JPH022399A - 抗原の同定法、そのアッセイ法及びそれを含むワクチン - Google Patents
抗原の同定法、そのアッセイ法及びそれを含むワクチンInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏで発現される抗原及びその診
断薬並びにワクチンとしての用途に関する。更に詳細に
は、ウィルス抗原特にエプスタイン−バールウィルス（
ＥＢＶ）抗原及びその診［１’ｉ薬並びにワクチンとし
ての用途に関する。
断薬並びにワクチンとしての用途に関する。更に詳細に
は、ウィルス抗原特にエプスタイン−バールウィルス（
ＥＢＶ）抗原及びその診［１’ｉ薬並びにワクチンとし
ての用途に関する。
精製した抗！京を護衛テスト用に使用することが益々重
要になって来ている。従来、抗原の精製は生化学方法を
用いて精製を何度＠ ４Ｍ返すことによって行なわれて
いる。他の方法として、組換えＤＮＡ技術を利用して！
！刊した抗原をクローン化して宿主生物中で発現する方
法が、今日では広く使用されるようになっている。
要になって来ている。従来、抗原の精製は生化学方法を
用いて精製を何度＠ ４Ｍ返すことによって行なわれて
いる。他の方法として、組換えＤＮＡ技術を利用して！
！刊した抗原をクローン化して宿主生物中で発現する方
法が、今日では広く使用されるようになっている。
エプスタイン−パールウィルスは、はとんどの成人が感
染しているヘルペスウィルスの１つてある。ＥＢＶは伝
染性ｉｐ核症（ＩＭ）を引き起こす病原体でもある。ま
た、ＥＢＶはリウマヂ性関節炎にも関係しており、バー
キットリンパ腫、上咽頭癌などのＢ−リンパルＦの病原
体でもある。しかしながらＥＢＶは良性の効果ら有して
おり、多くの人々は上記した病気にかかることなく、Ｅ
ＢＶの感染によってＥＢＶに対する抗体が陽性の血清を
持つようになる。
染しているヘルペスウィルスの１つてある。ＥＢＶは伝
染性ｉｐ核症（ＩＭ）を引き起こす病原体でもある。ま
た、ＥＢＶはリウマヂ性関節炎にも関係しており、バー
キットリンパ腫、上咽頭癌などのＢ−リンパルＦの病原
体でもある。しかしながらＥＢＶは良性の効果ら有して
おり、多くの人々は上記した病気にかかることなく、Ｅ
ＢＶの感染によってＥＢＶに対する抗体が陽性の血清を
持つようになる。
ｎ ＶｉｔｒＯでは、ＥＢＶはＢ−リンパ球の増殖を促
進し、増殖状態あるいは潜伏状態で生存することができ
る。
進し、増殖状態あるいは潜伏状態で生存することができ
る。
ＥＢＶ感染あるいはＦＢＶ再活性化の診断は、通常、′
］Ｆ４好性Ｐａｕｌ−Ｂｕｎｎｅｌ−Ｄａｖｉｄｓｏｎ
（Ｈｏｎｏｓｐｏｔ ）テストによって行なわれており
、このテストはＥ １３ Ｖ抗体と非関連ウマ蛋白質と
の偶発性交差反応を利用したものである。このテストは
迅速にかつ安価に行なうことができるが、その原理から
またその有効性がわずか８０％程度であることから、こ
のテストはラフな診断法として使用できるにすぎない。
］Ｆ４好性Ｐａｕｌ−Ｂｕｎｎｅｌ−Ｄａｖｉｄｓｏｎ
（Ｈｏｎｏｓｐｏｔ ）テストによって行なわれており
、このテストはＥ １３ Ｖ抗体と非関連ウマ蛋白質と
の偶発性交差反応を利用したものである。このテストは
迅速にかつ安価に行なうことができるが、その原理から
またその有効性がわずか８０％程度であることから、こ
のテストはラフな診断法として使用できるにすぎない。
またこのテストは、ＥＢＶ感染は異なってフェーズを有
しその進行性も箕常なため、１００％有効とは言えない
ものである。従って、より確実で有効なテスト法の開発
が必要である。より確実で有効なテストとしてスライド
テストがあり、この方法はＥＢＶ形質転換細胞、テスト
血清及び蛍光ラベル化第２抗体を使用するものである。
しその進行性も箕常なため、１００％有効とは言えない
ものである。従って、より確実で有効なテスト法の開発
が必要である。より確実で有効なテストとしてスライド
テストがあり、この方法はＥＢＶ形質転換細胞、テスト
血清及び蛍光ラベル化第２抗体を使用するものである。
このテストでは、ＥＢＶ抗原を放出する形質転換細胞が
溶解される。このスライドテストは理にかなっており安
価に実施することができるが、熟練を要し、ＥＢＶ形質
転換細胞が増殖すると言う危険性を有するものでもある
。
溶解される。このスライドテストは理にかなっており安
価に実施することができるが、熟練を要し、ＥＢＶ形質
転換細胞が増殖すると言う危険性を有するものでもある
。
従って、真＋ＥなＥＢＶ抗原を用いた診断法の開発が必
要である。
要である。
エプスタイン−バール核抗原（ＥＢＮΔ）、ウィルスカ
ブジッド抗原（ＶＣＡ）及び伯の初期ＥＢＶ抗原などの
多数のＦＢＶ抗原が今日では知られている。
ブジッド抗原（ＶＣＡ）及び伯の初期ＥＢＶ抗原などの
多数のＦＢＶ抗原が今日では知られている。
ＥＢＶの８９５−８株の全ＤＮＡ配列が決定されており
［Ｂａｅｒ、 Ｒ，、ｅｔ ａｌ、、 （１９８４）
Ｎａｔｕｒｅ３１０．２０７−２１１］、こレニよッテ
分子生物学の研究が大いに促進されている。
［Ｂａｅｒ、 Ｒ，、ｅｔ ａｌ、、 （１９８４）
Ｎａｔｕｒｅ３１０．２０７−２１１］、こレニよッテ
分子生物学の研究が大いに促進されている。
ＥＢＶの分子組織の分析が進んでおり、この分析研究は
内部反復配列を含む領域について益々精力的に行なわれ
ている（第１図のＢａｍＨＩＷフラグメン１〜参照＞
［ＣｈｅｕｎＬ Ａ、とＫｉｅｆ（Ｅ（１９８２）
Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、、４４．２８６−２９４ ：ＪＯｎ
Ｏ３，Ｈ，Ｄ、とＧｒｉｆｒｉｎ、 Ｅ、 Ｂ、 （１
９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ、、１１
、３９１３−３９３６］。
内部反復配列を含む領域について益々精力的に行なわれ
ている（第１図のＢａｍＨＩＷフラグメン１〜参照＞
［ＣｈｅｕｎＬ Ａ、とＫｉｅｆ（Ｅ（１９８２）
Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、、４４．２８６−２９４ ：ＪＯｎ
Ｏ３，Ｈ，Ｄ、とＧｒｉｆｒｉｎ、 Ｅ、 Ｂ、 （１
９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ、、１１
、３９１３−３９３６］。
今日までに行なわれているこれらの分析は次のようなも
のである。
のである。
（ｉ） ゲ／ムＥＢＶ ＤＮＡ７ラグメンｔ”を用
いたトランスフェクションの研究であり、これにヨリ、
ＥＢＶ核抗原２ （ＥＢＮＡ２）応答を誘導するために
はＢａｍＨｒ Ｗフラグメントのインククトコピーが
必要であることが明らかにされた［Ｒｙｍｏ、 Ｌ、
ｅｔ ａｌ、、 （１９８５） Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ八
ｃへｄ、 ｓｃｉ、 ｕ、 ｓ、 Ａ、、８
２ 、３ ４．３ ５ − ３ ４ ３ ９ ：Ｈ
ｕｅｌｌＯｒ−ＬａｎｔＺＳＣｈ、 Ｎ、、 ａｔ ａ
ｌ、、 （１９８５）ＥＭＢＯＪ、 ４．１８０５
−１８１１］ ：（ｉｉｌ 増殖性の、あるいは非増
殖性の感染細胞から得たウィルス転写体の分析研究であ
り、これにより、ＢａｍＨＩ Ｗフラグメントに相同
性を有する配列が該転写体に含まれていることが示され
た［Ｋｉｎｇ Ｗ、 ｅｔ ａｔ、、 （１９８０）
、Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ。
いたトランスフェクションの研究であり、これにヨリ、
ＥＢＶ核抗原２ （ＥＢＮＡ２）応答を誘導するために
はＢａｍＨｒ Ｗフラグメントのインククトコピーが
必要であることが明らかにされた［Ｒｙｍｏ、 Ｌ、
ｅｔ ａｌ、、 （１９８５） Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ八
ｃへｄ、 ｓｃｉ、 ｕ、 ｓ、 Ａ、、８
２ 、３ ４．３ ５ − ３ ４ ３ ９ ：Ｈ
ｕｅｌｌＯｒ−ＬａｎｔＺＳＣｈ、 Ｎ、、 ａｔ ａ
ｌ、、 （１９８５）ＥＭＢＯＪ、 ４．１８０５
−１８１１］ ：（ｉｉｌ 増殖性の、あるいは非増
殖性の感染細胞から得たウィルス転写体の分析研究であ
り、これにより、ＢａｍＨＩ Ｗフラグメントに相同
性を有する配列が該転写体に含まれていることが示され
た［Ｋｉｎｇ Ｗ、 ｅｔ ａｔ、、 （１９８０）
、Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ。
３６．８０６−８１８ ；Ｈｕｍｍｅｌ Ｈ，とに１ｅ
ｒｆ、 Ｅ（１９８２） Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、、４３．
２６２−２７２ ；５ｈｉｎ、 Ｓ、 ｅｔ、 ａｌ、
、 （１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、 １２４．１
３−２０］ ： （ｉｉｉ）スプライシングを受けた転写体に対応するＣ
ＤＮＡの配列決定と分析研究であり、これにより、Ｂａ
ｍＨＩ Ｗからのコモンエクソンを有するＣＤＮＡク
ローンのノアミリ−が同定された［Ｂｏｄｃｓｃｏｔ、
Ｈ，ｅｔ ａｌ、、 （１９８４） ＥＭＢＯＪ、、
３．１９１３−１９１７ ； Ｂｏｄｅｓｃｏｔ、 Ｈ
ａｔ ａｌ、、 （１９８６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
１ｄｓ Ｒｅｓ、 １４．２６１１−２６２０ ：
５ｐｅｃｋ Ｓ、 とＳｔｒｏｍｍｉｎｇｅｒＪ、
（１９８５） Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、。
ｒｆ、 Ｅ（１９８２） Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、、４３．
２６２−２７２ ；５ｈｉｎ、 Ｓ、 ｅｔ、 ａｌ、
、 （１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、 １２４．１
３−２０］ ： （ｉｉｉ）スプライシングを受けた転写体に対応するＣ
ＤＮＡの配列決定と分析研究であり、これにより、Ｂａ
ｍＨＩ Ｗからのコモンエクソンを有するＣＤＮＡク
ローンのノアミリ−が同定された［Ｂｏｄｃｓｃｏｔ、
Ｈ，ｅｔ ａｌ、、 （１９８４） ＥＭＢＯＪ、、
３．１９１３−１９１７ ； Ｂｏｄｅｓｃｏｔ、 Ｈ
ａｔ ａｌ、、 （１９８６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
１ｄｓ Ｒｅｓ、 １４．２６１１−２６２０ ：
５ｐｅｃｋ Ｓ、 とＳｔｒｏｍｍｉｎｇｅｒＪ、
（１９８５） Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、。
８２．８３０５−８３０９ ；５ｐｅＣｋ、 Ｓ、 Ｈ
，Ｑｔａｔ、、 （１９８６） Ｐｒｏｃ、 Ｈｏ目、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
，Ｑｔａｔ、、 （１９８６） Ｐｒｏｃ、 Ｈｏ目、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
Ｕ、Ｓ、八、、 ８３ 、９２９８−９３０２ ：Ｓ
ａｍｐｌｅ Ｊｅｔ ａｔ、、 （１９８６）Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、５ｃｉＵ、Ｓ、八、８３
、５０９６−５１００） ：（ｉｖ） 反復コー
ド化Ｔクノンの予想アミノ酸配列から推定されるベブヂ
ドを合成しこれを用いる研究により、それらのいくつか
に対する抗体はＥＢＶ発現蛋白質と反応することが示さ
れた［Ｄｉｌｌｉｎｅｒ、 Ｊ、 ｅｔ、 ａｔ、、
（１９８６） ＰｒｏｃＮａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓ
ｃｉ、、 Ｕ、Ｓ、Ａ、、 ８３．６６４１−６６４５
］。
ａｍｐｌｅ Ｊｅｔ ａｔ、、 （１９８６）Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、５ｃｉＵ、Ｓ、八、８３
、５０９６−５１００） ：（ｉｖ） 反復コー
ド化Ｔクノンの予想アミノ酸配列から推定されるベブヂ
ドを合成しこれを用いる研究により、それらのいくつか
に対する抗体はＥＢＶ発現蛋白質と反応することが示さ
れた［Ｄｉｌｌｉｎｅｒ、 Ｊ、 ｅｔ、 ａｔ、、
（１９８６） ＰｒｏｃＮａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓ
ｃｉ、、 Ｕ、Ｓ、Ａ、、 ８３．６６４１−６６４５
］。
本発明の目的は、ｉｎ ｖｉｖｏで発現される病原生物
の抗原の全てを同定することを可能にする方法及び該抗
原の診断薬並びにワクチンとしての用途を提供すること
にある。
の抗原の全てを同定することを可能にする方法及び該抗
原の診断薬並びにワクチンとしての用途を提供すること
にある。
本発明の他の目的は、真正なＥＢＶ抗原に基づいたＥＢ
Ｖのアッセイ法であって公知のＥ８Ｖ測定法及び検出法
に比べて感度が良くその測定範囲の広いアッセイ法を提
供することにある。
Ｖのアッセイ法であって公知のＥ８Ｖ測定法及び検出法
に比べて感度が良くその測定範囲の広いアッセイ法を提
供することにある。
しかして、本発明により、ｉｎ ｖｉｖｏで発現される
病原生物の抗原の全てを同定する方法であって、病原生
物の全ての核酸を含む核酸フラグメントを用いて遺伝子
バンクを作成し、該病原生物によって引き起こされた臨
床症状を有する対象から得た血清を用いて該遺伝子バン
クを直接スクリーニングすることからなる上記方法が提
供される。
病原生物の抗原の全てを同定する方法であって、病原生
物の全ての核酸を含む核酸フラグメントを用いて遺伝子
バンクを作成し、該病原生物によって引き起こされた臨
床症状を有する対象から得た血清を用いて該遺伝子バン
クを直接スクリーニングすることからなる上記方法が提
供される。
核酸フラグメントは、終止コドンをさ番ノるために、Ｉ
ｋｂ以下の平均の大きさを有するフラグメントが好まし
い。このような方法においては、病原生物の核酸を含む
配列は全て、発現される機会を有しており、適当な抗原
あるいは求める抗体については推定によって決定される
ということはない。
ｋｂ以下の平均の大きさを有するフラグメントが好まし
い。このような方法においては、病原生物の核酸を含む
配列は全て、発現される機会を有しており、適当な抗原
あるいは求める抗体については推定によって決定される
ということはない。
また本発明によれば、ｉｎ ｖｉｖｏで発現される抗原
をコードする核酸を得る方法であって、該抗原をコード
する配列を含む病原生物の全核酸を核酸フラグメントに
変換し、該核酸フラグメントを発現ベクターに移し、真
核もしくは原核宿主生物を該発現ベクターで形質転換し
、該宿主生物のコロニーを該病原生物によって引き起こ
された臨床症状を有する対象から得た血清でスクリーニ
ングすることからなる上記方法が提供される。
をコードする核酸を得る方法であって、該抗原をコード
する配列を含む病原生物の全核酸を核酸フラグメントに
変換し、該核酸フラグメントを発現ベクターに移し、真
核もしくは原核宿主生物を該発現ベクターで形質転換し
、該宿主生物のコロニーを該病原生物によって引き起こ
された臨床症状を有する対象から得た血清でスクリーニ
ングすることからなる上記方法が提供される。
ここで使用される核酸はＤＮＡが好ましい。
病原生物の全核酸は、１つまたはそれ以上の制限酵素を
用いてフラグメントに変換される。しかしながら、各種
のヌクレアーゼを用いることもでき、また１つもしくは
それ以上のヌクレアーゼとポリメラーゼを組合わせて用
いることもできる。
用いてフラグメントに変換される。しかしながら、各種
のヌクレアーゼを用いることもでき、また１つもしくは
それ以上のヌクレアーゼとポリメラーゼを組合わせて用
いることもできる。
この組合わせを用いることにより、発現ベクターに連結
する前にフラグメントを平滑末端にすることができる。
する前にフラグメントを平滑末端にすることができる。
超音波処理又は他の物理的手段を用いても、全核酸を核
酸フラグメントに変換することができる。
酸フラグメントに変換することができる。
病原生物は、バクテリア、昆虫、ウィルス、酵母、ある
いはこれら以外のバラサイトでもよい。
いはこれら以外のバラサイトでもよい。
好ましくは病原生物はウィルスである。
以下に、エプスタイン−パールウィルスをモデルとして
本発明を説明する。
本発明を説明する。
本発明によってスクリーニングする血清の対象はヒトで
もヒト以外の動物でもよい。
もヒト以外の動物でもよい。
本発明の方法を用いて、公知の蛋白質コード領域を有す
る遺伝子の抗原性領域を同定することもできる。
る遺伝子の抗原性領域を同定することもできる。
いずれの病原体ら免疫応答を引き起こす。しかして、本
発明の方法により、必ず存在する抗原を同定することが
できる。従って、本発明の方法により、未だ知られてい
ない分子生物学分野におけるウィルス又は他の抗原を単
離することもできる。
発明の方法により、必ず存在する抗原を同定することが
できる。従って、本発明の方法により、未だ知られてい
ない分子生物学分野におけるウィルス又は他の抗原を単
離することもできる。
病原抗原をコードする核酸配列はいずれも、１ｎｖｉｖ
ｏで発現される可能性を持っている。組換えＤＮＡ技術
を用いて抗原を宿主生物で発現するこれまでの実験では
ほとんどの場合、抗原をコードする核酸配列の分子生物
学的知識は知られていることが必要であった。
ｏで発現される可能性を持っている。組換えＤＮＡ技術
を用いて抗原を宿主生物で発現するこれまでの実験では
ほとんどの場合、抗原をコードする核酸配列の分子生物
学的知識は知られていることが必要であった。
本発明による上記した方法は、ある遺伝子が抗原をコー
ドすることが知られているような場合には抗原性領域の
正確な配列を規定するのに用いることができる。
ドすることが知られているような場合には抗原性領域の
正確な配列を規定するのに用いることができる。
また本発明によれば、以下に定義するＥＢＶ抗原をコー
ドするＤＮＡを得る方法であって、ＥＢＶ ＤＮＡを
フラグメントに変換し該フラグメントを発現ベクター中
にクローニングし、該発現ベクターで微生物を形質転換
し、ＥＢＶで感染していることが知られているヒトの血
清で該微生物のコロニーをスクリーニングし、次いでイ
ムノポジティブクローンを単離することからなる方法が
提供される。
ドするＤＮＡを得る方法であって、ＥＢＶ ＤＮＡを
フラグメントに変換し該フラグメントを発現ベクター中
にクローニングし、該発現ベクターで微生物を形質転換
し、ＥＢＶで感染していることが知られているヒトの血
清で該微生物のコロニーをスクリーニングし、次いでイ
ムノポジティブクローンを単離することからなる方法が
提供される。
ＥＢＶ ＤＮＡをフラグメントに変換するためには、
制限Ｍ索で消化するのが好ましい。
制限Ｍ索で消化するのが好ましい。
本発明の方法は、遺伝子中の反復前ＪＩＪを同定するの
に用いることができる。
に用いることができる。
本発明の更に他の局面によれば、核酸サンプルにおいて
反復して存在する領域を同定する方法であって、生物の
核酸の全てを含む核酸フラグメントを用いて遺伝子バン
クを作成し、該遺伝子バンクを相同性核酸のプローブで
スクリーニングし、反復核酸領域の存在を示す強くハイ
ブリダイズするコロニーを同定することからなる上記方
法が提供される。
反復して存在する領域を同定する方法であって、生物の
核酸の全てを含む核酸フラグメントを用いて遺伝子バン
クを作成し、該遺伝子バンクを相同性核酸のプローブで
スクリーニングし、反復核酸領域の存在を示す強くハイ
ブリダイズするコロニーを同定することからなる上記方
法が提供される。
本発明により、ｉｎ ｖｉｖｏでＥＢＶ抗原をコードす
るＤＮＡ配列であって、以下の配グ１から選ばれるＤＮ
Ａ配列が提供される。
るＤＮＡ配列であって、以下の配グ１から選ばれるＤＮ
Ａ配列が提供される。
（Ａ）
ＧＣＴＣＣＧＣＣＧＧＧ ＴＧＧ ＣＣＣ
ＴＧＧ ＧＧＴ へＡＧ丁ＣＴＧＧＧＡＧ
ＧＣＡＧＡＧＧＧＴＣＧＧＣＣ４８八ＧＣＣＧＡ
ＣＣＧ ＧＣＣＣＣＧ ＣＧＣＣＴＧ
ＧｅＯ２０丁 ＣＣＴ ＣＧＧ
ＧＧＣＣＡＧ ＣＣＧ ＣＣＧ
ＧＧＧ ＴＴＧＧＧＣＡＣＣ ＧＣＣＴＣＣ ＣＧＣＴＣＣ ＣＣＣＡＡＡ ＡＣＣＣＴＣ 丁Ｃ１７４・ ＧＣＣＣＧ ＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣＧＣＧ
ＧへＧＡＧＧ ＧＧＣ２９・ ＡＡＡＡＧＣＧＧＧＧＴＧＣＣＧＧＴＣＧ丁ＧＧＣＣＧ
ＧＣＴＴＣＴＡＣＡＧＧ ＡＣＣＡＴＣＡＡＣＧＣＣ
ＡＣＣＣＴＣＡＡＧ ＧＧＡ ＧＣ八
ＧＡＧ ＧＧＣＣ１１７・ ＣＴＧＴＴＡＣＣＡＣＡＴＴＣＴＡＧＧ丁ＣＣＴＧＣＡ
ｒＣＣＡＧ ｒＧＧ ＧＣ８２ＧＣＣＣＡ
ＣＴＡＣ（ＪＧ ＡＧＧ Ｃ６２゜ 配列（Ａ）−（Ｄ）はＥＢＶのＢａｍＨＩ Ｗ７ラグ
メントの１部であり、配列（Ｅ） 、（Ｆ） 、（Ｇ）
はそれぞれＥＢＶのＢａｍ１ｌ ＩＮ、ＢａｍＨＩＦ、
ＢａｍＨＩＶフラグメントの１部である。
ＴＧＧ ＧＧＴ へＡＧ丁ＣＴＧＧＧＡＧ
ＧＣＡＧＡＧＧＧＴＣＧＧＣＣ４８八ＧＣＣＧＡ
ＣＣＧ ＧＣＣＣＣＧ ＣＧＣＣＴＧ
ＧｅＯ２０丁 ＣＣＴ ＣＧＧ
ＧＧＣＣＡＧ ＣＣＧ ＣＣＧ
ＧＧＧ ＴＴＧＧＧＣＡＣＣ ＧＣＣＴＣＣ ＣＧＣＴＣＣ ＣＣＣＡＡＡ ＡＣＣＣＴＣ 丁Ｃ１７４・ ＧＣＣＣＧ ＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣＧＣＧ
ＧへＧＡＧＧ ＧＧＣ２９・ ＡＡＡＡＧＣＧＧＧＧＴＧＣＣＧＧＴＣＧ丁ＧＧＣＣＧ
ＧＣＴＴＣＴＡＣＡＧＧ ＡＣＣＡＴＣＡＡＣＧＣＣ
ＡＣＣＣＴＣＡＡＧ ＧＧＡ ＧＣ八
ＧＡＧ ＧＧＣＣ１１７・ ＣＴＧＴＴＡＣＣＡＣＡＴＴＣＴＡＧＧ丁ＣＣＴＧＣＡ
ｒＣＣＡＧ ｒＧＧ ＧＣ８２ＧＣＣＣＡ
ＣＴＡＣ（ＪＧ ＡＧＧ Ｃ６２゜ 配列（Ａ）−（Ｄ）はＥＢＶのＢａｍＨＩ Ｗ７ラグ
メントの１部であり、配列（Ｅ） 、（Ｆ） 、（Ｇ）
はそれぞれＥＢＶのＢａｍ１ｌ ＩＮ、ＢａｍＨＩＦ、
ＢａｍＨＩＶフラグメントの１部である。
ＥＢＶ ＢａｍＨＩ ＷフラグメントについてはＪ
ｏｎｃｓ、 Ｈ，Ｄ、とＧｒ＋Ｈｉｎ、 Ｂ、 Ｆ、
（１９８３）（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、
、 １１．３９１３−３９３６）のナンバーリング系
を用い、他のＥＢＶ（３部ｍＨＩフラグメントについて
はＢａｃｒ Ｒ，、０ｔａ１．（前記の通）のナンバ
ーリング系を用いて、上記したＤＮＡ配列についてヌク
レオチド番号を示すと以下の通りである。
ｏｎｃｓ、 Ｈ，Ｄ、とＧｒ＋Ｈｉｎ、 Ｂ、 Ｆ、
（１９８３）（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、
、 １１．３９１３−３９３６）のナンバーリング系
を用い、他のＥＢＶ（３部ｍＨＩフラグメントについて
はＢａｃｒ Ｒ，、０ｔａ１．（前記の通）のナンバ
ーリング系を用いて、上記したＤＮＡ配列についてヌク
レオチド番号を示すと以下の通りである。
ｑ ヌクレオチド番号
Ａ ２３７３−２４２１Ｂ
２５６６−２６７１Ｃ２６５８−２８３２ Ｅ ２７１２−２８
３１Ｆ ５５５９３−５５６７４Ｇ
１４６６９４−１４６７
５５ＤＮＡ配列（Ｂ）と（Ｃ）との間の１３ｂｌ）１？
複配列は下線で示した。
２５６６−２６７１Ｃ２６５８−２８３２ Ｅ ２７１２−２８
３１Ｆ ５５５９３−５５６７４Ｇ
１４６６９４−１４６７
５５ＤＮＡ配列（Ｂ）と（Ｃ）との間の１３ｂｌ）１？
複配列は下線で示した。
また本発明によれば、配列（Ａ）−（Ｇ）に対応するオ
ープンリープインフレームを含むＤＮＡ配列が提供され
る。
ープンリープインフレームを含むＤＮＡ配列が提供され
る。
また本発明によれば、上記したＤＮＡ配列（Ａ）−（Ｇ
）いずれかから選ばれるＤＮＡ配列を含むＤＮＡ発現ベ
クターが提供される。また本発明によれば、発現可能性
を有するＤＮＡトランスファーベクターであって、上記
したＤＮＡ配列（Ａ）−（Ｇ）のいずれかから選ばれる
ＤＮＡ配列を含む該ＤＮＡトランスファーベクターが１
♀供される。、発現ベクターはプラスミドが好ましく、
より具体的にはオーブンリーディングフレームプラスミ
ド１）ＯＲＦ １ （Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ、 Ｇ、 Ｈ
，ａｔ ａｔ、 ＰｒｏｃＮａｔｌ、 八ｃａｄ、
Ｓｃｉ、、 Ｕ、Ｓ、Ａ、、 ８０． ４４３２
−４４３６）である。該発現ベクターは微ター物中に導
入して複製することができる。
）いずれかから選ばれるＤＮＡ配列を含むＤＮＡ発現ベ
クターが提供される。また本発明によれば、発現可能性
を有するＤＮＡトランスファーベクターであって、上記
したＤＮＡ配列（Ａ）−（Ｇ）のいずれかから選ばれる
ＤＮＡ配列を含む該ＤＮＡトランスファーベクターが１
♀供される。、発現ベクターはプラスミドが好ましく、
より具体的にはオーブンリーディングフレームプラスミ
ド１）ＯＲＦ １ （Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ、 Ｇ、 Ｈ
，ａｔ ａｔ、 ＰｒｏｃＮａｔｌ、 八ｃａｄ、
Ｓｃｉ、、 Ｕ、Ｓ、Ａ、、 ８０． ４４３２
−４４３６）である。該発現ベクターは微ター物中に導
入して複製することができる。
更に本発明によれば、７−カー遺伝子に融合した上記の
ＤＮＡ配列員）−（Ｇ）のいずれかから選ばれたＤＮＡ
配列が提供される。該マーカー遺伝子は、プラスミドρ
０ＲＦ１のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が好ましい。
ＤＮＡ配列員）−（Ｇ）のいずれかから選ばれたＤＮＡ
配列が提供される。該マーカー遺伝子は、プラスミドρ
０ＲＦ１のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が好ましい。
しかして本発明によれば、」−１記したＤＮＡ配列（Ａ
）−（Ｇ）のいずれかから選ばれるＤＮＡ配列を含む発
現ベクターを保持する微生物が提供される。
）−（Ｇ）のいずれかから選ばれるＤＮＡ配列を含む発
現ベクターを保持する微生物が提供される。
特に好適な微生物はＥ、 ｃｏｌｉなどのバクテリアで
あり、より具体的には、ｌａｃ欠損株Ｅ、 ｃｏｌｉＭ
）１３０００：ａｒａ Ｄ１３９△（ａｒａ、 １ｅｕ
） ７６９７△（Ｉａｃ ） ｘ ７４ ｐａｌ Ｕ
ｇａｔ にｒＯ５（ｓｔｒ’ ）ＯＪＩ） Ｒ１０１
（Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ、 Ｇ、 Ｈ，、ｅｔ ａｌ、
５ｕｐｒａ）である。
あり、より具体的には、ｌａｃ欠損株Ｅ、 ｃｏｌｉＭ
）１３０００：ａｒａ Ｄ１３９△（ａｒａ、 １ｅｕ
） ７６９７△（Ｉａｃ ） ｘ ７４ ｐａｌ Ｕ
ｇａｔ にｒＯ５（ｓｔｒ’ ）ＯＪＩ） Ｒ１０１
（Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ、 Ｇ、 Ｈ，、ｅｔ ａｌ、
５ｕｐｒａ）である。
また本発明によれば、上記したＤＮＡ配列（Ａ）−（Ｇ
）のいずれかから選ばれるＤＮＡ配列によってコードさ
れる抗原性ＥＢＶペプチド／蛋白質が提供される。特に
本発明によれば、上記したＤＮＡ配列（八）ｉＧ）のい
ずれかによってコードされ、以下に示すアミノ酸配列か
ら選ばれる抗原性Ｅ８Ｖペプチド／蛋白質が提供される
： Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ ＴｒＤ Ｐｒｏ
Ｔｒｐ Ｇｌｙ ＬｙｓＧｌｙ Ｐｒ。
）のいずれかから選ばれるＤＮＡ配列によってコードさ
れる抗原性ＥＢＶペプチド／蛋白質が提供される。特に
本発明によれば、上記したＤＮＡ配列（八）ｉＧ）のい
ずれかによってコードされ、以下に示すアミノ酸配列か
ら選ばれる抗原性Ｅ８Ｖペプチド／蛋白質が提供される
： Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ ＴｒＤ Ｐｒｏ
Ｔｒｐ Ｇｌｙ ＬｙｓＧｌｙ Ｐｒ。
Ｐｒ。
１ａ
Ｇｌｙ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
Ａｌａ Ｇｌｕ八ｒへ ＧＩｙ Ａｌａ Ｖａｔ ｔｅｕ ＡＳＤ
Ｉｌｅ Ｓｅｒ 丁ｈｒ Ａ
ａＴｈｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｌｅｕ
Ｓｅｒ Ｈｉｓ ＬｅｕＬｅｕ Ｐｒｏ Ｈ
ｉｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ ｌ
１ｅＧｌｎ Ｔ叩゛ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ
Ａｒｇ Ｈｉｓ ＧｌｙＧｌｕ Ｌｃｕ Ｐｈ
ｅ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｉｌｅ 丁ｒｐ Ａａ
Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇペプチドをコー
ドする遺伝子のメクレオチド配列が明らかになれば、そ
のペプチドは化学的に合成することができる。
Ａｌａ Ｇｌｕ八ｒへ ＧＩｙ Ａｌａ Ｖａｔ ｔｅｕ ＡＳＤ
Ｉｌｅ Ｓｅｒ 丁ｈｒ Ａ
ａＴｈｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｌｅｕ
Ｓｅｒ Ｈｉｓ ＬｅｕＬｅｕ Ｐｒｏ Ｈ
ｉｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ ｌ
１ｅＧｌｎ Ｔ叩゛ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ
Ａｒｇ Ｈｉｓ ＧｌｙＧｌｕ Ｌｃｕ Ｐｈ
ｅ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｉｌｅ 丁ｒｐ Ａａ
Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇペプチドをコー
ドする遺伝子のメクレオチド配列が明らかになれば、そ
のペプチドは化学的に合成することができる。
また本発明によれば、その塩基配列の翻訳領域がマーカ
ー蛋白質と任意に結合していてもよい上記したＥＢＶペ
プチド／蛋白質をコードする塩基配列を含む、上記した
ヌクレオヂド配列（＾）−（Ｇ）またはその等個物の１
部もしくは全部を有するＤ Ｎ Ａを含む組換えＤＮＡ
発現ベクターが提供される。該マーカー蛋白質はβ−ガ
ラクトシダーゼｈり索が好適である。
ー蛋白質と任意に結合していてもよい上記したＥＢＶペ
プチド／蛋白質をコードする塩基配列を含む、上記した
ヌクレオヂド配列（＾）−（Ｇ）またはその等個物の１
部もしくは全部を有するＤ Ｎ Ａを含む組換えＤＮＡ
発現ベクターが提供される。該マーカー蛋白質はβ−ガ
ラクトシダーゼｈり索が好適である。
また本発明によれば、上記に定へした抗原性ＥＢＶペプ
チド／蛋白質を含むワクチンが提供される。
チド／蛋白質を含むワクチンが提供される。
また本発明によれば、上記したＥＢＶペプチドもしくは
蛋白質抗原に対して特異的な抗体調製狗が１５！供され
る。
蛋白質抗原に対して特異的な抗体調製狗が１５！供され
る。
ｎ ｖｉｖｏで発現される抗原に対する抗体のレベルは
患者によって変動し得るものである。抗原の存在に加え
て、抗原量も診断対象の値である。更には、抗原に対す
る血清中に存在する抗体のクラス（ｒｑＭ、ＩＯＡ、Ｉ
ｑＧ）も、診断用のインデイケータ−として有用である
。
患者によって変動し得るものである。抗原の存在に加え
て、抗原量も診断対象の値である。更には、抗原に対す
る血清中に存在する抗体のクラス（ｒｑＭ、ＩＯＡ、Ｉ
ｑＧ）も、診断用のインデイケータ−として有用である
。
また本発明によれば、ＥＢＶの検出及び測定法であって
、ＥＢＶに対する抗体を含むことが知られている又は疑
われる血清を上記した抗原と接触せしめ、ＥＢＶ抗原と
ＥＢＶに対づる抗体との免疫化学的反応を起こさせ、次
いでそれ自体公知の方法でＥＢＶに対する抗体の存在量
を測定することからなる上記方法が提供される。ＥＢＶ
に対する抗体は、酵素的に、免疫学的にあるいは放射活
性測定により測定することができる。
、ＥＢＶに対する抗体を含むことが知られている又は疑
われる血清を上記した抗原と接触せしめ、ＥＢＶ抗原と
ＥＢＶに対づる抗体との免疫化学的反応を起こさせ、次
いでそれ自体公知の方法でＥＢＶに対する抗体の存在量
を測定することからなる上記方法が提供される。ＥＢＶ
に対する抗体は、酵素的に、免疫学的にあるいは放射活
性測定により測定することができる。
本発明のＥ８Ｖ抗原は特異的ＥＢＶ抗体を冑る及びｌＪ
１彊する手段として使用することができ、またこのＦＢ
Ｖ抗体は、対応するＥＢＶ抗原の検出及び測定用イムノ
アッセイに用いることの出来るＥＢＶに対する抗体の不
溶化型を作成することに使用づることができる。
１彊する手段として使用することができ、またこのＦＢ
Ｖ抗体は、対応するＥＢＶ抗原の検出及び測定用イムノ
アッセイに用いることの出来るＥＢＶに対する抗体の不
溶化型を作成することに使用づることができる。
更に本発明によれば、ＥＥ３Ｖに対する抗体の検出及び
測定用イムノアッセイ法であって、（ａ） ＥＢＶに
対する抗体を含んでいる又は含んでいることが疑われる
体液サンプルを、上記に定へしたＥＢＶ抗原の不溶化型
に加え：（ｂ） 免疫化学反応を起こさせ：次いで（
Ｃ） ラベル化剤に共有結合した抗ＥＢＶ抗体からな
るラベル化抗体の一定量を加えて、サンプル中に存在す
るＥＢＶ抗体の量の１旨標である反応メディウムの活性
を測定する； ことからなる上記方法が提供される。
測定用イムノアッセイ法であって、（ａ） ＥＢＶに
対する抗体を含んでいる又は含んでいることが疑われる
体液サンプルを、上記に定へしたＥＢＶ抗原の不溶化型
に加え：（ｂ） 免疫化学反応を起こさせ：次いで（
Ｃ） ラベル化剤に共有結合した抗ＥＢＶ抗体からな
るラベル化抗体の一定量を加えて、サンプル中に存在す
るＥＢＶ抗体の量の１旨標である反応メディウムの活性
を測定する； ことからなる上記方法が提供される。
好ましくは、ラベル化抗体は、酵素又は放射性ラベル化
剤に共有結合した抗ＥＢ抗体からなるものであり、反応
メディウムの酵素活性又は放射活性は慣用的方法によっ
て測定できる。上記した変法として、体液サンプルとと
−ｂにラベル化ＥＢＶ抗体を同時に加え、次いでＥＢＶ
に対する抗体を測定する競合結合イムノアッセイ法があ
り、該方法によって測定することもできる。
剤に共有結合した抗ＥＢ抗体からなるものであり、反応
メディウムの酵素活性又は放射活性は慣用的方法によっ
て測定できる。上記した変法として、体液サンプルとと
−ｂにラベル化ＥＢＶ抗体を同時に加え、次いでＥＢＶ
に対する抗体を測定する競合結合イムノアッセイ法があ
り、該方法によって測定することもできる。
上記した方法にお（）る工程（Ｃ）は、伯の工程によっ
て行なうこともできる。即ち、反応メディウムに、不溶
化型ＥＢＶ抗原が結合したＥＢＶに対する抗体に更に抗
ヒトイムノグロブリン抗体が結合したものの一定量を加
え、次いで結合抗ヒトイムノグロブリン抗体量即ち結合
ＥＢＶ抗体量を測定する工程によって行なってもよい。
て行なうこともできる。即ち、反応メディウムに、不溶
化型ＥＢＶ抗原が結合したＥＢＶに対する抗体に更に抗
ヒトイムノグロブリン抗体が結合したものの一定量を加
え、次いで結合抗ヒトイムノグロブリン抗体量即ち結合
ＥＢＶ抗体量を測定する工程によって行なってもよい。
抗ヒトイムノグロブリン抗体は抗１ｑＭ、抗１ｑ△、抗
１ｏＧのいずれでもよい。
１ｏＧのいずれでもよい。
ＥＢＶ抗原は、蛋白質吸着用物質の表面上に直接又は間
接的にコートされているのが好ましい。
接的にコートされているのが好ましい。
かかる蛋白質吸着用物質としては、例えば、プラスチッ
ク製マイクロタイトレージョンプレートもしくはストリ
ップ、ラテックスビーズ、′デツプスティックパデバイ
スなどが挙げられる。好適なマイク［１タイトレージヨ
ンプレートとしては、トレードマーク・ＨＩＣＲＯＥＬ
ＩＳＡでＤＹＮＡＴＥＣＨから販売されているフラット
ウェルポリスチレンマイクロタイトレージョンプレート
、トレードマーク・ＮＵＮＣ：ＩＨＨＵＬＯＮで販売さ
れているプレートなどのガンマ照射マイクロタイトレー
ジョンプレートが挙げられる。好適なマイクロタイトレ
ージョンストリップとしては、トレードマーク・ＲＥＨ
ＯＶＡ１４ＥしＬでＤＹＮＡＴＥＣＩ＋より販売されて
いるものが挙げられる。
ク製マイクロタイトレージョンプレートもしくはストリ
ップ、ラテックスビーズ、′デツプスティックパデバイ
スなどが挙げられる。好適なマイク［１タイトレージヨ
ンプレートとしては、トレードマーク・ＨＩＣＲＯＥＬ
ＩＳＡでＤＹＮＡＴＥＣＨから販売されているフラット
ウェルポリスチレンマイクロタイトレージョンプレート
、トレードマーク・ＮＵＮＣ：ＩＨＨＵＬＯＮで販売さ
れているプレートなどのガンマ照射マイクロタイトレー
ジョンプレートが挙げられる。好適なマイクロタイトレ
ージョンストリップとしては、トレードマーク・ＲＥＨ
ＯＶＡ１４ＥしＬでＤＹＮＡＴＥＣＩ＋より販売されて
いるものが挙げられる。
蛋白質吸着用物質の表面にＥＢＶ抗原を間接的にコー１
−するためには、該表面に先ずＥＢＶ抗体を加えて結合
せしめ次いで結合したＥＢＶ抗体にＥＢＶ抗原を加える
ことによって行なうことができる。
−するためには、該表面に先ずＥＢＶ抗体を加えて結合
せしめ次いで結合したＥＢＶ抗体にＥＢＶ抗原を加える
ことによって行なうことができる。
しかしながら、本発明のＥＢＶ抗原は各種のイムノアッ
セイ法に用いることができる。
セイ法に用いることができる。
しかして、本発明によれば、ＥＢＶ抗体の検出及び測定
用イムノアッセイ法であって、（ａ’） ＥＢＶ抗体
を含んでいる又は含ｌυでいることが疑われる体液サン
プルを、上記した蛋白質吸着用物質の表面に加え； （ｂ’） ＥＢＶ抗原のある巾を加えて免疫化学反応
を起こさせ：次いで （Ｃ′） ラベル化Ｅ８Ｖ抗体の一定量を加えて、結
合ＥＢＶ抗体の指標であるラベル活性を測定する； ことからなる上記方法が提供される。
用イムノアッセイ法であって、（ａ’） ＥＢＶ抗体
を含んでいる又は含ｌυでいることが疑われる体液サン
プルを、上記した蛋白質吸着用物質の表面に加え； （ｂ’） ＥＢＶ抗原のある巾を加えて免疫化学反応
を起こさせ：次いで （Ｃ′） ラベル化Ｅ８Ｖ抗体の一定量を加えて、結
合ＥＢＶ抗体の指標であるラベル活性を測定する； ことからなる上記方法が提供される。
上記の工程（ｂ′）においては、ＥＢＶ抗原の代わりに
、β−ガラクトシダーゼ又は伯の酵素などのレポーター
エレメントに融合したＥＢＶ抗原の一定量を加えること
もできる。ＥＢＶ抗体の…は通常の方法によって測定す
ることができる。即ち、例えばβ−ガラクトシダーゼを
用いた場合には、β−ガラクトシダーゼが融合した結合
ＥＢＶ抗体のβ−ガラクトシダーゼ活性を測定すること
によって行なうことができる。このアッセイ法は、用い
るレポーターエレメントによって、常法により修正する
ことができる。
、β−ガラクトシダーゼ又は伯の酵素などのレポーター
エレメントに融合したＥＢＶ抗原の一定量を加えること
もできる。ＥＢＶ抗体の…は通常の方法によって測定す
ることができる。即ち、例えばβ−ガラクトシダーゼを
用いた場合には、β−ガラクトシダーゼが融合した結合
ＥＢＶ抗体のβ−ガラクトシダーゼ活性を測定すること
によって行なうことができる。このアッセイ法は、用い
るレポーターエレメントによって、常法により修正する
ことができる。
β−ガラクトシダーゼ活性を直接３１１１定する代わり
に、ラベル化抗β−ガラクトシダーゼ抗体を、β−ガラ
クトシダーげに融合した結合ＥＢＶ抗原に加え、次いで
ＥＲＶに対する抗体の指標としてラベル活性を測定する
こともできる。好ましいラベル化抗β−ガラクトシダー
ゼ抗体は、ホースラデイシュバーオキシダーゼなどのラ
ベル酵素に共有結合した抗β−ガラクトシダーゼ抗体か
らなるラベル化抗β−ガラクトシダーピ抗体である。他
のレポーターエレメントに対するラベル化抗体を使用す
ることもできる。
に、ラベル化抗β−ガラクトシダーゼ抗体を、β−ガラ
クトシダーげに融合した結合ＥＢＶ抗原に加え、次いで
ＥＲＶに対する抗体の指標としてラベル活性を測定する
こともできる。好ましいラベル化抗β−ガラクトシダー
ゼ抗体は、ホースラデイシュバーオキシダーゼなどのラ
ベル酵素に共有結合した抗β−ガラクトシダーゼ抗体か
らなるラベル化抗β−ガラクトシダーピ抗体である。他
のレポーターエレメントに対するラベル化抗体を使用す
ることもできる。
また本発明によれば、ＥＢＶに対する抗体の名神のクラ
スを測定する方法が提供される。本発明によれば、例え
ば、ＥＢＶに対するＩｇＭ抗体の検出及び測定用イムノ
アッセイ法であって、（ａ’Ｍ ＥＢＶに対するＩｇ
Ｍ抗体を含む又は含むことが疑われる体液サンプルを、
抗ヒトＩｇＭ抗体の不溶化型に加え； （ｂ”） 免疫化学的反応を起こさせ：次いで（Ｃ’
Ｍ レポーターエレメントに融合したＥＢＶ抗原のあ
る聞を加えて、更に免疫化学的反応を起こさせる： ことからなる上記方法が提供される。
スを測定する方法が提供される。本発明によれば、例え
ば、ＥＢＶに対するＩｇＭ抗体の検出及び測定用イムノ
アッセイ法であって、（ａ’Ｍ ＥＢＶに対するＩｇ
Ｍ抗体を含む又は含むことが疑われる体液サンプルを、
抗ヒトＩｇＭ抗体の不溶化型に加え； （ｂ”） 免疫化学的反応を起こさせ：次いで（Ｃ’
Ｍ レポーターエレメントに融合したＥＢＶ抗原のあ
る聞を加えて、更に免疫化学的反応を起こさせる： ことからなる上記方法が提供される。
レポーターエレメントはβ−ガラクトシダーゼが好まし
い。
い。
ＥＢＶに対するＩａＭ抗体の川は、β−ガラクトシダー
ゼあるいは他のレポーターエレメントに融合した結合Ｅ
ＢＶ抗原のβ−ガラクトシダーゼ活性を測定することに
より、又はラベル化抗βガラクトシダーゼ抗体あるいは
上記した他のレポーターエレメントに対するラベル化抗
体を用いて測定することができる。上記工程（Ｃ″）の
他の方法として、β−ガラクトシダーゼに融合したＥＢ
Ｖ抗原の代わりにＥ［３Ｖ抗原の一定量を加える方法を
採用してもよい。ＥＢＶに対するＩｇＭ抗体のけは、上
記したように、ラベル化ＥＢＶ抗体を加えることによっ
て測定できる。
ゼあるいは他のレポーターエレメントに融合した結合Ｅ
ＢＶ抗原のβ−ガラクトシダーゼ活性を測定することに
より、又はラベル化抗βガラクトシダーゼ抗体あるいは
上記した他のレポーターエレメントに対するラベル化抗
体を用いて測定することができる。上記工程（Ｃ″）の
他の方法として、β−ガラクトシダーゼに融合したＥＢ
Ｖ抗原の代わりにＥ［３Ｖ抗原の一定量を加える方法を
採用してもよい。ＥＢＶに対するＩｇＭ抗体のけは、上
記したように、ラベル化ＥＢＶ抗体を加えることによっ
て測定できる。
上記した方法は、Ｅ８Ｖ抗原に対するＩＯＡ抗体などの
他のクラスの抗体の測定に用いることもできる。
他のクラスの抗体の測定に用いることもできる。
また本発明によれば、ＥＢＶに対する抗体の検出及び測
定用イムノアッセイ法であって、（ａ”’ ”） β
−ガラクトシダーゼに融合したＥＢＶ抗原のある吊を、
抗β−ガラクトシダーゼ抗体の不溶化型に加えて、免疫
化学的反応を起こさせ； （ｂ′″） ＥＢＶに対する抗体を含む又は含むこと
が疑われる体液サンプルを加えて、免疫化学的反応を起
こさせ二次いで （Ｃ′″ ） 抗ヒトイムノグロブリン抗体の一定率
を加えて、免疫化学的反応を起こさせ、結合抗ヒトイム
ノグロブリン抗体の量を測定することによりＥＢＶに対
する抗体の場を測定する：ことからなる上記方法が提供
される。
定用イムノアッセイ法であって、（ａ”’ ”） β
−ガラクトシダーゼに融合したＥＢＶ抗原のある吊を、
抗β−ガラクトシダーゼ抗体の不溶化型に加えて、免疫
化学的反応を起こさせ； （ｂ′″） ＥＢＶに対する抗体を含む又は含むこと
が疑われる体液サンプルを加えて、免疫化学的反応を起
こさせ二次いで （Ｃ′″ ） 抗ヒトイムノグロブリン抗体の一定率
を加えて、免疫化学的反応を起こさせ、結合抗ヒトイム
ノグロブリン抗体の量を測定することによりＥＢＶに対
する抗体の場を測定する：ことからなる上記方法が提供
される。
上記した方法の場合においても、β−ガラク（〜シダー
ゼの代わりに他のレポーターエレメントを用いることが
できる。
ゼの代わりに他のレポーターエレメントを用いることが
できる。
上記の工程（ｂ”）および（Ｃｒｎ） は、他の方法
によって行なうこともできる。即ち、ラベル化したＥＦ
３Ｖに対する抗体と一緒に体液サンプリングを加えて競
合結合イムノアッセイを行ない、ＥＢＶに対する抗体の
聞を測定することによって行なうこともできる。
によって行なうこともできる。即ち、ラベル化したＥＦ
３Ｖに対する抗体と一緒に体液サンプリングを加えて競
合結合イムノアッセイを行ない、ＥＢＶに対する抗体の
聞を測定することによって行なうこともできる。
サンプルとしては血清サンプルが好ましい。
また本発明によれば、体液中のＥＢＶに対する抗体を検
出及び測定するためのテストパックであって、 （ａａ） 上記した不溶化型ＥＢＶ抗原の一定聞：及
び （ｂｂ） ′Ｍ素あるいは放射性ラベル化剤と抗ＥＢ
Ｖ抗体との結合生成物の対応量： を含む上記テストパックが提供される。テストパックに
、酵素と抗ＥＢＶ抗体との結合生成物が用いられる場合
には、該テストパックには酵素活性測定用基質が含まれ
る。
出及び測定するためのテストパックであって、 （ａａ） 上記した不溶化型ＥＢＶ抗原の一定聞：及
び （ｂｂ） ′Ｍ素あるいは放射性ラベル化剤と抗ＥＢ
Ｖ抗体との結合生成物の対応量： を含む上記テストパックが提供される。テストパックに
、酵素と抗ＥＢＶ抗体との結合生成物が用いられる場合
には、該テストパックには酵素活性測定用基質が含まれ
る。
放射性ラベル化剤は ｌが好ましい。
しかしながら、上記の本発明によるイムノアッセイを実
施するために必要な成分であれば、上記のテストパック
はいずれの成分を含んでいてもよい。
施するために必要な成分であれば、上記のテストパック
はいずれの成分を含んでいてもよい。
以下に図面について説明する。
第１Ａ図はＥＢＶ Ｂ９５−８ゲノムを直線的に示し
たものである。ＴＲ及びＩＲで命名されるタンデムに反
復する一群の配列は、ＵＳ及びＵＬ領領域境界を示すも
のである。
たものである。ＴＲ及びＩＲで命名されるタンデムに反
復する一群の配列は、ＵＳ及びＵＬ領領域境界を示すも
のである。
第１Ｂ図はＥＢＶ ８９５−８ウイルスゲノムのＢａ
ｍＨ１制限酵素地図を直線的に示したものである。
ｍＨ１制限酵素地図を直線的に示したものである。
第２図は、本発明で調製される抗原］−ド配列を含むク
ローン化ＥＢＶ ＤＮＡフラグメントが５ｒａａ １
部位に挿入された発現ベクターＤＯＲＦ１を示す。
ローン化ＥＢＶ ＤＮＡフラグメントが５ｒａａ １
部位に挿入された発現ベクターＤＯＲＦ１を示す。
第３図は、本発明によって調製されるＥＢＶＢ９５−８
ケノムバンクを抗ＥＢＶヒト血清でスクニーニングして
単離されたイムノポジティブクローンをボす。
ケノムバンクを抗ＥＢＶヒト血清でスクニーニングして
単離されたイムノポジティブクローンをボす。
第４図は、第３図で示したイムノポジティブクローンを
Ｃ１ａＩで消化後に選択されるプラスミドＤＮＡを示す
。
Ｃ１ａＩで消化後に選択されるプラスミドＤＮＡを示す
。
第５図は、ＥＢＶＢ９５−８のＢａｍＨＩフラグメント
の３２ｐ−ラベル化８０３ｂｐ ＰｖｕｌＩ！Ｊ−ブ
フラグメントでプローブされる第４図のプラスミドＤＮ
△のサザンプロット分析のオートラジオグラフィーを示
す。
の３２ｐ−ラベル化８０３ｂｐ ＰｖｕｌＩ！Ｊ−ブ
フラグメントでプローブされる第４図のプラスミドＤＮ
△のサザンプロット分析のオートラジオグラフィーを示
す。
第６図は、ＥＢＶ ８９５−８ ＢａｍｔｌｌＷフ
ラグメン１へのシングルコピーを示し、更に、転写及び
／又は発現されることが知られた配列の相対的位置及び
リーデングフレームを表わす。クローンＡ−Ｄ （ＣＬ
Ａ、ＣＬＢ、ＣＬＣ，ＣＬＤ）で示される薄い黒いバー
は、本発明によるＥ８Ｖ抗原をコードする発現ｔ）ＮＡ
配列（＾）−（Ｄ）を表わす。
ラグメン１へのシングルコピーを示し、更に、転写及び
／又は発現されることが知られた配列の相対的位置及び
リーデングフレームを表わす。クローンＡ−Ｄ （ＣＬ
Ａ、ＣＬＢ、ＣＬＣ，ＣＬＤ）で示される薄い黒いバー
は、本発明によるＥ８Ｖ抗原をコードする発現ｔ）ＮＡ
配列（＾）−（Ｄ）を表わす。
第７図は、ＥＢＶ Ｂ９５−８ゲノムをボし、本発明
によるＥＢＶ抗原をコードするＤＮＡ配列（Ａ）−（Ｄ
）の相対的位置を表わす。
によるＥＢＶ抗原をコードするＤＮＡ配列（Ａ）−（Ｄ
）の相対的位置を表わす。
以下の実施例により本発明を更に詳細に説明する。
実茄例１
ＦＢＶｔｉ！Ｌ原 現クローンの単
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｉｎ５ｔｉ
ｔｕｔｅ ｆｏｒＢｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ （フロリ
ダ、Ｕ、Ｓ、Ａ）及びＨｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
八５ｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｃへ （ベテスタ、メ’
Ｊ −７ント、ｆＪ、ｓ、Ａｌｌら、Ｅ８．Ｖ Ｂ９
５−８ＤＮＡを購入した。このＤＮＡは部分的分解が行
なわれており平均１ｋｂ以下の大ぎさのフラグメントで
ある。このＤＮＡを８１ヌクレアーゼ及びＴ４ＤＮＡポ
リメラーゼをを用いて平滑末端とし、オーブンリーディ
ングフレーム発現ベクターｐＯＲＦ１ （第２図） ［
Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ Ｃｔ ａ（１９８３） ５ｕｐｒ
ａコのユニークｓｍａ ＋部位へ連結した。このｐＯＲ
Ｆ １は次の特徴点を有している。即ち、（ｉ）非活性
のβ−ガラクトシダー１ｍ’１伝子を含んでいる； （
ｉｉ）β−ガラクトシダーゼ遺伝子のＮ−末端にポリリ
ンカークローニング部位を有している；（ｉ目）この部
位に挿入されたＯＲＦ ＤＮＡは、ｃ、 Ｃｏ１１プ
ロモーター及びイニシエーター配列ｏｍｐＦのコントロ
ール下で発現される。この挿入により翻訳フェーズに適
当な変化が生じ、このためβ−ガラクトシダーゼが融合
蛋白質として発現されるようになる。
ｔｕｔｅ ｆｏｒＢｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ （フロリ
ダ、Ｕ、Ｓ、Ａ）及びＨｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
八５ｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｃへ （ベテスタ、メ’
Ｊ −７ント、ｆＪ、ｓ、Ａｌｌら、Ｅ８．Ｖ Ｂ９
５−８ＤＮＡを購入した。このＤＮＡは部分的分解が行
なわれており平均１ｋｂ以下の大ぎさのフラグメントで
ある。このＤＮＡを８１ヌクレアーゼ及びＴ４ＤＮＡポ
リメラーゼをを用いて平滑末端とし、オーブンリーディ
ングフレーム発現ベクターｐＯＲＦ１ （第２図） ［
Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ Ｃｔ ａ（１９８３） ５ｕｐｒ
ａコのユニークｓｍａ ＋部位へ連結した。このｐＯＲ
Ｆ １は次の特徴点を有している。即ち、（ｉ）非活性
のβ−ガラクトシダー１ｍ’１伝子を含んでいる； （
ｉｉ）β−ガラクトシダーゼ遺伝子のＮ−末端にポリリ
ンカークローニング部位を有している；（ｉ目）この部
位に挿入されたＯＲＦ ＤＮＡは、ｃ、 Ｃｏ１１プ
ロモーター及びイニシエーター配列ｏｍｐＦのコントロ
ール下で発現される。この挿入により翻訳フェーズに適
当な変化が生じ、このためβ−ガラクトシダーゼが融合
蛋白質として発現されるようになる。
ＥＢＶ ＤＮＡを保持する発現ベクターで上記したＩ
ａｃ欠損株Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｍｌ−１３０００を形質
転換した。発現ベクターｐＯＲＦ１とＥ、 ｃｏｌｉＭ
Ｈ３０００は、Ｇ、 Ｈ，Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋから贈ら
れた。
ａｃ欠損株Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｍｌ−１３０００を形質
転換した。発現ベクターｐＯＲＦ１とＥ、 ｃｏｌｉＭ
Ｈ３０００は、Ｇ、 Ｈ，Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋから贈ら
れた。
配列（Ｇ）はＥ、 ｃｏｌｉ株Ｊ、Ｍ、１０５でも機能
を有していた。
を有していた。
ＥＢＶ Ｄ’ＮＡを含むプラスミドを保持したＥ、
ｃｏｌｉサンプル、１）ＥＢＶ−Ａ、 ｐＥＢＶ−Ｂ、
ｐＥＢＶ−Ｃ，ｐＥＢＶ−Ｄ、ｐＥＢＶ−Ｅ。
ｃｏｌｉサンプル、１）ＥＢＶ−Ａ、 ｐＥＢＶ−Ｂ、
ｐＥＢＶ−Ｃ，ｐＥＢＶ−Ｄ、ｐＥＢＶ−Ｅ。
１） Ｅ Ｂ Ｖ −１＝及び０ＥＢＶ−Ｇを、Ｎａｔ
ｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｒ Ｉｎｄｕ
ｓｔｒｉａｌ ａｎｄ ＭａｒｉｎｅＢａｃｔｅｒ
ｉａ Ｌｉｍ１ｔｅｄ （Ｎ Ｇ Ｉ Ｍ Ｂ ）に１
９８８年１０月２４日に寄託し、受託番号ＮＣｌＢ４Ｏ
０７５、ＮＣｌＢ４Ｏ０７６、ＮＣｌＢ４Ｏ０７７、Ｎ
ＣｌＢ４Ｏ０７８、ＮＣｌＢ４Ｏ０７９、ＮＧＩＢ４０
０８０１ＮＧＩ８４００８１がそれぞれ付されている。
ｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｒ Ｉｎｄｕ
ｓｔｒｉａｌ ａｎｄ ＭａｒｉｎｅＢａｃｔｅｒ
ｉａ Ｌｉｍ１ｔｅｄ （Ｎ Ｇ Ｉ Ｍ Ｂ ）に１
９８８年１０月２４日に寄託し、受託番号ＮＣｌＢ４Ｏ
０７５、ＮＣｌＢ４Ｏ０７６、ＮＣｌＢ４Ｏ０７７、Ｎ
ＣｌＢ４Ｏ０７８、ＮＣｌＢ４Ｏ０７９、ＮＧＩＢ４０
０８０１ＮＧＩ８４００８１がそれぞれ付されている。
プラスミドＤＮＡは、標準Ｃ５ＣＪ！／エチジウムプロ
ミド遠心法［Ｈａｎｉａｔｉｓ、 Ｔ、 ａｔ ａｌ、
、 （１９８２） Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ、 ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＨａｎｌＪａＣｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ ｌｌａｒｂｏｕｒＮｅｗ Ｖｏｒｋ ）によ
り調製した。プラスミドＤＮＡは、アルカリ溶解法［８
ｉｒｎｂｏｉｍ、 Ｉｆ、 Ｃ，とＤｏｌｙ。
ミド遠心法［Ｈａｎｉａｔｉｓ、 Ｔ、 ａｔ ａｌ、
、 （１９８２） Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ、 ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＨａｎｌＪａＣｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ ｌｌａｒｂｏｕｒＮｅｗ Ｖｏｒｋ ）によ
り調製した。プラスミドＤＮＡは、アルカリ溶解法［８
ｉｒｎｂｏｉｍ、 Ｉｆ、 Ｃ，とＤｏｌｙ。
Ｊ、（ｉ ９７９ ） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓ、 ７．１５１３１５２３］を用いてミニ溶解物
から調製することもできる。
Ｒｅｓ、 ７．１５１３１５２３］を用いてミニ溶解物
から調製することもできる。
形質転換は、Ｄａｇｅｒｔ、 ＨとＥｒ１ｉｃｈ、 Ｓ
、 Ｄ、 （１９７９） Ｇｅｎｅ６．２３に記載さ
れた方法に従って行なった。形質転換体は、アミピシリ
ンと５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β〜Ｄ
−ガラフｊ・ピラノシドを含む培地にプレートした。
、 Ｄ、 （１９７９） Ｇｅｎｅ６．２３に記載さ
れた方法に従って行なった。形質転換体は、アミピシリ
ンと５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β〜Ｄ
−ガラフｊ・ピラノシドを含む培地にプレートした。
６０．０００個の組換体からなるシーンバンクについて
、ＩＭｉΩ者から得た血清を用いてＥＢＶ抗原の発現能
を調べた。この血清は、Ｒｅｇｉｏｎａｌｌｏｓｐｉｔ
ａｌ、 Ｇａｌｗａｙ、 ＩｒｃｌａｎｄＦ伝染竹甲核
症と診断された思省から採取した。シーンバンクについ
てはＮｃｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ、 １６．７
（Ｗａｌｌｓ、 Ｄ、 ａｔａｌ、、 １９８８
）にも記載されている。
、ＩＭｉΩ者から得た血清を用いてＥＢＶ抗原の発現能
を調べた。この血清は、Ｒｅｇｉｏｎａｌｌｏｓｐｉｔ
ａｌ、 Ｇａｌｗａｙ、 ＩｒｃｌａｎｄＦ伝染竹甲核
症と診断された思省から採取した。シーンバンクについ
てはＮｃｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ、 １６．７
（Ｗａｌｌｓ、 Ｄ、 ａｔａｌ、、 １９８８
）にも記載されている。
１２−〇−テトラデカノイルポルボール−１３−アセテ
ートで誘導されたＰ３ＨＲ−１１１１胞、Ｒａｊｉｌ胞
をそれぞれ含むスライド上で、間接蛍光抗体法［１１ｅ
ｎｌｅ、 Ｗ、とＨｃｎｌｅ、 Ｇ、 （１９６６）
Ｊ、 ８ａｃｔｅｒｉｏ１．．９１．１２４８−１２５
６］により、ＥＢＡのウィルスカブジッド抗原（ＶＣ△
）、初期抗原（ＥＡ）に対する抗体レベルを測定して診
断した。ＥＢＶ核抗原（ＥＢＮＡ）に対する抗体価は、
Ｒａｊｉ細胞を用いＣＡ、Ｃｒ Ｆ ［Ｒｃｅｄｍａｎ
８Ｈ１とＫｌｅｉｎ、 Ｇ、 （１９７３） Ｉｎｔ
、 Ｊ、 Ｃａｎｃｅｒ。
ートで誘導されたＰ３ＨＲ−１１１１胞、Ｒａｊｉｌ胞
をそれぞれ含むスライド上で、間接蛍光抗体法［１１ｅ
ｎｌｅ、 Ｗ、とＨｃｎｌｅ、 Ｇ、 （１９６６）
Ｊ、 ８ａｃｔｅｒｉｏ１．．９１．１２４８−１２５
６］により、ＥＢＡのウィルスカブジッド抗原（ＶＣ△
）、初期抗原（ＥＡ）に対する抗体レベルを測定して診
断した。ＥＢＶ核抗原（ＥＢＮＡ）に対する抗体価は、
Ｒａｊｉ細胞を用いＣＡ、Ｃｒ Ｆ ［Ｒｃｅｄｍａｎ
８Ｈ１とＫｌｅｉｎ、 Ｇ、 （１９７３） Ｉｎｔ
、 Ｊ、 Ｃａｎｃｅｒ。
１１．４９９−５２０１により測定した。ＥＡに対する
抗体の力価は定量せず、十又は−でスコアー付番ノを行
なった所、はとんどの血清は十であつた。
抗体の力価は定量せず、十又は−でスコアー付番ノを行
なった所、はとんどの血清は十であつた。
Ｅ、 ｃｏｌｉ蛋白質と交差反応する抗体があるために
生じる初期のバックグランドをなくすために血清の前処
理が必要であった。Ｅ、 ｃｏｌｉ蛋白質が結合したア
フィニティークロマトグラフィーに血清を通して前処理
を行なうことにより、このような交差反応性蛋白質を除
去した。このスクリーニング工程によって単離された陽
性クローンは、第３図に示した。
生じる初期のバックグランドをなくすために血清の前処
理が必要であった。Ｅ、 ｃｏｌｉ蛋白質が結合したア
フィニティークロマトグラフィーに血清を通して前処理
を行なうことにより、このような交差反応性蛋白質を除
去した。このスクリーニング工程によって単離された陽
性クローンは、第３図に示した。
Ｙｏｕｎｇ、 Ｒ，Ａ とＤａｖｉｅｓ、 ｎ、 Ｗ
、 （１９８３）Ｐｒｏｃ、 Ｎａ口、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、 Ｕ、 Ｓ、Ａ１．８０．１１９４−１１
９６に記載された方法に、Ｗａｌｌｓ、 Ｄａｔ ａｌ
、、 （１９８８） （Ｎｅｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１
ｄｓ Ｒｅｓ、１６．７）の方法を加味して若干変更し
以下に示すようにして、ニトロセルロースフィルター上
でｉｎ ５ｉｔｕでスクリーニングすべきコロニーを溶
解した。
、 （１９８３）Ｐｒｏｃ、 Ｎａ口、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、 Ｕ、 Ｓ、Ａ１．８０．１１９４−１１
９６に記載された方法に、Ｗａｌｌｓ、 Ｄａｔ ａｌ
、、 （１９８８） （Ｎｅｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１
ｄｓ Ｒｅｓ、１６．７）の方法を加味して若干変更し
以下に示すようにして、ニトロセルロースフィルター上
でｉｎ ５ｉｔｕでスクリーニングすべきコロニーを溶
解した。
Ｌ基：
以下に示す各種のバッファーを調製した。
バ’／７７−Ａｌ：０．１７Ｍ ＮａＣ１０，０１Ｍ
Ｔｒｉｓ ＨＣｌ （ｐＨ８，Ｏ） ０．１ｍＭ ＰＭＳＦ（フェ ニルメタンスルボニルフルオ ライド） １．０ｍＭ Ｋ１０ バッファー△２：バツファ−ＡＩ＋０．０１％ＳＯ３（
ナトリウムドデシル スルフェート）。
Ｔｒｉｓ ＨＣｌ （ｐＨ８，Ｏ） ０．１ｍＭ ＰＭＳＦ（フェ ニルメタンスルボニルフルオ ライド） １．０ｍＭ Ｋ１０ バッファー△２：バツファ−ＡＩ＋０．０１％ＳＯ３（
ナトリウムドデシル スルフェート）。
バッファーＡ３ニバツファー八１千３％［３ＳＡウシ血
清アルブミン）（又は ミルク蛋白質（Ｃａｄｂｕｒｙの ＨａｒＶＯＩ ： Ｍａｒｖｅｌはトレードマーク））
＋０．１％ナトリウ ム７ジド。
清アルブミン）（又は ミルク蛋白質（Ｃａｄｂｕｒｙの ＨａｒＶＯＩ ： Ｍａｒｖｅｌはトレードマーク））
＋０．１％ナトリウ ム７ジド。
（実験を行なう日に調製した）。
バッファー８１：バツファ−Ａ１＋０．１％Ｔｒｉｔｏ
ｎ（Ｔｒｉｔｏｎはトレードマーク）Ｘ１００、 ＴｍＭ ＥＤＴＡ。
ｎ（Ｔｒｉｔｏｎはトレードマーク）Ｘ１００、 ＴｍＭ ＥＤＴＡ。
バッファーＢ２：バツファーＢ１千０．１％ＳＤＳ。
バッファーＢ３：バツファ−８１＋３％ＢＳＡ（又は５
％Ｈａｒｖ、ｅｌ） ＋０．１％ブトリウムアジド。
％Ｈａｒｖ、ｅｌ） ＋０．１％ブトリウムアジド。
（実験を行なう日に調製した）。
血清の処理：
宿主細胞（１，５ｄ）を−晩培養しく以上工程（１）参
照） 、６．ＯＯＯｒｐｍで５分間遠心した。
照） 、６．ＯＯＯｒｐｍで５分間遠心した。
上清を除去し、ペレットをＰＢＳ （リン［衝止食塩水
；１タブレット／１００ｄＨ２０）（１００μｍ）に再
懸濁した。ＰＢＳ （９０μｌ）を血清サンプル（１０
μｍ）に加え、かくして得られる血清を再懸濁した宿主
細胞（１００μｉ）に加え、室温で３０−４５分間放置
した。次いでサンプルを８．ＯＯＯｒｐｍで５分間遠心
した。ｊｑられた上清は、Ｂ３バッハファーを含むフィ
ルターに加えるのに用いた（Ｌｌ下■程（９）参照）。
；１タブレット／１００ｄＨ２０）（１００μｍ）に再
懸濁した。ＰＢＳ （９０μｌ）を血清サンプル（１０
μｍ）に加え、かくして得られる血清を再懸濁した宿主
細胞（１００μｉ）に加え、室温で３０−４５分間放置
した。次いでサンプルを８．ＯＯＯｒｐｍで５分間遠心
した。ｊｑられた上清は、Ｂ３バッハファーを含むフィ
ルターに加えるのに用いた（Ｌｌ下■程（９）参照）。
次いで以下の方法に従って、４日間に亘って、ヒト抗Ｅ
ＢＶ面清を用いて発現バンクについて免疫学的スクリー
ニングを実施した。
ＢＶ面清を用いて発現バンクについて免疫学的スクリー
ニングを実施した。
第１日
（１） コロニーを適当な選択培地で３７℃で一晩生
育せしめた。コロニーのレプリカコピーを他のプレート
上に置いた。
育せしめた。コロニーのレプリカコピーを他のプレート
上に置いた。
第２日
（２） ニトロセルロースフィルターをコロニを含む
プレート上に置き、５分間放置した。得られるニトロセ
ルロースフィルターコロニーを、ペトリ皿のバッファー
Ａ１とライソザイム（２ｍｇ／ｍＩ！”）に浸した８
２ ｒｍｓ ｗｈａｔ＋ｎａｎ５４１フイルター上に置
いた。クロロホルムに浸したＷｈａｔｍａｎ５４１フイ
ルターをペトリ冊のフタの中に置き、フタを閉じて３０
分間室４でインキュベートし、クローンを溶解した。
プレート上に置き、５分間放置した。得られるニトロセ
ルロースフィルターコロニーを、ペトリ皿のバッファー
Ａ１とライソザイム（２ｍｇ／ｍＩ！”）に浸した８
２ ｒｍｓ ｗｈａｔ＋ｎａｎ５４１フイルター上に置
いた。クロロホルムに浸したＷｈａｔｍａｎ５４１フイ
ルターをペトリ冊のフタの中に置き、フタを閉じて３０
分間室４でインキュベートし、クローンを溶解した。
（３） 次いでフィルターを取り、コロニー側を上に
して、バラノア−Ａ２ （７−）を含む新しい皿に１時
間浸した。この工程及びこれに続く全ての工程はす温で
実施した。
して、バラノア−Ａ２ （７−）を含む新しい皿に１時
間浸した。この工程及びこれに続く全ての工程はす温で
実施した。
（４） フィルターを取り、コロニー側を上にして、
バッファーＡＩ （７ａｔｅ）中で１０分間リンスした
。
バッファーＡＩ （７ａｔｅ）中で１０分間リンスした
。
（５） フィルターを取り、ＤＮＡ５ｅ （２μｙ／
−）を含むバッファー八１ （７ｄ＞中で首記と同様に
してインキュベートした。
−）を含むバッファー八１ （７ｄ＞中で首記と同様に
してインキュベートした。
（６） フィルターを取り、バッファーＡ１（７ｄ）
中で１０分間リンスした。次いでフィルターをガラスベ
トリ皿に移した。ガラスペトリ皿は以下の全ての工程で
用いた。
中で１０分間リンスした。次いでフィルターをガラスベ
トリ皿に移した。ガラスペトリ皿は以下の全ての工程で
用いた。
（７） フィルターをバッファーＡ３（７ｍｌ！／フ
ィルター）中で１時間インキュベートした。この工程中
は、上記した血清処理を実施した。
ィルター）中で１時間インキュベートした。この工程中
は、上記した血清処理を実施した。
（８） 血清（前記の血清の処理で得た上清）をバッ
ファーＢ３ （７ｍ）中に希釈し、この中でフィルター
をインキュベートした。次いでフィルターをゆっくりと
撹拌しながら・−晩インキユベートした。
ファーＢ３ （７ｍ）中に希釈し、この中でフィルター
をインキュベートした。次いでフィルターをゆっくりと
撹拌しながら・−晩インキユベートした。
第３日
（９） 血清を含むバッファーを除き、フィルターを
バッファーＢ２（７威）で１０分間洗）ｐした。
バッファーＢ２（７威）で１０分間洗）ｐした。
（１０） フィルターをバッファーＢ１（７−で１０
分間）で洗浄した。
分間）で洗浄した。
（１１） 工程（１０）をくり返した。
（１２）フィルターをバッファーＢ３ （７ｄ）で１５
分間洗浄した。
分間洗浄した。
（１３） フィルターを、 ｆ蛋白質Ａ （Ｓｌ
ｏｍａ ）（約２ｘ １０６ｃｐｍ ／）イＪｔｔター
：ｔ＜ツＶ７−Ｂ３で希釈）とともに１晩インキユベ
ートした。
ｏｍａ ）（約２ｘ １０６ｃｐｍ ／）イＪｔｔター
：ｔ＜ツＶ７−Ｂ３で希釈）とともに１晩インキユベ
ートした。
第４日
（１４） 工程（９）をくり返した。
（１５） フィルターをバッファー８１（７ｍ２＞で
１５分間洗浄した。
１５分間洗浄した。
（１６） 工程（１５）を更に１５分ＩＬ’ｌ ＜り
返した。
返した。
（１７） フィルターを乾燥し、−７０℃で１２−４
８時間増感スクリーンでオートラジオグラフィーに付し
、結合抗体を検出した。
８時間増感スクリーンでオートラジオグラフィーに付し
、結合抗体を検出した。
抗原ｉ′ｌ現が陽性である、即ち血清中に存在する抗体
に対応する抗原を有するコロニーとしてｉ ＩＲされ精
製されたコロニーのＥＢＶ ＤＮＡの配列決定を行な
い、ＥＢＶ遺伝遺伝ツプ上でのオープンリーディングフ
レームの仲買を同定した。
に対応する抗原を有するコロニーとしてｉ ＩＲされ精
製されたコロニーのＥＢＶ ＤＮＡの配列決定を行な
い、ＥＢＶ遺伝遺伝ツプ上でのオープンリーディングフ
レームの仲買を同定した。
ＢａｍＨＩ Ｗ領域のプローブを調製するために、商
業的に入手し得るインタクトＥＢＶ Ｂ９５−８ＤＮ
ＡをＢａｍ）ＩＩで消化しｐＯＲＦｌにクローン化した
。このバンクを、分解した全ＥＢＶ ＤＮＡをプロー
ブとしてスクリーニングした。スクリーニングすべきコ
ロニーを、製造業者の指針に基づき、８２＃ニトロセル
ロースフイルター（Ｓｃｈｌｃｉｃｈｅｒ、！：５ｃｈ
ｖｅｌｌ ） ニ移し、製造業者の指針に基づくハイブ
リダイゼーションプロト」−ルでハイブリダイゼーショ
ンを行なった。消化したプラスミドのサザンプロット分
析は、０．４Ｍ ＮａＯＨをトランスファーバッファ
ーとして用いて）ｌｙｂｏｎｄ Ｎ （トレードマー
ク、Ａｍｅｒｓｈａｍ ）上で行なった。ＤＮＡプロー
ブはオリゴラベル化法［ｒｅｉｎｂａｒｇ、＾、Ｐ、と
ＶＯ（ｌｅｌｓｔｅｉｎＢｉ１９８３）＾ｎａｌｙｔｉ
ｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 １３２．６−１３１によ
って作成した。強くハイブリダイズするコロニーを分析
用に採取した。そのほとんどは、ＥＢＶ ＢａｍＨＩ
Ｗコピーを有するρ０ＲＦ１組換えＤＮＡを保持し
ていることが、その大きさ及び以下の結果から判った、
Ｗの８０３ｂｐＰｖｕＩＩ−ＢａｍＨＩサブフラグメン
ト（第６図）を単離し、放射標識化して、イムノポジテ
ィブクローンから得たプラスミドＤＮＡＢＩ製物のＣ１
ａＩ消化物を探索するのに用いた。その結果は第４及び
第５図に示した。３個のイムノポジティブクローンのプ
ラスミドＤＮＡについて、ポジティブハイブリダイゼー
ションがｖＡ’Ｈされた。
業的に入手し得るインタクトＥＢＶ Ｂ９５−８ＤＮ
ＡをＢａｍ）ＩＩで消化しｐＯＲＦｌにクローン化した
。このバンクを、分解した全ＥＢＶ ＤＮＡをプロー
ブとしてスクリーニングした。スクリーニングすべきコ
ロニーを、製造業者の指針に基づき、８２＃ニトロセル
ロースフイルター（Ｓｃｈｌｃｉｃｈｅｒ、！：５ｃｈ
ｖｅｌｌ ） ニ移し、製造業者の指針に基づくハイブ
リダイゼーションプロト」−ルでハイブリダイゼーショ
ンを行なった。消化したプラスミドのサザンプロット分
析は、０．４Ｍ ＮａＯＨをトランスファーバッファ
ーとして用いて）ｌｙｂｏｎｄ Ｎ （トレードマー
ク、Ａｍｅｒｓｈａｍ ）上で行なった。ＤＮＡプロー
ブはオリゴラベル化法［ｒｅｉｎｂａｒｇ、＾、Ｐ、と
ＶＯ（ｌｅｌｓｔｅｉｎＢｉ１９８３）＾ｎａｌｙｔｉ
ｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 １３２．６−１３１によ
って作成した。強くハイブリダイズするコロニーを分析
用に採取した。そのほとんどは、ＥＢＶ ＢａｍＨＩ
Ｗコピーを有するρ０ＲＦ１組換えＤＮＡを保持し
ていることが、その大きさ及び以下の結果から判った、
Ｗの８０３ｂｐＰｖｕＩＩ−ＢａｍＨＩサブフラグメン
ト（第６図）を単離し、放射標識化して、イムノポジテ
ィブクローンから得たプラスミドＤＮＡＢＩ製物のＣ１
ａＩ消化物を探索するのに用いた。その結果は第４及び
第５図に示した。３個のイムノポジティブクローンのプ
ラスミドＤＮＡについて、ポジティブハイブリダイゼー
ションがｖＡ’Ｈされた。
特に第４図に示すように、クローン化ウィルスＤＮＡフ
ラグメントは１，３ｋｂベクタ一配列に結合しており、
そのフラグメントの大きさが増していることがその存在
を示している。レーン１はＯＯＲＦ １を含み、レーン
２−９はイムノポジティブクローンのＩ）ＯＲＦ １組
換えＤＮＡを含む。
ラグメントは１，３ｋｂベクタ一配列に結合しており、
そのフラグメントの大きさが増していることがその存在
を示している。レーン１はＯＯＲＦ １を含み、レーン
２−９はイムノポジティブクローンのＩ）ＯＲＦ １組
換えＤＮＡを含む。
レーンＭはλサイズマーカー（Ｈｉ ｎｄ １［消化）
を含み、レーンＷはＶｉ製ＥＢＶ ８９５−８Ｂａｍ
ＨＩ Ｗを含む。第５図は、３部ｍｆ−１ｆＷの３２
Ｐ−ラベル化８０３ｂｐＰｖｕＩＩサブフラグメントで
プローブした第４図のゲルのサザンプロットのオートラ
ジオグラフを示す。三つのクローン、ＣＬＡ、ＣＬＢ及
びＣＩｆ Ｃ並びにＢａｍＨＩ Ｗ自身に、ポジティ
ブハイブリダイゼーションが？６！察された。
を含み、レーンＷはＶｉ製ＥＢＶ ８９５−８Ｂａｍ
ＨＩ Ｗを含む。第５図は、３部ｍｆ−１ｆＷの３２
Ｐ−ラベル化８０３ｂｐＰｖｕＩＩサブフラグメントで
プローブした第４図のゲルのサザンプロットのオートラ
ジオグラフを示す。三つのクローン、ＣＬＡ、ＣＬＢ及
びＣＩｆ Ｃ並びにＢａｍＨＩ Ｗ自身に、ポジティ
ブハイブリダイゼーションが？６！察された。
実施例３
ＢａｍＨＩ Ｗ抗 現フラ メントのＤＮＡ配列分
析 ρ０ＲＦ１への挿入体をＢａｍＨＩフラグメントドしテ
ヘクターＭ１３ｍｐｌＯ（＾ｍｅｒｓｈａｍ ）にザブ
クローン化し、ジデオキシ法によって配列分析を行なっ
た。ＤＮＡ配列データを、Ｈｉｃｒｏｇｅｎｉｅ（トレ
ードマーク）ソフトウェアパッケージ及びＧｃｎｂａｎ
ｋ （トレード７−り）データベースを用いて分析し
た。これらのデータから１ｇられる配列を公知のＥＢＶ
８９５−８配列［Ｂａｅｒ ａｔ ａｔ（１９８４
） ５ｕｐｒａ ］と比較’Ｊ ルコ（！： ニヨッテ
、ＢａｍＨＩ Ｗにおけるそれらの配列の正確な位置
を決定した。すべての配列は、発現ベクター中での翻訳
方向と同じ方向を為するオーブンリーディングフレーム
の１部であった。しかしながら、１つのコピー上で一緒
にアラインメントを行なった所、これらの配列は、１３
ｂｌ）のｆｆｌ複ＤＮＡを含むフラグメントを２個有す
る３つの異なるオーブンリーディングフレームの１部で
あることが判った（第６図）。これらの領域からすでに
同定されているＤＮＡ配列の位置及び特徴付けが行なわ
れているＣＤＮＡ ［Ｂｏｄｅｓｃｏｔ、 Ｈ，ｅｔ
ａｌ、、 （１９８４）ｓｕｐｒａ ；８ｏｄｅｓｃｏ
ｔ、 Ｈ，ａｔ ａｔ、 （１９８６）ｓｕｐｒａ
；５ｐｅｃｋ、 Ｓ、 ａｔ ａｌ、、 （１９３６
） ５ｕｐｒａ ；Ｓａｍｐｌｅ Ｊ、ｅｔ ａｌ、
、 （１９８６） ３０１１ｒａ ］並びに抗原をコ
ードする配列は第６図に示されている。
析 ρ０ＲＦ１への挿入体をＢａｍＨＩフラグメントドしテ
ヘクターＭ１３ｍｐｌＯ（＾ｍｅｒｓｈａｍ ）にザブ
クローン化し、ジデオキシ法によって配列分析を行なっ
た。ＤＮＡ配列データを、Ｈｉｃｒｏｇｅｎｉｅ（トレ
ードマーク）ソフトウェアパッケージ及びＧｃｎｂａｎ
ｋ （トレード７−り）データベースを用いて分析し
た。これらのデータから１ｇられる配列を公知のＥＢＶ
８９５−８配列［Ｂａｅｒ ａｔ ａｔ（１９８４
） ５ｕｐｒａ ］と比較’Ｊ ルコ（！： ニヨッテ
、ＢａｍＨＩ Ｗにおけるそれらの配列の正確な位置
を決定した。すべての配列は、発現ベクター中での翻訳
方向と同じ方向を為するオーブンリーディングフレーム
の１部であった。しかしながら、１つのコピー上で一緒
にアラインメントを行なった所、これらの配列は、１３
ｂｌ）のｆｆｌ複ＤＮＡを含むフラグメントを２個有す
る３つの異なるオーブンリーディングフレームの１部で
あることが判った（第６図）。これらの領域からすでに
同定されているＤＮＡ配列の位置及び特徴付けが行なわ
れているＣＤＮＡ ［Ｂｏｄｅｓｃｏｔ、 Ｈ，ｅｔ
ａｌ、、 （１９８４）ｓｕｐｒａ ；８ｏｄｅｓｃｏ
ｔ、 Ｈ，ａｔ ａｔ、 （１９８６）ｓｕｐｒａ
；５ｐｅｃｋ、 Ｓ、 ａｔ ａｌ、、 （１９３６
） ５ｕｐｒａ ；Ｓａｍｐｌｅ Ｊ、ｅｔ ａｌ、
、 （１９８６） ３０１１ｒａ ］並びに抗原をコ
ードする配列は第６図に示されている。
そして注目ずべきことは、本発明によって明らかにされ
たＤＮＡ配列は、これらの遺伝子の１部として知られて
いなかったことである。
たＤＮＡ配列は、これらの遺伝子の１部として知られて
いなかったことである。
第６図に示すように、第１、第２及び第３フレームは、
第１図のスタンダードマツプで左から右へ示した３つの
可能なリーディングフレームを表わしている。薄い垂直
な線は終止コドンの位置を示している。前記したように
、薄い黒い水平の線は公知の配列を示している。これら
には、本発明によるＤＮＡ配列（八）−（Ｄ）が含まれ
ており、また抗原を有する他の配列［Ｄｉｌｌｎｅｒ、
Ｊ、、ｅｔ ａｌ、。
第１図のスタンダードマツプで左から右へ示した３つの
可能なリーディングフレームを表わしている。薄い垂直
な線は終止コドンの位置を示している。前記したように
、薄い黒い水平の線は公知の配列を示している。これら
には、本発明によるＤＮＡ配列（八）−（Ｄ）が含まれ
ており、また抗原を有する他の配列［Ｄｉｌｌｎｅｒ、
Ｊ、、ｅｔ ａｌ、。
１ ９ ８ ６ ）Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａ
ｃａｄ、 Ｓｃｉ、、 ｔｌ、 Ｓ、 八、。
ｃａｄ、 Ｓｃｉ、、 ｔｌ、 Ｓ、 八、。
（８３，６６４１−６６４５１も含まれている。
白い水平のバーで表わされる配列は抗原をコードしない
ものと推定されているものである［Ｄｉｌｌｎｅｒ、
Ｊ、 ａｔ ａｔ、、 （１９８５） Ｅ〜１８０Ｊ
、、４．１８１３−１８１８ ： Ｄｉｌｌｎｅｒ、
Ｊ、、ｅｔａｌ、＋ （１９８６） ５ＵＤｒａ ］
。Ｗ１とＷ２はｃＤＮΔのラージファミリーに存在す
るエクソンを示す［Ｂｏｄｃｓｃｏｔ、 Ｈ，、ａｔ
ａｌ、、 （１９８４）Ｓｔｌｌ）ｒａ ： ３ｐｅ
ｃｌｔ、 ｓ、 とＳｔｒｏｎｉｎｇｅｒ Ｊ、
（１９８５）ｓｕｐｒａ ； Ｓａｍｐｌｅ Ｊ、、
ｅｔ ａｌ、、 （１９８６） ５ｕｐｒａｌ。
ものと推定されているものである［Ｄｉｌｌｎｅｒ、
Ｊ、 ａｔ ａｔ、、 （１９８５） Ｅ〜１８０Ｊ
、、４．１８１３−１８１８ ： Ｄｉｌｌｎｅｒ、
Ｊ、、ｅｔａｌ、＋ （１９８６） ５ＵＤｒａ ］
。Ｗ１とＷ２はｃＤＮΔのラージファミリーに存在す
るエクソンを示す［Ｂｏｄｃｓｃｏｔ、 Ｈ，、ａｔ
ａｌ、、 （１９８４）Ｓｔｌｌ）ｒａ ： ３ｐｅ
ｃｌｔ、 ｓ、 とＳｔｒｏｎｉｎｇｅｒ Ｊ、
（１９８５）ｓｕｐｒａ ； Ｓａｍｐｌｅ Ｊ、、
ｅｔ ａｌ、、 （１９８６） ５ｕｐｒａｌ。
第６図のベースラインは、実施例２でクローンＣＬＡ−
ＣＬＤのプローブとして用いたＢａｍＨＩ Ｗの８０
３ ｂＤサブフラグメント（」蕩基数２２６９−３０７
２）を作成するのに使用したｐｖｕ［部位の位置を示す
。このプローブは、前記したエクソンＷ１とＷ２の配列
を含まないものである。
ＣＬＤのプローブとして用いたＢａｍＨＩ Ｗの８０
３ ｂＤサブフラグメント（」蕩基数２２６９−３０７
２）を作成するのに使用したｐｖｕ［部位の位置を示す
。このプローブは、前記したエクソンＷ１とＷ２の配列
を含まないものである。
上記実施例で用いた方法は、Ｅ Ｍ Ｂ ＯＪｏｕｒｎ
ａ７．４、ｐ１１１１９１−１１９６ （１９８８）に
記載されている。
ａ７．４、ｐ１１１１９１−１１９６ （１９８８）に
記載されている。
本発明に関連して、３部ｍＨＩ Ｗ反復領域のＥＢＶ
ＯＲＦ、及びｉｎ ｖｉｖｏ Ｆ抗原性ヘフチト／
蛋白質をコードするＥＢＶの領域を同定することを発明
明賃は試みた。このアプローチは、全ＥＢＶ ＤＮＡ
のランダムフラグメントを用いてこれを発現ベクターに
サブクローンし、得られるシーンバンクをＥＢＶイムノ
ポジティブ患者の血清でスクリーニングするものであり
、他の分析法とは、明らかに異なるものである。ＥＢＶ
遺仏ｆ発現についてのほとんどの研究は、セルカルチャ
ーでのウィルスの増殖及び維持に基づくものであるが、
本発明で用いた実験デザインはＩｎ ＶＩＶＯでの状態
を反映したものである。免疫学的検出法及び核酸ハイブ
リダイゼーションを組合わせて用いて、ｉｎ ｖｉｖｏ
で発現され抗原性を示すと考えられる７個のＤＮＡフラ
グメントを単離した。更に他のＤＮＡフラグメントも同
様に単爺した。ここで同定した７個のＥＢＶ抗原は、Ｅ
ＢＶｖＬ原として既に報告されている蛋白質の１部では
なく、またサンプル中のＥＢＶに対する抗体の存在を診
断するのに使用できるものである。これらの抗原の存在
、レベル及びクラスとＥＢＶによる病理との関係を明ら
かにするには、詳細な臨床研究が必殻である。
ＯＲＦ、及びｉｎ ｖｉｖｏ Ｆ抗原性ヘフチト／
蛋白質をコードするＥＢＶの領域を同定することを発明
明賃は試みた。このアプローチは、全ＥＢＶ ＤＮＡ
のランダムフラグメントを用いてこれを発現ベクターに
サブクローンし、得られるシーンバンクをＥＢＶイムノ
ポジティブ患者の血清でスクリーニングするものであり
、他の分析法とは、明らかに異なるものである。ＥＢＶ
遺仏ｆ発現についてのほとんどの研究は、セルカルチャ
ーでのウィルスの増殖及び維持に基づくものであるが、
本発明で用いた実験デザインはＩｎ ＶＩＶＯでの状態
を反映したものである。免疫学的検出法及び核酸ハイブ
リダイゼーションを組合わせて用いて、ｉｎ ｖｉｖｏ
で発現され抗原性を示すと考えられる７個のＤＮＡフラ
グメントを単離した。更に他のＤＮＡフラグメントも同
様に単爺した。ここで同定した７個のＥＢＶ抗原は、Ｅ
ＢＶｖＬ原として既に報告されている蛋白質の１部では
なく、またサンプル中のＥＢＶに対する抗体の存在を診
断するのに使用できるものである。これらの抗原の存在
、レベル及びクラスとＥＢＶによる病理との関係を明ら
かにするには、詳細な臨床研究が必殻である。
第６図に示すように、ＥＢＶ Ｂ９５−８の大きな内
部反復配列は、ウィルスにおいて約１１回繰返されてお
り、その結果、上記で示した配列（Ａ）−（Ｄ）のいず
れをもそれと同定するのが不可能である。しかしながら
、ＣＬＢとＣＬＤの終止コドンが有効に作用するとすれ
ば、ＣＬＡからＯＬＤのすべてから得られるフラグメン
トは異なるＯＲＦの１部である。３個の異なるリーディ
ングフレームが使用されている。、ＥＢＶ領域でのスプ
ライシングの今日の知識［Ｂｏｄｅｓｃｏｔ、 Ｈ，、
ｅｔａｌ、、（１９８４、１９８６）ｓｕｐｒａ ；
５ｐｅｃｋ、ＳとＳｔｒｏｍｉｎｇｅｒ Ｊ、、 ＜
１９８５ ） ５ＬＩＩ）ｒａ ： ５ｐｅｃｋ
ｅｔａｌ、 （１９８６）ｓｕｐｒａ ；Ｓａｍ
ｐｌｅ、Ｊ、ｅｔ ａ（１９８６） ５ｕｐｒａ ］
から判断ＬＴ、コレラツクローンのいくつかは同じ蛋白
質の異なる部分をコードしている可能性がある。
部反復配列は、ウィルスにおいて約１１回繰返されてお
り、その結果、上記で示した配列（Ａ）−（Ｄ）のいず
れをもそれと同定するのが不可能である。しかしながら
、ＣＬＢとＣＬＤの終止コドンが有効に作用するとすれ
ば、ＣＬＡからＯＬＤのすべてから得られるフラグメン
トは異なるＯＲＦの１部である。３個の異なるリーディ
ングフレームが使用されている。、ＥＢＶ領域でのスプ
ライシングの今日の知識［Ｂｏｄｅｓｃｏｔ、 Ｈ，、
ｅｔａｌ、、（１９８４、１９８６）ｓｕｐｒａ ；
５ｐｅｃｋ、ＳとＳｔｒｏｍｉｎｇｅｒ Ｊ、、 ＜
１９８５ ） ５ＬＩＩ）ｒａ ： ５ｐｅｃｋ
ｅｔａｌ、 （１９８６）ｓｕｐｒａ ；Ｓａｍ
ｐｌｅ、Ｊ、ｅｔ ａ（１９８６） ５ｕｐｒａ ］
から判断ＬＴ、コレラツクローンのいくつかは同じ蛋白
質の異なる部分をコードしている可能性がある。
クローンＣＬＢとＣＬＣの２つは、重寓配配を有してい
る。これらは異なるＯＲＦにあるので、異なる蛋白質の
１部を発現しているものと考えられる。このことは、同
じ配列は箕なるスプライシングパターンから恐らく生じ
る１１′４なるエクソンの１部であることを示している
。ＥＢＶ蛋白質によってエクソンがこのように共有され
ていることは、ＥＢＮＡ蛋白質のいくつかについて既に
報告されている（ Ｂｏｄｅｓｃｏｔ、 Ｈ，ｅｔ ａ
ｌ、、 （１９８４）ｓｕｐｒａ ］。本発明により、
これはこのような系に共通に生じるものと考えられる。
る。これらは異なるＯＲＦにあるので、異なる蛋白質の
１部を発現しているものと考えられる。このことは、同
じ配列は箕なるスプライシングパターンから恐らく生じ
る１１′４なるエクソンの１部であることを示している
。ＥＢＶ蛋白質によってエクソンがこのように共有され
ていることは、ＥＢＮＡ蛋白質のいくつかについて既に
報告されている（ Ｂｏｄｅｓｃｏｔ、 Ｈ，ｅｔ ａ
ｌ、、 （１９８４）ｓｕｐｒａ ］。本発明により、
これはこのような系に共通に生じるものと考えられる。
反復領域は全てが同様にスプライスされるものではなく
、このように反復領域には特有の多様性が存在すること
を考慮に入れてこの事実を考える時、ＯＲＦは実際に発
現される場合もあり、時々発現される場合もあり、また
決して発現されない場合もあると言える。
、このように反復領域には特有の多様性が存在すること
を考慮に入れてこの事実を考える時、ＯＲＦは実際に発
現される場合もあり、時々発現される場合もあり、また
決して発現されない場合もあると言える。
前記した実験デザインからして、ＣＬＢの１部の蛋白質
があるグループの細胞あるいは組織で発現され、ＣＬＣ
を含む蛋白質が他のグループの細胞あるいは組織で発現
される可能性がある。両者が抗原性を示す場合には、本
発明で使用した血清は両者に対する抗体を有することに
なる。プールした血清ではなく個々の面Ｆｆｉを用いて
コロニーのＥＢＶ抗原の免疫学的検出を行なった所、ク
ローンＣＬＡ−ＣＬＦについて（Ｊられた結果には検出
可能なほどの相違は見られず、いくらかの変動はＣＬＧ
について観察された（第７図）。しかしながら、ウィル
スの他の領域を用いたＥＢＶ抗原発現クローンでの結合
レベルはかなり変動していた（結果は示されず）。
があるグループの細胞あるいは組織で発現され、ＣＬＣ
を含む蛋白質が他のグループの細胞あるいは組織で発現
される可能性がある。両者が抗原性を示す場合には、本
発明で使用した血清は両者に対する抗体を有することに
なる。プールした血清ではなく個々の面Ｆｆｉを用いて
コロニーのＥＢＶ抗原の免疫学的検出を行なった所、ク
ローンＣＬＡ−ＣＬＦについて（Ｊられた結果には検出
可能なほどの相違は見られず、いくらかの変動はＣＬＧ
について観察された（第７図）。しかしながら、ウィル
スの他の領域を用いたＥＢＶ抗原発現クローンでの結合
レベルはかなり変動していた（結果は示されず）。
上記の実験から、伝染性単核症ではＥＢＶによってＤＮ
Ａ配列（Ａ）−（Ｇ）が発現されていることが示される
。ＥＢＶを保持したセルラインＢ９５８、Ｒａｊｉ及び
Ｎａｍａｌｗａから調製したＲＮＡのノーザンプロット
分析では、ラージ内部反復配列のＰＶｕｌＩ−Ｂａｍ）
ＩＩサブフラグメントあるいはＣＬＦで見られる配列と
相同性を示す転写体は検出できなかった。また、ＥＢＶ
［３９５−８セルラインのポリアデニル化細胞貿Ｒ
ＮＡから調製したＣＤＮＡバンクからは、この領域の配
列を含むクローンは単離されなかった。このＥＢＶＢ９
５−８セルラインはＨ，Ｐｅｒｒｉｃａｖｄｅｔから入
手したものである［ Ｂｏｄｅｓｃｏｔ ｅｔ ａｌ、
、 （１９８４，１９８６） ５ｕｐｒａ ］。これら
の結果を全て考え合わせると、本発明のウィルス配グＩ
ＣＬ−Ａ−ＣＬ、ｌ）及びＣＬＦは１つのグループの細
胞又は組織で発現され、ＥＢＶの発現を調節する同様の
一連の因子をセルカルチャーは持っていないことが判る
。、あるいはまた、本発明の配列を発現するＥＢＶ株は
血清源として対栄となった人々に広く存在していること
を示しテイル。ＥＢＶ Ｂ９５−８ＤＮＡを保持して
いるセルラインのｍＲＮ△を用いた同様の実験では、Ｃ
ＬＥとＣＬＧの両とが対応するｃＤＮＡ配列をポジティ
ブに同定した。
Ａ配列（Ａ）−（Ｇ）が発現されていることが示される
。ＥＢＶを保持したセルラインＢ９５８、Ｒａｊｉ及び
Ｎａｍａｌｗａから調製したＲＮＡのノーザンプロット
分析では、ラージ内部反復配列のＰＶｕｌＩ−Ｂａｍ）
ＩＩサブフラグメントあるいはＣＬＦで見られる配列と
相同性を示す転写体は検出できなかった。また、ＥＢＶ
［３９５−８セルラインのポリアデニル化細胞貿Ｒ
ＮＡから調製したＣＤＮＡバンクからは、この領域の配
列を含むクローンは単離されなかった。このＥＢＶＢ９
５−８セルラインはＨ，Ｐｅｒｒｉｃａｖｄｅｔから入
手したものである［ Ｂｏｄｅｓｃｏｔ ｅｔ ａｌ、
、 （１９８４，１９８６） ５ｕｐｒａ ］。これら
の結果を全て考え合わせると、本発明のウィルス配グＩ
ＣＬ−Ａ−ＣＬ、ｌ）及びＣＬＦは１つのグループの細
胞又は組織で発現され、ＥＢＶの発現を調節する同様の
一連の因子をセルカルチャーは持っていないことが判る
。、あるいはまた、本発明の配列を発現するＥＢＶ株は
血清源として対栄となった人々に広く存在していること
を示しテイル。ＥＢＶ Ｂ９５−８ＤＮＡを保持して
いるセルラインのｍＲＮ△を用いた同様の実験では、Ｃ
ＬＥとＣＬＧの両とが対応するｃＤＮＡ配列をポジティ
ブに同定した。
上記したように、本発明に従って、Ｅ、 ｃｏｌｉ発現
ベクターを用いてラージＥＢＶ Ｂ９５−８ゲノムＤ
ＮＡバンクを調製し、ヒトＩＡ患壱から得た血清プール
でスクリーニングした。かくしてｖｌられるイムノポジ
ティブクローンを、Ｗ領域用プローブでスクリーニング
した。ウィルスラージ内部反復配列の配列も含むイムノ
ポジティブクローン４個、及びＥＢＶの他の領域から調
製したイムノポジティブクローン３個を選択した。
ベクターを用いてラージＥＢＶ Ｂ９５−８ゲノムＤ
ＮＡバンクを調製し、ヒトＩＡ患壱から得た血清プール
でスクリーニングした。かくしてｖｌられるイムノポジ
ティブクローンを、Ｗ領域用プローブでスクリーニング
した。ウィルスラージ内部反復配列の配列も含むイムノ
ポジティブクローン４個、及びＥＢＶの他の領域から調
製したイムノポジティブクローン３個を選択した。
ＢａｍＨＩ Ｗオーブンリーディングフレーム（ＯＲ
Ｆ＞の免疫学的に検出される生成物をコードする上記４
個のクローンについてＤＮＡ配列を分析した所、それら
をコードするＤＮＡ配列は反復配列上にあり、それらは
３つのオーブンリーディングフレームに由来しており、
そしてそれらのうちの２つは１γｉ記したように・ト複
したリーディングフレームから構成されていることが判
った。このことは、イントロン／エクソンスプライシン
グが生じていることを示しており、あるいはまた、反復
配列自体がいくつかの異なる蛋白質をコードしているこ
とを示している。７個の発現エピトープが、それぞれ独
立の伝染性単核症において同時に存在していることが示
された。これらの（ＣＬＡ−ＣＬＤ及びＣＬＦ）エピト
ープの多くは、これまで報告されておらず、また本発明
で用いた如き実験に基いたものではない。本発明の実験
はｉｎ ｖｉｖｏでの状態を反映したものである。
Ｆ＞の免疫学的に検出される生成物をコードする上記４
個のクローンについてＤＮＡ配列を分析した所、それら
をコードするＤＮＡ配列は反復配列上にあり、それらは
３つのオーブンリーディングフレームに由来しており、
そしてそれらのうちの２つは１γｉ記したように・ト複
したリーディングフレームから構成されていることが判
った。このことは、イントロン／エクソンスプライシン
グが生じていることを示しており、あるいはまた、反復
配列自体がいくつかの異なる蛋白質をコードしているこ
とを示している。７個の発現エピトープが、それぞれ独
立の伝染性単核症において同時に存在していることが示
された。これらの（ＣＬＡ−ＣＬＤ及びＣＬＦ）エピト
ープの多くは、これまで報告されておらず、また本発明
で用いた如き実験に基いたものではない。本発明の実験
はｉｎ ｖｉｖｏでの状態を反映したものである。
本発明により調製されるＤＮＡ配列（Ａ）−（Ｇ）はい
ずれも、既に報告されているＥ Ｂ Ｎ’Ａ蛋白質の１
部をコードするものではなく、ＣＬＡ−ＣＬＤは、内部
反復領域の主要部にわたるスプライスされた転写体に対
応するこれまでに報告されているＣＤＮＡのいずれにも
存在しない。８９５−８ＲＮΔから調製されたＣＤＮＡ
バンクではそれらが検出されなかったことは、それらは
ヒトの体内でｉｎ ｖｉｖｏで発現されるものであって
、セルカルチャーでの条件下では発現されないことを示
している。
ずれも、既に報告されているＥ Ｂ Ｎ’Ａ蛋白質の１
部をコードするものではなく、ＣＬＡ−ＣＬＤは、内部
反復領域の主要部にわたるスプライスされた転写体に対
応するこれまでに報告されているＣＤＮＡのいずれにも
存在しない。８９５−８ＲＮΔから調製されたＣＤＮＡ
バンクではそれらが検出されなかったことは、それらは
ヒトの体内でｉｎ ｖｉｖｏで発現されるものであって
、セルカルチャーでの条件下では発現されないことを示
している。
第１図（７）Ａは、Ｅ Ｂ Ｖ Ｂ ９５−８ ’７
’ ／ ムラ直線的に示す。 第１図のＢは、ＥＢＶ Ｂ９５−８ウイルスゲノムの
１３ａｍｌ−Ｎ制限酵素地図を直線的に示す。 第２図は、クローン化ＥＢＶ ＤＮＡフラグメン１−
を含む発現ベクターｐＯＲＦｌを示す。 第３図は、ＥＢＶ Ｂ９５−８ゲノムバンクのスクリ
ーニングによって単離されるイムノポジティブクローン
を示す写真である。 第４図は、イムノポジティブクローンからｊ９られるプ
ラスミドＤＮＡを示す写真である。 第５図は、第４図のプラスミドＤＮＡのサザンプロット
分析の結果を示す写真である。 第６図は、ＥＢＶ Ｂ９５＝８ １３ａｍｌ−１１Ｗ
フラグメントのシングルコピーを示す。 第７図Ｇ、ｔ、Ｅ Ｂ Ｖ Ｂ ９５ ８ ’ｙ’
／ ムラＬＷ ＦＪ 的にボす。
’ ／ ムラ直線的に示す。 第１図のＢは、ＥＢＶ Ｂ９５−８ウイルスゲノムの
１３ａｍｌ−Ｎ制限酵素地図を直線的に示す。 第２図は、クローン化ＥＢＶ ＤＮＡフラグメン１−
を含む発現ベクターｐＯＲＦｌを示す。 第３図は、ＥＢＶ Ｂ９５−８ゲノムバンクのスクリ
ーニングによって単離されるイムノポジティブクローン
を示す写真である。 第４図は、イムノポジティブクローンからｊ９られるプ
ラスミドＤＮＡを示す写真である。 第５図は、第４図のプラスミドＤＮＡのサザンプロット
分析の結果を示す写真である。 第６図は、ＥＢＶ Ｂ９５＝８ １３ａｍｌ−１１Ｗ
フラグメントのシングルコピーを示す。 第７図Ｇ、ｔ、Ｅ Ｂ Ｖ Ｂ ９５ ８ ’ｙ’
／ ムラＬＷ ＦＪ 的にボす。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）ｉｎ ｖｉｖｏで発現される病原生物の抗原の全
てを同定する方法であつて、病原生物の全ての核酸を含
む核酸フラグメントを用いて遺伝子バンクを作成し、次
いで該病原生物によつて引き起こされた臨床症状を有す
る対象から得た血清を用いて該遺伝子バンクを直接スク
リーニングすることからなる上記方法。 （２）ｉｎ ｖｉｖｏで発現される抗原をコードする核
酸を得る方法であつて、該抗原をコードする配列を含む
病原生物の全核酸を核酸フラグメントに変換し、該核酸
フラグメントを発現ベクターに移し、真核もしくは原核
宿主生物を該発現ベクターで形質転換し、次いで該宿主
生物のコロニーを該病原生物によつて引き起こされた臨
床症状を有する対象から得た血清でスクリーニングする
ことからなる上記方法。 （３）核酸サンプルにおいて反復して存在する領域を同
定する方法であつて、生物の核酸の全てを含む核酸フラ
グメントを用いて遺伝子バンクを作成し、該遺伝子バン
クを相同性核酸のプローブでスクリーニングし、次いで
反復核酸領域の存在を示す強くハイブリダイズするコロ
ニーを同定することからなる上記方法。 （４）ｉｎ ｖｉｖｏで発現するＥＢＶ抗原をコードす
るＤＮＡを得る方法であつて、ＥＢＶ ＤＮＡをフラグ
メントに変換し該フラグメントを発現ベクター中にクロ
ーニングし、該発現ベクターで微生物を形質転換し、Ｅ
ＢＶで感染していることが知られているヒトの血清で該
微生物のコロニーをスクリーニングし、次いでイムノポ
ジテイブクローンを単離することからなる上記方法。 （５）以下に示す配列から選ばれるｉｎ ｖｉｖｏＥＢ
Ｖ抗原をコードするＤＮＡ配列：（Ａ）【遺伝子配列が
あります】 （Ｂ）【遺伝子配列があります】 （Ｃ）【遺伝子配列があります】 （Ｄ）【遺伝子配列があります】 （Ｆ）【遺伝子配列があります】 （Ｇ）【遺伝子配列があります】 （６）請求項５記載のＤＮＡ配列を含む、ＤＮＡ発現ベ
クター又は発現可能性を有するＤＮＡトランスフアーベ
クター。 （７）マーカー遺伝子に融合した請求項５記載のＤＮＡ
配列。 （８）請求項６記載のベクターを保持する微生物。 （９）請求項５記載のＤＮＡ配列によつてコードされる
抗原性ＥＢＶペプチドもしくは蛋白質。 （１０）以下のアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列
を含む、請求項９記載の抗原性ＥＢＶペプチドもしくは
蛋白質： （１）【遺伝子配列があります】 （２）【遺伝子配列があります】 （３）【遺伝子配列があります】 （４）【遺伝子配列があります】 （５）【遺伝子配列があります】 （６）【遺伝子配列があります】 （７）【遺伝子配列があります】 （１１）請求項９又は１０記載の抗原性ＥＢＶペプチド
もしくは蛋白質を含むワクチン。（１２）請求項９又は
１０記載のＥＢＶペプチドもしくは蛋白質抗原に対して
特異的な抗体調製物。 （１３）ＥＢＶの検出及び測定法であつて、ＥＢＶに対
する抗体を含むことが知られている又は疑われる血清を
、請求項９又は１０記載のＥＢＶペプチドもしくは蛋白
質抗原と接触せしめ、ＥＢＶ抗原とＦＢＶに対する抗体
とで免疫化学的反応を起こさせ、次いでそれ自体公知の
方法でＥＢＶに対する抗体の存在量を測定することから
なる上記方法。 （１４）ＥＢＶに対する抗体の検出及び測定用イムノア
ツセイ法であつて、 （ａ）ＥＢＶに対する抗体を含む又は含むことが疑われ
る体液サンプルを、請求項９又は１０記載のＥＢＶ抗原
の不溶化型に加え、 （ｂ）免疫化学的反応を起こさせ；次いで （ｃ）ラベル化剤に共有結合した抗ＥＢＶ抗体からなる
ラベル化抗体の一定量を加えて、サンプル中に存在する
ＥＢＶ抗体の量の指標である反応メデイウムの活性を測
定する； ことからなる上記方法。 （１５）ＥＢＶに対する抗体の検出及び測定用イムノア
ツセイ法であつて、 （ａ＾＊）ＥＢＶに対する抗体を含む又は含むことが疑
われる体液サンプルを、請求項９又は１０記載のＥＢＶ
抗原の不溶化型に加え、 （ｂ＾＊）免疫化学的反応を起こさせ；次いで （ｃ＾＊）反応メデイウムに、不溶化型ＥＢＶ抗原に結
合したＥＢＶに対する抗体に結合する抗ヒトイムノグロ
ブリン抗体の一定量を加えて、結合抗ヒトイムノグロブ
リン抗体の量を測定し、それによつて結合ＥＢＶ抗体の
量を測定する； ことからなる上記方法。 （１６）ＥＢＶ抗体の検出及び測定用イムノアツセイ法
であつて、 （ａ′）ＥＢＶ抗体を含む又は含むことが疑われる体液
サンプルを、蛋白質吸着物質の表面に加え； （ｂ′）ある量のＥＢＶ抗原を加えて免疫化学的反応を
起こさせ；次いで （ｃ′）ラベル化ＥＢＶ抗体の一定量を加えて、結合Ｅ
ＢＶ抗体の指標であるラベル活性を測定する； ことからなる上記方法。 （１７）ＥＢＶ抗原の代わりに、レポーターエレメント
に融合したＥＢＶ抗原のある量を加えて、ＥＢＶ抗体の
量をそれ自体公知の方法で測定する請求項１６記載の方
法。 （１８）ＥＢＶに対するＩｇＭ抗体の検出及び測定用イ
ムノアツセイ法であつて、 （ａ″）ＥＢＶに対するＩｇＭ抗体を含む又は含むこと
が疑われる体液サンプルを、抗ヒトＩｇＭ抗体の不溶化
型に加え； （ｂ″）免疫化学的反応を起こさせ：次いで （ｃ″）レポーターエレメントに融合した ＥＢＶ抗原のある量を加えて、更に免疫化学的反応を起
こさせる； ことからなる上記方法。 （１９）ＥＢＶに対する抗体の検出及び測定用イムノア
ツセイ法であつて、 （ａ′″）β−ガラクトシダーゼに融合したＥＢＶ抗原
のある量を、抗β−ガラクトシダーゼ抗体の不溶化型に
加えて、免疫化学的反応を起こさせ； （ｂ′″）ＥＢＶに対する抗体を含む又は含むことが疑
われる体液サンプルを加えて、免疫化学的反応を起こさ
せ；次いで （ｃ′″）抗ヒトイムノグロブリン抗体の一定量を加え
て、免疫化学的反応を起こさせ、結合抗ヒトイムノグロ
ブリン抗体の量を測定することによつてＥＢＶに対する
抗体の吊を測定する； ことからなる上記方法。 （２０）ラベル化ＥＢＶ抗体とともに体液サンプルを加
えて競合結合イムノアツセイを行なつてＥＢＶ抗体の量
を測定する工程を、工程（ｂ′″）及び（ｃ′″）に代
わつて行なう請求項１９記載の方法。 （２１）体液中のＥＢＶ抗体の検出及び測定用テストパ
ックであつて、 （ａａ）請求項９又は１０記載の不溶化型ＥＢＶ抗原の
一定量；及び （ｂｂ）酵素あるいは放射性ラベル化剤と抗ＢＶ抗体と
の結合生成物の対応量； を含む上記テストパック。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IE873041A IE873041L (en) | 1987-11-11 | 1987-11-11 | Viral antigens, diagnostic assay therefor and vaccines¹containing them |
| IE3041/87 | 1987-11-11 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH022399A true JPH022399A (ja) | 1990-01-08 |
Family
ID=11037551
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63284820A Pending JPH022399A (ja) | 1987-11-11 | 1988-11-10 | 抗原の同定法、そのアッセイ法及びそれを含むワクチン |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0316170A3 (ja) |
| JP (1) | JPH022399A (ja) |
| IE (1) | IE873041L (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JP2003043044A (ja) * | 2001-07-30 | 2003-02-13 | Denka Seiken Co Ltd | 抗体捕捉法による抗体の免疫学的測定方法 |
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| US7507804B2 (en) | 1992-03-13 | 2009-03-24 | Akzo Nobel, N.V. | Peptides and nucleic acid sequences related to the Epstein Barr Virus |
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| EP0173254B1 (en) * | 1984-08-23 | 1991-07-24 | Hans Joachim Wolf | Dna sequences of the ebv genome, recombinant dna molecules, processes for producing ebv-related antigens, diagnostic compositions and pharmaceutical compositions containing said antigens |
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1987
- 1987-11-11 IE IE873041A patent/IE873041L/xx unknown
-
1988
- 1988-11-10 JP JP63284820A patent/JPH022399A/ja active Pending
- 1988-11-10 EP EP19880310591 patent/EP0316170A3/en not_active Withdrawn
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0316170A2 (en) | 1989-05-17 |
| IE873041L (en) | 1989-05-11 |
| EP0316170A3 (en) | 1990-11-22 |
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