JPS6312295A - 甲状腺癌特異抗原に対するモノクロ−ナル抗体 - Google Patents
甲状腺癌特異抗原に対するモノクロ−ナル抗体Info
- Publication number
- JPS6312295A JPS6312295A JP62063165A JP6316587A JPS6312295A JP S6312295 A JPS6312295 A JP S6312295A JP 62063165 A JP62063165 A JP 62063165A JP 6316587 A JP6316587 A JP 6316587A JP S6312295 A JPS6312295 A JP S6312295A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- thyroid cancer
- monoclonal antibody
- fraction
- cancer
- density gradient
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
り策上μ市浬全１
本発明はヒト甲状腺癌組織に特異的に反応するモノクロ
ーナル抗体に関するものである。
ーナル抗体に関するものである。
従来の技術
従来、甲状腺癌の診断に使用できるモノクローナル抗体
に関する技術はなかった。
に関する技術はなかった。
わずかに腺癌の診断に使用するモノクローナル抗体に関
して特開昭６０−１８７６５号があるが、この抗体は腺
癌に特異的なものであり、甲状腺癌を他の腺癌から区別
することはできなかった。
して特開昭６０−１８７６５号があるが、この抗体は腺
癌に特異的なものであり、甲状腺癌を他の腺癌から区別
することはできなかった。
本発明が解決しようとする問題点
甲状腺癌はその発生部位から一般に、比較的早期に発見
可能な腫瘤である。しかし甲状腺癌と甲状腺の良性腫瘍
とを区別することは臨床医家には不可能に近い。
可能な腫瘤である。しかし甲状腺癌と甲状腺の良性腫瘍
とを区別することは臨床医家には不可能に近い。
生検材料を得て病理組織切片を顕微鏡下で検討して初め
て診断可能である。
て診断可能である。
病理診断に際しては熟練した甲状腺専門の病理学者（医
師）においてのみ正しい診断が可能であり、現在わが国
にはこの診断を下せる医師は数えるほどしか存在してい
ない。
師）においてのみ正しい診断が可能であり、現在わが国
にはこの診断を下せる医師は数えるほどしか存在してい
ない。
問題点を解決するための手段
本発明の甲状腺癌特異的モノクローナル抗体の使用によ
りこの問題は解決きれる。すなわち本発明のモノクロー
ナル抗体の使用により、比較的簡単な手技で甲状腺癌の
みを他の良性腫瘍や正常甲状腺と区別して染色でき、一
般の病理学者（医師）でも甲状腺癌の診断が簡単に行な
えるようになり、本疾患の治療方針を有効に決定できる
ようになる。
りこの問題は解決きれる。すなわち本発明のモノクロー
ナル抗体の使用により、比較的簡単な手技で甲状腺癌の
みを他の良性腫瘍や正常甲状腺と区別して染色でき、一
般の病理学者（医師）でも甲状腺癌の診断が簡単に行な
えるようになり、本疾患の治療方針を有効に決定できる
ようになる。
本発明につき以下に具体的に説明する。
Ｌ良見匁１１
ヒトの甲状腺癌組織を水冷下で切り刻み、適当な緩衝液
、例えば５％ショ糖含有トリス塩酸緩衝液を、ゆっくり
加えながらホモジナイズする。
、例えば５％ショ糖含有トリス塩酸緩衝液を、ゆっくり
加えながらホモジナイズする。
次に約６５０Ｘ ｇから約１．５００Ｘ ｇ 、約１０
分間で遠心分離してペレットを除いた上澄を１００．０
００Ｘ ｇ 。
分間で遠心分離してペレットを除いた上澄を１００．０
００Ｘ ｇ 。
１０分間程度遠心分離し、核小体、ミトコンドリア等を
沈殿せしめる。次いで２０％〜２８％、通常は約２５％
ショ糖含有緩衝液と、４５％〜６０％、通常は約５０％
ショ糖含有緩衝液の不連続密度勾配上に、上記上澄を重
層し、約６０．０００Ｘ ｇ〜約２００，０ＯＯＸ ｇ
約６０分間以上、通常は約９０分間程度遠心分離を行な
う。密度勾配の不連続面に、目的免疫原を含む分画が集
まる。この分画を採取し、約２０％ショ糖濃度に緩衝液
で調製し、次に緩衝液、例えば、トリス塩酸緩衝液を用
いた約２０％以下５０％の連続ショ糖密度勾配に重層し
、約６０．０００Ｘｇ〜約２００．０００Ｘ ｇ 、
４時間以上遠心分離を行なう、目的とする免疫原は、水
溶液の密度１．１９１ρ〜１．２１０ρの分画にある（
糖濃度としては４１．６％〜４５．２％に換算される）
。
沈殿せしめる。次いで２０％〜２８％、通常は約２５％
ショ糖含有緩衝液と、４５％〜６０％、通常は約５０％
ショ糖含有緩衝液の不連続密度勾配上に、上記上澄を重
層し、約６０．０００Ｘ ｇ〜約２００，０ＯＯＸ ｇ
約６０分間以上、通常は約９０分間程度遠心分離を行な
う。密度勾配の不連続面に、目的免疫原を含む分画が集
まる。この分画を採取し、約２０％ショ糖濃度に緩衝液
で調製し、次に緩衝液、例えば、トリス塩酸緩衝液を用
いた約２０％以下５０％の連続ショ糖密度勾配に重層し
、約６０．０００Ｘｇ〜約２００．０００Ｘ ｇ 、
４時間以上遠心分離を行なう、目的とする免疫原は、水
溶液の密度１．１９１ρ〜１．２１０ρの分画にある（
糖濃度としては４１．６％〜４５．２％に換算される）
。
この分画を集め、トリス塩酸緩衝液で、糖濃度約２０％
以下になるように薄め、 ６０．０００ Ｘ ｇ〜２０
０．０００Ｘ ｇ 、約６０分間以上、通常は９０分間
程度遠心分離を行なうと、本発明の製造に使用する免疫
原がペレットとして得られる。
以下になるように薄め、 ６０．０００ Ｘ ｇ〜２０
０．０００Ｘ ｇ 、約６０分間以上、通常は９０分間
程度遠心分離を行なうと、本発明の製造に使用する免疫
原がペレットとして得られる。
モノクローナル抗体の調製
まず動物に、適当なアジュバント、例えばフロイント完
全アジュバントと共に本発明の免疫原を数回投与するこ
とにより免疫抗体を産生させる。
全アジュバントと共に本発明の免疫原を数回投与するこ
とにより免疫抗体を産生させる。
例えばＢ Ａ Ｌ Ｂ／Ｃマウスに、本発明免疫原を１
匹当り１〜６０属を腹腔又は皮下投与し、１〜２週間後
に、アジュバントを抜いた免疫原を１〜２０Ｐｇ静脈投
与すれば、動物は免疫される。
匹当り１〜６０属を腹腔又は皮下投与し、１〜２週間後
に、アジュバントを抜いた免疫原を１〜２０Ｐｇ静脈投
与すれば、動物は免疫される。
免疫動物から抗体産生細胞を得るには、通常、脾細胞を
利用するのが実際的である０例えば前記ＢＡＬＢ／Ｃマ
ウスの肺臓を、アジュバント抜き免疫原投与の３日後に
摘出し、冷却しなからＲＰＭＩ−１６４０あるいはＰＢ
Ｓ緩衝液中で細かく刻み、次いでステンレスメツシュで
濾し、前記緩衝液で適当な細胞数に調製する。
利用するのが実際的である０例えば前記ＢＡＬＢ／Ｃマ
ウスの肺臓を、アジュバント抜き免疫原投与の３日後に
摘出し、冷却しなからＲＰＭＩ−１６４０あるいはＰＢ
Ｓ緩衝液中で細かく刻み、次いでステンレスメツシュで
濾し、前記緩衝液で適当な細胞数に調製する。
細胞融合に使用する骨髄腫細胞系は、例えばＫｏｈｌｅ
ｒ等により、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、６ ２９２
′２９５（１９７６）に記載されている、Ｐ３−ＮＳＩ
／１−Ａｇ４−１（一般にＭＳ−１と呼ばれている）の
如き、ＢＡＬＢ／ＣマウスＭＯＰＣ２１由来の骨髄腫を
使用する。この種の細胞系は８−アザグアニン耐性であ
り、ヒボキサンチン・グアニンホスホリボシルトランス
フェラーゼを欠くために、ＨＡＴ培地（ヒボキサンチン
−アミノプテリン−チミジン含有培地）中で生存できな
い。
ｒ等により、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、６ ２９２
′２９５（１９７６）に記載されている、Ｐ３−ＮＳＩ
／１−Ａｇ４−１（一般にＭＳ−１と呼ばれている）の
如き、ＢＡＬＢ／ＣマウスＭＯＰＣ２１由来の骨髄腫を
使用する。この種の細胞系は８−アザグアニン耐性であ
り、ヒボキサンチン・グアニンホスホリボシルトランス
フェラーゼを欠くために、ＨＡＴ培地（ヒボキサンチン
−アミノプテリン−チミジン含有培地）中で生存できな
い。
細胞融合剤としては、平均分子量１０００〜６０００の
ポリエチレングリコールがよく、とくにポリエチレング
リフール１５００が望ましい。濃度は分子量に従い４０
％〜５０％が使用され、ポリエチレングリコール１５０
０使用の場合は、ＲＰＭ Ｉ −１６４０で５０％に調
製して使用する。細胞融合は、まず前記の如き抗体産生
細胞と骨髄腫細胞を、ＲＰＭ Ｉ −１６４０で洗い、
前者と後者とを４：１〜１０：１の比率で混合し、８０
０Ｘ ｇ 、 ５分間程遠心分離を行ない沈殿させ、培
地をデカントする。このペレットに前記細胞融合剤を１
〜２Ｘ１０’細胞数当り１ ｔｄ （３７℃）位１分間
にわたりゆっくり攪拌しながら滴下し、更に攪拌を統け
ながら５〜１０分間かけて、徐々にＲＰＭ ｌ−１６４
０（３７℃、５〜１０ｍＱ）で懸濁する。４００〜６０
０Ｘ ｇ 、 ５分間遠心分離後、上澄をデカントし、
１５％ウマ血清含有ＲＰＭ Ｉ −１６４０で、細胞数
１〜２Ｘ１０’個／ＩＴＩＱに調製する。ハイブリドー
マの分離は、ＨＡＴ培地中での培養によるのが適当であ
る。（ＨＡＴセレクション）。まず、９６穴の組織培養
用のプレートの各穴に、前記融合の完了した細胞液を０
．１ｍｌずつ入れ、３７℃、２４時間培養し、０．１ｍ
ｌのＨＡＴ培地を加える。以後、１〜４日間隔で、半量
の培養液をＨＡＴ培地で置換しながら３週間程培養を続
ける。親細胸は全て死滅し、融合細胞のみ生育してくる
ので、以後は１５％ウマ血清添加ＲＰＭ Ｉ −１６４
０で培養し、抗体を産生させる。次にこれらのハイブリ
ドーマより、目的とする抗体を産生じているか否かを、
適当な方法例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡｓ ｓ
ａｙ）で調べる。
ポリエチレングリコールがよく、とくにポリエチレング
リフール１５００が望ましい。濃度は分子量に従い４０
％〜５０％が使用され、ポリエチレングリコール１５０
０使用の場合は、ＲＰＭ Ｉ −１６４０で５０％に調
製して使用する。細胞融合は、まず前記の如き抗体産生
細胞と骨髄腫細胞を、ＲＰＭ Ｉ −１６４０で洗い、
前者と後者とを４：１〜１０：１の比率で混合し、８０
０Ｘ ｇ 、 ５分間程遠心分離を行ない沈殿させ、培
地をデカントする。このペレットに前記細胞融合剤を１
〜２Ｘ１０’細胞数当り１ ｔｄ （３７℃）位１分間
にわたりゆっくり攪拌しながら滴下し、更に攪拌を統け
ながら５〜１０分間かけて、徐々にＲＰＭ ｌ−１６４
０（３７℃、５〜１０ｍＱ）で懸濁する。４００〜６０
０Ｘ ｇ 、 ５分間遠心分離後、上澄をデカントし、
１５％ウマ血清含有ＲＰＭ Ｉ −１６４０で、細胞数
１〜２Ｘ１０’個／ＩＴＩＱに調製する。ハイブリドー
マの分離は、ＨＡＴ培地中での培養によるのが適当であ
る。（ＨＡＴセレクション）。まず、９６穴の組織培養
用のプレートの各穴に、前記融合の完了した細胞液を０
．１ｍｌずつ入れ、３７℃、２４時間培養し、０．１ｍ
ｌのＨＡＴ培地を加える。以後、１〜４日間隔で、半量
の培養液をＨＡＴ培地で置換しながら３週間程培養を続
ける。親細胸は全て死滅し、融合細胞のみ生育してくる
ので、以後は１５％ウマ血清添加ＲＰＭ Ｉ −１６４
０で培養し、抗体を産生させる。次にこれらのハイブリ
ドーマより、目的とする抗体を産生じているか否かを、
適当な方法例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡｓ ｓ
ａｙ）で調べる。
抗体のスクリーニング
甲状腺癌特異的モノクローナル抗体のスクリーニングに
は、ヒト甲状腺癌ａｔ織、甲状腺癌のリンパ節転移癌組
織並びにセルライン３Ｔ３（マウス正常細胞由来のセル
ライン、ＡＴＣＣにＣＣＬ９２として寄託されている）
、セルラインＴ−４７Ｄ（ヒト乳癌より分離確立された
セルライン、ＡＴＣＣにＨＴＢ−１３３として寄託され
ている）及びセルラインＫＡＴＯＩ［［（ヒト胃癌より
分離確立されたセルライン、新潟大学渡辺教授より入手
）の培養細胞等を前記免疫原の調製法に従い調製したも
のを抗原として用い、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳ Ａ
ｓ５ａｙ）によりスクリーニングする。
は、ヒト甲状腺癌ａｔ織、甲状腺癌のリンパ節転移癌組
織並びにセルライン３Ｔ３（マウス正常細胞由来のセル
ライン、ＡＴＣＣにＣＣＬ９２として寄託されている）
、セルラインＴ−４７Ｄ（ヒト乳癌より分離確立された
セルライン、ＡＴＣＣにＨＴＢ−１３３として寄託され
ている）及びセルラインＫＡＴＯＩ［［（ヒト胃癌より
分離確立されたセルライン、新潟大学渡辺教授より入手
）の培養細胞等を前記免疫原の調製法に従い調製したも
のを抗原として用い、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳ Ａ
ｓ５ａｙ）によりスクリーニングする。
まず上記抗原を調製し、適当な緩衝液例えば、炭酸ソー
ダ緩衝液（ｐＨ９，５）で３〜５尾／ｍｌに希釈し、９
６大のマイクロタイタープレートの各穴にコートする。
ダ緩衝液（ｐＨ９，５）で３〜５尾／ｍｌに希釈し、９
６大のマイクロタイタープレートの各穴にコートする。
４℃で一夜放置後、ポリオキシエチレンソルビタンモノ
ラウレート（ツイーン２０）含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ
）でよく洗い、例えばウマ血清によるブロッキング操作
後、前記ハイプリドーマ培養液をｏ、 １ｍＱずつ加え
、３７℃で５〜６時間放置する。
ラウレート（ツイーン２０）含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ
）でよく洗い、例えばウマ血清によるブロッキング操作
後、前記ハイプリドーマ培養液をｏ、 １ｍＱずつ加え
、３７℃で５〜６時間放置する。
次に培養液をデカントレ、前記ＦＢ！１１衝液でよく洗
った後、１％ノーマルヤギ血清を加え、３７°Ｃ２１時
間程静置し、非特異的吸着をブロックする６次いで前記
ＰＢＳ緩衝液で洗浄後、ヤギ抗マウスグロブリンのペル
オキシダーゼ結合ＩｇＧを加え、３７°Ｃ，４時間程イ
ンキュベート後、前記ＰＢＳ緩衝液でよく洗う。
った後、１％ノーマルヤギ血清を加え、３７°Ｃ２１時
間程静置し、非特異的吸着をブロックする６次いで前記
ＰＢＳ緩衝液で洗浄後、ヤギ抗マウスグロブリンのペル
オキシダーゼ結合ＩｇＧを加え、３７°Ｃ，４時間程イ
ンキュベート後、前記ＰＢＳ緩衝液でよく洗う。
基質ノオルトフェニレンジアミンジヒドロクロライド及
び過酸化水素含有クエン酸ソーダ緩衝液を加え、３０分
後に吸光度を測定する。抗体を産生じない細胞の培養液
をコントロールとして、各穴の吸光度との差により有意
の色素反応を呈したものを陽性とする。
び過酸化水素含有クエン酸ソーダ緩衝液を加え、３０分
後に吸光度を測定する。抗体を産生じない細胞の培養液
をコントロールとして、各穴の吸光度との差により有意
の色素反応を呈したものを陽性とする。
目的とする抗体は、ヒト甲状腺癌及び、甲状腺癌のリン
パ節転移癌由来抗原に陽性であり、セルライン３Ｔ３．
Ｔ−４７Ｄ及びＫＡＴＯＩ［［由来抗原には陰性のもの
とし、更に病理切片に対する特異性があることを確認し
、それを産生ずるハイブリドーマを得る。
パ節転移癌由来抗原に陽性であり、セルライン３Ｔ３．
Ｔ−４７Ｄ及びＫＡＴＯＩ［［由来抗原には陰性のもの
とし、更に病理切片に対する特異性があることを確認し
、それを産生ずるハイブリドーマを得る。
病理切１の 仏法
病理切片は、ヒト癌組織のホルマリン固定パラフィン切
片より調製する。
片より調製する。
キシレンにより脱パラフイン後、１００％エタノールよ
り７０％エタノールまで段階的処理を行ない、終りにＰ
ＢＳＩＩＩ衝液でよく洗う。切片にヒアルロニダーゼを
３７℃、１時間作用させＰＢＳ緩衝液で洗浄後、トラジ
ロール添加ノーマルヤギ血清で３７°Ｃ９１０分間イン
キュベートする。ＰＢＳ緩衝液で洗浄後、前記スクリー
ニング後のモノクローナル抗体を３７℃、２０分間反応
させる。又ＰＢＳ緩衝液で洗浄後、ヤギ抗マウスグロブ
リンのペルオキシダーゼ結合ＩｇＧフラクションを加え
、３０分間室温でインキュベートする。更にＰＢＳｉａ
衝液で洗浄後、過酸化水素を添加したＤＡＤ（３，３’
−ジアミノベンジダイン）飽和ＰＢＳ、８１衝液中に１
０分間浸漬する。ＰＢＳＩｌ衝液で洗浄した切片を、定
法に従いメチレンブルー染色し、エタノールにて脱水後
、キシレンで洗い病理切片とし、顕微鏡観察を行なう。
り７０％エタノールまで段階的処理を行ない、終りにＰ
ＢＳＩＩＩ衝液でよく洗う。切片にヒアルロニダーゼを
３７℃、１時間作用させＰＢＳ緩衝液で洗浄後、トラジ
ロール添加ノーマルヤギ血清で３７°Ｃ９１０分間イン
キュベートする。ＰＢＳ緩衝液で洗浄後、前記スクリー
ニング後のモノクローナル抗体を３７℃、２０分間反応
させる。又ＰＢＳ緩衝液で洗浄後、ヤギ抗マウスグロブ
リンのペルオキシダーゼ結合ＩｇＧフラクションを加え
、３０分間室温でインキュベートする。更にＰＢＳｉａ
衝液で洗浄後、過酸化水素を添加したＤＡＤ（３，３’
−ジアミノベンジダイン）飽和ＰＢＳ、８１衝液中に１
０分間浸漬する。ＰＢＳＩｌ衝液で洗浄した切片を、定
法に従いメチレンブルー染色し、エタノールにて脱水後
、キシレンで洗い病理切片とし、顕微鏡観察を行なう。
抗体産生網 のスクリーニング
目的とする癌特異的抗体産生ハイブリドーマは、適当な
方法で分別・培養し、単一細胞から由来する単一クロー
ン細胞株とする（クローニング）。リミティングダイリ
ューション法（限界希釈法）が一般的である。
方法で分別・培養し、単一細胞から由来する単一クロー
ン細胞株とする（クローニング）。リミティングダイリ
ューション法（限界希釈法）が一般的である。
例えば、Ｂ Ａ Ｌ Ｂ／Ｃマウスの胸腺細胞または脾
細胞をフィーダーとして１〜５ Ｘ １０’／ｒｎｆ１
になるように調製し、９６穴組織培養用プレートの各穴
に０．１ｍ１ｌずつ分注しておく。次に前記のスクリー
ニングした抗体産生ハイブリドーマのうすい懸濁液を作
り、前記プレートの各穴に分注する。
細胞をフィーダーとして１〜５ Ｘ １０’／ｒｎｆ１
になるように調製し、９６穴組織培養用プレートの各穴
に０．１ｍ１ｌずつ分注しておく。次に前記のスクリー
ニングした抗体産生ハイブリドーマのうすい懸濁液を作
り、前記プレートの各穴に分注する。
フィーダー及びハイブリドーマの懸濁は、ＨＡＴ培地又
はウマもしくは胎児好手血清添加ＲＰＭ ｌ−１６４０
培地で行ない、ハイブリドーマは各穴に１個ずつ入るよ
うに調製する。フィーダーは必ずしも加えなくともよい
０次いで、５％ＣＯ８培養装置にて３７°Ｃで培養する
と、１〜２週間後にクローンが生育してくる。顕微鏡で
１つの穴に１個のクローンのみ生育しているものを選び
、前記スクリーニングの方法で分析し、目的とする抗体
を産生じているクローンを選択する。
はウマもしくは胎児好手血清添加ＲＰＭ ｌ−１６４０
培地で行ない、ハイブリドーマは各穴に１個ずつ入るよ
うに調製する。フィーダーは必ずしも加えなくともよい
０次いで、５％ＣＯ８培養装置にて３７°Ｃで培養する
と、１〜２週間後にクローンが生育してくる。顕微鏡で
１つの穴に１個のクローンのみ生育しているものを選び
、前記スクリーニングの方法で分析し、目的とする抗体
を産生じているクローンを選択する。
Ｗ体り犬１オ進
スクリーニングされたハイブリドーマは、生体外培養ま
たは生体内培養のいずれにおいても、抗体産生せしめる
ことが可能である。
たは生体内培養のいずれにおいても、抗体産生せしめる
ことが可能である。
生体外培養は、ハイブリドーマを適当な栄養培地、例え
ば、胎児好手血清あるいはウマ血清を補充したＲ ＰＭ
Ｉ −１６４０培地中で適当時間培養すればよく、他
の免疫グロブリンを含まない純粋なモノクローナル抗体
を得るのに適している。多量のモノクローナル抗体を得
るには、生体内培養が好都合である。
ば、胎児好手血清あるいはウマ血清を補充したＲ ＰＭ
Ｉ −１６４０培地中で適当時間培養すればよく、他
の免疫グロブリンを含まない純粋なモノクローナル抗体
を得るのに適している。多量のモノクローナル抗体を得
るには、生体内培養が好都合である。
例えば、以下に示す方法で行なう。ＢＡＬＢ／Ｃマウス
に２．６，１０．１４−テトラメチルペンタデカン（ブ
リスタン）を０．５ｍｌｍｌ的投与し、２〜２０日経過
後、スクリーニングされたハイブリドーマを腹腔内に１
〜５Ｘ１０’個投与する。２〜３週間後に増殖、定着し
たハイブリドーマは腹水癌化した株であるので、必要画
数のマウスに腹腔内投与することにより、２〜３週間後
より連続して、目的とするモノクローナル抗体を含む腹
水を得ることができる。適当な方法により特異的な抗体
活性より確認し、適当な精製手段、例えば、硫安による
塩析法、ＤＥＡＥセルロース等によるイオン交換法、ゲ
ル濾過法、アフィニティクロマトグラフィー等により、
高純度の標品が得られる。
に２．６，１０．１４−テトラメチルペンタデカン（ブ
リスタン）を０．５ｍｌｍｌ的投与し、２〜２０日経過
後、スクリーニングされたハイブリドーマを腹腔内に１
〜５Ｘ１０’個投与する。２〜３週間後に増殖、定着し
たハイブリドーマは腹水癌化した株であるので、必要画
数のマウスに腹腔内投与することにより、２〜３週間後
より連続して、目的とするモノクローナル抗体を含む腹
水を得ることができる。適当な方法により特異的な抗体
活性より確認し、適当な精製手段、例えば、硫安による
塩析法、ＤＥＡＥセルロース等によるイオン交換法、ゲ
ル濾過法、アフィニティクロマトグラフィー等により、
高純度の標品が得られる。
モノクローナル抗体の特性
このようにして得られる甲状腺癌に特異的反応を示すモ
ノクローナル抗体の特性は次の通りである。
ノクローナル抗体の特性は次の通りである。
（１）分子量 約１６０．０００（２）
クラス・サブクラス Ｉ ｇＧ２ ａ（３）認識する
抗原物質 分子量約２５０．０００の高分子物質 り４）反応特異性 （４）−１甲状腺癌組織及び甲状腺癌のリンパ節転移組
織並びにセルライン３Ｔ３．Ｔ−４７１１１びＫＡＴＯ
ＩＩＩ培養細胞から調製された抗原に対する反応特異性
を抗体のスクリーニングに使用した酵素免疫測定法（Ｅ
ＬＩＳ Ａｓ５ａｙ）によって検討した結果、第１図
の如く甲状腺癌組織及び甲状腺癌のリンパ節転移組織よ
り調製した抗原にのみ強く反応し、マウス正常細胞３Ｔ
３やヒト乳癌細胞株Ｔ−４７Ｄきらにヒト胃癌細胞株Ｋ
ＡＴＯ■から調製した抗原には全く反応性を示さなかっ
た。
クラス・サブクラス Ｉ ｇＧ２ ａ（３）認識する
抗原物質 分子量約２５０．０００の高分子物質 り４）反応特異性 （４）−１甲状腺癌組織及び甲状腺癌のリンパ節転移組
織並びにセルライン３Ｔ３．Ｔ−４７１１１びＫＡＴＯ
ＩＩＩ培養細胞から調製された抗原に対する反応特異性
を抗体のスクリーニングに使用した酵素免疫測定法（Ｅ
ＬＩＳ Ａｓ５ａｙ）によって検討した結果、第１図
の如く甲状腺癌組織及び甲状腺癌のリンパ節転移組織よ
り調製した抗原にのみ強く反応し、マウス正常細胞３Ｔ
３やヒト乳癌細胞株Ｔ−４７Ｄきらにヒト胃癌細胞株Ｋ
ＡＴＯ■から調製した抗原には全く反応性を示さなかっ
た。
（４）−２甲状腺癌４８例について病理切片の染色法で
しめした免疫組織酵素抗体法によって染色した結果、第
１表の如く４８例金側が陽性であった。一方同一組織切
片の正常甲状腺部分には全く反応が見られなかった。
しめした免疫組織酵素抗体法によって染色した結果、第
１表の如く４８例金側が陽性であった。一方同一組織切
片の正常甲状腺部分には全く反応が見られなかった。
第１表
甲状腺癌組織 ４８ ４８ １００（
４）−３甲状腺腫（Ａｄｅｎｏｍａ ）、甲状腺腫隣接
正常甲状腺、慢性甲状腺炎、（Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｔｈｙ
ｒｏｉｄｉｔｉｓ）、甲状腺機能亢進症（Ｈｙｐｅｒ
Ｔｈｙｒｏｔｃｌｉｓｍｕｓ ）及び腺腫性甲状腺腫（
Ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ Ｇｏｉｔｅｒ ）の組織につ
いて、上記と同じ方法で染色した結果第２表の如く金側
陰性であった。
４）−３甲状腺腫（Ａｄｅｎｏｍａ ）、甲状腺腫隣接
正常甲状腺、慢性甲状腺炎、（Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｔｈｙ
ｒｏｉｄｉｔｉｓ）、甲状腺機能亢進症（Ｈｙｐｅｒ
Ｔｈｙｒｏｔｃｌｉｓｍｕｓ ）及び腺腫性甲状腺腫（
Ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ Ｇｏｉｔｅｒ ）の組織につ
いて、上記と同じ方法で染色した結果第２表の如く金側
陰性であった。
第２表
甲状腺腫 １４ ０甲状腺
腫隣接 １４ ０正常甲状腺 慢性甲状腺炎 ２０ 甲状腺機能冗進症 １０ （４）−４甲状腺癌以外の癌組織に対する反応性を上記
方法に従い調べた結果、第３表に示す如く、咽頭、食道
、肺、乳腺、胃、膵臓、胆嚢、卵巣、子宮及び精巣の癌
並びに神経膠腫に対しても全く反応しなかった。
腫隣接 １４ ０正常甲状腺 慢性甲状腺炎 ２０ 甲状腺機能冗進症 １０ （４）−４甲状腺癌以外の癌組織に対する反応性を上記
方法に従い調べた結果、第３表に示す如く、咽頭、食道
、肺、乳腺、胃、膵臓、胆嚢、卵巣、子宮及び精巣の癌
並びに神経膠腫に対しても全く反応しなかった。
第３表
癌組織 染色例 陽性咽 頭
１０ 食 道 ２゜ 肺 ４゜ 乳 腺 ６゜ 胃 ４０ 牌 臓 ３゜ 胆 嚢 ２゜ 卵 巣 １０ 子 宮 ３゜ 精 巣 ２゜ 神経膠腫 １゜ 計 ２９ ０上記の如く
、本発明のモノクローナル抗体は甲状腺癌にのみ特異的
に反応性を示し、良性の各種甲状腺疾患には反応せず、
更に甲状腺癌以外の癌にも反応しないので甲状腺癌の診
断に極めて有用なものである。
１０ 食 道 ２゜ 肺 ４゜ 乳 腺 ６゜ 胃 ４０ 牌 臓 ３゜ 胆 嚢 ２゜ 卵 巣 １０ 子 宮 ３゜ 精 巣 ２゜ 神経膠腫 １゜ 計 ２９ ０上記の如く
、本発明のモノクローナル抗体は甲状腺癌にのみ特異的
に反応性を示し、良性の各種甲状腺疾患には反応せず、
更に甲状腺癌以外の癌にも反応しないので甲状腺癌の診
断に極めて有用なものである。
実施例
次に実施例を挙げて説明する。
実施例１ モノクローナル抗体の製造
１−１ 免疫原の製造
ヒトの甲状腺癌組織を水冷下で細切し、５％ショ糖（％
＃／賢）含有ＴＨＥ緩衝液（０，０１Ｍトリス−塩酸（
ｐＨ７，５）、０．１５Ｍ ＮａＧ 、 ０．００３Ｍ
ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０＞）中で細胞破砕装置を用いホモ
ジナイズする。その際、上記トリス塩酸緩衝液は、癌組
織１ｇ当り４ｍｌの割合で加え、１５秒被破砕後０秒冷
却する操作を４回繰り返す。次いで６５０Ｘｇで１０分
間遠心分離すると、核小体、ミドフンドリア等は沈殿し
、目的とする免疫原成分を含む上ｉｇ（ｓｕｐ−２）が
得られる。
＃／賢）含有ＴＨＥ緩衝液（０，０１Ｍトリス−塩酸（
ｐＨ７，５）、０．１５Ｍ ＮａＧ 、 ０．００３Ｍ
ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０＞）中で細胞破砕装置を用いホモ
ジナイズする。その際、上記トリス塩酸緩衝液は、癌組
織１ｇ当り４ｍｌの割合で加え、１５秒被破砕後０秒冷
却する操作を４回繰り返す。次いで６５０Ｘｇで１０分
間遠心分離すると、核小体、ミドフンドリア等は沈殿し
、目的とする免疫原成分を含む上ｉｇ（ｓｕｐ−２）が
得られる。
次に２０％ショ糖（Ｗ／Ｗ）含有ＴＮＥ緩衝液８ｍｌと
５０％ショ糖（Ｗ／賀）含有ＴＮＥ緩衝液６＋ｎＱの不
連続密度勾配を作り上記上澄（ｓｕｐ−２）２５ｒｄを
重層し、ｓｗ２７のスインギングパケットで１００．０
００Ｘ ｇ 、 ９０分間遠心分離を行なう。目的免疫
原を含む分画は、密度の異なる両緩衝液の界にて得られ
る６次いで１５ｍ１ずつの２０％（Ｗ／Ｗ）ショ糖含有
ＴＨＥ緩衝液と、５０％（Ｗ／Ｗ）ショ糖含有ＴＨＥ緩
衝液を用い、連続密度勾配を作り、その上に２０％ショ
糖濃度になるように、ＴＨＥ緩衝液で調製した上記の不
連続密度勾配遠心で密度界面に得られた試料１０ｍ１１
を重層し、１００．０００Ｘ ｇ 、 １２時間ｓｗ２
７にて遠心分離を行なう。遠心分離後スインギングパケ
ットの底より１．２ｍ１ｌずつ３２〜３３分画に分ける
。糖の密度を測定し、１．１９１ρ〜１．２１０ρ（４
１，６％〜４５．２％糖濃度）密度の分画を集め、ＴＮ
Ｅｍ衝液で糖濃度が２０％以下になるように調製し、１
００．０００Ｘ ｇ 、９０分間遠心分離を行ない、ペ
レットを採取することにより目的とする免疫原が得られ
る。
５０％ショ糖（Ｗ／賀）含有ＴＮＥ緩衝液６＋ｎＱの不
連続密度勾配を作り上記上澄（ｓｕｐ−２）２５ｒｄを
重層し、ｓｗ２７のスインギングパケットで１００．０
００Ｘ ｇ 、 ９０分間遠心分離を行なう。目的免疫
原を含む分画は、密度の異なる両緩衝液の界にて得られ
る６次いで１５ｍ１ずつの２０％（Ｗ／Ｗ）ショ糖含有
ＴＨＥ緩衝液と、５０％（Ｗ／Ｗ）ショ糖含有ＴＨＥ緩
衝液を用い、連続密度勾配を作り、その上に２０％ショ
糖濃度になるように、ＴＨＥ緩衝液で調製した上記の不
連続密度勾配遠心で密度界面に得られた試料１０ｍ１１
を重層し、１００．０００Ｘ ｇ 、 １２時間ｓｗ２
７にて遠心分離を行なう。遠心分離後スインギングパケ
ットの底より１．２ｍ１ｌずつ３２〜３３分画に分ける
。糖の密度を測定し、１．１９１ρ〜１．２１０ρ（４
１，６％〜４５．２％糖濃度）密度の分画を集め、ＴＮ
Ｅｍ衝液で糖濃度が２０％以下になるように調製し、１
００．０００Ｘ ｇ 、９０分間遠心分離を行ない、ペ
レットを採取することにより目的とする免疫原が得られ
る。
１−２ マウス牌細胞の免疫化
６週齢のＢ Ａ Ｌ Ｂ／Ｃ又はＮＺＢマウスの腹腔に
、当量のフロイント完全アジュバントを含むＰＢＳ緩衝
液０．３ｒ＋ｔＱに溶解した実施例１−１にて調製した
免疫原５０Ｐｇを投与し、１週間後に、当量のフロイン
ト完全アジュバントを含むＰＢＳｉ衝液０．３ｍ１ｌに
溶解した上記免疫原２５尾を腹腔内投与する。更に１週
間後に、ＰＢＳ！１衝液０．３ｒｎｆＬに溶解した上記
免疫原５尾を尾静脈投与する。次いで３日後に肺臓を摘
出し、ＰＢＳ緩衝液で洗い、ステンレスメツシュで濾し
て単一細胞の懸濁液とし、次いでＰＢＳｉａ衝液にて１
！１胞数を２×１０１個／ｍｆ１になるように調製する
。
、当量のフロイント完全アジュバントを含むＰＢＳ緩衝
液０．３ｒ＋ｔＱに溶解した実施例１−１にて調製した
免疫原５０Ｐｇを投与し、１週間後に、当量のフロイン
ト完全アジュバントを含むＰＢＳｉ衝液０．３ｍ１ｌに
溶解した上記免疫原２５尾を腹腔内投与する。更に１週
間後に、ＰＢＳ！１衝液０．３ｒｎｆＬに溶解した上記
免疫原５尾を尾静脈投与する。次いで３日後に肺臓を摘
出し、ＰＢＳ緩衝液で洗い、ステンレスメツシュで濾し
て単一細胞の懸濁液とし、次いでＰＢＳｉａ衝液にて１
！１胞数を２×１０１個／ｍｆ１になるように調製する
。
１−３免疫化牌細胞とマウス骨髄腫細胞との畝立
使用するマウス骨髄腫細胞は、例えばＫｏｈｌｅｒ等に
よってＥｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、６２９２〜２９５
（１９７６）に記載されているように、ＢＡＬＢ／Ｃマ
ウスＭＯＰＣ２１から誘導されたもので、マウス骨髄腫
ＮＳ−１と呼ばれている。まず、ＲＰＭ Ｉ −１６４
０完全培地（グルタミン２ｍＭ、ピルビン酸ソーダ１ｍ
Ｍ。
よってＥｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、６２９２〜２９５
（１９７６）に記載されているように、ＢＡＬＢ／Ｃマ
ウスＭＯＰＣ２１から誘導されたもので、マウス骨髄腫
ＮＳ−１と呼ばれている。まず、ＲＰＭ Ｉ −１６４
０完全培地（グルタミン２ｍＭ、ピルビン酸ソーダ１ｍ
Ｍ。
フンキノン０．２５ｑ／＋ｎ１１．ストレプトマイシン
５０所、ペニシリン５０ ｕｎｉｔ／ ｍｆｌ、ウマ血
清１５％）で培養した対数増殖期のマウス骨髄腫細胞を
、ウマ血清不合のＲＰＭ ｌ−１６４０の培地で洗い、
細胞数５×１０″個／ｍＱになるように、ウマ血清不含
ＲＰＭ ｌ−１６４０培地で調製する０次に実施例１−
２で調製した免疫化マウス牌細胞懸濁液４０ｍ１ｌと、
上記マウス骨髄腫細胞懸濁液１０ＴｎＱを混合し、８０
０×ｇで５分間遠心分離してペレットを形成させ、上澄
はデカントにより完全に除く、このペレットに、３７℃
に加温したポリエチレングリフール（ＰＥＧ−１５００
）溶液（ウマ血清不含ＲＰＭＩ−１６４０で５０％濃度
に調製したＰＥＧ−１５００溶液）１ｍｌｌを、攪拌し
ながら徐々に加え、１分間攪拌を続ける。次に、ウマ血
清不含ＲＰＭ Ｉ −１６４０６ｍｌを、攪拌を続けな
がら６〜７分間にわたり徐々に加える。６００Ｘｇ、５
分間遠心分離し、ウマ血清不含ＲＰＭＩ−１６４０を除
いた後、ＲＰＭＩ−１６４０を加えて、細胞数２ＸｌＯ
’個／ＴＩＩＱの懸濁液とする。
５０所、ペニシリン５０ ｕｎｉｔ／ ｍｆｌ、ウマ血
清１５％）で培養した対数増殖期のマウス骨髄腫細胞を
、ウマ血清不合のＲＰＭ ｌ−１６４０の培地で洗い、
細胞数５×１０″個／ｍＱになるように、ウマ血清不含
ＲＰＭ ｌ−１６４０培地で調製する０次に実施例１−
２で調製した免疫化マウス牌細胞懸濁液４０ｍ１ｌと、
上記マウス骨髄腫細胞懸濁液１０ＴｎＱを混合し、８０
０×ｇで５分間遠心分離してペレットを形成させ、上澄
はデカントにより完全に除く、このペレットに、３７℃
に加温したポリエチレングリフール（ＰＥＧ−１５００
）溶液（ウマ血清不含ＲＰＭＩ−１６４０で５０％濃度
に調製したＰＥＧ−１５００溶液）１ｍｌｌを、攪拌し
ながら徐々に加え、１分間攪拌を続ける。次に、ウマ血
清不含ＲＰＭ Ｉ −１６４０６ｍｌを、攪拌を続けな
がら６〜７分間にわたり徐々に加える。６００Ｘｇ、５
分間遠心分離し、ウマ血清不含ＲＰＭＩ−１６４０を除
いた後、ＲＰＭＩ−１６４０を加えて、細胞数２ＸｌＯ
’個／ＴＩＩＱの懸濁液とする。
１−４ ８ＡＴセレクション
実施例１−３で調製した細胞懸濁液を、９６大の組織培
養用プレートの各穴に０．１憾ずつ分注し、５％ＣＯ２
培養装置中で３７℃で培養する。２４時間後、各穴の培
養液に０．１ｍｌのＨＡＴ培地（ヒボキサンチン、アミ
ノプテリン及びチミジン含有ＲＰ Ｍ Ｉ −１６４０
（Ｌｉｔｔｌｅｆｉｅｌｄ、５ｃｉｅｎｃｅ １４５７
０９〜７１０．１９６４ ）を加え、次に０．１ｍｌず
つ培養液を除き、培養を続ける。更に培養開始より２日
、３日、５日、８日、１１日、１４日、１７日、２１日
毎に、上記の如く、培養液の半量をＨＡＴ培地で置換す
る操作を繰り返す。このＨＡＴセレクションにより骨髄
腫細胞は死滅し、融合細胞のみ生育してくる。生育して
きたハイプリドーマをウマ血清添加ＲＰＭ ｌ−１６４
０で培養し、その培養液を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳ
Ａｓ５ａｙ）の分析試料とする。
養用プレートの各穴に０．１憾ずつ分注し、５％ＣＯ２
培養装置中で３７℃で培養する。２４時間後、各穴の培
養液に０．１ｍｌのＨＡＴ培地（ヒボキサンチン、アミ
ノプテリン及びチミジン含有ＲＰ Ｍ Ｉ −１６４０
（Ｌｉｔｔｌｅｆｉｅｌｄ、５ｃｉｅｎｃｅ １４５７
０９〜７１０．１９６４ ）を加え、次に０．１ｍｌず
つ培養液を除き、培養を続ける。更に培養開始より２日
、３日、５日、８日、１１日、１４日、１７日、２１日
毎に、上記の如く、培養液の半量をＨＡＴ培地で置換す
る操作を繰り返す。このＨＡＴセレクションにより骨髄
腫細胞は死滅し、融合細胞のみ生育してくる。生育して
きたハイプリドーマをウマ血清添加ＲＰＭ ｌ−１６４
０で培養し、その培養液を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳ
Ａｓ５ａｙ）の分析試料とする。
実施例１−１の方法に従って、ヒト甲状腺癌組織、甲状
腺癌のリンパ節転移組織並びにセルライン３Ｔ３、セル
ラインＴ−４７Ｄ及びセルラインＫＡＴＯＩ［［の培養
細胞から調製したものを抗原とし酵素免疫測定法（ＥＬ
ＩＳ Ａｓ５ａｙ）を行なう。これらの抗原を炭酸ソ
ーダ緩衝液（０，０５ＭＮａＨＣＯｍ 、 ０．０５Ｍ
Ｎａ＊ＣＯ＊ 、 Ｉ）Ｈ９，５）にて４ Ｐｇ／
＋ｎＱ ６度に希釈する。次に９６穴のマイクロタイタ
ープレートの各穴に、それぞれｏ、 １ｍＱずつ分注し
、プレートの表面をシールした後、４°Ｃ−夜装置する
。翌朝０．０５％ポリオキシエチレンソルビクンモノラ
ウレート（ツイーン２０）を含むＰＢＳ緩衝液でよく洗
った後、実施例１−４で調製したハイブリドーマの＠養
液０．１ｍｌずつを各穴に加え、３７°Ｃにて６時間放
置する。コントロールとして、抗体産生じていない細胞
の培養液を使用する。
腺癌のリンパ節転移組織並びにセルライン３Ｔ３、セル
ラインＴ−４７Ｄ及びセルラインＫＡＴＯＩ［［の培養
細胞から調製したものを抗原とし酵素免疫測定法（ＥＬ
ＩＳ Ａｓ５ａｙ）を行なう。これらの抗原を炭酸ソ
ーダ緩衝液（０，０５ＭＮａＨＣＯｍ 、 ０．０５Ｍ
Ｎａ＊ＣＯ＊ 、 Ｉ）Ｈ９，５）にて４ Ｐｇ／
＋ｎＱ ６度に希釈する。次に９６穴のマイクロタイタ
ープレートの各穴に、それぞれｏ、 １ｍＱずつ分注し
、プレートの表面をシールした後、４°Ｃ−夜装置する
。翌朝０．０５％ポリオキシエチレンソルビクンモノラ
ウレート（ツイーン２０）を含むＰＢＳ緩衝液でよく洗
った後、実施例１−４で調製したハイブリドーマの＠養
液０．１ｍｌずつを各穴に加え、３７°Ｃにて６時間放
置する。コントロールとして、抗体産生じていない細胞
の培養液を使用する。
次に培養液をデカントし、０．０５％ツイーン２０添加
ＰＢＳ緩衝液で５回洗い、１％ノーマルヤギ血清添加Ｐ
ＢＳｍ街液０．１＋ｎｌｌずつを加え、３７℃、１時間
放置後、ツイーン２０添加ＰＢＳ緩衝液でよく洗う。
ＰＢＳ緩衝液で５回洗い、１％ノーマルヤギ血清添加Ｐ
ＢＳｍ街液０．１＋ｎｌｌずつを加え、３７℃、１時間
放置後、ツイーン２０添加ＰＢＳ緩衝液でよく洗う。
次に、冷凍ストックからの１：３０にＰＢＳ緩衝液で希
釈したヤギ抗マウスグロブリンのワサビペルオキシグー
ゼ結合ＩｇＧフラクションを０．１ｍｌずつ加え、３７
°Ｃ，４時間インキュベートする。
釈したヤギ抗マウスグロブリンのワサビペルオキシグー
ゼ結合ＩｇＧフラクションを０．１ｍｌずつ加え、３７
°Ｃ，４時間インキュベートする。
各穴をツイーン２０添加ＰＢＳａ衝液で４回洗い、基質
として１／１００容の４０ｍＭ ＡＢＴＳ ［２。
として１／１００容の４０ｍＭ ＡＢＴＳ ［２。
２′−アジノージ−（３−エチルベンゾチアゾリン）ス
ルホン酸ジアンモニウム塩］ 及ヒ１ ／１００容の０
．００５％過酸化本業を含む０．５％クエン酸リす酸ソ
ーダ＠衝液（ｐＨ５，８）を加える。３０分後に各穴の
吸光度を測定する。コントロールより有意の色素反応を
呈したものを陽性とし、甲状腺癌及び甲状腺癌のリンパ
節転移癌組織から調製した抗原に反応し、セルライン３
Ｔ３．Ｔ−４７Ｄ及びＫＡＴＯＩＩＩから調製した抗原
に反応しないものを選び出す。更に病理組織切片に対す
る反応特異性があることを確認し、限界希釈法によるク
ローニングを行なう。
ルホン酸ジアンモニウム塩］ 及ヒ１ ／１００容の０
．００５％過酸化本業を含む０．５％クエン酸リす酸ソ
ーダ＠衝液（ｐＨ５，８）を加える。３０分後に各穴の
吸光度を測定する。コントロールより有意の色素反応を
呈したものを陽性とし、甲状腺癌及び甲状腺癌のリンパ
節転移癌組織から調製した抗原に反応し、セルライン３
Ｔ３．Ｔ−４７Ｄ及びＫＡＴＯＩＩＩから調製した抗原
に反応しないものを選び出す。更に病理組織切片に対す
る反応特異性があることを確認し、限界希釈法によるク
ローニングを行なう。
１−６ 組織切片の 仏法
ヒト甲状腺癌及び、甲状腺癌のリンパ節転移組織のホル
マリン固定パラフィン切片をまず、キシレンに浸し、パ
ラフィンを溶出させ、次いで１００％〜７０％エタノー
ル溶液に段階的に浸し、終りにＰＢＳ緩衝液でよく洗浄
する。
マリン固定パラフィン切片をまず、キシレンに浸し、パ
ラフィンを溶出させ、次いで１００％〜７０％エタノー
ル溶液に段階的に浸し、終りにＰＢＳ緩衝液でよく洗浄
する。
つぎにヒアルロニダーゼ（６００ｕｎｉｔ／ ｍＱＯ，
ＯＬＭＰＢＳ緩衝液ｐＨ６，５） ０．１５ｙｎＱを、
切片に３７℃、１時間作用させる。ＰＢＳ緩衝液で洗浄
後、蛋白分解酵素阻害剤のトラジロール０．５ ｕｎｉ
ｔ／ ｍｆＬを添加したノーマルヤギ血清（ＰＢＳ緩衝
液にて５０％濃度に調製）で、３７℃、１０分間インキ
ュベートし、組織への非特異的な吸着をブロックする。
ＯＬＭＰＢＳ緩衝液ｐＨ６，５） ０．１５ｙｎＱを、
切片に３７℃、１時間作用させる。ＰＢＳ緩衝液で洗浄
後、蛋白分解酵素阻害剤のトラジロール０．５ ｕｎｉ
ｔ／ ｍｆＬを添加したノーマルヤギ血清（ＰＢＳ緩衝
液にて５０％濃度に調製）で、３７℃、１０分間インキ
ュベートし、組織への非特異的な吸着をブロックする。
ＰＢＳ緩衝液で静かに洗浄後、実施例１−５でスクリー
ニングしたモノクローナル抗体で、３７℃、２０分間イ
ンキュベートする。ＰＢＳＩＩ衝液で３回洗浄後、ヤギ
抗マウスグロブリンのワサビペルオキシダーゼ結合Ｉｇ
Ｇフラクション（ＰＢＳ緩衝液で全ヤギ血清に対し１０
０ｑ Ｉ ｇ ０７ｍに調製）を室温にて３０分間作用
させる。更にＰＢＳ緩衝液で洗浄後、過酸化水素０．０
０５％を添加したＤＡＢ（３゜３°−ジアミノベンジダ
イン）飽和ＰＢＳｕ街液中に、室温にて１０分間浸す。
ニングしたモノクローナル抗体で、３７℃、２０分間イ
ンキュベートする。ＰＢＳＩＩ衝液で３回洗浄後、ヤギ
抗マウスグロブリンのワサビペルオキシダーゼ結合Ｉｇ
Ｇフラクション（ＰＢＳ緩衝液で全ヤギ血清に対し１０
０ｑ Ｉ ｇ ０７ｍに調製）を室温にて３０分間作用
させる。更にＰＢＳ緩衝液で洗浄後、過酸化水素０．０
０５％を添加したＤＡＢ（３゜３°−ジアミノベンジダ
イン）飽和ＰＢＳｕ街液中に、室温にて１０分間浸す。
次いでＰＢＳ緩衝液中にて洗浄、メチレンブルーで染色
し、７０％〜１００％のエタノールで、段階的に脱水を
行ない、終りにキシレンで洗い、病理切片とする。
し、７０％〜１００％のエタノールで、段階的に脱水を
行ない、終りにキシレンで洗い、病理切片とする。
１−７ 限 希釈法
実施例１−５でスクリーニングしたハイブリドーマをウ
マ血清添加ＲＰＭ Ｉ −１６４０で培養し、次いで、
細胞数１００個／ｍＱ、５０個／ｍＱ、 １０個／ｍｌ
！及び５個ＺＴＩＩｌｌに、ウマ卑情添加ＲＰＭ Ｉ
−１６４０で希釈する。次に、各々の懸濁液を９６穴組
織培養用プレートに０．１ｒｎｌｌずつ分注し培養する
。細胞増殖の認められた穴の培養液を、実施例１−５の
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳ Ａｓ５ａｙ）に従い、抗
体産生の有無を調べる。この操作を２度繰り返して、単
一クローン細胞を得た。
マ血清添加ＲＰＭ Ｉ −１６４０で培養し、次いで、
細胞数１００個／ｍＱ、５０個／ｍＱ、 １０個／ｍｌ
！及び５個ＺＴＩＩｌｌに、ウマ卑情添加ＲＰＭ Ｉ
−１６４０で希釈する。次に、各々の懸濁液を９６穴組
織培養用プレートに０．１ｒｎｌｌずつ分注し培養する
。細胞増殖の認められた穴の培養液を、実施例１−５の
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳ Ａｓ５ａｙ）に従い、抗
体産生の有無を調べる。この操作を２度繰り返して、単
一クローン細胞を得た。
１−８ 抗体の大量生産
ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、ブリスタン０．５ｍＱを腹腔内
投与し、２０日後に実施例１−７で得た単一クローン化
ハイブリドーマを２Ｘ１０’個接種する。
投与し、２０日後に実施例１−７で得た単一クローン化
ハイブリドーマを２Ｘ１０’個接種する。
１０〜２０日後に腹水癌が現われ、腹水癌株が得られる
。この腹水癌株を、他の複数のＢ Ａ Ｌ Ｂ／Ｃマウ
スに２Ｘ１０’個程度、腹腔内投与すると、２〜３週間
後より目的とするモノクローナル抗体を含む腹水が得ら
れる。
。この腹水癌株を、他の複数のＢ Ａ Ｌ Ｂ／Ｃマウ
スに２Ｘ１０’個程度、腹腔内投与すると、２〜３週間
後より目的とするモノクローナル抗体を含む腹水が得ら
れる。
１−９ 抗体の精製
実施例１−８により得られる抗体を含有する腹水１０ｍ
１に、当量のＰＢＳ緩衝液を加え、次いで、３６％Ｎａ
＊Ｓ０ＳＯ４２Ｏを加え、最終的に１８％Ｎａ１ｓＯ４
溶液とする。 １０．０００ ｒ、ｐ、ｍ、１５分間遠
心分離し、上澄を除去し、ペレットをＰＢＳ緩衝液で一
夜透析する０次いでプロティンＡセファロース４Ｂカラ
ムに吸着させ、酢酸緩衝液（０，１Ｍ酢酸、０．１４Ｍ
ＮａＧ ｐＨ５，０，４，３）で溶出するフラクション
をプールする６分析の結果、得られたモノクローナル抗
体は分子量約１６０．０００であり、クラス・サブクラ
スはＩ ｇＧ２ ａであった。
１に、当量のＰＢＳ緩衝液を加え、次いで、３６％Ｎａ
＊Ｓ０ＳＯ４２Ｏを加え、最終的に１８％Ｎａ１ｓＯ４
溶液とする。 １０．０００ ｒ、ｐ、ｍ、１５分間遠
心分離し、上澄を除去し、ペレットをＰＢＳ緩衝液で一
夜透析する０次いでプロティンＡセファロース４Ｂカラ
ムに吸着させ、酢酸緩衝液（０，１Ｍ酢酸、０．１４Ｍ
ＮａＧ ｐＨ５，０，４，３）で溶出するフラクション
をプールする６分析の結果、得られたモノクローナル抗
体は分子量約１６０．０００であり、クラス・サブクラ
スはＩ ｇＧ２ ａであった。
免丑五力１
以上詳述したように本発明のモノクローナル抗体は甲状
腺癌にのみ特異的に抗原抗体反応性を示し、甲状腺の各
種の良性疾患には反応性を示さず、更に甲状腺癌以外の
種々の癌にも反応性を示さない、極めて優れた性質を有
するので、甲状腺癌の診断には非常に有効である。
腺癌にのみ特異的に抗原抗体反応性を示し、甲状腺の各
種の良性疾患には反応性を示さず、更に甲状腺癌以外の
種々の癌にも反応性を示さない、極めて優れた性質を有
するので、甲状腺癌の診断には非常に有効である。
第１図は本発明抗体の各種抗原の各濃度に対する反応特
異性を示す吸光度分布図である。
異性を示す吸光度分布図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ヒト甲状腺癌特異抗原を認識するモノクローナル抗
体 ２、分子量が１６０，０００であり、クラス・サブクラ
スがＩｇＧ２ａである特許請求の範囲第１項記載のモノ
クローナル抗体 ３、分子量が約２５０，０００のタンパク成分を含むヒ
ト甲状腺癌特異抗原を認識する特許請求の範囲第１項記
載のモノクローナル抗体 ４、ヒト甲状腺癌細胞をホモジナイズした細砕混合物を
遠心分離し、その上澄を不連続ショ糖密度勾配液中遠心
分離し、密度勾配の不連続面に集まった分画を採集した
後、これを連続ショ糖密度勾配液に重層し、超遠心分離
を行なって密度１．１９１ρ〜１．２１０ρの癌特異的
抗原に富んだ分画を分離し、これを抗原として動物を免
疫し、その免疫脾細胞と骨髄腫細胞との融合細胞を作り
、目的とする抗体を産生するハイブリドーマをスクリー
ニングし、クローニングを行ない、次いで培養すること
により得られる特許請求の範囲第１項記載のモノクロー
ナル抗体
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6441186 | 1986-03-20 | ||
| JP61-64411 | 1986-03-20 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6312295A true JPS6312295A (ja) | 1988-01-19 |
Family
ID=13257528
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62063165A Pending JPS6312295A (ja) | 1986-03-20 | 1987-03-18 | 甲状腺癌特異抗原に対するモノクロ−ナル抗体 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0238320A3 (ja) |
| JP (1) | JPS6312295A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007061063A (ja) * | 2005-09-02 | 2007-03-15 | Hiroshi Takeyama | 甲状腺癌抗原を認識するポリペプチド |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0370768A3 (en) * | 1988-11-22 | 1990-09-26 | Taisho Pharmaceutical Co. Ltd | Monoclonal antibody for the antigen specific to carcinoma of the thyroid |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2142428A (en) * | 1983-06-23 | 1985-01-16 | Erba Farmitalia | Adenocarcinoma related antigenic determinants and antibodies specific thereto |
-
1987
- 1987-03-18 JP JP62063165A patent/JPS6312295A/ja active Pending
- 1987-03-18 EP EP87302314A patent/EP0238320A3/en not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007061063A (ja) * | 2005-09-02 | 2007-03-15 | Hiroshi Takeyama | 甲状腺癌抗原を認識するポリペプチド |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0238320A2 (en) | 1987-09-23 |
| EP0238320A3 (en) | 1989-01-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1320459C (en) | Anti-human pulmonary carcinoma monoclonal antibody | |
| JPWO1986004092A1 (ja) | ヒト癌特異的モノクロナ−ル抗体の製造法 | |
| NO175944B (no) | Monoklonale antistoffer for anvendelse til in vitro påvisning av tumorassosiert mucinantigen, og hybridomcellelinjer som produserer disse | |
| EP0163141A2 (en) | Monoclonal anti-human IgG antibody and process for preparing the same | |
| US4898932A (en) | Monoclonal antibodies reactive with activated and oncogenic ras p21 proteins | |
| EP0154550A2 (en) | Monoclonal antibodies capable of binding to pancreatic carcinoma of ductal origin | |
| JPH05500454A (ja) | 結腸癌のムチンエピトープに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマｃｔ４３ | |
| CA1238285A (en) | Monoclonal antibody specific for a mammary tumor cytoplasmis antigen | |
| JPS6312295A (ja) | 甲状腺癌特異抗原に対するモノクロ−ナル抗体 | |
| EP0218257A2 (en) | Anti-human pulmonary adenocarcinoma specific monoclonal antibody | |
| CA1231067A (en) | Monoclonal antibody to peroxidase and hybridoma producing it | |
| JPH02238893A (ja) | 甲状腺癌特異抗原に対するモノクローナル抗体 | |
| JP4493882B2 (ja) | 抗原およびこの抗原を識別するモノクローナル抗体 | |
| EP0370768A2 (en) | Monoclonal antibody for the antigen specific to carcinoma of the thyroid | |
| US4894327A (en) | Anti-human mesothelial cell monoclonal antibody | |
| EP0207170A1 (en) | Process for preparing human cancer-specific monoclonal antibody | |
| CN114213542B (zh) | Cps-i抗体及其用途 | |
| JP2743015B2 (ja) | Ｏ―アセチル化されたガングリオシドｇｍ▲下３▼に特異的なモノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ及びその作製方法 | |
| JPH01231893A (ja) | 抗ヒトプロテインｓモノクローナル抗体およびその利用 | |
| JP3180125B2 (ja) | ヒト成熟骨髄腫細胞に対するモノクローナル抗体 | |
| CA2115171C (en) | Monoclonal antibodies to human pulmonary surfactant apoprotein d and use thereof | |
| JPS63157995A (ja) | 抗ヒト大腸癌単クロ−ン性抗体ａｃｃ−５７４ | |
| JPS61250000A (ja) | モノクロ−ナル抗体 | |
| JP2845568B2 (ja) | モノクローナル抗体 | |
| JPH0549495A (ja) | モノクローナル抗体及びヒト血漿α（１→３）フコース転移酵素の定量方法 |