JPH02238900A - 架橋補体を用いるヌクレオチドプローブの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 特異的オリゴヌクレオチド配列（　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
）は相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）ヌクレオチ
ド配列を検出する極めて有用な手段である。核酸グロー
ブの二つの必要条件は、配列特異的シグナル、及び単一
のハイプリダイゼτション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏ
ｎ）事象を多重的検出可能な事象に変換する要素の形成
である。標識プローブを製造する現在の酵素的方法にお
いては、放射性又はビオチン化された（ｂｉｏｔｉｎｙ
ｌａｔｅｄ）ヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼ又は末
端転移酵素のような重合酵素の使用によりプローブ中に
導入されている。単一な酵素又はハプテン分子を化学的
にＤＮＡ中に導入する多くの方法が利用できるが、これ
らの単一に標識されたグローブは充分なシグナル（ｓｉ
ｇｎａｌ）を発生せず、従って生物学的試料中の相補的
配列を検出するのに必要な感度を欠いている。

ワード（Ｗａｒｄ）等の米国特許第４．７１１，９５５
号は化学的決定因子（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）を用い
てヌクレオチドを誘導体化（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅ）す
ることから成るヌクレオチドブローブを標識する方法を
開示している。誘導体化されたヌクレオチドは次いで酵
素的に重合される。こうしてこれらの類似体は核酸ポリ
メラーゼに対し基質として作用する。この目的のために
は化学的決定因子が環上の位置に置かれず立体的に、言
い換えれば、塩基の正常のワトソン・クリック（Ｗａｔ
ｓｏｎ　Ｃｒｉｃｋ）水素結合ポテンシャルを妨害する
ような位置に置かれることが重要である。

本発明の総括 本発明は当技術分野に既知の標識された核酸プローブの
合成とは別な方法を提供する。本方法によれば第一の“
標的認識成分”及び第二の“シグナル発生成分”を有す
るプロープを生じる。各成分は３′及び５′末端を構成
し、二種の成分は相互に３″−５′配置で結合している
。本方法は下記の：ａ）少なくとも約４のヌクレオチド
塩基の第一特異末端配列を有する“標的認識成分”を提
供すること、 ｂ）それに結合した多重標識を有し、及び又少なくとも
約４ヌクレオチド塩基の第二の特異的末端配列を有する
第二の“シグナル発生成分”を提供し、 Ｃ）架橘（ｂｒ　ｉｄｇ　ｉｎｇ）補体（ｃｏｍｐｌｅ
ｍｅｎｔ）中の該ヌクレオチドの少なくとも約４は、該
“標的認識成分“の該特異的末端配列とハイブリダイズ
することができ、そして該架橋補体中の少なくとも約４
の他のヌクレオチドは該“シグナル発生成分”の特異的
末端とハイブリダイズすることができる、約８−２５ヌ
クレオチドのヌクレオチド配列から成る第三の架橘補体
を提供し； ｄ）適当なハイブリダイズする条件下で該架橘補体と該
″標的認識成分”の第一の特異的末端配列及び該“シグ
ナル発生成分”の第二の特異的末端配列とハイブリダイ
ズして総ての三種のノ１イブリダイゼーションした複合
体を形成させ；その際、該成分の一つの３゜末端は他者
の５′末端と整合（ａｌｉｇｎ）Ｌ、該３゜末端及び該
５゛末端は第一及び第二成分の間に３’−５’糖一燐酸
結合の形成を可能とするような方式で相互に相対的な位
置を占めており；及び ｅ）該第一及び第二成分の該３″末端及び該５″末端の
間に該糖一燐酸化学結合の形成を可能とするのに効果的
な量を用い及び時間をかけて、該複合体を核酸連結（ｌ
ｉｇａｔｉｏｎ）手段と接触させ、相互に化学的に結合
した該“標的認識成分”と該“シグナル発生成分”から
成るヌクレオチドプローブを生成する 段階から成る。

この糖一燐酸結合の生成後に、本発明の方法は化学的に
結合した該成分を有する該複合体と、該複合体から該架
橘補体を除去することができる酵素との接触から成る、
段階（ｆ）を含んでいる。

本発明は又この二成分の化学的結合体から形成された標
識されたヌクレオチドプローブ、及び該プローブを含む
診断用及び研究用試薬を提供する。

本文で使用されるような“ヌクレオチドグローブという
用語は配列の一部として、被検ヌクレオチド配列に、少
なくとも部分的にノ−イブリダイズすることができ、及
び該被検配列を検出し、監視し、局所的に集中し、単離
する等に使用できる成分を有する、標識されたヌクレオ
チド配列を意味する。この用語はオリゴヌクレオチド、
ホモポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド等を含むもの
として広義に解されねばならない。

本文に用いられる“ハイプリダイゼーション（ｈｙｂｒ
ｉｄｉｚａｔｉｏｎ）”という用語は、標的核酸配列の
全部又は一部に結合する相補的塩基対結合を称する、即
ち：プローブは少なくとも成程度の相補性を含まなけれ
ばならない。この結合は完全に合致する必要はないこと
を理解すべきである。実際内部ルーフ、バルジ（ｂｕｌ
ｇｅ）ループ、ヘアピンループ、十字形結合をもたらす
不対領域、又は他の不適合領域が存在してもよい。ハイ
ブリダイゼーシａンは標的の検出を可能とするのに必要
な程度に起こる必要性があるだけである。

本文で使用されるように、“標的認識成分”という用語
は被検試料とハイブリダイゼーション又は結合するプロ
ーブの一部を意味する。標的認識成分はヌクレオチド配
列から成り、ヌクレオチド塩基の特異的配列であれ、ホ
モポリヌクレオチド配列等であれ、該被検体（ａｎａｌ
ｙｔｅ）と結合する任意の適当な配置をとることができ
る。

本文で使用される“シグナル発生成分”は放射性標識、
酵素的標識、化学的標識、免疫的標識等によるシグナル
を発生することができるプロープの一部を意味する。

本文で使用される“標的被検体配列“は生物学的、生理
学的、環境的試料等に見いだされる、生物的物質中に含
まれるか又はそれに関係する核酸の全部又は一部を称す
る。

本文で使用される“５″端”及び“３′端”は技術上一
般に受容されている意味、即ちヌクレオチド配列の一端
の末端ヌクレオチドがその燐酸二エステル結合のエステ
ル酸素がペントースの第五又は第三炭素原子の夫々のい
ずれかに自由に結合し得る、遊離の５′及び３″基を有
するという意味に解釈すべきである。

本発明の詳述 本発明は一つの成分の３′端及び他の成分の５′端の間
に糖一燐酸化学結合の形成を可能とするような位置に二
つの成分を保持する架橋補体を使用することにより、プ
ローブの二種の成分、即ち標的認識配列成分及びシグナ
ル発生成分の化学的カップリング又は接合（ｊｏｉｎｄ
ｅｒ）による、標識されたヌクレオチドプローブの合成
方法を提供する。

本発明の方法を用いて標識されたグローブを製造するた
めには、第一の結合するヌクレオチド配列である標的認
識配列成分が任意の適当な手段で供給される。例えばこ
の成分は検出することを必要とする生物体のゲノムＤＮ
Ａから単離することができ、組換え的に製造してもよく
、又は標準のオリゴヌクレオチド合成方法によって化学
的に合成してもよい。後者に対する適当な方法について
の良い記述は、メソッズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍ
ｅｔｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ１ｏｇｙ）、１５４巻
、２２ｌ一３２８頁、アカデミック・プレス（Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、Ｎ．Ｊ．、ｌ９８７、レー・
ウ（Ｒａｙ　Ｗｕ）及びＬ．グロスマン（Ｇｒｏｓｓｍ
ａｎ）、編集、に見いだすことができる。

少なくとも成程度、被検体の核酸の少なくとも一部と結
合できる限り、アデニン、グアニン、シトシン、チミン
、ウラシル、又はメチルシトシンを含む任意の配置の窒
素塩基が、この標的認識配列のヌクレオチド配列を形成
することと考えられる。結合事象自体は標的被検体の検
出を行うのに適当な任意の相補的塩基対の結合である。

標的認識配列成分の長さは塩基が数百から塩基が約５に
亙る広範囲に変わることができ、好適には約５−７５、
より好適には約５−６０であり、及び約１５−５０の塩
基が最も好ましい。この結合成分の長さは、被検体の配
列自体の結合特性により支配され、技術上の経験者によ
りその都度最適なものとすることができることを理解す
べきである。

好適な配列長さは約１００塩基以下の長さ、及び好適に
は約１５−５０塩基の長さの範囲であり、この長さであ
れば使用が容易であることが認められている。これは、
一般に１５ないし５０の範囲のヌクレオチド塩基の配列
は、便利に合成することが容易であり、費用が効率的で
あり、且つ各種の操作及び処理に耐える安定な二重鎖（
ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔａｒｎｄｅｄ）構造を与えるのに充
分な水素結合性能を存しているという現象によるもので
ある。約１００塩基より大きい配列は、その合成が困難
で、費用効率が小さくなることがあり、分子内の二次構
造が増加する傾向がある。当業者は配列の長さが或長さ
を超えると、配列の長さを増大することによってハイブ
リッドには殆ど安定性が追加されることはないことが理
解される。

或場合には直接又は間接にリポーター（ｒｅｐｏｒｔｅ
ｒ）分子として役立つというような各種の理由から、標
的認識配列中の色々な位置に誘導体又は他の化学的成分
を組み込むことが望ましいことを理解すべきである。こ
の標的認識配列中の各種の位置にこうした化学的誘導体
を付加することが、この成分の被検体への結合を事実上
妨害しない限りにおいて、任意のかような誘導体は本発
明の範囲内にある。

燐酸基が標的認識成分の一方又は両方の末端ヌクレオチ
ド残基上に存在しないならば、糖一燐酸結合に燐酸成分
を付与するための“５′ホスフェートーオン（Ｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅ−ｏｎ）”シアノエチルホス７才ラミダイト
（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）、ポリヌクレオチ
ドキナーゼ等を使用するような慣用の方法で燐酸残基が
オリゴマーに付加される。標的認識成分は次いでカラム
クロマトグラフィー、ゲル電気泳動法等のような周知の
技術を用いて精製される。

本発明のグローブの第二成分であるシグナル発生成分は
、標的認識成分について記載されたような任意の適当な
手段により提供される。プローブのシグナル発生成分は
多重検出可能な標識を含むことができ、更に３’−５’
糖一燐酸結合により標的認識成分に化学結合することが
できる任意のヌクレオチド配列を含んでいる。これらの
ヌクレオチド配列は、プローブの標的認識成分の被検体
への結合をシグナルすることができる充分な標識を含む
限り、それらの特定の配列内で広範に変えることができ
、従って多重標識を含まなければならない。多重標識と
はシグナル成分が少なくとも二つの、及び好適には５−
ＩＯ、最も好適には８ｌＯのシグナル発生要素を結合し
て有することを意味する。ここに記載されたようなシグ
ナル成分により生じる利点は使用者が一定の場所に多重
標識を付与し、及び又標的認識成分に化学結合する前に
も部位を標識することができる点である。

シグナル発生成分は市販により得られるか又は天然給源
からの変性一重鎮ＤＮＡ，天然源からのＲＮＡ，又はオ
リゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ホモポリヌクレ
オチド又はホモオリゴヌクレオチドの化学合成を含む任
意の適当な原料から製造できる。この配列は必要なシグ
ナル増幅及び結合すべき標識の量に相応した方式により
長さが変わる。しかし約５０ないし２００のヌクレオチ
ド塩基の長さは、この長さのヌクレオチドが検出に充分
な標識を保有する可能性を有するが、ハイプリダイゼー
ションの速度に悪影響を与えず、且つ合成が容易で経済
的であるという事実によって特に有用であることが見出
された。

シグナル発生成分中のヌクレオチド配列の標識は、通常
の放射性同位元素標識、化学的標識、免疫学的標識、又
は光散乱効果等を用いる標識を含む多くの形態をとるこ
とができる。このように、シグナル発生成分の標識は放
射線標識（例えば１ｃ，３１ｐＳ３Ｈ等）、酵素（例え
ばベルオキシダーゼ、アルカリ又は酸ホス７アターゼ、
等）、細菌標識、蛍光標識（蛍光体）、抗体標識（二重
抗体系において使用することができる）、抗１１１Ｋ（
Ｉｌｌ識された抗体と共に使用される）、ビオチン（ア
ヴイジン、ストレプトアヴイジン又は抗ビオチン系と共
に使用される）の類のハグテンのような小分子、抗７ル
オレッセイン抗体と共に使用されるフルオレッセインの
ようなハプテン、ラテックス粒子（浮力又はラテックス
凝集系において使用される）、フェリチンのような電子
高密度化合物（電子顕微鏡と共に使用される）、又はコ
ロイド金のように光を散乱する粒子のような金属、又は
触媒、又は染料又は任意の組み合わせ又はそれらの順列
交換、を含むことができる。

例えばシグナル発生成分の標識が抗原であれば、該抗原
を抗体／酵素コンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）と
複合させ、続いて酵素の基質を加えることによりシグナ
ルを発生することができる。シグナル発生成分の標識部
分が抗体であれば、抗抗体又はプロテインＡのようなＦ
６結合蛋白質をそれらと複合させることによって発生す
ることができる。これらの第二抗体又はプロテインＡは
既に酵素とコンジュゲートしているものである。

プローブの取り扱いにおける容易性及び安全性の理由か
ら、シグナル発生成分は化学的に、特に免疫原的に又は
酵素的に標識することが好適である。より好適な具体化
において、選りすぐられた化学的標識はビオチン、イミ
ノビオチン、７ルオレッセイン等のようなハプテンであ
る。これらは現在合成の容易さ、並びに特異的な高活性
の二次試薬及びそれらの使用技術の利用が可能であるこ
とによって好適である。シグナル発生成分中に含まれて
いる或種のヌクレオチド塩基は化学的標識の付与の前に
、慣用の技術を用いてアミン又は他の誘導体基を導入す
るように改質することができる。

一例を挙げれば、一つの好適な具体化において、シグナ
ル発生成分はビオチン／ストレブトアヴイジン系に基づ
くシグナルを発生する。この系は各種の手段によりシグ
ナル発生成分中に組み込むことができる。例えば、シグ
ナル発生成分のポリヌクレオチド部分はシトクロムＣブ
リッジ（ｂｒｉｄｇｅ）を経てビオチンに共有結合的に
結合することができ、（マニング［Ｍａｎｎｉｎｇ］等
、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１１６：１３６４−１３７
０　（１９７７）、マニング等、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ
Ｓ５３：１０７−１１７　（１９７５）、ソジャーＩＳ
ｏｄｊａｌ、Ａ．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ，　５：３８５−４０１　（１９７８））
　、又はビオチンは特異的なヌクレオチド残基に共有結
合的に結合することができ、（ランジャ−　［Ｌａｎｇ
ｅｒｌ　Ｐ．Ｒ．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｎ
ａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ，ＵＳＡ，　７８：６６３３−６６３７　（１９８
１））　、又はビオチンはジアミン（例えばベンタンジ
アミン）ブリッジによりポリヌクレオチドに結合できる
（ブローカー［Ｂｒｏｋｅｒｌ　Ｔ．Ｒ．等、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈｓ　５：３６３
−３８４　（１９７８））。シグナル発生成分中のピオ
チン分子とアヴイジン、ストレプトアヴイジン又は抗ピ
オチン抗体との相互作用が次いで行われるが、この場合
アヴイジン、ストレプトアヴイジン又は抗体は、ラテッ
クス粒子（ソジャー、Ａ．等、前掲、又はマニング等、
Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｓ前掲）、フエリチン（ブローカ
ー、前掲）、フルオレッセインのような蛍光Ｋ　（ｆｌ
ｕｏｒｏｇｅｎ）、酵素、二次抗体、磁性粒子等のよう
なシグナル発生成分にコンジュゲートしている。

シグナル発生成分の機能は、被検体ヌクレオチド配列へ
の結合の存在をシグナルすることであることにも留意す
べきである。従ってこのシグナル成分内のヌクレオチド
が被検体、又は実際上、分析時に試料中に存在するかも
しれない任意の他の塩基とハイブリダイゼーションする
ことは、発生するシグナルを消すかも知れないので望ま
しくない。それ故この塩基の通常のハイブリダイゼーシ
ョン機能を防ぐために、シトシン残基上の４環外アミノ
基をビオチン、免疫ビオチン、フルオレッセイン等のよ
うなハプテンで置換し、グローブのハイプリダイゼーシ
３ンがシグナル発生成分経由でなく、標的認識成分を通
じて行われることを確実化することが好適である。

第三の成分であるブリッジ補体は任意の適当な方法によ
り提供される。好適な具体化においては、ブリッジ補体
は慣用のＤＮＡ合成機を用いて合成された約８ないし約
２５ヌクレオチドのオリゴマーである。勿論これは標的
認識成分及びシグナル発生成分の両者の５′文は３′端
のいずれかの末端配列が事実上既知であることを前提と
している。

多くの場合において、シグナル発生成分はホモポリヌク
レオチドである。こうして、ブリッジ補体は少なくとも
四個の相補的ホモポリヌクレオチド塩基を含むことのみ
が必要である。標的認識成分について見れば、その配列
は少なくとも一部は、標的被検体配列に対し相補的であ
る。従ってこの成分の少なくとも一つの末端からの配列
ｔｆｔ報は、対応するブリッジ補体を生成するためには
既知でなければならない。他方、標的認識成分が化学的
に合成されるならば、ホモヌクレオチド配列が一方又は
両端に生成するであろう。そうであれば、第三結合成分
のための対応する相補的ブリッジ成分を容易に生成する
ことができる。こうしてシグナル発生成分及び標的認識
成分の両者の末端配列に相補的である少なくとも四つの
ヌクレオチドを含むブリッジ補体が合成できる。好適な
具体化においては、このプリッジ補体の相補的ヌクレオ
チド部分の各々は、たった一つのヌクレオチド塩基によ
って相互に分離される。これにより標的認識成分の末端
配列及びシグナル発生成分の末端配列は、相互に列をな
して並んだ時には、糖一燐酸結合の生成が可能である程
に相互に充分近接することが確実になるであろう。

好適な具体化においては、ブリッジ補体の生成の後に、
その濃度の正確な見積もりが可能であるように精製され
る。ブリッジ補体の正確な濃度に関する知識はアニーリ
ング（ａｎｎｅａｌ）される三種の反応剤の化学量論を
決定する際に有用である。こうして生成後多方面に亙る
精袈を施すことなく、良好な品質のブローブが得られる
。この目的に適当な精製技術は逆相高圧液体クロマトグ
ラフィーゲル電気泳動等を含むが、これらの方法はこれ
に関して敏感であることが知られている。

上記のような三成分はアニーリングされ、ブリッジ補体
が標的認識成分とシグナル発生成分とを一つの成分の３
゜端と他の成分の５′端の間に糖一燐酸化学結合の生成
が可能であるような位置に保持している複合体を形成す
る。このアニーリング工程は慣用のハイブリダイゼーシ
ョン技術を用いて行うことができる。例えば分子内二次
構造が融解する高温において三成分を混合する。次いで
最も安定なハイブリッド複合体が確実に形成するように
典型的な冷却方法が使用される。適当なＤＮＡ連結手段
を用いて、標的認識成分とシグナル発生成分とを結合す
るために糖一燐酸結合を導入することができる。この目
的のためには、例えば化学的連結手段（Ｚ．Ａ．シャバ
ロバ［Ｓｈａｂａｒｏｖａｌ、Ｍ．Ｓ．イバノプスカヤ
［Ｉｖａｎｏｖｓｋａｙａｌ及びＭ．Ｇ．イサグリアン
ツ［Ｉｓａｇｕｌｉａｎｔｓ］、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅ
ｒｓ１１　５　４巻、２号、４月１９８３）；光連結技
術“ＤＮＡ　Ａｓｓａｙ■ｓｉｎｇ　Ｔｅｍｐｌａｔｅ
−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｐｈｏｔｏｌｉｇａｔｉｏｎ”、
ＳａｎＤｉｅｇｏ　Ｓｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　　ｔｈｅ　
　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　　ｏｆ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｃｈｅｎ＋ｉｓｔｒｙ−ＡＭＯＣ
Ｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐ．Ｏ．
Ｂｏｘ　４００、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，　ＩＬ．　６
　０　５　６　６　；又はこの目的のための特異な酵素
のような慣用の手段が使用される。後者の中では、リガ
ーゼのような酵素；例えば：Ｔ．ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．
Ｃｏｌｉリガーゼ等が挙げられる。

ハイブリダイゼーション検査において標識されたヌクレ
オチドプローブの使用前にブリッジ補体を除去すること
が必要であれば、複合体からブリッジ補体を変性するア
ルカリ性条件、高温及び他の類似の技術に複合体を暴露
することができる。解離したブリッジ補体はクロマトグ
ラフィー法等の任意の適当な精製技術により除去される
。しかしブリッジ補体はプローブをハイブリダイゼーシ
ョン検査に使用する前に殊更除去する必要はないことを
理解すべきである。厳密なハイブリダイゼーション条件
（下記に述べる）は殊更この目的のために追加的な工程
を必要とすることなくブリッジ補体の除去を行うのに充
分である。

上記のようにして構成されたヌクレオチドプローブは水
、緩衝水溶液、ホルムアミドを含む緩衝液、等のような
ハイプリダイゼーション反応を促す溶液中に保持される
ことによって、液体試薬として提供することができる。

好適な具体化において、該液体試薬は適当なハイブリダ
イゼーション強化剤、活性剤、担体ＤＮＡ、及びホルム
アミドのような特異性を増強する化合物を含むことがで
きる。該液体試薬は本文に記載されたように製造された
一種又は多種の、試薬のプローブ部分としての任意の組
み合わせにおけるヌクレオチドプローブから成る。液体
試薬形態において、保存寿命は一般に一年を超える範囲
にある。

別法として、プローブを凍結乾燥することうでき、こう
して使用者が試料被検体についてハイブリッド検査を行
う前に、上記のような緩衝液を用いて再構成できる乾燥
試薬型として供給することもできる。

ハイブリダイゼーシ町ン検査における本発明により記載
されたように製造されたハイプリダイゼーションプロー
プの使用は、ポリヌクレオチド標的被検体配列の事前の
選択を仮定している。標的ポリヌクレオチド中のプリン
及びビリミジン塩基の特定な配列が生物体の突然変異し
た又は正常な遺伝子に特徴的であることが既知であるか
又は考えられ、及びこの特定の突然変異した又は正常な
遺伝子の存在又は非存在は感染剤、発癌物質、病気の容
体、又は或他の遺伝的特徴の存在及び非存在と関連付け
ることができるから、多くの具体化において、特定の被
検体の検出が必要である。

標的被検体配列は各種の媒体中に、最も多くは生物学的
、生理学的、又は環境的検体中に存在している。或場合
には本発明の方法による分析を行う前に、標的被検体ヌ
クレオチド配列を含む検体を各種の抽出、精製及び単離
操作に処することが好適である。このような手段は被検
体のハイブリダイゼーシ１ンプロープへの結合を妨害す
る試料物賞を除去するために望ましい。こうした実験操
ムス（Ｈａｍｅｓ）＆Ｓ．ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）
１！，　　Ｉ　Ｒ　Ｌ出版、ワシントンＤ．Ｃ．（１９
８５）の第二章に、及び標準的な教科書に見出される。

合成ヌクレオチドが研究の目的によっては生々にして望
ましいことがある等の理由で、合成ホモー又はヘテロー
ポリーヌクレオチドが、非生物起源であるにも拘らず、
標的被検体配列として役立つように、実験室内で製造す
ることができることも本発明の範囲内にある。

本文に記載されるように製造されたプローブの使用は、
標的配列を検出するために、生物学的検体中の標的核酸
にプローブのハイブリダイゼーシ羅ンを行う何か特殊な
方法又は技術に限定されない。

数種のハイブリダイゼーション検査技術が技術上既知で
あり、例えばドット・プロット（ｄｏｔ　ｂｌｏｔ）ハ
イプリダイゼーション法、サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）
プロッティング法；ランキ（Ｒａｎｋｉ）等により米国
特許第４．５６３．４１５号及び４，４８６．５３９号
に記載されたようなサンドイッチハイプリダイゼーシ３
ン検査法；ハンセン（Ｈａｎｓｅｎ）等により欧州特許
出願第８４３０６５１３．７号に記載されたようなビー
ズ上のサンドイッチハイブリダイゼーション；国際公開
パンフレットｗ０８７／０３９１１に記載されたような
置換（ｄｉｓｐｌａｃａｍｅｎＬ）ハイプリダイゼーシ
３ン法；核酸プロープを最初に固体の支持体上に固定し
、次いで試料と接触させる捕捉（Ｃａｐｔｕｒｅ）技術
；Ｐｌｏｅｇ．　Ｆｏｌｉａ　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃ
ａａｔ　Ｃｙｔｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｓ　２　４巻（１
９８６）第３号、１８９−１９４頁に採用され又は記載
されたようなイン・シトウ（ｉｎ　ｓｉｔｕ）ハイブリ
ダイゼーション法等が知られている。

多くの場合には、本発明の方法により形成されるハイプ
リダイゼーシコンブローブの標的認識成分へのハイブリ
ダイゼーションを容易にするために、標的被検体配列は
一重鎖であることが好ましい。標的被検体ヌクレオチド
配列を含む試料は標的被検体を一重鎖に転換するように
処理されなければならないことが屡々ある。この一重鎖
への転換は技術上慣用されている種々の方法により達成
することができる。例えば、二重鎖核酸の変性を熱的に
、化学的に、又は他の慣用の方法で達成することができ
る。変性過程はｐＨ，イオン強度、温度及び周囲媒体の
他の性質（例えば尿素、ホルムアミド、グリオキサール
、メチル水銀水酸化物又は他の薬剤の存在）に依存し、
同様に塩基の組成（即ち、ＧＣ／ＡＴ）配列、及び二重
鎖核酸の長さにも依存する。変性の各種の方法の概説は
標準的な教科書に、及びＪ．マーマー（Ｍａｒｍａｒ）
、Ｃ．シュルトクラウト（Ｓｃｈｉｌｄｋｒａｕｔ）及
びＰ．ドーティ（Ｄｏｔｙ）のＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂ
ａｓｉｓ　ｏｆ　Ｎｅｏｐｌａｓｉａ，テキサス大学出
版部、オースチン（Ａｕｓｔｉｎ）、テキサス、１９６
２年版に見られる。

或ハイブリダイゼーション方法においては、相補的一重
鎖核酸の再ハイプリダイゼーションを支持することが知
られている媒体を生じるように、標的被検体を“第二の
溶液”と混合することが適当である。第二の溶液は水性
又は非水性又は両者の混合物であることができる。ハイ
ブリダイゼーションの速度を増加させ及び／又は再ハイ
ブリダイゼーシ１ンの平衡範囲（即ち、再ハイブリッド
の安定性）を増大するために、相補的一重鎖核酸の再ハ
イブリダイゼーションに影響することが知られている或
種の無機又は有機添加剤を添加することができる。無機
の添加剤の中ではクエン酸ナトリウム及び塩化ナトリウ
ムが挙げられ；有機化合物中ではホルムアミドのような
化合物が挙げられる。他の有用な添加剤はポリエチレン
グリコール、硫酸デキストラン、ドデシル硫酸ナトリウ
ム及びカゼインである。

説明のためにのみ例を挙げると、一つのハイプリダイゼ
ーション方法は、被検体の標的ヌクレオチド配列がもし
あるとして、それがプローブのヌクレオチドの標的認識
成分中に含まれている相補的領域に全体的に又は部分的
にハイブリダイズできる条件下で、液体試料とプローブ
を接触させることから成る。この接触段階は各種の方法
により、及び様々な“苛酷度”の条件下で行うことがで
きる。再ハイプリダイゼーション（再会合［ｒｅａｓｓ
ｏｃｉａｔｉｏｎ］）過程に影響する因子の概説は、Ｎ
ｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，
Ｂ．ヘイムス（Ｈａｍｅｓ）＆Ｓ．ヒギンス（Ｈｉｇｇ
ｉｎｓ）編、ＩＲＬ出版、ワシントンＤ．Ｃ．（１９８
５）中で利用できる。プローブ及び被検体標的ポリヌク
レオチドの長さ、複合性、及び相補性の度合を反映する
因子の外に、因子は温度、ｐＨｓ塩濃度及び溶剤媒体の
条件を含んでいる。

接触期間は所望の程度までハイブリダイゼーシジンを行
うのに必要な時間の長さに依存して変わり、これは標的
認識成分中の結合領域の長さ並びに反応条件に一部依存
している。

結合した相補的な標的被検体配列を伴ったヌクレオチド
プローブは、所望のハイブリダイゼーションが行われた
後に生物学的試料から分離される。

この分離はクロマトグラフィー（カラム、ゲル等）、濾
過、電気泳動（電気溶離を含む）等を含むが、これらに
限定されるものではない。プロープに結合した再ハイブ
リダイゼーション物質から未結合の物質を充分且つ確実
に分離するために、更に洗浄工程又は任意の他の適当な
工程を組み入れることが望ましい。

ハイブリダイゼーション事象が生起し、結合物質が未結
合物質から分離された後に、シグナル発生成分上の標識
の検出は、結合物質、未結合物質又は両者を検査するこ
とにより行われる。標識が放射性のものであれば、慣用
の放射性同位元素定量技術ににより直接の検出が行われ
る。標識が例えばビオチンのような化学的なものであれ
ば、間接的な検出が行われる。

実施例 ａ）標的認識成分である、長さ５０ヌクレオチド塩基の
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｅａヌクレオチド
配列特異的オリゴマーをＤＮＡ合成機上で典塁的なホス
フォラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）化
学により合成した。合成後、合成機を使用して、“５ホ
スフェート・オン（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｏｎ）”シア
ノエチルホス７才ラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉ
ｄｉｔｅ）法を用いて、燐酸基を化学的に付加し、その
後保護基を除去するためにオリゴマーを脱ブロック（ｄ
ｅｂｌｏｃｋ）した。別にポリヌクレオチドキナーゼの
作用（脱ブロッキング後）により燐酸基を添加した。オ
リゴマーは合成後セ７アデックスＧ−２５カラム上で精
製された。このオリゴマーは標的認識成分を構成した。

ｂ）シグナル発生成分オリゴマーはＤＮＡ合成機上で合
成され、或場合には各カップリング合成のキャッピング
段階を省略した。このオリゴマーは長さとして５０−２
００塩基であった；塩基の２０−１００％はシトシン残
基（Ｃ）であった。

５゜端に８チミジン残基の延長（ｓｔｒｅｔｃｈ）があ
った。

脱ブロッキング後にセファデックスＧ−２５上で脱塩し
、オリゴマーを凍結乾燥し、乾燥したオリゴマーに２ｍ
ｇのアミノ基転移混合物を添加することによってＣの環
外（ｅｘｏｃｙｃｌｉｃ）アミノ基のアミノ基転移反応
を行った。次いで混合物を室温で２７−２４時間振盪し
た。アミノ基転移混合物は下記のようにして作成された
：５．６７ｇのヘキサンジアミン二塩酸塩を５０ｒＲＱ
のねじ蓋付きチューブ内で５００μαの濃厚水酸化ナト
リウム中の０．２３１ｇのモル７オリノエタンスルホン
酸と混合した。温水で容積を９．５ｍＱとし、事実上溶
解するまで混合物を振盪した。１９のメタ亜硫酸水素ナ
トリウムを添加して溶解し、ｐＨを６．０−６．２に調
節した。２４−７２時間反応が進行した後、ｐＨを２時
間の間８。５とし、次いで３０分間７に下げた。次いで
生成物をＩＸ４０ｃｍセファデックスＧ−５０カラム上
で精製した。

Ｃ）アミノ基転移処理されたシグナル発生成分オリゴマ
ーを、標的認識成分オリゴマーに連結（前記のア二一リ
ング過程）する前又は後のいずれかの時点で、ビオチン
又はフルオレツセイン　インチオシアネート（ＦＩＴＣ
）のいずれかのハグテンで標識した。いずれの場合も、
ビオチン（ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン）又はＦＩＴＣをジ
メチルホルムアミドに溶解し、ハプテン対アミ７基の比
が少なくとも２であるように、０．１Ｍ，ｐＨ９の炭酸
水素ナトリウム中に溶解した等容積のアミノ基転移旭理
されたオリゴマーと混合した。混合物を室温で１６時間
放置した。未反応のハプテンをセファデックスＧ−２５
クロマトグラフィーにより除去した。一方、一回又は二
回ブタノール抽出し、次いでセファデックスＧ−２５ク
ロマトグラ７イーを行って過剰のＦＩＴＣを除去した。

両方の場合共、精製したオリゴマーを凍結乾燥し、水に
再溶解した。

ｄ）標的認識成分の最初の６−８残基に相同（ｈｏｍｏ
ｌｏｇｏｕｓ）である、３′端に８Ａ残基及び５′端に
６−８残基から成る１４−１６モノマー単位から成る架
橋補体オリゴマーを末端トリチル基を残したまま合成し
、逆相ＨＰＬＣにより精製した。

オリゴマーの正確な濃度の見積もりができるように、こ
のオリゴマーは上記のようにして精製された。

ｅ）上記の三種のオリゴマーを下記のようにしてアニー
リングした：各ｉｎモルのオリゴマーを５０ｍモル　ト
リスー塩酸、ｐＨ７．５、ｌｏｗモルＭｇＣＩ！（最終
濃度）中に混合し、７０℃とする。約１時間に亙って温
度を５０℃まで下げ、３７℃の水浴中に移した。浴のス
イッチを切り、温度を約２５℃に下げた。次いで１２℃
の水浴に移した。１２°Ｃで１時間後、冷ジチオトレイ
トール（１（１＋Ｍ）及びＡＴＰ（ｌｍＭ）（最終濃度
）、及び４０単位のＴ．ＤＮＡリガーゼを加えて連結反
応を開始した。反応は１２℃で１６時間進行させた。次
いで最終濃度が２０ｍＭとなるようにＥＤＴＡを添加し
、反応混合物を９５℃に１０分間加黙した。

ｆ）或場合には、連結反応後、セフアクリル（Ｓｅｐｈ
ａｃｒｙｌ）　Ｓ　−　２　０　０　（寸法２ＸＩＯＯ
ｃｍ）上に試料を通して未反応の標的認識成分オリゴマ
ーを除去した。

ｇ）生成物の特性決定： 標識されたグローブは二種の方法により特性決定がなさ
れた。第一はポリアクリルアミドゲル電気泳動によりも
のであり、ここでは生成物の分子量の増大が標識に対す
るプローブの結合が成功した証拠として注目された。第
二に、生成物はＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｅ
ａを検出する際に機能性があることが示された。ハイブ
リダイゼーションは下記のように行われた： ｈ）病Ｊ［Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種を確実に単離するため
に、直接テイヤー・マーチン（Ｔａｙｅｒ　Ｍａｒｔｉ
ｎ）　（　Ｔ　Ｍ　）、変形セイヤー・マーチン（Ｔｈ
ａｙｅｒ　Ｍａｒｔｉｎ）　（　Ｍ　ＴＭ）、ニューヨ
ーク・シティ（ＮＹＣ）又はマーチンルイス（Ｍａｒｔ
ｉｎ　Ｌｅｗｉｓ）培地のような選択的な増菌培地上で
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの培養を
行った。接種された培地を湿った３−７％二酸化炭素雰
囲気中で３５−３６℃において、細菌の成長が明らかに
なるまで（１６−２４時間）培養した。コロニーの形態
について培養基を目視的に検査した。単離物は９６時間
（４日）以上たったものではなかった。疑わしい生物体
は塗布棒の平らな先端で細菌のコロニーに軽く触れるこ
とにより、培養面から揚げた。次いで試験用パドル（ｐ
ａｄｄｌｅ）に取り付けられた試験ドット（ｄａｔ）上
に塗布具を用いて細菌を塗り付けた。この試験を行うた
めには、試験ドットが過負荷にならないように、単一＋
７）ｌａｗのコロニーで充分である。細菌はできるだけ
平均に塗布され、引っ掻き、引き裂き又は力のかけ過ぎ
による試験ドットの損傷を避けた。接種された試験パド
ルを３７℃の加熱ブロック上に置いた。溶解（Ｉｙｓｉ
ｓ）剤（界面活性剤を含む０．５Ｍアルカリ）の微小滴
（約ｌＯμＱ）を試験ドット上に直接点ける。パドルを
３７℃で１分間インキユベートした。次いでパドルを加
熱ブロックから取り去り、ｌ分間中和試薬（０．５Ｍｌ
−リス／界面活性剤含有塩酸）中に入れた。次いでパド
ルを遅滞なく直接加熱ブロック上に戻し、過剰の試薬を
直接圧力をかけて吸い取り紙で吸い取った。微小滴（約
１０μａ）のプローブ試薬（ビオチン化された又はＦＩ
ＴＣとコンジュゲートしたＮ．　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ
ｅ特異性プロープ及び５０％ホルムアミド、ｌＯ％のハ
イブリダイゼーション増強剤、トリトンＸ−ｔｏｏ及び
担体ＤＮＡを含む緩衝液）を直接試験ドット上に置く。

パドルを３７℃で１分間インキユベートし、前のように
吸い取る。次いで微小滴（約ｌＯμＩ２）のコンジュゲ
ート試薬（１％の担体蛋白質及び安定剤及び保存剤、０
．１５％のチメロサールを含むストレプトアヴイジンー
セイヨウワサビペルオキシダーゼ複合体又は抗一ＦＩＴ
Ｃ抗体）を試験ドット上に直接付け、３７℃で１分間イ
ンキユベートした。パドルを加熱ブロックから取り出し
、過剰の試薬を軽くたたいて除いた。次いで過剰のプロ
ープ及び酵素コンジュゲートを洗い去るためにパドルを
洗浄試薬中に入れた。洗浄試薬は還元剤と活性剤を含ん
でいた。

パドルを２分間浸漬し、断続的に撹拌した。パドルを加
熱ブロックに戻し、前のように吸い取った。

ビオチン化されたプローブの場合には、微小滴（約ｌＯ
μＱ）の基質溶液（過酸化水素及びＴＭＢを含む緩衝液
）を直接試験ドットに付けた。パドルを１分間３７℃で
インキユペートした。パドルを加熱ブロックから取り除
き、約ｌＯ秒間停止試薬（１％ナトリウムアジド）中に
入れた。次いでパドルを取り去り、吸い取って、Ｎ．　
ｇ＋）ｎｏｒｒｈｏｅａｅの存在を確認するために目視
的に読み取つＩ；。

Ｎ．　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの陽性試験は明瞭な青い
シグナルを生じた。陰性の結果はシグナルの識別不能か
ら背景が微青色に着色することまでに互っている。

ＦＩＴＣ一標識プローブは慣用の技術を用いて検出され
た。ピオチン又はＦＩＴＣは標的認識成分がシグナル発
生オリゴマーに共有結合的に結合していることを示し、
プローブがＮ．　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅからＤＮＡに
ハイブリダイズした場合にのみ検出され　に　。

実施例 ａ）サルモネラの検出のための標識されたオリゴヌクレ
オチドプローブは下記のようにして構成された。サルモ
ネラヌクレオチド配列の一部に対応する４０モノマー単
位のものをＤＮＡ合成機上で合成し、このオリゴヌクレ
オチドの５′末端を化学的に燐酸化した。これは標的認
識成分を構成する。

ｂ）シグナル発生成分については、３′端に８チミジン
残基を有する１００モノマー単位のポリヌクレオチドを
生成した：残りのヌクレオチドはシトシンであった。こ
のポリヌクレオチドを亜硫酸水素ナトリウムの存在にお
いてへキシルジアミンで飽理し、環外アミノ基をヘキシ
ルジアミノ基にアミノ基転移した（Ｈ．ヒャツ［Ｈｙａ
ｔｓｕｌ　、Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　
Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ　Ｂｉｏｔｏｇｙ％ｌ６巻、７５−１１５頁（１　
９　７　６）参照）。

ポリヌクレオチドを次いで各種の第一アミン反応試薬で
処理して、このＤＮＡ中にハプテンを導入することがで
きた。この特殊な場合においては、７ルオレッセイン残
基を検出部分中に導入するためにフルオレッセイウイソ
シアネートが使用された。

Ｃ）架橘補体として、標的認識成分の５′端における最
初の８ヌクレオチドに相補的である、５′端に８アデニ
ン残基を、３゜端に８ヌクレオチド残基を有する１６七
ノマー単位体を生成した。

ｄ）三種の成分を約等量混合し、約４０単位のＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを添加して標的認識配列成分をシグナル発生
成分に共有結合的に結合した。

ｅ）慣用のゲル濾過法により精製後、プローブは上記実
施例ｌに記載の検定段階に従ってハイブリダイズ検定に
おけるそのサルモネラ検出効率について試験された。フ
ルオレッセインはプロープがその適当な標的にハイブリ
ダイズしたときのみ検出された。

本発明の主なる特徴及び態様は以下の通りである。

ｌ． ａ）少なくとも約４のヌクレオチド塩基の第一の特異的
末端配列を有する第一の標的認識成分を提供し、 ｂ）それに付けられた多重標識を有し、及び又少なくと
も約４ヌクレオチド塩基の第二の特異的末端配列を有す
る第二のシグナル発生成分を提供し、 Ｃ）架禍補体中の該ヌクレオチドの少なくとも約４は該
標的認識成分の該第一の特異的末端配列とハイブリダイ
ズすることができ、そして該架橋補体中の少なくとも約
４の他のヌクレオチドは、該シグナル発生成分の該第二
の特異的末端とハイブリダイズすることができる、約８
−２５ヌクレオチドのヌクレオチド配列から成る第三の
架橋補体を提供し； ｄ）適当なハイブリダイゼーション条件下で該架橋補体
と該標的認識成分の第一の特異的末端配列の少なくとも
一部及び該シグナル発生成分の第二の特異的末端の少な
くとも一部とハイブリダイズして全三種のハイブリダイ
ズした複合体を形成させ： その際、該成分の一つの３゛末端は他者の５′末端と整
合し、該３″末端及び該５′末端は第一及び第二成分の
間に３’−５’糖一燐酸結合の形成を可能とするような
方式で相互に相対的な位置を占めており；及び ｅ）該第一及び第二成分の該３゜末端及び該５″末端の
間に該３’−５’糖一燐酸結合の形成を可能とするのに
効果的である量を用い及び時間をかけて、該複合体をＤ
ＮＡ連結手段と接触させ、相互に化学的に結合した該標
的認識成分と該シグナル発生成分から成るヌクレオチド
プローブを生成する 段階から成る、 各成分が３′末端及び５″末端を有する第一標的認識成
分及び第二シグナル発生成分を有する標識されたヌクレ
オチドプローブの合成方法。

２．更に共有結合的に結合した該第一及び第二の成分を
有する該複合体を、該複合体から該架橋補体を除去する
ことができる酵素と接触させる段階（ｆ）から成る上記
ｌに記載の方法。

３．該ヌクレオチドプローブがハプテンで標識されてい
る、上記ｌに記載の方法。

４．該ハプテンがビオチンである上記３に記載の方法。

５．該ハプテンが７ルオレッセインである、上記３に記
載のプロープ。

６．該架橘補体が約１４ヌクレオチド塩基から成る、上
記ｌに記載の方法。

７．ＩＩｌ的認識成分がＤＮＡ配列である、上記ｌに記
載の方法。

８．標的認識成分がＲＮＡ配列である、上記ｌに記載の
方法。

９．標的認識成分がオリゴヌクレオチドである、上記ｌ
に記載の方法。

ｌＯ．標的認識成分が微生物の配列である、上記ｌに記
載の方法。

１１．微生物がウイルスである、上記ｌＯに記載の方法
。

１２．微生物がバクテリアである、上記１０に記載の方
法。

１３．バクテリアがＮｅｉｓｓｅｒｉａである、上記ｌ
２に記載の方法。

１４．バクテリアがＳａｌｍｏｎｅｌｌａである、上記
ｌ２に記載の方法。

１５．バクテリアがＳｈｉｇθｌｌａである、上記ｌ２
に記載の方法。

１６．微生物がＭｙｃｏｐｌａｓｍａである、上記１０
に記載の方法。

１７．シグナル発生成分が高分子である、上記ｌに記載
の方法。

１８．シグナル発生成分が核酸である、上記ｌに記載の
方法。

１９．核酸がＤＮＡである、上記ｌ８に記載の方法。

２０．核酸がＲＮＡである、上記ｌ８に記載の方法。

２１．シグナル発生核酸がオリゴヌクレオチドである、
上記ｌ８に記載の方法。

２２．シグナル発生核酸が均質重合体である、上記ｌ８
に記載の方法。

２３．ビオチンが酵素を含むコンジュゲートに結合でき
る、上記４に記載の方法。

２４．酵素がベルオキシダーゼである、上記２３に記載
の方法。

２５．酵素がアルカリ　ホス７アターゼである、上記２
３に記載の方法。

２６．シグナル発生成分上の標識が蛍光体である、上記
ｌに記載の方法。

２７．シグナル発生成分上の標識が化学発光性である、
上記ｌに記載の方法。

２８．シグナル発生成分上の標識が触媒である、上記１
に記載の方法。

２９．シグナル発生成分上の標識が染料である、上記ｌ
に記載の方法。

３０．シグナル発生成分上の標識が金属である、上記ｌ
に記載の方法。

３１．１１１識がコロイド状金である、上記３０に記載
の方法。

３２． ａ）少なくとも４ヌクレオチド塩基の第一の特異的末端
配列を有する第一の標的認識成分；ｂ）それに付けられ
た多重標識を有し、及び又少なくとも約４ヌクレオチド
塩基の第二特異的末端配列を有する第二のシグナル発生
成分：及びＣ）約８−２５ヌクレオチドのヌクレオチド
配列から成る架橘補体； から成り、 その際、該成分の該特異的末端配列は該成分の一つの３
″末端が他者の５″末端と整合し、３゛５′糖一燐酸化
学結合を形成するように整合し且つ化学的に結合した末
端を有し；及び 該架橋補体は該第一成分及び該第二成分の各々の該特異
的末端配列と少なくとも部分的にハイブリダイズしてい
る、標識されたヌクレオチドグロ一ブ。

特許出願人　オーソ・ダイアグノスティック・システム
ズ●インコーポレーテッ ド

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、 ａ）少なくとも約４のヌクレオチド塩基の第一の特異的
   末端配列を有する第一の標的認識成分を提供し、 ｂ）それに付けられた多重標識を有し、及び又少なくと
   も約４ヌクレオチド塩基の第二の特異的末端配列を有す
   る第二のシグナル発生成分を提供し、 ｃ）架橋補体中の該ヌクレオチドの少なくとも約４は該
   標的認識成分の該第一の特異的末端配列とハイブリダイ
   ズすることができ、そして該架橋補体中の少なくとも約
   ４の他のヌクレオチドは、該シグナル発生成分の該第二
   の特異的末端とハイブリダイズすることができる、約８
   −２５ヌクレオチドのヌクレオチド配列から成る第三の
   架橋補体を提供し； ｄ）適当なハイブリダイズする条件下で該架橋補体と該
   標的認識成分の第一の特異的末端配列の少なくとも一部
   及び該シグナル発生成分の第二の特異的末端の少なくと
   も一部とハイブリダイズして全三種のハイブリダイズし
   た複合体を形成させ； その際、該成分の一つの３′末端は他者の５′末端と整
   合し、該３′末端及び該５′末端は第一及び第二成分の
   間に３′−５′糖−燐酸結合の形成を可能とするような
   方式で相互に相対的な位置を占めており；及び ｅ）該第一及び第二成分の該３′末端及び該５′末端の
   間に該３′−５′糖−燐酸結合の形成を可能とするのに
   効果的である量を用い及び時間をかけて、該複合体をＤ
   ＮＡ連結手段と接触させ、相互に化学的に結合した該標
   的認識成分と該シグナル発生成分から成るヌクレオチド
   プローブを生成する 段階から成る、 各成分が３′末端及び５′末端を有する第一標的認識成
   分及び第二シグナル発生成分を有する標識されたヌクレ
   オチドプローブの合成方法。 ２、 ａ）少なくとも４ヌクレオチド塩基の第一の特異的末端
   配列を有する第一の標的認識成分；ｂ）それに付けられ
   た多重標識を有し、及び又少なくとも約４ヌクレオチド
   塩基の第二の特異的末端配列を有する第二のシグナル発
   生成分；及びｃ）約８−２５ヌクレオチドのヌクレオチ
   ド配列から成る架橋補体； から成り、 その際、該成分の該特異的末端配列は該成分の一つの３
   ′末端が他者の５′末端と整合し、３′−５′糖−燐酸
   化学結合を形成するように整合し且つ化学的に結合した
   末端を有し；及び 該架橋補体は該第一成分及び該第二成分の各々の該特異
   的末端配列と少なくとも部分的にハイブリダイズしてい
   る、標識されたヌクレオチドプローブ。