他の複数のＢＡＬＢ／Ｃマウスに２Ｘ１０’個程
度、腹腔内投与すると、２〜３週間後より目的とするモ
ノクローナル抗体を含む腹水が得られた． Ｄユ』■遅１ｌ 前記［８］により得られた抗体を含有する腹水１０ｍｌ
に、当量のＰＢＳ緩衝液を加え、次いで、当量の飽和硫
安溶液を加え、最終的に５０％硫安溶液とした． １０
．０００ ｒ．ｐ．ｍ．１５分間遠心分離し、上澄を除
去し、ベレットをＰＢＳ４１衝液で一夜透析した．次い
でセフアクリルＳ−４００カラムを通し、ＰＢＳで溶出
し、ＩｇＭ画分をプールした．分析の結果、得られたモ
ノクローナル抗体は分子量約９０万であり、クラスはＩ
ｇＭであった．λ肌卑吃１ 以上詳述したように本発明のモノクローナル抗体は甲状
腺癌にのみ特異的に抗原抗体反応性を示し、甲状腺の各
種の良性疾患には反応性を示さず、更に甲状腺癌以外の
種々の癌にも反応性を示さない、極めて優れた性質を有
するので、甲状腺癌の診断には非常に有効である．
． ＯＩＭＰＢＳＩｌ衝液ｐｔｔａ． ５）０． １５
ｍｌｌを、切片に３７℃，１時間作用させた。ＰＢＳ緩
衝液で洗浄後、蛋白分解酵素阻害剤のトラジロール０．
５ ｕｎｉｔ／ ｍＱを添加したノーマルヤギ血清（
ＰＢＳ緩衝液にて５０％濃度に調製）で、３７゜Ｃ，１
０分間インキユベートし、組織への非特異的な吸着をプ
ロックした。ＰＢＳ緩衝液で静かに洗浄後、前記［５］
でスクリーニングしたモノクローナル抗体で、３７℃，
２０分間インキユベートした，ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄
後、ヤギ抗マウスグロプリンのワサビペル才キシダーゼ
結合ＩｇＧフラクション（ＰＢＳ緩衝液で全ヤギ血清に
対し１００ＭｈＩ ｇ Ｇ ／ ＴｒＩ！ｌに調製）を
室温にて３０分間作用させた．更にＰＢＳ緩衝液で洗浄
後、過酸化水素３０％を添加したＤＡＢ（３ ，３ ’
−ジアミノベンジダイン）飽和ＰＢＳＩＩ衝液中に、室
温にて１０分間浸した．次いでＰＢＳ緩衝液中にて洗浄
、メチレンブルーで染色し、７０％〜１００％のエタノ
ールで、段階的に脱水を行ない、終りにキシレンで洗い
、病理切片とした． ［叡尽韮 前記［５］でスクリーニングしたハイプリドーマをウマ
血清添加Ｒ ＰＭ Ｉ−１６４０で培養し、次いで、細
遡数１００個／ｍＱ，５０個／＋ｎＱ ， １０個／ｍ
Ｑ及び５個／ｍＱに、ウマ血清添加Ｒ ＰＭ Ｉ −１
６４０で希釈した．次に、各々の懸濁液を９６穴組織培
養用プレートに０． １ｍＱずつ分注し培養した。細胞
増殖の認められた穴の培養液を、前記［５］の酵素免疫
測定法（ＥＬＩＳ Ａｓｓａｙ）に従い、抗体産生の
有無を調べた．この操作を２度繰り返して、単一クロー
ン細胸を得た． 得られたハイプリドーマは、工業技術院微生物工業技術
研究所（茨城県》に微工研条寄第２０６０号として寄託
された． ８ 抗体の 量生 ＢＡＬＢ／Ｃ７ウスに、ブリスタン０． ５ｍＱを腹腔
内投与し、２０日後に前記［７］で得た単一クローン化
ハイプリドーマを２Ｘ１０’個接種した．１０〜２０日
後に腹水癌が現われ、腹水癌株が得られた．この腹水癌
株を、他の複数のＢＡＬＢ／Ｃマウスに２Ｘ１０’個程
度、腹腔内投与すると、２〜３週間後より目的とするモ
ノクローナル抗体を含む腹水が得られた． Ｄユ』■遅１ｌ 前記［８］により得られた抗体を含有する腹水１０ｍｌ
に、当量のＰＢＳ緩衝液を加え、次いで、当量の飽和硫
安溶液を加え、最終的に５０％硫安溶液とした． １０
．０００ ｒ．ｐ．ｍ．１５分間遠心分離し、上澄を除
去し、ベレットをＰＢＳ４１衝液で一夜透析した．次い
でセフアクリルＳ−４００カラムを通し、ＰＢＳで溶出
し、ＩｇＭ画分をプールした．分析の結果、得られたモ
ノクローナル抗体は分子量約９０万であり、クラスはＩ
ｇＭであった．λ肌卑吃１ 以上詳述したように本発明のモノクローナル抗体は甲状
腺癌にのみ特異的に抗原抗体反応性を示し、甲状腺の各
種の良性疾患には反応性を示さず、更に甲状腺癌以外の
種々の癌にも反応性を示さない、極めて優れた性質を有
するので、甲状腺癌の診断には非常に有効である．
Claims (4)
- （１）分子量が約９０万であり、クラスがＩｇＭである
ヒト甲状腺癌特異抗原を認識するモノクローナル抗体 - （２）分子量が還元条件で約２５万のタンパク性分を含
むヒト甲状腺癌特異抗原を認識する請求項（１）記載の
モノクローナル抗体 - （３）微工研条寄第２０６０号として寄託されたハイブ
リドーマから得られる請求項（１）記載のモノクロナー
ル抗体 - （４）ヒト甲状腺癌細胞をホモジナイズした細砕混合物
を遠心分離し、その上澄を不連続ショ糖密度勾配液中遠
心分離し、密度勾配の不連続面に集まった分画を採集し
た後、これを連続シヨ糖密度勾配液に重層し、超遠心分
離を行なつて密度１．１９１ρ〜１．２１０ρの癌特異
的抗原に富んだ分画を分離し、これを抗原として動物を
免疫し、その免疫脾細胞と骨髄腫細胞との融合細胞を作
り、目的とする抗体を産生するハイブリドーマをスクリ
ーニングし、クローニングを行ない、次いで培養するこ
とにより得られる請求項（１）記載のモノクローナル抗
体
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1293671A JPH02238893A (ja) | 1988-11-22 | 1989-11-10 | 甲状腺癌特異抗原に対するモノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29508788 | 1988-11-22 | ||
| JP63-295087 | 1988-11-22 | ||
| JP1293671A JPH02238893A (ja) | 1988-11-22 | 1989-11-10 | 甲状腺癌特異抗原に対するモノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02238893A true JPH02238893A (ja) | 1990-09-21 |
Family
ID=26559513
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1293671A Pending JPH02238893A (ja) | 1988-11-22 | 1989-11-10 | 甲状腺癌特異抗原に対するモノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02238893A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007061063A (ja) * | 2005-09-02 | 2007-03-15 | Hiroshi Takeyama | 甲状腺癌抗原を認識するポリペプチド |
| CN104352985A (zh) * | 2014-11-20 | 2015-02-18 | 邹士东 | 一种改善甲状腺癌术后心肝阴虚证的中药组合物 |
-
1989
- 1989-11-10 JP JP1293671A patent/JPH02238893A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007061063A (ja) * | 2005-09-02 | 2007-03-15 | Hiroshi Takeyama | 甲状腺癌抗原を認識するポリペプチド |
| CN104352985A (zh) * | 2014-11-20 | 2015-02-18 | 邹士东 | 一种改善甲状腺癌术后心肝阴虚证的中药组合物 |
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