JPH022393A - 抗ヒト卵巣癌単クローン性抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、抗ヒト卵巣癌単クローン性抗体及びこれを用
いる癌の診断法及び治療法に関する。

本発明は、卵巣癌、乳癌、子宮癌の病理診断及び治療に
使用することができ、診断薬、医薬の分野で利用可能で
ある。

卵巣癌は膵癌と並び最も発見の困難な癌の一つである。

卵巣が体の深部にある臓２ｇであることもあり、良い診
断法も少なく、良性１ＦＦ瘍と悪性ＩＩＩＦ！瘍の判別
も難しい。卵巣癌のうち、漿液性卵巣腺癌に関しては、
腫瘍マーカーＣＡ−１２５が報告されており〔ジャーナ
ル・才ブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ、
　Ｃｌ１ｎ、！ｎｖｅｓｔ、　）６８、１３３１（１９
８１））　、その臨床上の有用性が確認されつつあるが
、漿液性卵巣腺癌への特異性が極めて高いため、粘液性
卵巣腺癌等の診断には無効である。粘液性卵巣腺癌のマ
ーカーとしては、癌胎児性抗原（Ｃａｒｃｉｎｏｅｎｂ
ｒｉｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＥ八）〕等が知られ
ているが、陽性率が低く、必ずしも実用的とは言いにく
い。免疫組織学的分析で、粘液性卵巣腺癌に反応性を示
す単クローン性抗体及び粘液性卵巣腺）１÷，漿液性卵
巣腺癌を含めた卵巣癌全般と反応性を有する単クローン
性抗体が知られている〔キャンサー・リザーチ（Ｃａｎ
ｃｅｒ　Ｒｅｓ、）　６０　、７８７　（１！１８５）
、同（１９８５）、　ジャーナル・オブ・ナショナル・
キャンサー・インスティデュート（、Ｊ、Ｎ、Ｃ，！、
）　７６　、７８１（１！３８６））が、漿液性卵巣腺
癌及び粘液性卵巣腺癌を含めた卵巣癌全般と高率に反応
し、さらに、乳癌及び子宮癌と高率に反応する単クロー
ン性抗体は知られていない。

発明が解決しようとする課題 卵巣癌全般と高率に反応し、さらに乳癌及び子宮癌と高
率に反応するＩｆｔクローン性抗体があれば産婦人科領
域における癌の診断、治療上非常に有益である。

課題を解決するための手段 本発明者らは、ヒト卵巣癌患者腹水の高分子分画を免疫
原として樹立したハイブリドーマが生産する単クローン
性抗体が卵巣癌細胞株、各種組織型の卵巣癌組織及び子
宮癌、乳癌組織と高率に反応し、卵巣癌、子宮癌及び乳
癌の病理診断及び治療に有用であることを見い出し、本
発明を完成するに至った。

本発明は、ヒト卵巣癌患者腹水の高分子分画で免疫した
マウスの牌細胞とマウス骨髄腫細胞とを融合させてハイ
ブリドーマを作製し、ヒト卵巣癌に反応性を有する単ク
ローン性抗体を選択し、該ハイブリドーマを培地中に培
養するかマウスに投与して該マウスを腹水癌化し、２’
Ａ　’Ｂ養物または腹水より採取することにより得られ
る抗ヒト卵巣癌単りローン性抗体を提供する。

本発明のｒｎクローン性抗体は、ＩｇＧクラスに属し、
粘液性卵巣腺癌、漬液性卵巣腺癌、淡明細胞卵巣癌、乳
癌及び子宮癌に反応性を有し、卵巣癌患者腹水の分子ｍ
　，０００．０００以上の蛋白質に特異的に結合し、蛋
白質を抗原決定基として認識する。

本発明の単クローン性抗体の具体例としては、ハイブリ
ドーマ細胞株ＫＯＣ−７０８（昭和６３年２月２５日付
で工業技術院微生物工業技術研究所にＦＣＩＩＭ　［１
１’−１７６２として寄託しである）が生産ずろＫＯＣ
−７０８があげられる。

以下に本発明の弔クローン性抗体の製造法を詳細に説明
する。

〔り動物の免疫と抗体産生細胞の調製 ３〜ｌＯ週令、望ましくは８週令のマウスに、ヒト卵巣
癌患者腹水の高分子分画を免疫して、その動物の胛、リ
ンパ節９末梢血中の抗体産生細胞を、’ａ製する。免疫
するマウスはヒト正常域２：；で前処理して免疫寛容に
したマウスを用いるのが好ましい。免疫の方法は、動物
の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジ一
バントし例えば、フロイントの完全アジユバント（Ｃｏ
ｍｐｌｅＬｅ　Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　Ａｄｊｕｖａｎｔ）
または、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンな
ど〕とともにヒト卵巣癌患者腹水の高分子分画（１０〜
５００μｇ／匹）を投与する。以後、１〜２週問おきに
抗原を２〜５回投与する。各免疫後３〜７日目に眼底静
脈叢より採血し、その血清がヒト卵巣癌と反応すること
を以下に示す酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ＥＬＩ
ＳΔ）：医学書院用１９７６年］などで調べる。

酵素免疫測定法： ９６大のＥＩＡ用プレート〔フロー・ラボラトリーズ（
Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製〕に、正常
あるいは腫瘍細胞１組織の膜成分（蛋白量として１０〜
ｌ、　ｏ　ｏ　ｏμｇ／ｍｌ含有する膜断片）を１００
〜２００μｔｌ／穴ずつ分注し、４℃で１〜２晩放置し
て、上清を抜き去った後、レジン水あるいは、ＰＢＳ　
（リン酸ニナトリウ１４．８３ｇ、　　リン酸−カリウ
ム０．２１ｇ１食塩７．（ｉ５ｇ、蒸留水１ｆ、ｐ）１
７．２）でよく洗浄後、１％ＢＳΔ（牛血清アルブミン
）−Ｐ）３３を１００〜２００μｌ／穴分注し、４℃で
１〜２晩放置して、プレート上に残った蛋白質との結合
残基をブロック（ブロッキング）した。その後、ＢＳＡ
−ＰＢＳを捨て、レジン水あるいはＰ　Ｂ　Ｓでよく洗
浄した後、第１抗体として、Ｂ　ＳΔ−ＰＩ３Ｓ”Ｃ希
釈した試料（マウス血清、ハイブリドーマｊｉζ養上清
、ｍｒ＋”ｌ製Ｉｐ、　り［１７性抗体）　’、ｒ　ｌ
　ＯＯμｌ／穴分注し、４℃でｌ晩成；１ｔする。レジ
ン水で１回、２Ｍ　　ＮａＣ！溶液で６回洗浄した後、
第２抗体としてウサギの抗マウスイムノグロブリンＩｇ
Ｇ−ペルオキシダーゼ結合物〔ダコ（ＤへＫＯ）社製、
販売元協和メデックス〕の１００倍希釈液を１００μＱ
／穴分注し、室温で２時間数１ｄする。

ＰＢｓでよ（洗浄後、ＡＢＴＳ２！質液〔２゜２′−ア
ジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン
酸）ニアンモニウム５５０ｍｇを０．１Ｍクエン酸緩（
（１液（ｐＨ４，２）Ｉｆに溶かした溶液に、使用直前
に過酸化水素ｌμＱ　／　ｍ　ｌを加えた溶液〕を用い
、発色をＯＤ　４１５１１１１の吸光度で測定する。こ
のとき、卵巣癌患者腹水の高分子分画に対して強く反応
するマウスをヒト卵巣癌免疫マウスとしてノ１イブリド
ーマ作製のための抗体産生細胞の供給源として用いる。

酵素免疫測定法を行うにあたって、抗原として、細胞そ
のものを用いる場合は、ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）　
３０７２プレート中で、標的細胞を培養し、０．２５％
ゲルタールアルデヒド−ＰＢＳを加え、室温に１〜２時
間放置し、ＰＢＳでよく洗浄後、１％Ｂ　Ｓ　Ａ−Ｐ　
Ｉ３５１００〜２００μＱを加え、２時間放置し、レジ
ン水またはＰＢＳでよく洗浄し、そのプレートを用いて
、一般の抗原コートプレートを用いるのと同様の方法に
て、抗体価の測定を行う。

細胞融合に供するにあたって、免疫化マウスに融合処理
の３〜４日前に、ヒト卵巣癌患者腹水の高分子分画ｌＯ
〜４００μｇ／匹をｌｌｕ腔内に投与し、ＩＩＱＩ　臓
細胞を摘出し、肺細胞を調製する。胛臓をＭＥＭ　（日
永製薬社製）中で細断し、ビンセットでほぐし、１２０
０ｒｐｍ、５分間遠心分離にかけ、上清を捨て、トリス
−塩化アンモニラｌ−緩（＋１液（ｐ　ｆｌ　７．６５
）で１〜２分間処理し赤血球を除去し、ＭＥＭで３回洗
浄して融合用肝細胞として提供する。

ヒト卵巣癌患者腹水の高分子分画の調製は下記のとおり
行う。

すなわち、−８０℃に凍結保存しておいた漿液性卵巣腺
癌のうち乳頭状腺ｌｉｄ患社の腹水を融解後、３，００
０叩ｍ、１０分間遠心分離し、固ＪＦ２分を除いた上清
をセルロファインＧＣＩ、−２０００ＳＦ（生化学工業
社製）カラムに通塔し、分子量，０００．０００以上の
高分子画分を集め、卵巣癌患者腹水の高分子分画とする
。

また、分子ｈ１１５万付近の両分を集め低分子分画とす
る。

（２）骨髄腫細胞の調製 骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使
用する。たとえば°、８−アザグアニン耐性マウス（Ｂ
ΔＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３八ｇ８−Ｕ
ｌ（Ｐ３−Ｕｌ）Ｃカレント・トピックス・イン・ミク
ロバイオロジイ・アンド・イムノロシイ−！（Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ　ａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　−１）　］　　Ｃヨ
ーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロシイ（Ｅｕｒ
ａρｅａｎ　Ｊ。

１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）　　　６．　５１１−５１９　
　（１９７６）］　　、　Ｓ　　Ｐ　　２１０−Ａｇ　
１４　　（ＳＰ−２）　　Ｃネイチャー（Ｎａｉｒｅ）
　　２７６、２６９−２７０　（１９７８））　、Ｐ　
３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３　（６５３）　Ｃジャーナル
・オブ・イムノロシイ（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）　
１２３．１５４８−１５５０　（１９７９）　）　、Ｐ
　３−Ｘ　６３−Ａｇ　８（Ｘ６３）　　［不イチ＋　
−（Ｎａｔｕｒｅ）　２５［ｉ、　　４９５−４９７　
（１９７５）：１などが用いられる。これらの細胞株は
、８−アザグアニン培地１［ＰＭ　！−１６４０培地に
グルタミン（１，５ｒｒ＋Ｍ）。

２メルカプトエタノール（５ｘ　Ｉ　Ｏ−５Ｍ）。

ジエンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）および牛胎児血清
（ＦＣ３，Ｃ３Ｌ社製）（１０％）を加えた正常培地に
、さらに８−アブグアニン（１５μｇ／ｍｌ）を加えた
培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地
に継代し、融合当日２Ｘ１０’以上の細胞数を確保する
。

（３）細胞融合 （１）で免疫した抗体産生細胞と（２）で得られた骨髄
腫細胞をＭＥＭＪ７〜地またはＰＢＳでよく洗浄し、細
胞数が、抗体産生細胞；骨髄腫細胞−５〜１ｏｌｌにな
るよう混合し、遠心分離（１，２０Ｏｒｐｍ、　５分）
した後、上清を捨て、沈殿した細胞群をよくほぐした後
、撹拌しながら、３７℃で、ポリエチレングライコール
１０００　（ＰＥＧ−１，０００）　２　ｇ、　ＭＥＭ
２ｍｌおよびジメチルスルホキシド０．７ｍｌの混液０
，２〜１ｍｌ／ＩＱ３抗体産生細胞を加え、１〜２分間
毎にＭＥＭＩ〜２ｍｌを数回加えた後、ＭＥＭを加えて
全量が５０ｍ１になるようにする。遠心分離（９００ｒ
ｐｍ、　５分）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐ
した後、正常培地（ＲＰＭ＋−１（ｉ４０．ＦＣ３ＩＯ
％）１００ｍｌを加え、メスピペットによる吸込み、吹
出しでゆるやかに細胞を懸濁する。

このｕｆＱ液を２４穴培養用プレートに１ｍｌ／穴ずつ
分注し、５％ｃｏ２インキュベーター単３７℃で２４時
間培養する。’Ｎ養プレートに１ｍ１／穴のＨＡ　Ｔ培
地〔正常培地にヒボキサンチン（１０−’？ｖ４）　、
チミジン（１，５Ｘ　１　（’Ｉ−’Ｍ）およびアミツ
ブゾリン（／ｌＸ１０−’Ｍ）を加えた培地〕を加え、
さらに２４時間培養する。以後２０間、２４時間毎に、
培養上？＋”ｔ　ｌ　ｍ　ｌを捨て、新たに同量の１１
八Ｔｊｚ〜地を加え、Ｃ０２インキユベーター単３７℃
でｌＯ〜１４日間培養する。

コロニー状に生育してきた融合細胞の認められる穴につ
いて、」二重１＋＋＋ｌを捨て、ＩＩＴ培地（ＨΔ′Ｆ
培地からアミノプテリンを除いた培地）を同量加え、以
後２日間、２４時間毎にＨＴ培地への変換を行う。

Ｈ′ｒ培地で３〜４日間培養後、培養上清の１部をとり
上記の酵素免疫測定法により、ヒト卵巣癌患者腹水の高
分子分画に対する抗体価を測定する。このとき、同様の
方法で、ヒト正常細胞１組織あるいはその膜成分などと
の反応性も測定し、ヒト卵巣癌細胞１組織あるいはその
１１り成分に特５で的に反応するものを選択する。ヒト
卵巣フ１与１細１１包、　、ｆｕｒｌ織あるいはその膜
成分に強く反応し、ヒト正常細胞１組織あるいはその膜
成分などに反応しない穴について、限界希釈法によりク
ローニングを２回握り返し、安定してヒト卵巣癌細胞１
組織あるいはその膜成分に強い抗体価の認められたもの
を抗ヒト卵巣癌単りローン性抗体産生ハイブリドーマ株
として選択する。

（４）　　！ｒ’−クローン性抗体の調製ブリスタン処
理［２，６，１０，１４−テトラメチルベンタテ゛カン
（ｒｒｉｓＬａｎｅ）　０．５　ｍｌを腹腔内投与し、
２週間飼育するコした８〜１０週令のヌード雌マウスに
、（３）で（）られた抗ヒト卵巣癌単りローン性抗体産
生ハイブリドーマ細胞２〜４ＸＩＯ’細胞／匹を腹腔内
注射する。１０〜２１日でハイブリドーマは腹水癌化す
る。このマウスから腹水を採取し、遠心分離（３，００
Ｏｒｐｍ、　　５分）して固形分を除去後、５０％硫酸
アンモニウムにて塩析し、０．０４Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ８，０，０，０３ＭＮａＣｊ！を含む）で透析後、Ｄ
Ｅ　５２　（Ｗｈａｔｍａｎ社契）のカラムに通塔し、
ＩｇＧ両分を集め、精製型クローン性抗体とする。

抗体のイソタイプの決定は、オクタロニイ（Ｏｕｃｈｔ
ｅｒｌｏｎｙ）法（二重免疫拡１１に法）（免疫学実験
入門、生物化学実験法１５、学会出版センター刊、７４
頁、１９８１年）によって行う。

蛋白量の定量は、フォーリン法および２８０ｎｍでの吸
光度［１，４（ＯＤ２ｓｏ　）−イトノグロブリンＩ＋
ｎｇ／ｍｌ］よりｐ［出する。

得られたｌ’ｔクローン性抗体の特異性の決定は複数の
検体から得られたヒトの各種のＩｌｉ器由来の正常ある
いは腫瘍組織あるいはその膜成分との反応性、各種ヒト
正常あるいは腫瘍細胞培養株またはヒト胎児細胞培養株
もしくはそれらの膜成分との反応性、従来から知られて
いる癌胎児性抗原（例えばＣＥΔ）との反応性を酵累免
疫測定法、免疫組織学的判定法ＣＡＢＣ法）などにより
行い、いずれの測定法においてもヒト卵巣癌以外とは、
なるべく反応しないものを選択する。

（５）抗原解析 前述の酵素免疫測定法、免疫組織化学的セｊ定法の実施
に際して、抗原（卵巣癌患者腹水の高分子分画、卵巣癌
ＪΔ養細胞株、卵果癌組織）をノイラミニダーゼ（ｎｃ
ｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）。

プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）などの酵素や過ヨウ
素酸などの試薬で前処理した後、単クローン性抗体と反
応さけ、それらの処理をしていない元の抗原と単クロー
ン性抗体の反応性との差より、抗原の化学的性状（弔り
【１−ン性抗体の認識する抗原部位の化学的性状）を明
らかにした。すなわち、ノイラミニダーゼ処理により抗
原性が消失すればシアル酸が、プロテアーゼ処理により
消失すれば蛋白質が、また過ヨウ累酸処理により消失す
れば糖鎖が、抗原決定基に関与していると推定される。

なお、実施例で用いるウェスタン・プロッティング法は
、トーヴインらの方法〔プロシーディング・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス　（Ｐｒｏ
ｃ、　　Ｎａｔｌ、八ｃａｄ。

Ｓｃｉ、）　７６、４３５４（１９７９）］の変法を用
いた。すなわち、卵巣癌患者腹水の高分子分画または、
低分子分画をＳＤＳポリアクリルアミドグラデュエント
ゲル（４〜２０％）（デフコ社！！り電気泳動で泳動し
、得られたゲルをニトロセルロース膜と重ね合わせ、電
気泳動トランスファー・プロッティング装置（アト−社
製）を用いて１１２　（４ｊ液Ｃ３ｇ／ｊ）ｌ−１）ス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン、１４４ｇ／ｉ！グ
リシン、２０％メタノール、ｐＩ−１８，３］中で１０
℃以下、４０Ｖ、（ｉｏｏｍＡで通電し、タンパクを膜
に転写する。ニトロセルロース膜は風乾後、３％ゼラチ
ン溶液でブロック（ブロッキング）　した。洗ｔ１＋後
、バイブリド−７培養上清に浸し、室温で２時間反応さ
せる。さらにウサギ抗マウスイｌ、ノグｉｆｆプリンＩ
ｇＧ−ペルオキシダーゼ結合物〔ダコ（ＤＡＫＯ＞社製
、販売元協和メデックス。

４００倍沿釈液〕に浸し、室温で、２時間反応させる。

洗浄後、ペルオキシダーゼ発色液（１００ｍｌのトリス
・塩酸バッファー・セイライン（ＴＩ３Ｓ）　　［）リ
ス（七ドｔ１キシメチル）アミノメタン２．４２ｇ、　
食塩２９．２４ｇ。

蒸留水１，　ｐＨ７，５１に３０％過酸化水素を６０μ
Ｃ加えた溶液と、冷却したメタノール２０ｍ１に遮光下
ＨＲＰカラーディベロップメント・リーエイジェイント
　（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）［ｉｏｍＨを溶解した溶液と
を室温で混合したもの）に浸して発色させ、冷水で反応
を停止させる。

単クローン性抗体を用いる病理診断法は免疫組織化学的
染色法〔［酵素抗体法」（渡辺ｊ表−１中根−穂編、学
齢企画、　１９８５年）第１０６頁記載のＡＢＣ法］に
よって行う。

以下本発明の実施例を示す。

実施例１゜ （１）　　免疫原の調製 一８０℃に凍結保存しておいた染液性卵巣腺癌のうち、
乳頭状腺癌患者の腹水を融解後、３．００Ｏｒｐｍ、　
ｌ　Ｏ分間遠心分離し、固形分を除いた上清８ｍｌを０
，５ＭＮａＣｌ！を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７
，２）で平衡化したベツドボリューム７５０ｍ１のセル
ロファインＧＣＬ−２０００ＳＦ　（生化学工業社製）
カラ！・に通塔し、分子ｍ　ｌ、　０００．０００以上
の高分子画分（ボイドフラクション；フラクション番号
４１〜５０）を集め、これをヒト卵巣癌患者腹水の高分
子分画とした。セル【１フアインＧＣＬ２０００　Ｓ　
Ｉ”の溶出パターンを第１図に示した。

（２）抗体産生細胞の調製 ヒト正常肺膜成分（１００μｇ蛋白質／匹）を、生後２
４時間以内の新生仔Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス（静
岡実験動物製）に静脈内投与した。

を週間経過後のマウスに（１）で調製したヒト卵巣癌患
者の高分子分画１０（ｊμｇ（蛋白質換算）７匹を水酸
化アルミニウドケル２ｍｇ／匹、百日咳菌死菌ワクチン
ｌｘ　Ｉ　Ｏ／匹とともに腹腔内投与した。以後１〜２
週おきに、同一抗原１００μｇ（蛋白質換算）７匹で３
〜５回免疫した。これら免疫処理したマウスのうち、そ
の抗商１１′７が、ヒト卵巣癌患者腹水の高分子分画と
強く反応したマウス４免疫マウスとして選択し、そのマ
ウスより、肝細胞を調製して、細胞融合に供した。

（３）マウス骨髄腫細胞の調製 ８−アブグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−１１を
正常培地で培養し、細胞融合時に２Ｘ１０’以上の細胞
を（）、細胞融合に親株として供した。

（４）ハイブリドーマの作製 （２）と（３）で得られた肝細胞と骨髄腫細胞とを５：
１の割合で用い、前述した方法で融合させ、■（△Ｔ培
地で３７℃、１４日間Ｃ０２５％下で培養して、融合細
胞を選択し、）ＩＴ培地に変えてさらに培養し、ヒト卵
巣癌に対する抗体価の測定をして、活性な穴を選び、さ
らに正常ｊｓ地に変え、２回クローニングを段り返して
、酵素免疫測定法、免疫組織学的判定法（ΔＢＣ法）に
より、ヒト正常細胞や組織に全く反応せず、ヒト卵！！
癌に反応する単クローン性抗体を産生ずるハイブリドー
マ株ＫＯＣ−７０８を選択した。

（５）単クローン性抗体の精製 ブリスタン処理した８迎合ヌード雛マウスに（４）で得
られたハイブリドーマ株ＫＯＣ７０８を４Ｘ１０’細胞
／匹腹腔内注射した。

１０〜２１日後に、ハイブリドーマは腹水癌化した。腹
水のたまったマウスから、腹水を採取（５〜１０ｍ１／
匹）し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、　５分）して固
形分を除去した。４０％０％硫酸アンモニラにて塩析し
、０．０４Ｍリン酸１）２　ｔＪｊ液（ｐ　）−１８，
０，０，０３Ｍ　　ＮａＣｊ＋を含む）で透析後、ＤＥ
　５２　（ＷｈａＬｍａｎ社製）（ベットボリューノ・
５０ｍ１）のカラトに流速２０〜３０ｍ１／時で通塔し
ＩｇＧ両分を集め、ｆ＋’ｉ　！ｊ！　’ｒ’−クロー
ン性抗体とした。

（ｆｉ）　　Ｋ　ＯＣ〜７０８の特異性このようにして
（′シられた抗ヒト卵巣前型りローン性抗体ＫＯＣ−７
０８の反応性Ｗ性を第１表に示した。

測定は、酵よ免疫測定法（Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ）により
以下のとおり行った。

卵巣癌患者腹水の高分子分画をど；的とする場△　・ 酵素免疫分析用９６穴プレー）　（ｌｉｎｂｒｏ社！！
Ａ）にＩＯμｇ／ｍｌの卵Ｅ　ｆｍ患者１１１！水の高
分子分画液を５０μＱ／穴入れ、３７υで２１１８　ｆ
ｉｌｌまたは４℃で１晩放置してプレート穴底面に固定
した。ＰＢＳで洗浄後、ＩＯ％ＦＣ３含有ＰＢＳを１０
０μＱ／穴分注し、プレート上の活性残基を保護した。

ＰＢＳで洗浄後、第１抗体（ＫＯＣ−７０８）５０μＱ
／穴を入れ、３７℃で１〜２時間または４℃で１晩赦置
して標的お抗体を反応させた。０．０５％７ｗｅｅｎ２
０（和光紬薬工業社製）含有１３　Ｂ　Ｓで５回洗浄し
て未反応の抗体を除去した。第２抗体としてペルオキシ
ダーゼ結合ウサギ抗マウス免疫グロブリン（Ｍｉｌｅｓ
−Ｙｃｄａ社：２００ｆｆｆ希釈）５０μＱ／穴を入れ
、３７℃で１時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅ　ｅ　
ｎ−２０含有１’ＢＳで５回洗浄後、レジン水で３回洗
浄した。へＢＴＳ５０μＱ／穴を加えて反応を開始し、
５％ラウリル硫酸ナトリウｌ、水溶液５０μＱ／穴を加
えて反応を停止させた。

培養株細胞を標的とする場合： 細胞をＪΔ養用９Ｇ穴プレー）（１，ｉ篩「０社製）で
培養し、コンフルエントになった時点で上記の卵巣１１
；４患者１復水の高分子分画の場合と同様に反応させた
。ただし第１抗体、第２抗体とも反応条件は室温で３０
分間とし、発色後に反応液を分析用９６穴プレートに移
すことにより反応を停止させた。

抗原ＣＥΔの場合は卵巣癌患者腹水の高分子分画に替え
てＣＥＡを用いる以外は組織の場合と同様に行った。い
ずれの場合も、／１１９０ｎｍを対照波長として４１５
ｎｍの吸光度を測定した。

第１表に示すごとく、ＫＯＣ−７０８は、各種組織型の
卵巣癌と高率に反応した。しかし、ＣＥＡと反応しない
ことから、抗−ＣＥＡ抗体とは異なることがわかる。

実施例２゜ ミクロトームで５犀にスライスした各種正常成人、胎児
臓器および癌組織のホルマリン固定パラフィン包埋組織
切片を、卵白γルブミンでコートしたスライドグラスに
固定し、キシレンで脱パラフイン後、アルコール−水で
段階的に親水化した。レジン水で５分間ずずぎ、０．３
％Ｈ，Ｃ）ａを含むメタノール中で室温３０分間静置し
、内因性ペルオキシダーゼをブロックした。

次に切片を２０分間ＰＢＳ″′Ｑ洗浄後、希釈したウマ
正常血清中で室温２０分間静置した。切片から過剰の血
〆ｎを吸い取り、第１抗体（抗ヒト卵巣前型りローン性
抗体ＫＯＣ−７０８゜ｌＯ■／ｍｌ）と３０分間反応さ
せた。洗浄後、卵 子 乳 希釈ビオチン化抗体〔ビオチン化つサギ抗１ｇＧ抗体（
ベクター社製）〕を３３０分間反させ、さらに洗浄後、
アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体（ベクタ
ー社ｎ；ａ＞を３ｏ分間反応させた。よく洗浄後、ペル
オキシダーゼ基質［０，０２％＋（、Ｏ，を含む０．１
　Ｍ　）リスー塩酸緩ｆｌｉ液（ｐＨ７，２）で調整し
た０、１％ジアミノヘンジジンデトラヒドロクロライド
（ｄｉａｍｉｎｏｂｃｎｚｉｄｉｎｅＬｅＬｒａｈｙｄ
ｒｏｃｌｏｒｉｄｅ　）　］を２２分間反させ、水冷中
で反応を停止した。ヘマトキシレン染色後、アルコール
−水４１よびキシレンで脱水後、カナダバルサムで固定
し、検鏡した。その結果を第２表に示す。

巣 宮 ＋十　　　　　　　± 癌　　５　　４０　　１　　０ 癌　　４　　３１　　０　　０ 癌　　１７　　１１　　４　　１　　１第２表に示すよ
うにＫＯＣ−７０８は、卵巣癌組織と、高率に強く反応
した。また、ＫＯＣ−７０８は、子宮癌、乳癌に対して
も高率に強く反応した。正常・胎児組織（心、膵、胃、
大腸、腎、甲状腺、脳、胛、肝、小腸など）では、一部
の細胞と極めて弱く反応するものがみられたが、その他
の組織とは全く反応しなかった。

実施例３ ！ｎクローン性抗体ＫＯＣ−７０８が認識する抗原を解
析するために、卵巣癌患者腹水の高分子分画を下記各種
酵累および試薬で処理した後ＫＯＣ−７０８との反応性
を調べた。

酵−＋：および試薬 トリプシン（ＧｒＢＣＯ社製　２．５％溶液）ＰＢＳ中
　０．２５％ ノイラミニダーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製） ０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４，５）−３ｍＭ　　Ｃ
ａＣＡ、中０．ｌＵ／ｍ α−Ｌ−フコシダーゼ（ベーリンガー・マンハイｌ、社
製） ０．１Ｍリン酸バッファー（ｐ　！（６，３）中０、ｌ
Ｕ／ｍｌ プロプアーゼ（シグマ社製） ０．１Ｍリン酸バッファー（ｐ　Ｈ７，２）中１０Ｕ／
ｍ１ ＮａｌＯ４（和光紬薬社製） ＰＢＳ［１１５０ｍＭ 卵巣癌患者１復水の高分子分画（′ｆＦＬ白量ｌＯμｇ
　／　ｍ　ｌ　）を５ｕＱ／穴ずつ、ＥｒＡ用プレート
（Ｌｉｎｂｒｏ社製）に分注し、４℃で１晩放置後、Ｐ
ＢＳで３回洗浄し、１％　ＢＳΔ−ＰＢＳを２００μＱ
／穴分注し、：（０分間〜２時間室温で放置し、ＰＢＳ
で３回洗浄後、上記酵素液または試薬液を５０μＱ／穴
分注し、３７℃で１時間反応させた。ついでＰＢＳで５
回洗浄し、！ｐ−りｏ　−ン性抗体ＫＯＣ−７０８（１
０μｆｆ／ｍｌ）を５０μσ／穴分注し、４℃で１晩放
置した。

Ｔｗｅｅｎ−２０−ＰＢＳ　　（Ｔｗｅｃｎ−２０は和
光純桑工業社製）で５回洗浄後、ペルオキシダーゼ４票
識抗マウスＩｇＧ（ダコ（ＤへＫＯ＞社製、販売元協和
メデックス４００倍希釈液〕を５０μＱ／穴加え、室温
で２時間反応後、’ｌ’ｗｅ　ｅ　ｎ−２０−ＰＢＳで
５回洗浄し、Ａｌ３ＴＳ基質液１００μＱを加え、３０
分間反応後、４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。

抗原性は、第２図に示したとおり、トリプシン、プロテ
アーゼ処理により消失した。この結果より、単クローン
性抗体ＫＯＣ−７０８は抗原決定基として蛋白質をＫｎ
　＝１しているものと推定された。

実施例４ 前記のウェスタン・プロッティング法によりＫＯＣ−７
０８の卵巣癌患者腹水の高分子分画及び低分子分画との
反応性を調べた。その結果を第３図に示した。ＫＯＣ−
７０８は高分子分画のうち分子ｍ　，０００．０００以
上の蛋白質と反応した。

発明の効果 本発明によれば卵巣癌、乳癌及び子宮癌の病理診断、治
療に有用な単クローン性抗体が供給される。

【図面の簡単な説明】

ｍ１図は実施例１のセルｆ１ファインＧＣＩ−２０００
Ｓ　Ｆの溶出パターンを示す。 第２図は単クローン性抗体ＫＯＣ−７０８の認識抗原解
析の結果を示す。図単・はノイラミニダーゼ０、ＩＵ／
ｍｌ、口はα−１７−フコシダーゼ０．ｌＵ／ｍｌ。○
はトリプシン０．２５％、ムはプロテアーゼｌ０ＬＩ／
ｍｌ、△はＮａｒｏ。 ５０ｍＭの処理を示す。 工３図は実施例４のウェスタン・プロッティング法によ
り単クローン性抗体ＫＯＣ，７０８の反応性を調べた結
果を示す。Δ）はアミドブラック染色、Ｂ）はＫＯＣ−
７０８による免疫染色である。△）、Ｂ）とも■、■は
分子量マーカー（ミオシン：２００Ｋｄ、　　β−力°
ラクトシダーゼ：Ｉ１６．２５Ｋｄ、　　フナスフオリ
ラーゼＢ：９２．５Ｋｄ、　　ウシ血清アルブミン：　
６６．２Ｋｄ、オボアルブミン：４５Ｋｄ）、■は卵巣
癌患者腹水の高分子分画、■は卵巣癌患者腹水の低分子
分画を検体としている。 特許出願人（＋０２）協和醗酵工業株式会社第 図 何 片Ｏ ワ○ フラ７ンヨン番号（丈。込／ｌ、ｂｅ）第２図 賦漿（オ刺令状牢

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＩｇＧクラスに属し、粘液性卵巣腺癌、漿液性卵
   巣腺癌、淡明細胞卵巣癌、乳癌及び子宮癌に対して反応
   性を有し、卵巣癌患者腹水の分子量１，０００，０００
   以上の蛋白質に特異的に結合し、抗原決定基が蛋白質で
   ある抗ヒト卵巣癌単クローン性抗体。
2. （２）請求項（１）記載の抗ヒト卵巣癌単クローン性抗
   体ＫＯＣ−７０８。
3. （３）抗ヒト卵巣癌単クローン性抗体ＫＯＣ−７０８を
   生産する能力を有するハイブリドーマを培地中に培養す
   るかマウスに投与して腹水化し、培養物または腹水中に
   抗ヒト卵巣癌単クローン性抗体ＫＯＣ−７０８を蓄積さ
   せ、該培養物または腹水からこれを採取することによる
   抗ヒト卵巣癌単クローン性抗体ＫＯＣ−７０８の製造法
   。
4. （４）請求項（１）記載の単クローン性抗体を生産する
   ハイブリドーマ。
5. （５）ハイブリドーマ株ＫＯＣ−７０８（ＦＢＲＭＢＰ
   −１７６２）。