JPS6283898A - 抗ヒト肺腺癌特異的単クロ−ン性抗体 - Google Patents
抗ヒト肺腺癌特異的単クロ−ン性抗体Info
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- JPS6283898A JPS6283898A JP60225327A JP22532785A JPS6283898A JP S6283898 A JPS6283898 A JP S6283898A JP 60225327 A JP60225327 A JP 60225327A JP 22532785 A JP22532785 A JP 22532785A JP S6283898 A JPS6283898 A JP S6283898A
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- lung adenocarcinoma
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3023—Lung
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、ヒト肺癌、特にヒト肺腺癌に特異性を有し、
その認識する抗原（エピトープ）がシアル酸化された糖
タンパクあるいは糖脂質であることを特徴とする単クロ
ーン性抗体およびその肺腺癌の病理診断ならびに血清診
断・モニタリングへの利用に関するものである。
その認識する抗原（エピトープ）がシアル酸化された糖
タンパクあるいは糖脂質であることを特徴とする単クロ
ーン性抗体およびその肺腺癌の病理診断ならびに血清診
断・モニタリングへの利用に関するものである。
従来技術
最近、免疫動物からの抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融
合させて得られるハイブリドーマを培養して特異的に腫
瘍と反応する単クローン性抗体を１尋る方法が報告され
ている。ヒト肺癌に対する単クローン性抗体をこのよう
な手法で得ることもすでに報告されている〔キャンサー
・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、） ４２．１５０（
１９８２）、 キャンサー・１Ｊｔ−チ（Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｅｓ、） ４２．３１８７（１９ｇ２＞、 ジ
ャーナル、オブ・サージカル・リサーチ（Ｊ、Ｓｕｒｇ
ｉｃａｌ Ｒｅｓ、）、３０゜４０３（１９８１）、
）ランスプランテーション・プロシイ−ディング（Ｔｒ
ａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｅｄ、）、
ＸＩＩ［（４）。
合させて得られるハイブリドーマを培養して特異的に腫
瘍と反応する単クローン性抗体を１尋る方法が報告され
ている。ヒト肺癌に対する単クローン性抗体をこのよう
な手法で得ることもすでに報告されている〔キャンサー
・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、） ４２．１５０（
１９８２）、 キャンサー・１Ｊｔ−チ（Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｅｓ、） ４２．３１８７（１９ｇ２＞、 ジ
ャーナル、オブ・サージカル・リサーチ（Ｊ、Ｓｕｒｇ
ｉｃａｌ Ｒｅｓ、）、３０゜４０３（１９８１）、
）ランスプランテーション・プロシイ−ディング（Ｔｒ
ａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｅｄ、）、
ＸＩＩ［（４）。
１９４２ （１９８１） 、 ジャーナル・オブ・イ
ムノロシイ（Ｊ。
ムノロシイ（Ｊ。
［ｍｍｕｎｏｌ、）、 １３１ （１） ４９７ （
１９８３）、免疫学会要旨Ｐ、２１２（演題番号１０７
番） （１９８３）京泉誠之〕。しかし、それらの単ク
ローン性抗体の多くは、肺癌以外の癌や、ヒト正常細胞
とも反応するものがほとんどで肺癌特異的といえるもの
は少ない。また、比較的肺癌に特異的といえるもの〔ジ
ャーナル・オブ・イムノロシイ（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ
、） １３１ （１） ４９７（１９８３）でも、小細
胞癌と非小細胞癌を識別することができるのみで扁平上
皮癌、腺癌などの組織型を判別することはできない。ま
た、肺癌の血清診断へ応用できる単クローン性抗体につ
いての報告はない。
１９８３）、免疫学会要旨Ｐ、２１２（演題番号１０７
番） （１９８３）京泉誠之〕。しかし、それらの単ク
ローン性抗体の多くは、肺癌以外の癌や、ヒト正常細胞
とも反応するものがほとんどで肺癌特異的といえるもの
は少ない。また、比較的肺癌に特異的といえるもの〔ジ
ャーナル・オブ・イムノロシイ（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ
、） １３１ （１） ４９７（１９８３）でも、小細
胞癌と非小細胞癌を識別することができるのみで扁平上
皮癌、腺癌などの組織型を判別することはできない。ま
た、肺癌の血清診断へ応用できる単クローン性抗体につ
いての報告はない。
最近、抗ヒト消化器癌（胃癌、膵癌、大腸癌）単クロー
ン性抗体を用いる消化器癌の血清診断が報告されている
。これらの単クローン性抗体はいずれも、血清中抗原と
してシアル酸化された糖タンパクをＳ忍識しているもの
である〔ジャーナル・オブ・クリニカル・イムノロシイ
（Ｊ、 ＣＩ ｉｎ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ。
ン性抗体を用いる消化器癌の血清診断が報告されている
。これらの単クローン性抗体はいずれも、血清中抗原と
してシアル酸化された糖タンパクをＳ忍識しているもの
である〔ジャーナル・オブ・クリニカル・イムノロシイ
（Ｊ、 ＣＩ ｉｎ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ。
２、１３５（１９８２）、 フェデレーション・ブロ
シイーデインダス（Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃ、
）、 ４１．８９８ （１９８２） 。
シイーデインダス（Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃ、
）、 ４１．８９８ （１９８２） 。
キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、）、
４２．６０１（１９８２）、 バイブリド−？
（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）、 ２． １１０（１９８３
） ）。一方、肺癌に対する単クローン性抗体で、シア
ル酸化された糖蛋白質あるいは糖脂質を認識するものは
これまで全く報告がない。
４２．６０１（１９８２）、 バイブリド−？
（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）、 ２． １１０（１９８３
） ）。一方、肺癌に対する単クローン性抗体で、シア
ル酸化された糖蛋白質あるいは糖脂質を認識するものは
これまで全く報告がない。
発明が解決すべき問題点および解決方法肺癌に特異的に
反応する単クローン性抗体が得られれば、肺癌の診断に
有用である。肺癌の単クローン性抗体は知られているけ
れども、さらに優れた抗体の開発が望まれている。本発
明者はヒト肺腺癌組織膜成分で免疫した抗体産生マウス
の牌〕 細胞とマウス骨髄腫細胞とが融合したハイブリ
ドーマが生産するモノクローナル抗体が、肺腺癌に対し
て特に優れた反応性を有し、肺癌の血清診断に応用でき
ることを見出し本発明を完成した。
反応する単クローン性抗体が得られれば、肺癌の診断に
有用である。肺癌の単クローン性抗体は知られているけ
れども、さらに優れた抗体の開発が望まれている。本発
明者はヒト肺腺癌組織膜成分で免疫した抗体産生マウス
の牌〕 細胞とマウス骨髄腫細胞とが融合したハイブリ
ドーマが生産するモノクローナル抗体が、肺腺癌に対し
て特に優れた反応性を有し、肺癌の血清診断に応用でき
ることを見出し本発明を完成した。
以下本発明について詳細に説明する。
本発明は、ヒト肺腺癌組織膜成分で免疫したマウスの肺
細胞とマウス骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマ
を作製し、ヒト肺腺癌に特異性を有する単クローン性抗
体を選択し、該ハイブリドーマを培地中に培養するかマ
ウスに投与して該マ）、 ウスで腹水化し、該培養物ま
たは腹水より採取することにより得られ、かつシアル酸
化された糖蛋白質または糖脂質を抗原として認識する抗
ヒト肺腺癌特異的単クローン性抗体を提供する。
細胞とマウス骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマ
を作製し、ヒト肺腺癌に特異性を有する単クローン性抗
体を選択し、該ハイブリドーマを培地中に培養するかマ
ウスに投与して該マ）、 ウスで腹水化し、該培養物ま
たは腹水より採取することにより得られ、かつシアル酸
化された糖蛋白質または糖脂質を抗原として認識する抗
ヒト肺腺癌特異的単クローン性抗体を提供する。
本発明の単クローン性抗体は、ＩｇＭクラスに属し、肺
腺癌細胞に対して特異的に反応し、シアル酸化された糖
蛋白質または糖脂質を抗原として言忍識する。
腺癌細胞に対して特異的に反応し、シアル酸化された糖
蛋白質または糖脂質を抗原として言忍識する。
本発明単クローン性抗体の具体例としては、ハイブリド
ーマ細胞株ＡＬＣ−１８６（ＮＣＡＣＣ８５０８２９０
３）が生産するＡＬＣ−１８６があげられる。
ーマ細胞株ＡＬＣ−１８６（ＮＣＡＣＣ８５０８２９０
３）が生産するＡＬＣ−１８６があげられる。
以下に本発明単クローン性抗体の製造法を詳細に説明す
る。
る。
（１）動物の免疫と抗体産生細胞の調製３〜１０週令、
望ましくは８週令のマウスに、ヒト肺腺癌の細胞１組織
あるいはそれらの膜成分を免疫して、その動物の牌、リ
ンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を調製する。免疫する
マウスはヒト正常肺細胞で前処理して免疫寛容にしたマ
ウスを用いるのが好ましい。免疫の方法は、動物の皮下
あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバント
〔例えば、フロイントの完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌ
ｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）または
、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕と
ともにヒト肺腺癌細胞（１０６〜１０７細胞／匹）、ヒ
ト肺腺癌組織もしくはそれらの膜成分（膜断片）（１０
〜５００μｇ／匹）を投与する。以後、１〜２週問おき
に、抗原を２〜５回投与する。各免疫後３〜７日目に眼
底静脈叢より採血し、その血清がヒト肺腺癌と反応する
ことを以下に示す酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（Ｅ
ＬＩＳＡ）：医学書腕利１９７６年〕などで調べる。
望ましくは８週令のマウスに、ヒト肺腺癌の細胞１組織
あるいはそれらの膜成分を免疫して、その動物の牌、リ
ンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を調製する。免疫する
マウスはヒト正常肺細胞で前処理して免疫寛容にしたマ
ウスを用いるのが好ましい。免疫の方法は、動物の皮下
あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバント
〔例えば、フロイントの完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌ
ｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）または
、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕と
ともにヒト肺腺癌細胞（１０６〜１０７細胞／匹）、ヒ
ト肺腺癌組織もしくはそれらの膜成分（膜断片）（１０
〜５００μｇ／匹）を投与する。以後、１〜２週問おき
に、抗原を２〜５回投与する。各免疫後３〜７日目に眼
底静脈叢より採血し、その血清がヒト肺腺癌と反応する
ことを以下に示す酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（Ｅ
ＬＩＳＡ）：医学書腕利１９７６年〕などで調べる。
酵素免疫測定法：
９６穴のＥＩＡ用プレート〔フロー・ラボラトリーズ（
Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製〕に、正常
あるいはｌｌｉ瘍細胞１組織の膜成分（蛋白量として１
０〜１．０００μｇ ７ｍｌ含有する膜断片）を１００
〜２００μｌ／穴ずつ分注し、４℃で１〜２晩放置して
、牛血清アルブミンをプレート穴底面にコートし、上清
を抜き去った後、レジン水あるいは、ＰＢＳ （リン酸
二ナトリウム１、８３ ｇ 、リン酸−カリウム０．２
１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸溜水１β、ｐＨ７，２）でよ
く洗浄後、第１抗体として、１％ＢＳＡ、（牛血清アル
ブミン）−ＰＢＳを１００〜２００μｌ／穴分注し、４
℃で１〜２晩放置して、プレート上に残った蛋白質との
結合残基をブロック（ブロッキング）した。その後、Ｂ
ＳΔ−ＰＢＳを檜て、レジン水あるいはＰＢＳでよく洗
浄した後、第１抗体として、ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈した
試料（マウス血清、ハイプリドーマ培養上清、粗精製モ
ノクローナル抗体）を１００μβ／穴分注し、４℃で１
晩放置する。レジン水で１回、２Ｍ ＮａＣｊ！溶液
で６回洗浄した後、第２抗体としてウサギの抗マウスイ
ムノグロブリンＩｇＧ−ペルオキシダーゼ結合物〔ダコ
（ＤＡＫＯ）社製、販売元協和メデックス〕の１００倍
希釈液を１００ｍ／大分注し、室温で２時間放置する。
Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製〕に、正常
あるいはｌｌｉ瘍細胞１組織の膜成分（蛋白量として１
０〜１．０００μｇ ７ｍｌ含有する膜断片）を１００
〜２００μｌ／穴ずつ分注し、４℃で１〜２晩放置して
、牛血清アルブミンをプレート穴底面にコートし、上清
を抜き去った後、レジン水あるいは、ＰＢＳ （リン酸
二ナトリウム１、８３ ｇ 、リン酸−カリウム０．２
１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸溜水１β、ｐＨ７，２）でよ
く洗浄後、第１抗体として、１％ＢＳＡ、（牛血清アル
ブミン）−ＰＢＳを１００〜２００μｌ／穴分注し、４
℃で１〜２晩放置して、プレート上に残った蛋白質との
結合残基をブロック（ブロッキング）した。その後、Ｂ
ＳΔ−ＰＢＳを檜て、レジン水あるいはＰＢＳでよく洗
浄した後、第１抗体として、ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈した
試料（マウス血清、ハイプリドーマ培養上清、粗精製モ
ノクローナル抗体）を１００μβ／穴分注し、４℃で１
晩放置する。レジン水で１回、２Ｍ ＮａＣｊ！溶液
で６回洗浄した後、第２抗体としてウサギの抗マウスイ
ムノグロブリンＩｇＧ−ペルオキシダーゼ結合物〔ダコ
（ＤＡＫＯ）社製、販売元協和メデックス〕の１００倍
希釈液を１００ｍ／大分注し、室温で２時間放置する。
ＰＢＳでよく洗浄後、ＡＢＴＳ基質液〔２゜２′−アジ
ノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸
）ニアンモニウム５５０■を０、１ Ｍクエン酸緩衝液
（ｐＨ４，２）ｉｌに溶かした溶液に、使用直前に過酸
化水素１ｍ／ｍｌを加えた溶液〕を用い、発色をＯＤ、
、ｓ工の吸光度で測定する。このとき、肺腺癌細胞、組
織あるいはそれらの膜成分に対して強く反応するマウス
をヒト肺腺癌免疫マウスとしてハイブリドーマ作製のた
めの抗体産生細胞の供給源として用いる。
ノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸
）ニアンモニウム５５０■を０、１ Ｍクエン酸緩衝液
（ｐＨ４，２）ｉｌに溶かした溶液に、使用直前に過酸
化水素１ｍ／ｍｌを加えた溶液〕を用い、発色をＯＤ、
、ｓ工の吸光度で測定する。このとき、肺腺癌細胞、組
織あるいはそれらの膜成分に対して強く反応するマウス
をヒト肺腺癌免疫マウスとしてハイブリドーマ作製のた
めの抗体産生細胞の供給源として用いる。
酵素免疫測定法を行うにあたって、抗原として、細胞そ
のものを用いる場合は、ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）
３０７２プレート中で、標的細胞を培養し、０．２５％
ゲルタールアルデヒド−ＰＢＳを加え、室温に１〜２時
間放置し、ＰＢＳでよく洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ
１００〜２００ＡＩ！を加え、２時間放置し、レジン水
またはＰＢＳでよく洗浄し、そのプレートを用いて、一
般の抗原コートプレートを用いるのと同様の方法にて、
抗体価の測定を行った。
のものを用いる場合は、ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）
３０７２プレート中で、標的細胞を培養し、０．２５％
ゲルタールアルデヒド−ＰＢＳを加え、室温に１〜２時
間放置し、ＰＢＳでよく洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ
１００〜２００ＡＩ！を加え、２時間放置し、レジン水
またはＰＢＳでよく洗浄し、そのプレートを用いて、一
般の抗原コートプレートを用いるのと同様の方法にて、
抗体価の測定を行った。
細胞融合に供するにあたって、免疫化マウスに融合処理
の３〜４日前に、ヒト肺腺癌細胞。
の３〜４日前に、ヒト肺腺癌細胞。
組織あるいはその膜成分を２〜５Ｘ１０’細胞／匹ある
いは２．０〜４００μｇ／匹復腔内に投与し、膵臓細胞
を摘出し、肺細胞を調製する。
いは２．０〜４００μｇ／匹復腔内に投与し、膵臓細胞
を摘出し、肺細胞を調製する。
膵臓をＭＥＭ （日永製薬社製）中で細断し、ピンセッ
トでほぐし、１２０Ｏｒｐｍ、５分間遠心分離にかけ、
上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７
，６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去し、ＭＥＭで
３回洗浄して融合用肺細胞として提供する。
トでほぐし、１２０Ｏｒｐｍ、５分間遠心分離にかけ、
上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７
，６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去し、ＭＥＭで
３回洗浄して融合用肺細胞として提供する。
（２）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使
用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡ
ＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕｌ
（Ｐ３−Ｕｌ）〔カレント・トピックス・イン・ミク
ロバイオロジイ・アンド・イムノロシイ−１（Ｃｕｒｒ
ｅｎｔＴｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ −１） 〕〔ヨーロ
ピアン・ジャーナルφオブ・イムノロシイ（Ｅｕｒｏｐ
ｅａｎ Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ） ６ ５１
１−５１９（１９７６）） 、ＳＰ２１０−Ａｇ １４
（ＳＰ−２）〔ネイチ−？ −（Ｎａｔｕｒｅ） ２
７６、２６９−２７０ （１９７８））、Ｐ３−Ｘ６３
−Ａｇ８６５３ （６５３） Ｃジャーナル・オブ・イ
ムノロシイ（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ） １２３．
１５４８−１５５０ （１９７９） ） 、Ｐ３−Ｘ６
３−Ａｇ３ （Ｘ６３）〔ネイチ＋ −（Ｎａｔｕｒｅ
） ２５６． ４９５−４９７（１９７５） ’］など
が用いられる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培
地〔ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１，５ｍＭ
）、２メルカプトエタノール（５Ｘ １０−’Ｍ） 、
ジェンクマイシン（１０μｇ／ｍｌ）および牛胎児血清
（ＦＣ３）（Ｃ３Ｌ社製）（１０％）を加えた正常培地
に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ ／ｍｌ ）を
加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正
常培地に継代し、融合当日２Ｘ１０’以上の細胞数を確
保する。
用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡ
ＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕｌ
（Ｐ３−Ｕｌ）〔カレント・トピックス・イン・ミク
ロバイオロジイ・アンド・イムノロシイ−１（Ｃｕｒｒ
ｅｎｔＴｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ −１） 〕〔ヨーロ
ピアン・ジャーナルφオブ・イムノロシイ（Ｅｕｒｏｐ
ｅａｎ Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ） ６ ５１
１−５１９（１９７６）） 、ＳＰ２１０−Ａｇ １４
（ＳＰ−２）〔ネイチ−？ −（Ｎａｔｕｒｅ） ２
７６、２６９−２７０ （１９７８））、Ｐ３−Ｘ６３
−Ａｇ８６５３ （６５３） Ｃジャーナル・オブ・イ
ムノロシイ（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ） １２３．
１５４８−１５５０ （１９７９） ） 、Ｐ３−Ｘ６
３−Ａｇ３ （Ｘ６３）〔ネイチ＋ −（Ｎａｔｕｒｅ
） ２５６． ４９５−４９７（１９７５） ’］など
が用いられる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培
地〔ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１，５ｍＭ
）、２メルカプトエタノール（５Ｘ １０−’Ｍ） 、
ジェンクマイシン（１０μｇ／ｍｌ）および牛胎児血清
（ＦＣ３）（Ｃ３Ｌ社製）（１０％）を加えた正常培地
に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ ／ｍｌ ）を
加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正
常培地に継代し、融合当日２Ｘ１０’以上の細胞数を確
保する。
（３）細胞融合
（１）で免疫した抗体産生細胞と（２）で得られた骨髄
腫細胞をＭ Ｅ Ｍ培地またはＰＢＳでよく洗浄し、細
胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１にな
るよう混合し、遠心分離（１，２０Ｏｒｐｍ ５分）し
た後、上清を捨て、沈殿した細胞群をよくほぐした後、
攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングライコール１
．０００ （ＰＥＧ−１，０００）２ｇ、ＭＥＭ２ｍｌ
およびジメチルスルホキシド０．７ｍｌの混液０．２〜
１ｍｌ／ １０’抗体産生細胞を加え、１〜２分間毎に
ＭＥＭ１〜２ｍｌを数回加えた後、ＭＥＭを加えて全量
が５Ｑｍｌになるようにする。遠心分離（９００ｒｐ５
分）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、正
常培地（ＲＰＭ Ｉ １６４０．、 ＦＣ３１０％）１
００ｍｌを加え、メスピペットによる吸込み、吹出しで
ゆるやかに細胞を懸濁する。
腫細胞をＭ Ｅ Ｍ培地またはＰＢＳでよく洗浄し、細
胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１にな
るよう混合し、遠心分離（１，２０Ｏｒｐｍ ５分）し
た後、上清を捨て、沈殿した細胞群をよくほぐした後、
攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングライコール１
．０００ （ＰＥＧ−１，０００）２ｇ、ＭＥＭ２ｍｌ
およびジメチルスルホキシド０．７ｍｌの混液０．２〜
１ｍｌ／ １０’抗体産生細胞を加え、１〜２分間毎に
ＭＥＭ１〜２ｍｌを数回加えた後、ＭＥＭを加えて全量
が５Ｑｍｌになるようにする。遠心分離（９００ｒｐ５
分）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、正
常培地（ＲＰＭ Ｉ １６４０．、 ＦＣ３１０％）１
００ｍｌを加え、メスピペットによる吸込み、吹出しで
ゆるやかに細胞を懸濁する。
この懸濁液を２４穴培養用プレートに１ｍ１／穴ずつ分
注し、５％ＣＯ２インキユベーター中、３７℃で２４時
間培養する。培養プレートに１ｍｌ／穴のＨＡＴ培地〔
正常培地にヒポキサンチン（１０−’Ｍ）、チミジン（
１，５Ｘ １０−’Ｍ）およびアミノプテリン（４Ｘ１
０−’Ｍ）を加えた培地〕を加え、さらに２４時間培養
する。以後２日間、２４時間毎に、培養上清１ｍｌを捨
て、新たに同量のＨＡＴ培地を加え、ＣＯ２インキュベ
ーター中、３７℃で１０〜１４日間培養する。
注し、５％ＣＯ２インキユベーター中、３７℃で２４時
間培養する。培養プレートに１ｍｌ／穴のＨＡＴ培地〔
正常培地にヒポキサンチン（１０−’Ｍ）、チミジン（
１，５Ｘ １０−’Ｍ）およびアミノプテリン（４Ｘ１
０−’Ｍ）を加えた培地〕を加え、さらに２４時間培養
する。以後２日間、２４時間毎に、培養上清１ｍｌを捨
て、新たに同量のＨＡＴ培地を加え、ＣＯ２インキュベ
ーター中、３７℃で１０〜１４日間培養する。
コロニー状に生育してきた融合細胞の認められる穴につ
いて、上清１ｍｌを揄で、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からア
ミノプテリンを除いた培地）を同量加え、以後２日間２
４時間毎にＨＴ培地への変換を行う。
いて、上清１ｍｌを揄で、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からア
ミノプテリンを除いた培地）を同量加え、以後２日間２
４時間毎にＨＴ培地への変換を行う。
ＨＴ培地で３〜４日間培養後、培養上清の一部をとり上
記の酵素免疫測定法により、ヒト肺腺癌に対する抗体価
を測定する。このとき、同様の方法で、ヒト正常網胞１
組織あるいはその膜成分などとの反応性も測定し、ヒト
肺腺癌細胞組織あるいはその膜成分に特異的に反応する
ものを選択する。ヒト肺腺癌細胞１祖織あるいはその膜
成分に強（反応し、ヒト正常細胞１組礒あるいはその膜
成分などに反応しない穴について、限界希釈法によりク
ローニングを２回繰 。
記の酵素免疫測定法により、ヒト肺腺癌に対する抗体価
を測定する。このとき、同様の方法で、ヒト正常網胞１
組織あるいはその膜成分などとの反応性も測定し、ヒト
肺腺癌細胞組織あるいはその膜成分に特異的に反応する
ものを選択する。ヒト肺腺癌細胞１祖織あるいはその膜
成分に強（反応し、ヒト正常細胞１組礒あるいはその膜
成分などに反応しない穴について、限界希釈法によりク
ローニングを２回繰 。
り返し、安定してヒト肺腺癌綿胞９組織あるいはその膜
成分に強い抗体価の認められたものを抗ヒト肺腺癌単り
ローン性抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
成分に強い抗体価の認められたものを抗ヒト肺腺癌単り
ローン性抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
（４）単クローン性抗体の調製
ブリスタン処理Ｃ２，６，１０，１４−テトラメチルペ
ンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ） ０．５ｍｌを腹腔内
投与し、２Ｍ間飼育する〕した８〜１０週令のＢＡＬＢ
／ｃ雌マウスに、（３）で得られた抗ヒト肺腺癌単りロ
ーン性抗体産生ハイブリドーマ細胞２〜４Ｘ１０６細胞
／匹を腹腔内注射する。１０〜２１日でハイブリドーマ
は腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分
離（３，０００ｒｐｍ ５分）して固形分を除去後、５
０％硫酸アンモニウムにて塩析し、ＰＢＳにＮａＣｊ２
０．５Ｍを加えた液で透析し、セファクリル５３００（
ファルマシア・ファイン・ケミカル社Ｉり（ペットポリ
ニーム７５０ｍ１ ）のカラムに流速１５ｍ１ ／ｈｒ
で通塔し、ＩｇＭ画分を集め、精製単クローン性抗体と
する。
ンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ） ０．５ｍｌを腹腔内
投与し、２Ｍ間飼育する〕した８〜１０週令のＢＡＬＢ
／ｃ雌マウスに、（３）で得られた抗ヒト肺腺癌単りロ
ーン性抗体産生ハイブリドーマ細胞２〜４Ｘ１０６細胞
／匹を腹腔内注射する。１０〜２１日でハイブリドーマ
は腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分
離（３，０００ｒｐｍ ５分）して固形分を除去後、５
０％硫酸アンモニウムにて塩析し、ＰＢＳにＮａＣｊ２
０．５Ｍを加えた液で透析し、セファクリル５３００（
ファルマシア・ファイン・ケミカル社Ｉり（ペットポリ
ニーム７５０ｍ１ ）のカラムに流速１５ｍ１ ／ｈｒ
で通塔し、ＩｇＭ画分を集め、精製単クローン性抗体と
する。
抗体のインタイブの決定は、オクタロニイ（Ｏｕｃｈｔ
ｅｒｌｏｎｙ）法（二重免疫拡散法）（免疫学実験入門
、生物化学実験法１５、学会出版センター刊、 Ｐ、
７４１９８１年）によって行う。
ｅｒｌｏｎｙ）法（二重免疫拡散法）（免疫学実験入門
、生物化学実験法１５、学会出版センター刊、 Ｐ、
７４１９８１年）によって行う。
蛋白量の定量は、フォーリン法および２８０ｎｍでの吸
光度（１，４（ＯＤｚｓｏ ） ’ｉイムノグロブリン
ｌｕｇ／ｍｌ）より算出する。
光度（１，４（ＯＤｚｓｏ ） ’ｉイムノグロブリン
ｌｕｇ／ｍｌ）より算出する。
得られた単クローン性抗体の特異性の決定は複数の検体
から得られたヒトの各種の臓器由来の正常あるいは腫瘍
組織あるいはその膜成分との反応性、各種ヒト正常ある
いは腫瘍細胞培養株またはヒト胎児細胞培養株もしくは
それらの膜成分との反応性、従来から知られている癌胎
児性抗原（例えばＣＥＡ）との反応性、正常。
から得られたヒトの各種の臓器由来の正常あるいは腫瘍
組織あるいはその膜成分との反応性、各種ヒト正常ある
いは腫瘍細胞培養株またはヒト胎児細胞培養株もしくは
それらの膜成分との反応性、従来から知られている癌胎
児性抗原（例えばＣＥＡ）との反応性、正常。
患者ヒト血清との反応性などを、酵素免疫測定法、螢光
抗体法、免疫組織学的判定法（ＰＡＰ法）などにより行
い、いずれの測定法においてもヒト肺腺癌以外とは、反
応しないものを選択する。
抗体法、免疫組織学的判定法（ＰＡＰ法）などにより行
い、いずれの測定法においてもヒト肺腺癌以外とは、反
応しないものを選択する。
また、このようにして得られた、ヒト肺腺癌に特異的に
反応する単クローン性抗体は、血清検査１組織診断、イ
メージーングなどによる肺癌の診断、さらには、抗体そ
のものを、あるいは、抗体に制癌剤や毒素を結合させた
、いわゆるイムノトキシンを癌患者に投与することによ
り肺癌の治療を行うことができるものと期待される。さ
らに、この腫瘍特異抗原クローン性抗体を用いるアフィ
ニティーカラムにより、腫瘍特異抗原を精製し、その抗
原の解析ひいては、肺癌ワクチンの開発にも使用できる
ものと期待される。
反応する単クローン性抗体は、血清検査１組織診断、イ
メージーングなどによる肺癌の診断、さらには、抗体そ
のものを、あるいは、抗体に制癌剤や毒素を結合させた
、いわゆるイムノトキシンを癌患者に投与することによ
り肺癌の治療を行うことができるものと期待される。さ
らに、この腫瘍特異抗原クローン性抗体を用いるアフィ
ニティーカラムにより、腫瘍特異抗原を精製し、その抗
原の解析ひいては、肺癌ワクチンの開発にも使用できる
ものと期待される。
（５）肺癌血清診断法
血清診断は次の通り行う
９６穴ＥＩＡ用プレートに、第一抗体１０〜１００ｘ／
ｍｌを５０〜２００ｇ／穴ずつ分注し、４℃で１〜２晩
あるいは、室温で２〜４時間放置する。ＰＢＳで洗浄後
、ＢＳＡ−ＰＥＳ２００ｄ／穴を加え、さらに４℃で１
晩あるいは室温で２時間放置する。このプレートをＰＢ
Ｓでよく洗浄後、各穴に血清検体を１〜１００倍希釈で
、５０〜１００４を加える。４℃で１晩あるいは室温で
２時間放置後、ＰＢＳでよく洗浄する。次に、ビオチン
化した第二抗体あるいは、ペルオキシダーゼ標識した第
二抗体（１０〜１００ｇ／ｌ１ｉ）を５０〜１００Ｊｊ
Ｊｌ／穴加え、さらに４℃で１晩あるいは室温で２〜４
時間放置する。第二抗体として、ビオチン化抗体を使用
した場合には、プレートをＰＢＳでよく洗浄後、アビジ
ン−ビオチン−ペルオキシダーゼ（１０ｘ／ｍりを５０
〜１００ｄ／穴加え、室温で３０分間放置後ＰＢＳでよ
く洗浄する。次に基質液として、ＡＢＴＳ基質液を５０
〜１００ｄ／穴加え、室温で１０〜３０分間放置し、５
％ＳＤＳ溶液５０〜１００ｄ／穴を加え反応を停止する
。各穴のＯＤ、、、値を測定し、その発色度より、血清
検体中の抗原量を算出する。このようにして得られた健
常人血清中の抗原量と肺癌患者血清中の抗原量を比較す
ることにより、正常値を決定し、その正常値を超えるも
のを肺癌陽性とした。
ｍｌを５０〜２００ｇ／穴ずつ分注し、４℃で１〜２晩
あるいは、室温で２〜４時間放置する。ＰＢＳで洗浄後
、ＢＳＡ−ＰＥＳ２００ｄ／穴を加え、さらに４℃で１
晩あるいは室温で２時間放置する。このプレートをＰＢ
Ｓでよく洗浄後、各穴に血清検体を１〜１００倍希釈で
、５０〜１００４を加える。４℃で１晩あるいは室温で
２時間放置後、ＰＢＳでよく洗浄する。次に、ビオチン
化した第二抗体あるいは、ペルオキシダーゼ標識した第
二抗体（１０〜１００ｇ／ｌ１ｉ）を５０〜１００Ｊｊ
Ｊｌ／穴加え、さらに４℃で１晩あるいは室温で２〜４
時間放置する。第二抗体として、ビオチン化抗体を使用
した場合には、プレートをＰＢＳでよく洗浄後、アビジ
ン−ビオチン−ペルオキシダーゼ（１０ｘ／ｍりを５０
〜１００ｄ／穴加え、室温で３０分間放置後ＰＢＳでよ
く洗浄する。次に基質液として、ＡＢＴＳ基質液を５０
〜１００ｄ／穴加え、室温で１０〜３０分間放置し、５
％ＳＤＳ溶液５０〜１００ｄ／穴を加え反応を停止する
。各穴のＯＤ、、、値を測定し、その発色度より、血清
検体中の抗原量を算出する。このようにして得られた健
常人血清中の抗原量と肺癌患者血清中の抗原量を比較す
ることにより、正常値を決定し、その正常値を超えるも
のを肺癌陽性とした。
（６）抗原解析
前述の酵素免疫抗体法、免疫組繊化学的染色法あるいは
血清診断法の実施に際して、抗原（肺腺癌膜成分、肺癌
培養細胞株、肺癌組織）をノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒ
ａｍｉｎｉｄａｓｅ）、 プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａ
ｓｅ）などの酵素や過ヨウ素酸などの試薬で前処理した
後、単クローン性抗体と反応させ、それらの処理をして
いない元の抗原と単クローン性抗体の反応性との差より
、抗原の化学的性状（単クローン性抗体のｒｔする抗原
部位の化学的性状）を明らかにした。すなわち、ノイラ
ミニダーゼ処理によ°り抗原性が消失すれば、シアル酸
が、プロテアーゼ処理により消失すれば蛋白質が、また
過ヨウ素酸処理により消失すれば糖鎖が、抗原決定基に
関与してい −ると推定される。
血清診断法の実施に際して、抗原（肺腺癌膜成分、肺癌
培養細胞株、肺癌組織）をノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒ
ａｍｉｎｉｄａｓｅ）、 プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａ
ｓｅ）などの酵素や過ヨウ素酸などの試薬で前処理した
後、単クローン性抗体と反応させ、それらの処理をして
いない元の抗原と単クローン性抗体の反応性との差より
、抗原の化学的性状（単クローン性抗体のｒｔする抗原
部位の化学的性状）を明らかにした。すなわち、ノイラ
ミニダーゼ処理によ°り抗原性が消失すれば、シアル酸
が、プロテアーゼ処理により消失すれば蛋白質が、また
過ヨウ素酸処理により消失すれば糖鎖が、抗原決定基に
関与してい −ると推定される。
以下本発明の実施例を示す。
実施例１゜
〔１〕 抗体産生細胞の調製
ヒト正常肺組織膜成分（１００，ｑ蛋白質７匹）を、生
後２４時間以内の新生仔ＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈内投
与した。８週間経過後のマウスにヒト肺腺隔膜断片１０
０■（蛋白質換算）７匹を水酸化アルミニウムゲル２ｍ
ｇ／匹、百日咳菌死菌ワクチンｌＸｌ０’／匹とともに
腹腔内投与した。以後１〜２週おきに、同一抗原１００
μｇ（蛋白質換算）７匹で３〜５回免疫した。
後２４時間以内の新生仔ＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈内投
与した。８週間経過後のマウスにヒト肺腺隔膜断片１０
０■（蛋白質換算）７匹を水酸化アルミニウムゲル２ｍ
ｇ／匹、百日咳菌死菌ワクチンｌＸｌ０’／匹とともに
腹腔内投与した。以後１〜２週おきに、同一抗原１００
μｇ（蛋白質換算）７匹で３〜５回免疫した。
これら免疫処理したマウスのうち、その抗血清が、ヒト
肺腺癌細胞または組織あるいはそれらの膜断片と強く反
応したマウスを免疫マウスとして、そのマウスより、肺
細胞を調製して、細胞融合に供した。
肺腺癌細胞または組織あるいはそれらの膜断片と強く反
応したマウスを免疫マウスとして、そのマウスより、肺
細胞を調製して、細胞融合に供した。
（２）マウス骨髄腫細胞の調製
８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｕｌを
正常培地で培養し、細胞融合時に２×１０７以上の細胞
を得、細胞融合に親株として供した。
正常培地で培養し、細胞融合時に２×１０７以上の細胞
を得、細胞融合に親株として供した。
（３）ハイブリドーマの作製
（１）と（２）で得られた肺細胞と骨髄腫細胞とを５＝
１の割合で用い、前述した方式で融合させ、ＨＡＴ培地
で３７℃、１４日間ＣＯ２５％下で培養して、融合細胞
を選択し、ＨＴ培地に変えてさらに培養し、抗ヒト肺腺
癌に対する抗体価の測定をして、活性な穴を選び、さら
に正常培地に変え、２回クローニングを繰り返して、種
々の測定法により、ヒト正常細胞や組織あるいは他の癌
に全く反応せず、ヒト肺腺癌に特異的に反応する単クロ
ーン性抗体を産生ずるハイプリドーマ株ΔＬＣ−１８６
を選択した。
１の割合で用い、前述した方式で融合させ、ＨＡＴ培地
で３７℃、１４日間ＣＯ２５％下で培養して、融合細胞
を選択し、ＨＴ培地に変えてさらに培養し、抗ヒト肺腺
癌に対する抗体価の測定をして、活性な穴を選び、さら
に正常培地に変え、２回クローニングを繰り返して、種
々の測定法により、ヒト正常細胞や組織あるいは他の癌
に全く反応せず、ヒト肺腺癌に特異的に反応する単クロ
ーン性抗体を産生ずるハイプリドーマ株ΔＬＣ−１８６
を選択した。
（４）単クローン性抗体の精製
プリスタン処理した８週令ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスに（３
）で得られたハイプリドーマ株ＡＬＣ−１８６を４Ｘ１
０”細胞／匹腹腔内注射した。
）で得られたハイプリドーマ株ＡＬＣ−１８６を４Ｘ１
０”細胞／匹腹腔内注射した。
１０〜２１日後に、ハイブリドーマは腹水癌化する。腹
水のたまったマウスから、腹水を採取（５〜１０ｍ１／
匹）し、遠心分離（３，００Ｏｒｐｍ。
水のたまったマウスから、腹水を採取（５〜１０ｍ１／
匹）し、遠心分離（３，００Ｏｒｐｍ。
５分）して固形分を除去した。５０％硫酸アンモニウム
ニテ塩析し、ＰＢＳにＮａ（Ｊ！ ０．５Ｍを加えた
液で透析し、セファクリル３００（ファルマシア・ファ
イン・ケミカル社製）（ベット・ポリニーム？５０１１
１１）のカラムに流速１５ｍｌ ／ｈｒで通塔しＩｇＭ
画分を集めＭ製抗体として用いた。
ニテ塩析し、ＰＢＳにＮａ（Ｊ！ ０．５Ｍを加えた
液で透析し、セファクリル３００（ファルマシア・ファ
イン・ケミカル社製）（ベット・ポリニーム？５０１１
１１）のカラムに流速１５ｍｌ ／ｈｒで通塔しＩｇＭ
画分を集めＭ製抗体として用いた。
（５）ＡＬＣ−１８６の特異性
このようにして得られた抗腫腺癌特異釣車クローン性抗
体ＡＬＣ−１８６の反応特異性を第１表に示した。
体ＡＬＣ−１８６の反応特異性を第１表に示した。
第１表
実施例２゜
実施例１で得られた単クローン性抗体ＡＣＬ−１８６を
用いて、肺腺癌組織の免疫組織化学的染色を行った。１
０例の肺腺癌患者摘出肺腺癌パラフィン包埋ブロック切
片について検討した結果、８例で癌細胞が強く染まった
。以上の結果より、ＡＬＣ−１８６を用いる免疫組織化
学染色により、肺腺癌の病理診断が可能であった。
用いて、肺腺癌組織の免疫組織化学的染色を行った。１
０例の肺腺癌患者摘出肺腺癌パラフィン包埋ブロック切
片について検討した結果、８例で癌細胞が強く染まった
。以上の結果より、ＡＬＣ−１８６を用いる免疫組織化
学染色により、肺腺癌の病理診断が可能であった。
実施例３゜
９６穴ＥＩＡ用プレート〔フロー・ラボラトリーズ（Ｆ
ｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製〕に、ＡＬＣ
−１８６（１０ｘ／ｍｌ）を５０Ｉ／穴加え、４℃で１
晩放闇後、ＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ２００
ｓ／穴加え１晩放置し、ＰＢＳでよ（洗浄したプレート
に、健常人血清（７７検体）および肺癌患者血清（９２
検体）を４倍希釈して４０ｄ／穴加え、４℃で１晩放置
後、ＰＢＳでよく洗浄した。次に、第二抗体として、ビ
オチン化抗腫癌％／クローｆル抗体ＡＬＣ−１８６（１
０ｕ／ｍｌ）を１００ｄ／穴加え、４℃で１晩放置し、
ＰＢＳでよく洗浄した後、アビジン−ビオチン−ペルオ
キシダーゼ〔ベクトール（ＶＢＣＴＯＲ）社製〕（１０
■／ｎ＋１） １００ｊＩ！！／穴加え、室温で１時間
放置し −た後、ＰＢＳで洗浄した。次にＡＢＴＳ基質
液を１００ｄ／穴加え、室温で３０分間反応させ、５％
ＳＤＳ溶液１００ｄ／穴を加え反応を停止した。
ｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製〕に、ＡＬＣ
−１８６（１０ｘ／ｍｌ）を５０Ｉ／穴加え、４℃で１
晩放闇後、ＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ２００
ｓ／穴加え１晩放置し、ＰＢＳでよ（洗浄したプレート
に、健常人血清（７７検体）および肺癌患者血清（９２
検体）を４倍希釈して４０ｄ／穴加え、４℃で１晩放置
後、ＰＢＳでよく洗浄した。次に、第二抗体として、ビ
オチン化抗腫癌％／クローｆル抗体ＡＬＣ−１８６（１
０ｕ／ｍｌ）を１００ｄ／穴加え、４℃で１晩放置し、
ＰＢＳでよく洗浄した後、アビジン−ビオチン−ペルオ
キシダーゼ〔ベクトール（ＶＢＣＴＯＲ）社製〕（１０
■／ｎ＋１） １００ｊＩ！！／穴加え、室温で１時間
放置し −た後、ＰＢＳで洗浄した。次にＡＢＴＳ基質
液を１００ｄ／穴加え、室温で３０分間反応させ、５％
ＳＤＳ溶液１００ｄ／穴を加え反応を停止した。
各穴の発色を吸光度計（ＯＤ ４１５ ）で測定した。
その結果、第１図に示した様に、健常人血清では、ＯＤ
４１ ｓが０．３５をこえる陽性例は７７例ウニ例し
かなかったが、肺腺癌患者血清では、ＯＤ４＋ｓが０．
３５をこえる陽性例が３３例ウニ６例あった。
４１ ｓが０．３５をこえる陽性例は７７例ウニ例し
かなかったが、肺腺癌患者血清では、ＯＤ４＋ｓが０．
３５をこえる陽性例が３３例ウニ６例あった。
このことより、本抗体を用いる血清診断法により、４８
％の確率で肺腺癌患者を見出すことが可能であることが
わかる。肺扁平上皮癌患者血清では、ＯＤ ４１５が０
．３５をこえる陽性例が、３３例ウニ例（３％）、肺小
細胞癌患者血清では、２２例ウニ例（０％）、肺小細胞
癌患者血清では、４ウニ０例（０％）であったが、肺腺
癌患者血清では１６例ウニ例（０％）と全く陽性例はな
かった。
％の確率で肺腺癌患者を見出すことが可能であることが
わかる。肺扁平上皮癌患者血清では、ＯＤ ４１５が０
．３５をこえる陽性例が、３３例ウニ例（３％）、肺小
細胞癌患者血清では、２２例ウニ例（０％）、肺小細胞
癌患者血清では、４ウニ０例（０％）であったが、肺腺
癌患者血清では１６例ウニ例（０％）と全く陽性例はな
かった。
また、肺腺癌患者血清をプロットすると、第２図に示す
ごとく、ステージ■では６５％（２０例ウニ３例）で陽
性となった。この結果は、本抗体による血清診断が、肺
腺癌のモニタリングに有効であることを示している。
ごとく、ステージ■では６５％（２０例ウニ３例）で陽
性となった。この結果は、本抗体による血清診断が、肺
腺癌のモニタリングに有効であることを示している。
実施例４゜
単クローン性抗体ＡＬＣ−１３５が認識する抗原を解析
するために、肺腺癌組織の膜成分を下記各種酵素および
試薬で処理した後ＡＬＣ−１８６との反応性を調べた。
するために、肺腺癌組織の膜成分を下記各種酵素および
試薬で処理した後ＡＬＣ−１８６との反応性を調べた。
酵素および試薬
トリプシン（ＧＩＢＣＯ社製 ２．５％溶液）ＰＢＳ中
０．２５％ ノイラミニダーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製） ０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４，５） −３＋ｎＭＣ
ａ Ｃｊ！ ２中Ｑ、ＩＬＩ／ｍｌ α−Ｌ−７コシダーゼ（ベーリンガー・マイハイム社製
） ０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６，３）中０、ＩＵ／
ｍｌ プロテアーゼ（シグマ社製） ０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７，２）中１０Ｕ／ｍ
１ ＮａＩＯ＊（和光純薬社製） ＰＢＳ中５０ｍＭ 肺腺癌組織の膜成分（蛋白量１００■／ｍｌ ）を５０
４７穴ずつ、ＥＩＡ用プレート〔リンプロ（Ｌｉｎｂｒ
ｏ）社製〕に分注し、４℃で１晩放置後、ＰＢＳで３回
洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを２００ｗ１／穴分注し、
３０分間〜２時間室温で放置し、ＰＢＳで３回洗浄後、
上記酵素液または試薬液を５０ｄ／大分注し、３７℃で
１時間反応させた。
０．２５％ ノイラミニダーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製） ０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４，５） −３＋ｎＭＣ
ａ Ｃｊ！ ２中Ｑ、ＩＬＩ／ｍｌ α−Ｌ−７コシダーゼ（ベーリンガー・マイハイム社製
） ０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６，３）中０、ＩＵ／
ｍｌ プロテアーゼ（シグマ社製） ０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７，２）中１０Ｕ／ｍ
１ ＮａＩＯ＊（和光純薬社製） ＰＢＳ中５０ｍＭ 肺腺癌組織の膜成分（蛋白量１００■／ｍｌ ）を５０
４７穴ずつ、ＥＩＡ用プレート〔リンプロ（Ｌｉｎｂｒ
ｏ）社製〕に分注し、４℃で１晩放置後、ＰＢＳで３回
洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを２００ｗ１／穴分注し、
３０分間〜２時間室温で放置し、ＰＢＳで３回洗浄後、
上記酵素液または試薬液を５０ｄ／大分注し、３７℃で
１時間反応させた。
ついでＰＢＳで５回洗浄し、単クローン性抗体ＡＬＣ−
１８６（１０ｘ／ｍｌ＞を５０ρ／穴分注し、４℃７１
晩放置した。
１８６（１０ｘ／ｍｌ＞を５０ρ／穴分注し、４℃７１
晩放置した。
Ｔｗｅｅｎ−２０−ＰＢＳ （Ｔｗｅｅｎ ’ＩｃＪは
和光純薬工業社製）で５回洗浄後、パーオキシダーゼ標
識抗−マウスＩｇＧ（４００倍希釈液）を５０ｄ／穴加
え、室温で２時間反応後、Ｔｗｅｅｎ−２０−ＰＢＳで
５回洗浄し、ΔＢＴＳ基質１００ｄを加え、３０分間反
応後、４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。
和光純薬工業社製）で５回洗浄後、パーオキシダーゼ標
識抗−マウスＩｇＧ（４００倍希釈液）を５０ｄ／穴加
え、室温で２時間反応後、Ｔｗｅｅｎ−２０−ＰＢＳで
５回洗浄し、ΔＢＴＳ基質１００ｄを加え、３０分間反
応後、４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。
抗原性は、第３図に示したとおり、過ヨウ素酸（Ｎａ
ＩＯ４） 、ノイラミニダーゼ、パーオキシダーゼ処理
により完全に消失した。この結果より、単クローン性抗
体ＡＬＣ−１８６はシアル酸化された糖蛋白質を認識し
ているものと推定された。
ＩＯ４） 、ノイラミニダーゼ、パーオキシダーゼ処理
により完全に消失した。この結果より、単クローン性抗
体ＡＬＣ−１８６はシアル酸化された糖蛋白質を認識し
ているものと推定された。
第１図は、単クローン性抗体ＡＬＣ−１８６による肺腺
癌の血清診断の結果を示す。 第２図は、単クローン性抗体ＡＬＣ−１８６による肺腺
癌の血清診断におけるステージの影響を示す。 第３図は、肺腺癌組織の膜成分の各種酵素、試薬処理に
よる単クローン性抗体ＡＬＣ−１８６との反応性の消長
を示す。 ・はノイラミニダーゼ０．１ｔＪ／＋＋＋］、△はα−
Ｌ−フコシダーゼ０． Ｉ Ｕ ／ｍｌ、口はトリプシ
ン０．２５％、―はプロテアーゼｌ０ＬＩ／ｍｌ、○は
Ｎａ１０４５０ｍＭの処理を示す。×は無処理を示す。 特許出願人（１０２）協和醗酵工業株式会社”ｂ ｌ
”５コ Ａ ＬＣ−１２ら１：工５ＩＩｉ）Ｉ１９こイ
１三ｎｋ 清舌彩ｉ鉦（ｔ［０Ｄ４Ｉｓ、− ＯＤ ４１りｉい
癌の血清診断の結果を示す。 第２図は、単クローン性抗体ＡＬＣ−１８６による肺腺
癌の血清診断におけるステージの影響を示す。 第３図は、肺腺癌組織の膜成分の各種酵素、試薬処理に
よる単クローン性抗体ＡＬＣ−１８６との反応性の消長
を示す。 ・はノイラミニダーゼ０．１ｔＪ／＋＋＋］、△はα−
Ｌ−フコシダーゼ０． Ｉ Ｕ ／ｍｌ、口はトリプシ
ン０．２５％、―はプロテアーゼｌ０ＬＩ／ｍｌ、○は
Ｎａ１０４５０ｍＭの処理を示す。×は無処理を示す。 特許出願人（１０２）協和醗酵工業株式会社”ｂ ｌ
”５コ Ａ ＬＣ−１２ら１：工５ＩＩｉ）Ｉ１９こイ
１三ｎｋ 清舌彩ｉ鉦（ｔ［０Ｄ４Ｉｓ、− ＯＤ ４１りｉい
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）ヒト肺腺癌の細胞組織または組織膜成分で免疫した
マウスの脾細胞とマウス骨髄腫細胞とを融合させてハイ
ブリドーマを作製し、ヒト肺腺癌に特異性を有する単ク
ローン性抗体を選択し、該ハイブリドーマを培地中に培
養するかマウスに投与して該マウスで腹水化し、該培養
物または腹水より採取することにより得られ、かつシア
ル酸化された糖蛋白質または糖脂質を抗原として認識す
る抗ヒト肺腺癌特異的単クローン性抗体。 ２）該ハイブリドーマがＡＬＣ−１８６（ＮＣＡＣＣ８
５０８２９０３）である特許請求の範囲第１項記載の単
クローン性抗体。 ３）該単クローン性抗体がＩｇＭクラスに属することを
特徴とする特許請求の範囲第１項記載の単クローン性抗
体。 ４）ヒト肺腺癌細胞と反応し、ヒト正常肺組織とは反応
せず、シアル酸化された糖蛋白質または糖脂質を抗原と
して認識する抗ヒト肺腺癌特異的単クローン性抗体ＡＬ
Ｃ−１８６を用いる免疫組織化学的染色法。 ５）ヒト肺腺癌細胞と反応し、ヒト正常肺組織とは反応
せず、シアル酸化された糖蛋白質または糖脂質を抗原と
して認識する抗ヒト肺腺癌特異的単クローン性抗体ＡＬ
Ｃ−１８６を用いるサンドイッチ方式による酵素免疫測
定法またはラジオイムノアッセイにより肺腺癌の血清診
断またはモニタリングを行う方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60225327A JPS6283898A (ja) | 1985-10-09 | 1985-10-09 | 抗ヒト肺腺癌特異的単クロ−ン性抗体 |
| CA000520126A CA1306707C (en) | 1985-10-09 | 1986-10-08 | Anti-human pulmonary adenocarcinoma specific monoclonal antibody |
| EP19860114025 EP0218257B1 (en) | 1985-10-09 | 1986-10-09 | Anti-human pulmonary adenocarcinoma specific monoclonal antibody |
| DE8686114025T DE3684857D1 (de) | 1985-10-09 | 1986-10-09 | Spezifischer monoklonaler antikoerper gegen menschliches lungenadenokarzinom. |
| US08/194,633 US5552291A (en) | 1985-10-09 | 1994-02-10 | Anti-human pulmonary adenocarcinoma specific monoclonal antibody |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60225327A JPS6283898A (ja) | 1985-10-09 | 1985-10-09 | 抗ヒト肺腺癌特異的単クロ−ン性抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6283898A true JPS6283898A (ja) | 1987-04-17 |
| JPH0570434B2 JPH0570434B2 (ja) | 1993-10-05 |
Family
ID=16827613
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60225327A Granted JPS6283898A (ja) | 1985-10-09 | 1985-10-09 | 抗ヒト肺腺癌特異的単クロ−ン性抗体 |
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|---|---|
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| JP (1) | JPS6283898A (ja) |
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| DE (1) | DE3684857D1 (ja) |
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-
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- 1986-10-09 EP EP19860114025 patent/EP0218257B1/en not_active Expired
- 1986-10-09 DE DE8686114025T patent/DE3684857D1/de not_active Expired - Lifetime
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