JPH022400A - 制限断片長多型性分析方法及びその装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、制限断片長子型性（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ
ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈ
ｉｓｍ　；　ＲＦ　Ｌ　Ｐ　）分析、ヌクレオチドラベ
ル化及び蛍光検出に係わる。

［従来の技術］ 植物改良に関してバイオテクノロジーが重大な影響を与
えた一つの分野は、個々の植物分離株及び品種の分化を
スクリーニングし同定する新規な方法の開発についての
ものである。植物品種改良法においてかかる目的及び他
の目的のためにＲＦ「Ｐを用いる方法はこれまでにも幾
つか発表されている（　ＨＯＩｅｎｔｊａｒｌＳ他、　
ＩａＭ　Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ、５：１０９−１１８　（１
９８５））。この方法はＲＦＬＰ遺伝子連鎖地図を作成
するのに使用された（　ｌ１ｅｌｅｎｔｊａｒｉｓ他、
Ｔｈｅｏｒ、Ａ　　１．Ｇｃｎｃｔ、　７２ニア６ｌ−
７６９（１９８６））　。また最内形質発現及び不連続
遺伝子効果（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅｇｅｎｅ　ｅｌ
ｅｃｔｓ　）に於ける個々の植物遺伝子の役ハ１を同定
し特徴付ける方法に上記手法を利用することも幾つか発
表されている（Ｎｅｉｎｈｕｉｓ他、虹迎−錐工猥９工
２７・７９７−８０３（１９８７）　）。

現在の典型的なＩりＦ　Ｌ　Ｐ法はサザンプロット法を
利用するものである（　５ｏｕｔｈｅｒｎ、［、Ｈ，Ｊ
、Ｈ。

団、９８：５０３−５１７（１９７５）　）。この方法
は一般的には、ＤＮＡ制限断片試料をアガロースゲル士
で分離し、該ゲル中で変性させ、膜（例えばナイロン）
へ移し、ラベル化プローブＤＮＡとハイブリダイズさせ
、洗浄して非結合プローブを除去し、そして最後に、例
えば、オートラジオグラフィによって評価するものであ
る。

［解決すぺさ課題］ ＤＮＡが結合した腹のＵＡ製及び通常多数回連続的に繰
返されることの多いラベル化プローブとのその後のハイ
ブリダイゼーションは、非常に時間を要するステップで
あり、従って経費がかかり労力を要する困難なものであ
り（ｑる。更に、各サザンプロット分析についてたった
一つの制限酵素断片長条型性クローンしか分析すること
ができず、通常放射活性標識及びオートラジオグラフィ
を使用するものである。従って、同じ型の遺伝子型情報
をより〒くより経済的に得ることができる技術が開発さ
れ、ＲＦＬＰ分析がより多数の試料に用いられるように
なれば、これらの問題はかなり解消され、ＲＦ　Ｌ　Ｐ
法が研究及び産業の両分野に於いて応用される機会をよ
り多く提供することができるようになるものと煮えられ
る。

１課題を解決するための手段］ 本発明の特徴の一つは、蛍光発光団をヌクレオチドラベ
ルとして使用することである。この蛍光発色団ラベルは
幾種類かの分析応用技術として、最も最近では自動ＤＮ
Ａシークエンサーで用いられている（　Ｃｏｎｎｃｌ　
ｌ他、１自ＩＪ　Ｄ　ＮΔ配列分析］、Ｂｏｏ−Ｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ　５：３４２−３４８（１９８７）＞　
、この方法に於いては、発色団の蛍光をレーザーを用い
て誘起するためにフェムトモル（１０−１５）からアナ
モル（１０１８＞の範囲という微量の検出が可能である
。

本発明２！ｉ等は、この技術を自動化し１７るＲ　Ｆ　
Ｌ−Ｐ分析操作に用い、従来のＲＦＬＰ法の持つ時間的
、労力的、及び経詩的欠点を除去することに成功した。

上記方法の一つの改良は、検出されるゲノム多型性のコ
ピー数を増循させることである。ＲＦＬＰプローブによ
って検出される被験植物ＤＮＡ領域に対応する該領域を
増強させることのできるプライマーが作成される。コピ
ー数を数オーダー増幅させることによって、単一塩基レ
ベルまでのＤＮＡ配列の分析が可能になる。

本発明方法では、従来のＲＦ　１．　Ｐ分析にお【）る
と同様にして、被験植物ＤＮＡを調製し、選択した制限
酵素で切断し、−本鎖ＤＮＡに変性ざぜる。

平均的１，０００ヌクレオヂド長を有する現存の多望性
プローブの各５゛及び３°末端の配列を決定する。

該プローブの各末端からの塩基対プライマー配列を従来
のＤＮＡ合成手法によって構築し、以下の延長ステップ
で用いる。発色団を選び、各塩基対プライマーに付着さ
せる。次いでこれらのプライマーを好ましくはシーヶ犬
−ゼ（５ｅｑｕｅｎａｓｃ　）である化学修飾されたフ
ァージＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（高度に連続移動的（Ｐ
ｒｏｃｅｓｓｉｖｅ）　テあって、３゛から５°へのエ
キソヌクレアーゼ活性はない）を用いて延長することに
よって減衰（、ｐａｕｓｅ　）部位に於ける終結又は二
次構造障害（ｉｍｐｅｄｉＩｌｌｅｎｔｓ　）によるバ
ックグランドが実質的になくなる結果をもたらす。

７ａｂＯｒ及びＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、　”ＤＮＡ　５
ｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ　ｗｉｔｈ　ａ　ｍｏ
ｄｉｆｉｅｄ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　Ｔ７ＤＮ
八　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、　　　　　Ｐｒｏｃ、　　
Ｎａ口、　＾ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、ｌｌ５Ａ８４　：４
７６７−４７７１　（１９８７）、参照。

こうして延長されたプライマーは、元の一本鎖制限切断
試験植物ゲツムＤＮΔと共に変性ゲル上で泳動させる。

ハイブリダイゼーションは、レーザー及び適当な検出器
を用いてゲルを観察することで決定する。サーザンプロ
ットは不要である。何故ならば、発色団は種々の異なる
放出光スペクトルを与えるような蛍光を発するため、様
々な発色団が付着した多数のＲドＬ１つプローブを同時
に単一ゲル上で泳動させ、同様に同時に検出することが
できるからである。

本発明方法は成る種の技術要素と結合されて自動ＲＦ　
Ｌ　１）分析系を構成する。例えば、広帯域レーザービ
ームで、モノクロメータ−を用いて選択した波長を利用
しつつ、」ンビュータ調節のスーｒツブモーターによっ
てその動きが調りされるゲルプレートを走査する。該ゲ
ルを通過する放出スペクトルを、受けた光をデジタル信
号に変換する高感度リニアフォトダイオードアレイ検出
器と結合させた放出スペクト（」グラフによって検出す
る。

このγジタル出力はデータ収集及び解析用コンピュータ
ーに転送される。このコンピューターからの出力はスペ
クトルデータ及びバンド同定等の如何なる数の型をとる
ことが可能で、チャートレコーダ、プリンタ又はコンピ
ュータースクリーン上にそのデータを表わづことができ
る。

本発明のＲＦＬＰ分析改良における一変形として単一塩
基レベルにおける配列変化を検出するためのアッセイ感
度を増加させる目的で、二重鎖被験植物ＤＮＡ／プライ
マーＤＮＡが増強＜　ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　＞され
る。この変形方法によれば単一塩基レベルにａ３ける多
ｙＷ性に阜づくサイズ変化の検出を可能にするのみなら
ず、ＲＦＬＰプローブに相補的なブライマ一対応するゲ
ノムＩ）　ＮΔ領領域配列決定をも可能にするものであ
る。本質的には、ＤＮＡ配向が逆である点を除いて前記
の場合と同様な方法でプライマーを選択し作成した。

前記の場合、プライマーは外側（ｏｕｔｗａｒｄ　）へ
の伸長、即ち、被験植物制限断片末端方向への伸長に用
いられる。この変形方法においては、プライマーは内側
（ｉｎｗａｒｄ）へ配向し、ＤＮＡポリメラーゼによる
伸長はプライマー間の領域において生起する。被験植物
ＤＮＡとハイブリダイズした伸長プライマーのコピー数
は数オーダーまで増幅される。増強によって使用ラベル
の信号強度が単に増大されるだけでなく、配列決定に用
いられるＤＮＡｆｎの増加がもたらされる。こうした増
強操作を可能にするプライマーを用いることによって、
幾つかの又は単一・の塩基のＲＦ　Ｌ　Ｐの検出及びＲ
ＦＬＰの実際の配列検出のための操作が可能になる。こ
のような検出法は自動分析を容易にもすることができる
。

Δ、瓜１巳上Ｊヨ久貫 ＲＦＬＰは制限エンドヌクレアーゼ消化ＤＮＡの断片長
に於ける遺伝子型間に観察される差異である。ＲＦＬＰ
は染色体位置の側面に位置する制限酵素認識部位に於け
る塩基対又は位置の変化の結果発生するもので、該染色
体断片部分と相同な配列を含むラベル化ＤＮＡプローブ
とのハイブリダイぜ一ジョンによって検出し得るもので
ある。

非圧ｍ　（ｕｎｉｑｕｅ）クローン化配列とのハイブリ
ダイゼーシヨンによって特異的染色体領域（遺伝子座）
の同定が可能となる。

この方法は、ＤＮＡ配列レベルに於ける個体間の差異を
検出するためにクローン化ＤＮＡ断片を用いるものであ
るａ’ｌｌ伝的に区別される二つの個体からのゲノムＤ
ＮＡを制限酵素で消化し、電気泳動にかけ、ラベル化Ｄ
ＮＡクローンでプローブ化りると、個体間の配列の差異
に帰因するところのハイブリダイゼーションパターンに
於ける多型性が見られることがある。ｒ　ＲＦ　Ｌ　Ｐ
　Ｊという用語はこの変異を記述するための用語である
。

例えばアガロースゲル電気泳動によって解明される断片
長における差異はそのＲＦＬＰの対立因子（ａｌｌｅｌ
ｅｓ　）として機能する。つまり、ＲＦＬＰは従来の多
型性又はアイソザイムマーカーと類似の様式で遺伝マー
カーとして用いることができる。しかしながら他の多く
の遺伝マーカーと異なり、ＲＦＬＰは転写及び翻訳産物
ではない。更に、ＲＦＬＰには従来使用されてきた遺伝
マーカーに較べて成る種の付加的利点がみられる。第一
にＲＦＬＰは遺伝的に区別される個体間の現存する差異
を反映するものだという点である。従って、全ての実用
目的を達成するためのＲＦ　Ｌ　Ｐの可能な数は無限で
あり、いずれかの高等真核生物のゲノムＤＮΔを６塩素
認識酵素で消化した場合でも百万個以上の断片が生じ、
その多くは多型性であり得る。更には、現在１００種以
上のｒｔｌ、なる制限酵素が得られており、その各々は
新規で互いに異なっている断片セットを生成することの
できるものである。アイソザイムマーカー又は多型性マ
ーカーを研究上利用するにあたっては、遺伝子座の不充
分な利用可能性又は染色体上の不充分な分布によって、
又は対象となるライン系の情報の欠如によってしばしば
制限を受けることがある。

従来の表現型又はアイソザイムマーカーシステムと比較
しての本発明のＲＦＬＰの右する多数の潜在性用途及び
理論的利点がこれまでにも記載されている（　Ｈｅ１ｅ
ｎｔｊａｒｉｓ他、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　ＢＩＯ上掲
）植物研究に４３けるＲ　Ｆ　Ｌ　Ｐマーカーの使用に
関する出願においてこれらのマーカーに基づく遺伝子連
鎖地図が構築されている（　１Ｉｅｌｅｎｔｊａｒｉｓ
他、Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ。１上掲）
。例えば、トウモロコシにおいて３００種以上に及ぶＲ
Ｆ　Ｌ　Ｐが連鎖群に分類されている。トウモ【ココシ
のＲＦ　Ｌ　Ｐ遺伝子座の位置（１ｏｃａｔｉｏｎ）が
、種々の染色体について一染色体性の１〜・クモロコシ
ラインにおけるＲＦＬＰの遺伝パターンを分析すること
によって（ｔｌｅｌｅｎｔｊａｒｉｓ　　他、　Ｐｒｏ
ｃ、　　Ｎａｔｌ、　　八ｃａｄ、　　ｓｃｉ、　　Ｕ
Ｓ八へ３：６０３５−６０３９（１９８６）　）　、ま
たアイソザイムマーカー、クローン化遭伝子、及び染色
体上の位置がすでに固定されている冬型性マーカーとの
連鎖関係を確立することによって（Ｗｒｉｇｈｔ他、Ｈ
ＮＬ６１：８９−９０（１９８７））　、そしてＢ−Ａ
転座ストックに於ける遺伝パターンを分析することによ
り、従来得られているトウモロコシの遺伝子地図と相関
付けられている。ＲＦＬＰを用いて多遺伝子形質をそれ
らの個々の遺伝成分に分断することについても記載があ
る。ＲＦ　Ｌ　Ｐで飽和したゲノム若しくはその一部分
又は選択ＲＦ　Ｌ　Ｐマーカーでプローブされたゲノム
若しくはその一部分によって、強力な環境影響下におい
てさえも複合遺伝形質を個々の遺伝子座に分割（分断）
するのに必要な解決が得られることが判明した。この方
法は優性及び劣性形質のいずれについても同等に適用し
ＩＪ、所望遺伝子の商業上許容し得る栽培品種内への移
入（ｉｎｔｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ　）を促進するために
用いることができる（Ｎｉｅｎｈｕｉｓ他、１掲）。

従って、植物研究に於いてＲＦＬＰ分析の多数の有用性
があるために、出来るだけ効率良く、早く且つ経済的な
方法でこの技術を利用することがＪ：り一層望ましい状
態になっていることが理解されよう。本明細占では、特
異的な方法で蛍光−発色団を利用づるＲＦＬＰ分析に関
する新規方法が開示されている。この方法では、ＲＦＬ
Ｐに付着された発色団の蛍光を誘起するためにレーザー
を用いるため、経費、労力及び時間がサザンプロット及
び放射活性ラベル化に較べて著しく低減される。更に様
々な放出周波数を有する複数の発色団を使用することに
よって、複数の目標化合物の存在を同時に検出すること
が可能である。即ち、例えば３２Ｐのような同−秒の放
射活性化合物ですべてラベル化された種々のプローブで
サザンプロットを繰返してハイブリダイズしなければな
らない代りに、夫々が種々の異なる発色団を担持する多
数のプローブを同時に用いてプロットをハイブリダイズ
することが可能である。

こうした基本的方策（戦略）は、ニトロセルロース又は
ナイロン膜のようなサザンプロット固体マトリックス上
に不８態化された目標物にハイブリダイズされた発色団
を検出するために用いることができるが、このような発
色団を溶液中又はゲル上で検出する場合に較べると数オ
ーダーの吊だけ感度が落ちることが予想される。この感
度の損失は、ヒト又はトウモロコシのような高等真核生
物に於ける単一コピーＤＮＡ配列の実際的な検出が出来
なくなる程に大きいものであり得る。更にずでに記した
ように、ゲル中の制限ＤＮＡ断片を膜に移し、ＲＦＬＰ
をその膜にハイブリダイズさせ、そして非結合プローブ
を除去する段階を依然として実施しなければならないで
あろう。

以下に示す別の方法によって固体マトリックス上での検
出に伴なう潜在的問題が回避される。この別法は更に、
ゲルからゲノムＤＮＡ断片を移行させる操作を不要にす
るといった追加の利点を有するものである。検出はゲル
中で行なわれるため、全操作中の操作段階数を暑しく少
なくでき、単一試料について複数プローブを同時にアッ
セイすることが可能になる。

この方法においては、約１５〜約２０ヌクレオチド、又
はＤＮＡプライマーとして機能するに充分な長さを有す
る二つの一重鎖ＤＮＡプライマーを従来のザザンブロツ
［−分析によって多型性を解明し得るものとして知られ
ているクローン化プローブからの配列情報を用いて構築
する。該クローン化プローブの各末端からの短かい距離
の配列を決定することによって、５°から３°方向にプ
ローブ末端から外側に伸長する各末端に於ける配列を推
論することができる。制限酵素消化によって得られるゲ
ノム断片の冬型性領域をブ［１−ブは実際に含有してい
ないかもしれないが、該領域は有益な（ｉｎｆｏｒｍａ
ｔｉｖｅ　）断片の両末端間に位首する。もしも、二つ
のプライマーがクローン化末端からゲノムＤＮＡ断片の
残部方向に伸長（）たら、その二つのプライマーは多型
性ゲノム断片の末端で最終的に停止するであろう。これ
ら二つの伸長鎖のうちの少なくとも一つは該冬型性領域
を必らず含むものであり、実際には、この両者ともにか
かる情報を備えていることが証明されている。

このようなプライマーを各ブ［１−ブについて作成した
後、以下に記すように、発色団を該プライマーに付着さ
せる。当然のことながら、発色団の付着によって該プラ
イマーの相補配列ＤＮＡへのハイブリダイゼーション及
びＤＮＡポリメラーゼによる３゛末端からの該プライマ
ーの伸長が妨害されるようなことがあってはならない。

被験ゲノムＤＮＡ試料を適当な制限酵素で消化して多型
性ないし情報を与え１ｑる断片を作成する。

全消化物を発色団付着プライマーと混合し約３〜５分間
加熱することによって−・本領に変性させ、そして直ち
に３７℃浴に移しそこで短期間維持する。

この期間は変性ＤＮＡ混合物を３７℃まで冷却させるに
充分な期間である必要があるが、全ての高等真核生物の
ゲノム中に存在する多数コピー配列の多くが再結合でき
る程に長いものであってはならない。約数分間の期間で
充分であろう。−重鎖ＤＮＡの二重ｔＱＤＮＡへの再結
合は時間及び含有配列の濃度に依存するため、そして、
非反復配列のゲノム中に於ける濃度は極めて低いため、
数分門という時間内ではこれら配列の殆んどは再結合で
きないであろう。一方、相補的プライマーは非常に高濃
度、例えば、数ナノグラムで添加することができるため
、プライマーは相補的ゲノムＤＮＡ断片に対して数千倍
過剰になる。従って、このためにプライマーはそれらの
相補的ゲノム配列とほぼ瞬間的にアニールすることにな
り短かい二重鎖領域を形成する。

次の段階においてポリメラーゼ、好ましくは修飾Ｔ７Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（シーケナーゼ）を四種類ノ個々（７
）ｔ３ＪｔｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ
の全て及び適当な緩衝液とともに添加する。この酵素は
、小さいプライマーを使用して非常に大きな一本鎖ＤＮ
Ａを索〒く複製する能力を有している。他の研究では、
種々の小さいゲノム配列（１００−２００塩基の範囲）
を増幅し検出するためにＤＮＡポリメラーゼの大フラグ
メント（に１ｅｎＯＷ）を用いてきたが、この方法では
、ヒト及び植物のＲＦ　Ｌ　Ｐ分析にとって必要な大フ
ラグメント（２，０００−１２，０００塩基もの範囲に
なり得る）にとっては実用的ではない。クレノーフラグ
メント（ｋｌｅｎｏｗ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　）のコピー
速度は遅すぎるため、繰返し配列が存在するために、コ
ピー操作が完全に終了する前に変性鎖が再びアニールし
てしまうことがありうる。一方修飾Ｔ７ボリメラーゼは
非常に早い複製速度及び非常に高い連続移動性を右して
おり、この結果、数分間で１０，０００塩基のＶｉ型を
複製することができる。本発明方法においては、比較的
短時間で修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼはプライマーの３
°末端をゲノム断片の末端までｆうつと仲長さぜる。こ
の酵素はすでに形成された他の如何なるアニール配列を
も伸長することができる。発色団付着プライマーを伸長
させたものだけが本発明方法において検出される。

反応生成物の二つの検出方法（よ以■のとおりである。

第一に、残存する一本鎖ＤＮＡを８１ヌクレアーゼで消
化し、また該酵素は伸長断片の反対側−重鎖ＤＮＡ末端
を除去してこれを完全な二重鎖にしてしまう。この酵素
は、典型的には非常に過剰に加えられたプライマーの未
使用部分を全て破壊するようにも義能する。二重鎖ＤＮ
Ａに複製されたＤＮＡ鎖だけが次の単離段階で回収され
る。この！、ｔｉ　離段階は、エタノール沈澱又はミニ
カラムクロマトグラフィ等の従来公知の多数の技術のう
ちのいずれを用いても達成することができる。甲雌され
た断片は次いで標準中性アガロースゲル上に移され電気
泳動によりその大きさに従って分離される。

もう一つの別の方法では、修１Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ
による処理に続いて、全反応生成物を一本鎖に変性し、
変性アガロースゲルシステムにおける電気泳動によって
分析する。前者の方法のほうが好ましい。何故ならば、
ゲルを汚す結果最終分析を複雑なものにしかねない未使
用の発色団を除去しているからである。

上記二方法のいずれに於いても、電気泳動後に、レーザ
ーでゲルを走査して発色団を励起させ蛍光を発生させ、
これをリニアフォトダイオードアレイ検出器で検出する
ことができる。各発色団に特有の放出スペクスルに関す
るデータを検討することによって、試験ＤＮＡの冬型性
領域が検出される。更に充分小のプライマー、例えば１
００アッセイ分のプライマーがいったん調製されたなら
ば、残りの段階、即ち、消化、変性、伸長、電気泳動、
及び検出が橿めて短時間で完了させることができる。−
例として全操作を約２０プローブ及び多数のゲノム試験
試料につき１作業日で実施することができる。従来のサ
ザンプロット法を用いて同量の作業を完成させようとす
れば、理想的な条件下でさえも、数ケ月かかる場合もあ
る。要約すれば、部約された時間及び費用はこのような
ＲＦＬＰ分析を利用する上で非常に重要なものであるこ
とが判明するであろう。

レーザー誘起蛍光検出及び蛍光発色団を付着するように
化学修飾したＤＮＡ断片は現在市販されている（　Ｐｒ
ｏｂｅｒ他、５ｃｉｅｎｃｅ　２３８：３３８−３４１
（１９８７））。

ＤＮＡ配列決定に使われた技術は３２Ｐオートラジオグ
ラフイりとって代るだけの感度を有しているが、選択さ
れた蛍光放出光の波長でのみ検出し得るものである。つ
まり、上記Ｐｒ０ｂｅｒの文献が示すように互いにその
放出最大波長が近接している４種の蛍光発色団までしか
使われていない。

前）ホしたように、蛍光フォｌ−ダイオードアレイ検出
系、例えば、Ｇｌｕｃｋｍａｎ他、Ａｎａｌ、ｃｈｅｍ
、　５７：１５４６−１５５２（１９８５）　、及び放
出スペクトルが特異的な種々の蛍光発色団でラベルした
ＲＦＩＰＩ！７ｉ片のレーザー励起を組み合わせること
によって、分離ゲル媒体中で低濃度（１０”　〜１０−
１８１０−ｌ８のＤＮＡ断片を検出できるのみならず、
コンピューターの助けをかりてスペクトルを比較するこ
とによって一つの蛍光発色団を他のそれと識別できるも
のである。このことによって、単一の制限酵素によって
生じたＤＮＡ断片群を複数ＤＮＡプローブを用いて単独
ゲルレーン中で同時に分析することが可能になる。

本発明方法で使用する光学系は１掲のＧｌｕｃｋｍａｎ
他のらのを変更したものである。泳動後のゲルを水晶板
（２０Ｘ　２０ｃｍ　＞上に載量する。該板をＸ−Ｙ座
標に沿って移ωｊさせ、単色光レーザービームで特異的
蛍光発色団（ＤＮＡプローブ）を含むＤＮＡ断片を示す
バンドを励起づる。高感度リニアフォトダイオードアレ
イ（ＬＰＤΔ）検出器と組合せた放出スペクトルグラフ
を用いて水晶板を通過する全放出スペクトルを検出する
。高感度ＬＰＤＡからの出力を検出器コントローラ／イ
ンターフェイスによってデジタル信号に変換し、これを
」ンビュータに転送する。デジタル信号の転送が早いた
め同一バンドを複数回走査することが可能で、これによ
ってバックグランドノイズレベルを低下させシグナルレ
ベルを高めることができる。引き続いて、コンピュータ
ーによる標準蛍光発色団のスペクトルライブラリーによ
って対応ＤＮＡプローブに対して各バンドの相関を求め
る。即ら、ＲＦＬＰ所片はその蛍光ブ［−１−ブ型及び
ゲル板のＸ−Ｙ座標によって同定される。蛍光光度フォ
トダイオードアレイ検出器、スペクトル集積（収集）及
び比較のためのコンピュータープログラミング、及びゲ
ル走査駆動装置といった技術は存在しているが、これま
でにＲＦＬＰ分析用分析数ＤＮＡプローブを検出するた
めにこれらの技術が組み合されて使用されたことはなか
った。

以下に、プライマーの製造、発色団の選択、プライマー
ラベリング、ゲノムＤＮＡの消化、鋳型及びプライマー
の変性及びアニーリング（再結合）伸長反応、及びＳ１
ヌクレアーゼ処理について詳説する。これ以外の方法及
び手段についても、同じ結果を奏効し得る限り、本発明
で使用することが可能である。

従来のサザンプロット分析において冬型性を解明したク
ローン化プローブを用いてプライマーを作成するのが現
在のところ好ましい。このようなＲＦ　１．　Ｐブ［１
−１は、典型的にはサザンプロット分析で検出する断片
よりも小さいが、このことは必要条件でも必須条件でも
ない。ランダムに又はその他の方法で選択されたＲＦＬ
Ｐプローブは、複数のクローニング部位（ＭＣ８）を有
し、ＭＣ８末端に相補的なプライマーを用いて挿入物の
末端に至るＤＮＡ配列を決定することが可能なプラスミ
ド、例えば、ＵＣｌ３内でクローニングすることができ
る。この系によって、−回の操作によって容易に各末端
から数百塩基の配列を決定づることができる。こうして
得られた配列情報は次に二種のプライマーを製造する際
に用いることができる。この二種のプライマーはゲノム
ＤＮＡ上で伸長されて、元のクローン化プローブによっ
て検出された冬型性領域のいずれをもカバーする伸長生
成物を生ずることとなる。例えば、いずれかの２０塩基
配列を一つのプライマーとして使用して、これを鋳型の
末端への一方向で伸長することができる。もしも相補配
列を第二のプライマーとして次に用いたとすれば、それ
は鋳型のもう一方の末ｑ：に向って伸長されるであろう
。従って、二つの有用なプライマーを短かい１２２基配
列を決定する作業だけで選択することが可能である。も
しもその配列がゲノム中の他の位置で見出された場合に
は、この選択されたプライマーは有効でなくなる可能性
がある。しかしながらこの分析で用いられるプローブは
それらの相対的な非反復性（ｕｎｉｑｕｅｎｅｓｓ）に
基づいて選択されているために、前記のようなことは起
りそうにないと思われる。当然のことながら、もしも選
択したプライマーがその後の分析に；ρいて二つ以上の
配列を明らかにしたような場合には、クローン化プロー
ブのもう一つの領域からもう一つのプライマーを調製す
ることが可能である。

（以下余白） 固相ホスホラミダイト化学において知られている方法に
よりオリゴマー（２０マー）デオキシリボヌクレオチド
を合成した。オリゴデオキシリボヌクレオチド製造の後
、これ等の合成ヌクレオチドを、第１級アルキルアミン
基、Ｎ−モノメトキシトリチル−メトキシ−Ｎ、Ｎ−ジ
イソプロピルアミノホスフィニル−３−アミノ−１−プ
ロパツールを同様に公知方法により５−末端に結合する
ことにより化学的に改変した。改変したオリゴデオキシ
リボヌクレオチドを単離し、精製し、市販のアミン選択
性螢光染料を結合することにより標識した。

螢光標識オリゴデオキシリボヌクレオチドをＨＰＬＣに
より￥Ｉ製し、異なる制限酵素フラグメントクローンの
プライマーとして使用した。

改変オリゴデオキシリボヌクレオチドの合成は、Ｂ、＾
、　Ｃｏｎｏｌｌｙ　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅ５ｅｒｃｈ　Ｖｏｌ。

１５　（７）　：　３１３１．１９８７）をいくらが改
変したものに従って行なった。＾Ｄｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｎ　Ｄ　Ｎ　Ａ合成撮を使用してオリゴデオ
キシリボヌクレオチドを生成した。３つのアミン選択性
螢光物質、ダンジルクロライド（ｄａｎｓｙｌｃｈｌｏ
ｒｉｄｅ、＾１ｄｒｉｃｈ　Ｃｏ、　　）、ＦＩＴＣ（
フルオロゼイン−５−イソチオシアネート）及びＮＢＤ
−フルオライド（４−フルオ０−７−二トロベンズー２
−アザ−１，３−ジアゾール）（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
Ｐｒｏｂｅｓ）を改変オリゴデオキシリボヌクレオチド
を標識するために選択した。

上記の螢光物質の１つを合成オリゴデオキシリボヌクレ
オチドプライマーの５′末端に結合に使用するためのＮ
−モノメトキシトリチル−Ｏ−メトキシーＮ、Ｎ−ジイ
ソプロピルアミノホスフィニル−３−アミノ−１−プロ
パツールは以下のようにして製造した。Ｐ−アニシルジ
フＩニルクロロメタン（７，７２ｇ、　２５ｎｎｏｌ）
及び３−アミノ−１−プロパツール（７，５ｔｔｄ！、
　１００　ａｎｏｌ）を乾燥Ｃ）−１２ｃ、！２２（モ
レキュラーシーブ＃３Ａ及び無水Ｎａ２５ｏ４で１過し
たもの）５０−及ヒ２５ｄ　ＧＣソれぞれ溶解した。Ｐ
−アニシルジフェニルクロロメタン溶液を、芸械的に撹
拌され続けている３−アミノ−１−プロパツールの水冷
溶液に一時間かけて滴下した。混合物を０．５時間室温
に放！し、その後５％ＮａＨＣ，０３（５０ｄ＞で２回
洗浄し同容量の飽和ブラインで洗浄した。洗浄したＣＨ
２Ｃｌ！２溶液をＮａ２ＳＯ４（無水〉で乾燥し、真空
下に濃縮した。濃縮混合物をＥｔ２０：ヘキサン中に溶
解し、液体窒素で冷却してＮ−モノメトキシトリチル−
３−アミノ−１−プロパツールを結晶化した。

結晶を回収し、黄色が全て消失するまで冷Ｗヘキサンで
洗浄した。Ｎ−モノメトキシトリチル−３−アミノ−１
−プロパツールの白色結晶を冷却Ｅｔ２０中で再結晶化
させ、真空中Ｓｉ　−ゲルで乾燥させた。４．５ｇ以上
の結晶が得られた。生成物をＴＬＣ，ＩＨ−ＮＭＲ及び
ＦＡＢ−ＭＳで分析し、文献値と比較した。

所望の中間体Ｎ−モノメトキシトリチル−３−アミノ−
１−プロパツールの合成の完了後、５ｉ−ＴＬＧプレー
トをＣＨＣρ　　：　ＣＨ３０Ｈ：　ＥＴ３Ｎ　（９７
：　　２：　　１．Ｖ：Ｖ：Ｖ）で１度展開し、バニリ
ンＨ２ＳＯ４により可視化した。出発化合物Ｐ−アニシ
ルクロロジフェニルメタン及び最終生成物Ｎ−モノメト
キシトリチル−３−アミノ−１−プロパツールはそれぞ
れ０．９及び０．５８のＲｆ値を有している。生成物を
ＦＡＢ（＋）ＭＳ及び１日ＮＭＲ（２００ＭＨｚ　、　
ＣＤ　ＣＨ３，ＶＭＳ　）により特性化した。ＦＡＢ（
＋）ＭＳスペクトルは、ｍ／　ｚ　２７３（ｃ２Ｈ１７
０）十の大フラグメントイオンピークに沿ったＭ　／　
２３４８の準安定イオン（Ｍ＋　Ｈ）十を示し、これは
０２３Ｈ２５０２Ｎの分子式を示している。Ｎ−モノメ
トキシトリチル−３−アミノ−１−プロパツールのＩ　
Ｈ−ＮＭＲスペクトルは７．４５−７．１５（ｍ、１４
Ｈ＞、６．８１　（ｄ、２Ｈ）、３．８９（ｔ。

２Ｈ＞、３．７８（ｓ、３Ｈ）、２．３４（ｔ、２Ｈ）
。

１．６９　＜　ｄ　ｄ　ｄ　、　２　Ｈ）を示した。こ
れ等の値は文献値と非常によく一致する。実験値と文献
値における若干のＲｆ値の差異は、ＴＩＣ条件の多少の
違いによるものであろう。これ等のスペクトルデータは
、反応混合物（６５％収率）が所望中間体Ｎ−モノメト
キシトリチル−３−アミノ−１−プロパツールであるこ
とを明確に支持するものであった。

Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１，９ｄ。

１０　ｎ＋＋ｎｏｌ　）を、Ｎ−モノメトキシトリチル
−３−アミノ−１−プロパツールのＣＨ２Ｃρ２溶液（
１０成の乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中１．７３ｇ、　５　ｎ＋ａ
ｏｌ）に加え、混合物を氷上で冷却した。撹拌を続けな
がら、Ｎ。

Ｎ−ジイソプロピルメチルホスホラミデイッククロライ
ド（０，９７戒、　５Ｉ１１ｏｌ）を５分間で加えた。

反応混合物を水浴中に１０分間放置した。１０分間の後
、ＣＨ３０Ｈ（１，０ｄ）を加え、さらに１０分間室温
に放置した。ざらにＣＨＣｌ３（２５ｒｄ）を加え、５
％ＮａＨＣＯ３（５０ｍ＞で２回、飽和ブライン（５０
ｄ　）で１回洗浄した。このＣＨ２Ｏρ２溶液をＮａＳ
Ｏ４（無水）で乾燥し、真空下に濃縮した。シリカゲル
フラッシュカラムクロマトグラフィーにより反応混合物
からＮ−モノメトキシトリチル−０−メトキシ−Ｎ、Ｎ
−ジイソプロピルアミノホスフィニル−３−アミノ−１
−プロパツールを精製した。適当なカラム分画の真空下
における濃縮により１．６７ｇの透明無色油が得られた
。

化合物をＴＬＣ，３１Ｐ−ＮＭＲ及びＦＡＢ　（＋）Ｍ
Ｓで分析した。

上記の反応の完了をＴＬＣで再度確認した。■ＬＣプレ
ート（Ｓｉ）をヘキサン：Ｅｔ３Ｎ（９：１　、　ｖ／
ｖ　）で−度展開し、Ｕ、　Ｖ、　２５４　ｎｎランプ
の下で観察した。出発中間化合物Ｎ−モノメトキシトリ
チル−３−アミノ−１−プロパツール及び最終生成物Ｎ
−モノメトキシトリチル−〇−メトキシーＮ、Ｎ−ジイ
ソプロピルアミノホスフィニル−３−アミノ−１−プロ
パツールはそれぞれ０．０５及び０．６３のＲｆ値を有
する。この最終生成物をフランシュカラム＜Ｓｉ）クロ
マトグラフィーで精製し、ＦＡＢ（＋）ＭＳ及び３１Ｐ
−ＮＭＲ（ｃＤＣ１３／Ｅｂ３Ｎ、９　：　１，８１．
３ＭＨｚ　、ＨＰＯ４）によつ分析した。該最終生成物
のＦＡＢ　（＋）ＭＳスペクトルは、ｍ／２５０９の準
安定イオン（Ｍ＋Ｈ）十を示し、Ｃ３０Ｈ４１０３Ｎ　
２　Ｐの分子式を示している。最終生成物の３ＩＰ−Ｎ
ＭＰスペクトルはＨ３ＰＯ４からのダウンフィールドの
１４７．７３ｐｐ１１で単一ピークを示した。この値は
文献値１４８．２９１）ｐＩとほぼ一致する。これ等の
スペクトルデータにより最終反応生成物がＮ−モノメト
キシトリチル−〇メトキシ−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルア
ミノホスフィニル−３−アミノ−１−プロパツールであ
ることが同定された。

フラッシュカラムクロマトグラフィーは下記のようにし
て行なった。シリカゲル（４０ｔｍ　）をフラッシュカ
ラム中に湿潤充填した（ｃＨ２Ｃρ２゜１５ｃｍ×３　
ｃｍ）　ｏ充１兵カラムをヘキサン（２００ｒｄ）で２
回、ヘキサン−Ｅｔ３　Ｎ　＜３　：　１．２００蛇）
で１回洗浄した。反応混合物を少容吊の溶出溶媒（ヘキ
サン−Ｅｔ３Ｎ、８：１）に溶解した。約１０戒容吊の
フラクションを回収した。

Ｎ−モノメトキシトリチル−〇−メトキシーＮ。

Ｎ−ジイソプロピルアミノホスフィニル−３−アミノ−
１−プロパツールで５−末端を改変したデオキシリボヌ
クレオシドの合成は以下の方法により行なった。オリゴ
デオキシリボヌクレオチド（２０マー）は、当初結合ヌ
クレオチドの約１μｓのスケールで通常の固相ホスホラ
ミダイト法により製造した。所望の配列合成が終了した
後、Ｎ−モノメトキシトリチル−〇−メトキシーＮ、Ｎ
−ジイソプロピルアミノホスフィニル−３−アミノ−１
−プロパ／−ル（７セトニトリル中１２．７ｍｇ、　２
５Ｉｍ＞及びテトラゾール６０Ｐを使用してさらに一巡
の合成を行なった。この結合の後、１２／Ｈ２０／ＴＨ
Ｆによるホスファイトトリエステルの酸化、チオフェノ
ールによる脱メチル化及びＮＨ３による塩基保護基の解
裂と脱ブロツク化を、新しく導入したＮＨ２基を脱保護
することなく行なった。租製モノメトキシトリチル保護
オリゴヌクレオチドを逆相ＨＰＬＣによりＶ４製した。

精製オリゴヌクレオチドを８０％ＨＯＡｃの２ｄに２時
間で溶解し、アミン基を脱保護した。２時間の後、ＨＯ
Ａｃを蒸発により除去し、プロピルアミン基を有するオ
リゴマーを小容量の水に溶解した。

改変オリゴヌクレオチドを螢光物質に結合するために、
改変オリゴヌクレオチドの水性溶液（１００〜５００１
１ｉ中０．０１〜０．２５ｕ　）を等容量の５％ＮａＨ
ＣＯ／Ｎａ２Ｃｏ３バッファ’−（ｐ）（１０）と混合
した。ＮＢＤ−フルオライド及びＦＩＴＣをジメチルホ
ルムアミド（１００Ｎ／ｄ）で溶解し、ダンジルクロラ
イドをアセトニトリル中に溶解したくオリゴマーに対し
１００当量、１〜２５ｔ１Ｍ）。これ等の螢光物質溶液
を改変オリゴヌクレオチド溶液に加え、３時間インキュ
ベートした。螢光物質標識オリゴヌクレオチドを逆相Ｈ
ＰＬＣにより精製し、以下のＲＦＬＰ分析に使用した。

Ｂ、試験植物ＤＮＡ／延長プライマーＤＮＡの増強試験
植物ＤＮＡの巾を増強する方法は、アッセイの感受性を
増加させること及び申−塩基レベルでの配列変化を検知
することの両方に使用し得る。

そのような改変を使用することにより、微小な大きざの
変化が検出できるばかりでなく、ＤＮＡ配列における変
化自体を特性化することができる。

植物の間では、変異の大部分は単一塩基対レベルでの変
化を構成するものであることから、上記のことは有意義
である。このような変化の結果としてのゲノムＤＮＡフ
ラグメント間の差異は、サザンブロツティングあるいは
ゲル電気泳動により実用的に検出するには大きさが小さ
すぎる。また変異は塩基対の置換であることがあり、こ
れは検出可能な大きさの変化を伴なわず、また最もスト
リンジェントなハイブリダイゼーション条件下以外では
プローブ（あるいはプライマー）の結合を阻止すること
ができない。さらに、上記例で使用するＴ７ＤＮＡポリ
メラーゼによるプライマーの延長においては、Ｔ７を使
用して延長された配列の部分におけるＤＮＡ配列のわず
かな変化は検出できない。プライマーＤＮＡが試験植物
ＤＮＡ結合する頻度はかなり低く、これはプライマーが
由来するプローブが、該植物のゲノム中のそれ等の低コ
ピー数に基づいて選択されるからである。従って、本発
明の改変の目的は、延長プライマーに結合した試験植物
ＤＮＡの量を選択的に増加させることである。

単一塩基レベルでの変異を検出し、同時に本発明の分析
をより自動化し易いものとするためには、プライマーが
結合した試験植物ＤＮＡを約１００万倍まで増強する方
法が好ましい。試験植物ＤＮＡの吊のこのような増加は
、例えば、増強セグメントの直接の配列化を可能として
単一塩基対変化の検出及び特性化を可能とし、延長プラ
イマー／試験植物ＤＮＡの増強により信号（例えばプラ
イマーに結合した螢光物質標識からの螢光）の増幅を可
能として非常に低い当初濃度でも検出することを可能に
する。さらに信号の増加により、より低感度の検出装置
でよいことになる。

ポリメラーゼ鎖反応すなわちｒＰｃＲ （ｐｏｌｙｎｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏ
ｎ　）　Ｊは、延長プライマーＤＮＡ／試験植物ＤＮＡ
ハイブリッドの選択的増幅に使用し得る方法の１つであ
る。ＰＣＲは米国特許４６８３１９５＠及び４６８３２
０２号に記載されており、これらは参考文献として本明
細店の一部とする。この方法を使用することにより二本
鎖延長プライマー／試験植物ＤＮＡのみが増幅され、非
結合−重鎖ＤＮＡは取り込まれず変化しないまま残る。

本発明の所望のＤＮＡフラグメントを増幅するためにＰ
ＣＲ法を使用するには、所望のフラグメントが正確に増
幅されるために十分短いものであることが必要であるが
、殆んどの場合ＰＣＲは約Ｉｋｄ未満のセグメントの増
幅に限られている。多形態性を示す試験植物ゲノムフラ
グメントはその全体で１ｋｂを超えていることが多く、
従って多形態性自体が、我々が使用した約１ｋｂＲＦ　
Ｌ　Ｐプローブの末端を超えて存するものである。

この問題を解決するために、分析の焦点をＲＦしＰ自体
（即ち植物ＤＮＡにおける制限フラグメント長の差異）
から、試験した植物間におけるＤＮＡの配列の変異に移
した。この考えは、配列変異はＲＦＬＰに現われるが、
ＲＦＬＰ分析のみでは通常配列変異の性質そのものは示
されないということに関連する。いい換えれば、分析は
制限フラグメントの長さの変化に限定されるものではな
く、長さにおける変化を生起する配列変化についても行
なうということである。また、配列長の変化を起さない
ことがあり得る塩基置換のような配列変化も含まれ、ま
た実際上検出できない長さの変化を生起するわずかな配
列の付加及び削除も含む。

プライマーが結合した試験植物ＤＮＡを増強するために
上記と同じ基本的方法を使用した。しかし、試験植物制
限フラグメントの末端に向ってそれぞれ外側に延長され
得る２つのプライマーを製造する代りに、内側に向って
延長され得るプライマー、即ち、それぞれが他方に向っ
て延長され従って試験植物の中間領域に向って延長され
得るプライマーを製造した。この方法においては、増幅
される二本領領域はプライマーが由来するプローブの大
きさに制限される。典型的にはプローブは１ｋｂ未満か
らなるので、ＰＣＲを用いた増幅が可能である。

増幅の後、さもなければ非常に低いコピー数であるはず
のゲノムＤＮＡ制限フラグメントの数１００万に至るコ
ピーが生成され、配列化に充分なりＮＡが供給される。

ＤＮＡポリメラーゼにより充填されたプライマー間の領
域は、単離物あるいは変異体間により異なることがある
ので、実際の配列における差異が特性化できる。

また、標識オリゴマーを使用した二本鎖延長プライマー
／試験植物ＤＮＡのプライマー間の領域の増幅により、
標識の信号も同時に増幅され得る。

これにより検出方法の複雑さを有意に減じることができ
る。

増幅の後は、種々の配列変異検出法が使用可能である。

下記の４つの検出法は例として記載するものであり、他
の検出法は当業者に明らかであろう。

増幅領域における再配列により生起したサイズ多形態性
は、増幅領域上の標識を検出手段として使用してゲルあ
るいはカラム上で直接分析することができる。この方法
によれば信号の強さは増加されるが、単一塩基対変化は
検出されそうにない。

もし、配列変化が増幅領域内に新しい制限部位を生成す
れば、増幅の前の試験ＤＮＡ　（内側に延長したプライ
マーに結合した）の予備消化により増幅が阻止されるで
あろう。試験植物間の増幅における差異は配列の変化の
性質を示すことになる。

このｒ＋／−ｊタイプのアッセイは自動化を容易にする
一方、制限部位の偶然の創生あるいは破壊について信頼
性がある。

試験植物ゲノムＤＮＡが、延長プライマーに由来する配
列に対応する配列を有するか否かを同定するもう一つの
方法は、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件
を使用することである。当業者には公知の、このような
ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下におい
ては、非対応オリゴマー間のハイブリダイゼーションに
対して識別される。非標識オリゴマーと増幅させ、熱変
性させ、その後種々の配列変異体の全てに適合する標識
内部オリゴマーとストリンジェント条件下でハイブリダ
イゼーションさせることができた。

この［＋／−Ｊアッセイにおいては、特定の植物ゲノム
フラグメントが、特定の配列を含んでいるか否かを確認
することができる。

非常に厳格なストリンジェントハイブリダイゼーション
条件を使用して増強プロセスにおけるアニーリング段階
を行なうことよっても、試験ＤＮＡフラグメントが単一
の塩基対変化を含んでいるかさえ検出できる実用的なア
ッセイが得られる。

本質的に、異なるプライマーを使用し、１つは増幅が要
求されるものの末端に固定されたものであり、別の２つ
はそれぞれの末端（３′末端）が異なる塩基であるもの
である。この二つの可変プライマーのそれぞれも、異な
る標識により標識される。例えば、１つを赤色螢光発色
団で標識し、他方を緑色螢光発色団で標識することがで
きる。固定されたプライマーは、前記標識プライマー（
可変３′末端において）と、固定プライマー自身の間の
領域を充填することによって生成された完全オリゴヌク
レオチドの逆の末端として作用する。

この「固定」プライマーは、ストリンジェントハイブリ
ダイゼーション条件下で、それぞれがその末端に異なる
塩基対配列を有し、異なる標識を有する種々のオリゴヌ
クレオチドと共に試験植物ＤＮＡとアニーリングする。

次に、後述するように結合「固定」プライマー並びに任
意の結合可変プライマーを、例えばＴａｑポリメラーゼ
のような任意のＤＮＡポリメラーゼを使用して互いに向
って延長する。次に試験植物／延長プライマー二重鎖Ｄ
ＮＡを、オリジナルプライマーの標識の全てのコピーへ
の取込みが可能な条件下で増幅させる。３′末端が不適
合なプライマーは極端な不充分な延長しか起さないので
、試験ＤＮＡにうまく適合する３′末端を有するオリボ
マーのみが増幅され得る。増幅生成物を分析して、例え
ば赤色発色団、緑色発色団あるいはその両方といったよ
うなどのような標識が存在するかを確認することができ
た。検出された異なる標識は、例えば、試験植物が同種
接合偉観あるいは異種接合体遺伝子型かを示し得た。

Ｒ後に記載した検出方法をさらに改変して、選択した固
定プライマー及び標識可変プライマーとの間の距離に基
づいて増幅領域のサイズを変化させた。いくつかの異な
る遺伝子座間のこの距離を変化させ、それら全てを同時
に増幅させ（１つの容器で行なうことができる）、混合
物をゲル上に流し、分析することができた。種々のプラ
イマーの３′末端の変異を有する遺伝子座のそれぞれを
、異なる発色団あるいは使用した他の標識を検出するこ
とによりゲル上で異なる分子量の点で検出した。このよ
うにして、ただ２つだけの標識を使用して単一のゲルレ
ーン中で多数の遺伝子座をスクリーニングできた。

以下に増幅及びゲノムＤＮＡの配列化の手順をより詳細
に記載する。これ等のプロトコールと同じ結果を得るた
めの他の手段も可能であり、それらも有用であると考え
られる。

以下は２つの異なるプライマーが結合したトウモロコシ
ゲノムＤＮＡのポリメラーゼ鎖反応増幅に使用したプロ
トコールである。試験したトウモロコシ系を以下に慣用
的な名称により示す。全てのトウモロコシ系は公共的あ
るいは商業的供給源より入手可能である。

使用したプライマーはＨｅ１ｅｎｔｊａｒｉｓ　、　Ｔ
ｒｅｎｄｓｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　３：　２１７　　（
１９８７）に示されたようにトウモロコシ遺伝子座から
ＲＦＬＰプローブを使用して従来の方法により製造した
。使用したプライマーのＤＮＡ配列は第２図から第１０
図に示した。

第２図〜第６図はトウモロコシ遺伝子座２８８の核酸配
列を示す。プライマーとして使用した遺伝子座の部分に
下線を付し、特異的なプライマーを小した。第９図及び
第１０図はトウモロコシ遺伝子座４５１のＤＮＡ配列を
示しており、やはり特異的プライマーを示した。プライ
マーは従来の技術により、それ等の方向が使用したプラ
イマー間のＰＣＲによる延長が可能となるように製造し
た。

下記のゲノムＤＮＡ／プライマー混合物を使用した。

１つの試験植物ゲノムＤＮＡ当り２つの対向するプライ
マーを使用した。

ＰＣＲ増幅のプロトコールはＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｎｅｒ
Ｃｅｔｕｓ　　（Ｎｏｒｗａｌｋ　、　ＣＴ）により製
造されたＴａｑポリメラーゼを使用して行なった。製品
のパンフレットに記載された手順をたどったが、この手
順は参考文献として本明細書の一部とする。またＤＮＡ
配列の増幅について記載したＬｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａ
ｔｕｒｅ３２５：４１４　　（１９８８＞も参照された
い。

非精製ゲノムＤＮＡ中のＲＮＡは下記のもの１０μを加
えることにより消化した。

Ｈ２Ｏ １０Ｘ　　　ＰＣＲ ＭＳＯ ゼラチン ＲＮアーゼ Ｒｘ（２４Ｘ） １２４８　成 ４．８ 混合物を５分間室温、その後９５℃で５分間でインキュ
ベートした。

前出の増幅キットの中のものとして提供されるＴａｑポ
リメラーゼを使用したポリメラーゼ鎖反応混合物は下記
のものである。

Ｒｘ（２３Ｘ＞ ｄＨ２０１３゜８ ２５ｎＨｄＸＴＰｓ　　　　　　　　　１８４１０Ｘ　
　ＰＣＲ２３ 酵　　　素　　　　　　　　　　　　　　　　　９．２
ポリメラ一ゼ鎖反応は、９３℃で２分間、５５℃で２分
間及び７２℃で４分間のそれぞれ３０サイクルと最後の
１０分間の延長サイクルに亘って行なった。

上記のサイクルで、ゲノムＤＮＡの相補鎖の有意な再ア
ニーリングなしに十分なプライマーの結合が得られるこ
とが判明した。

各増幅生成物の１０μをアガロースゲル上に流し、従来
のように調製し、臭化エチジウムで染色した。

このゲルは第１１図に示した。このゲルは、２８８プラ
イマーが試験したラインの小部分にあることを示してい
る。４５１プライマーは約３００ｂｐのバンドを示して
いる。ライン３ｉ４は、２８８Ａプライマー及び２８８
ＥＯＬＩプライマーを有する他の系よりも大きいフラグ
メントを示した。

サンプルの残りは配列化のために用意した（後記参照）
。２３ｐｉの５ｘＰＣＲｆ？’止混合物を加え、サンプ
ルを５０℃で６０分間インキュベートした。サンプルを
フェノール及びクロロホルムでそれぞれ１回抽出し、Ｃ
ｅｎｔｒｉｃｏｎ　　（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｏｒｐ、。

Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、　Ｍａｓｓ、）で３回透析した。

その後サンプルを酢酸アンモニウムで沈殿させ、１０　
／Ｊのバッファー中に再懸濁させた。

多数の栽培変種植物及び増幅器を使用したＰＣＲ増幅 ここでは、種々の栽培変種植物を種々のプライマーと共
に試験した。さらに、種々の吊の試験植物Ｄ　Ｎ　Ａを
使用した。

上記と同じプロトコールをＰＣＲ増幅に使用し、１０／
１ｉを取りアガロースゲル上に流したく第１２図）。

このゲルは臭化エチジウム染色により検出されるように
近親交配系の均一な増幅を示している。さらに、５ＩＪ
ｇの［）ＮＡは最適な増幅を促進するが、１０埒を使用
したときは増幅の減少が認められるようである。第１１
図に示したＢ　１４Ａにおける多形態性がやはり検出さ
れた。

卸 〇　　　　　　。−０゜、。

−Ｎの寸Ｎ口Φ−Ｗ　ｒ　ｒ　ｒ　ｆｆる影響 標準的な方法でトウモロコシ近親交配ＭＴからのゲノム
ＤＮＡを単離し、全てのサンプルに使用した。ブ５イｖ
−２８８ＢＯＬ　１及び２８８ＥｏＬ１の両方を各サン
プルに使用した。下記の「汚染」ＤＮＡは、タンパクあ
るいはその他の外来の物質の除去のための予備処理をし
ていないＭＴゲノムＤＮＡを示す。「精製Ｊ　ＤＮＡは
、ＲＮアーゼ処理したゲノムＤＮＡサンプルをフェノー
ル及びクロロホルムで１回ずつ抽出したものである。Ｐ
ＣＲ増幅の後、サンプルをさらに４回Ｃｅｎｔｒｉｃｏ
ｎで透析し、酢酸アンモニウムで沈殿させた。ＤＮＡ沈
殿物を８０％エタノールで１回洗浄した。

ＰＣＲサイクル数も変化させ、サンプルを３０回または
３５回のサイクルにかけた。

使用したサンプルは以下の通りである。

１、　１埒の汚染ＤＮＡ−３５サイクルのＰＣＲ２、５
ｐ！ｉの汚染ＤＮＡ−３５サイクルのＰＣＲ５、１ｐ９
の汚染ＤＮＡ−３０サイクルのＰＣＲ６、５ｐｇの汚染
Ｄ　Ｎ　Ａ　−３０サイクルのＰＣＲ８、１ｐ！ｇの汚
染ＤＮＡ−３０サイクルのＰＣＲ１５サイクルで酵素を
付加 ９、　１Ｈの精製Ｄ　Ｎ　Ａ　−３０サイクルのＰＣＲ
ｌｏ、　　　５埒の１ＩＤＮＡ−３０サイクル（７）Ｐ
ＣＲ１５，８と同じＣｅｎｔｒｉＣＯｎカラムサンプル
を再使用 使用したＰＣＲ増幅は前記のものである。

サンプルのゲル電気泳動分析は、試験ＤＮＡの５埒の使
用が、試験ＤＮＡ１ｙを使用したときに得られるものよ
りも増幅ＤＮＡの量を増加させることを示している。Ｐ
ＣＲ前の精製はわずかに増幅の増加を示したが、有意な
ものではなかった。

増幅においては、サンプルに３５サイクルのＰＣＲを行
なった場合でも３０サイクルで検出されるものと差異は
認められなかった。

増幅反応物の直接配列化 増幅生成物の配列化の好ましい方法を示す。ここで使用
したサンプルは、上記の「多数の栽培変種植物及び増幅
器を使用したＰＣＲ増幅」の項で記載したように調製し
たサンプル８〜１４である。

サンプル８〜１４を２５：２４：１のフェノール：ＣＨ
Ｃρ　　：イソアミルアルコールで１回抽出し、次に２
４：１のＣＨＣρ　：イソアミルアルコールで１回抽出
した。サンプルを３０　ｋＤａ　Ｃｅｎｔｒ＋ｏｎ限外
ｅ過膜で４回濾過した。各濾過においで２成の水で連続
的に希釈した。最終的に得られた保持物を回収し、最終
濃度２ＭまでＮＨ４０Ａｃを加えた。２容吊の冷エタノ
ールを加え、混合物を一晩−２０℃に冷却した。

ＤＮＡの配列化を、５ｅｑｕｅｎａｓｅ　　（商標）キ
ット（Ｕ、Ｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｌｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ　
、　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ　、　０旧を使用し、製造者に
よる説明書に従い行なった。この説明書は参考文献とし
て水量１！ｔｉｌｌの一部とする。

ＰＣＲ鋳型ＤＮＡを沈降させ、７０％冷エタノールで洗
浄した後、１０成のバッファー中に溶解した。

１成を電気泳動サンプルとして取ったが、これは殆んど
のサンプルにおいて約１５０〜３００ｎｇの回収に相当
する。

残りの９ｍを沸騰水浴中で５分間加熱し、３７℃に加温
した以下のプライマー／バッファー混合物の３Ｉｄを加
えた。混合物は１０ｍ　５　ｘ　５ｅｑｕｅｎａｓｅバ
ツフア一＋８μｍμＭ２８８ＥＯＬ１である。得られた
混合物を短時間回転させて液体を単一容量に回収し、室
温で１５分間ＤＮＡをアニーリングさせ、その後以下の
混合物の５．５　ｌ１Ｉｔを６管に加えた。

ｉ　　Ｘ８ １　　　８　　　１Ｍ　　　ＤＴＴ Ｏ，４３，２非希釈　標識混合物 ０．５　　４　　　　　　　　［ａ３５Ｓ］　ｄＡＴＰ
ｏ、２５　２　　　　非希釈　５ｅｑｕｅｎａｓｅ　　
（商標）３．３５２７水 末端溶液Ｇ、Ａ、Ｔ及びＣの２．５戒を含む管に各反応
物の３．５ｐｉを導入したときに、上記のように反応物
を５分間室温で標識した。

室温での５〜６分後に４成の反応停止溶液を６管に加え
、その後管を一２０℃で凍結した。

種々のトウモロコシ栽培変異植物についてのトウモロコ
シ遺伝子座２８８及び４５１の配列を第１３図及び第１
４図に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明方法の概略を示す図、第２図〜第１０図
は本発明の実施に使用したプライマーのＤＮＡ配列を示
す図、第１１図及び第１２図は本発明によるＰＣＲ増幅
を示すためのアガロースゲル上での分析の生物の形態を
示す写真、第１３図及び第１４図は種々のトウモロコシ
栽培変異植物の遺伝子座２８８及び４５１のＤＮＡ配列
を示す図である。 ＡＡＣＣＧＧＴＧｋｋ　　ＴＧＧｋＧＴＧＣＧＣＡＴＡ
ＣＣＴＡＣＴＡ　　ＧｋＴＴＧ入ＡＣＴＡ　　ＣＴＧＣ
ＡＣＣＴＧＣＡＣＴＧＡＴＧＡＡＧＴｒＴＣＣＴＣＧＧ
ＣＴＧＴＡＴＧＡＴＧＡ　ＧＧＣＧＡＣＧＡＣＧ　Ａ。 ＴＴｒＣＣＴＣＡＴＣＴｆｆＩＴＣｒＴＣＧ　ＴＡＣＧ
ＣＴＣＣＧＡ　ＣＴＧＴＴＣＣＧＣＴ　ＴＣＣ’１ＴＧ
ＧＣＣＧ　ＧＧＣＧＣＴＣＴＴＴＡＡＧＴＣＴＴＩＴＡ
　　ＣＡＣＴＡＣＡＴＣＡ　ＧＧＡＧＣＴＧＧＧＧ　ｒ
、−ＡＣＣＧＡＡＡＧＣＧ　ＴＧＣＣｒＧＣＣＧＣＣＣ
ＧＴＡＴＴＣＡＣＧ［ＧＣＡＡＧＧＧＡＧＡ　ＡＧＧＡ
ＧＭＧＧＣＣＴＣＴＴＣＡＣｒＣＴｔｃＣＡＣＣＡＣＡ
ＧＡ　ＡＴＧＣＡＡＴＧＣＡ　ＣＴＣＴＴＧＣＡＣＴ　
Ｇ［ＧＧＡＣＴＧＣＡＧ １０　　　　　　　　２０　　　　　　　　　コ０　　
　　　　　　　４０　　　　　　　　　５０　　　　　
　　　　６０ＣＴＧＣＡＧＡＡＣＣＴＣＣＴＣＴ！　　
ＡＴＣλＧＧＣＴ入Ｔ　　ＧＴＣＡＡＡＣＡＧＧ　　Ｃ
ＴＡＴＧＴＣ入入入　ＣＡＧＧＴＣＡＡＧＣＴＣＣＡ’
Ｉ’ｒＣＣＭ　　ＡＴ？ＴＧＡＡＣ入ＡＴＡＧＧＡＴＧ
ＡＴＧ　　ＣＡＧＧＧＡＧＡＴＣＣＧＣＣＣＡＴＣＣＴ
　入入入ＧＧ’ｆｆＴＴＧＡＧＣＴＴＴＧＡＴｒ　　Ｇ
ＣｋＣＣｈＡＡＴＧＧＣＡＴＣＡＡＣＴＡ　ＴＣ入ＡＧ
ＣＧＣ入ＡＧＡＧＣＣＡＴＡＡＧ　ＧＡＧＧＴＧＡＴＡ
Ｇ５コ０　　　　　　　　５４０ ＡＧＣＡＣＡＧＴＧＡ　　ＡＧＣＡＡＧにＧＧＧＩＧ　
７ ＡＧＡＧＭＡＡＡＡ　　ＡＣＧＡＣＴＧＧＣＧ　　ＡＴ
ＣＣＴＡＣＴＴ”ｌ”　　ＴＧＡＴＣＧＴＧＡＧ　　Ｃ
ＣＡＣＴＣＣＡＧＡ　　ＴＣＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣにＴ
ＣＧＴＩ’ＣＡ　　ＣＣＡＧＡＧＣＣ？ＣＧＣＡＧＡＧ
ＣＴＣＧ　　ＭＡＣＣＴＧＣＡＧ５５０　　　　５６０
　　　　５７０　　　　５８０　　　　５９０　　　〆
′；πＡＡＡＴＴＣＡＣＡＡ　　ＣＡＧＡＣＴＡＣＴ入
　入ＴＡ入入ＴＴ入ＡＣＣＣＴ入入ＡＴＴＴＴ　　ＴＴ
ＧＡＡＡＣＡＡＣＣＴｋｋＧＣＧＴＧｋ５１Ｃ

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）制限断片長多型性プローブの一部分に充分
   相補的であり、蛍光分子でラベルされている少なくとも
   一つのオリゴデオキシリボヌクレオチドをプライマーと
   して用いてこれをオリゴデオキシリボヌクレオチド延長
   酵素の存在下に制限目標ＤＮＡ試料とハイブリダイズさ
   せ； （ｂ）（ａ）段階のハイブリダイゼーシヨン混合物をポ
   リアクリルアミドゲル電気泳動にかけ； （ｃ）前記電気泳動後のハイブリダイゼーシヨン混合物
   中に存在する全ての蛍光分子を光励起し； （ｄ）前記光励起された蛍光分子の存在及び位置を同定
   する； 各段階から成る迅速な制限断片長多型性分析方法。
2. （２）夫々が異なる制限断片長多型性プローブに対する
   プライマーとして有用であり、且つ夫々が異なる波長の
   蛍光を発する蛍光分子でラベルされている、二つ以上の
   前記オリゴデオキシリボヌクレオチドを段階（ａ）のハ
   イブリダイゼーシヨン混合物の調製に使用することを特
   徴とする請求項１記載の方法。
3. （３）前記オリゴデオキシリボヌクレオチド延長酵素が
   ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項１記
   載の方法。
4. （４）前記ＤＮＡポリメラーゼがシーケナーゼであるこ
   とを特徴とする請求項３記載の方法。
5. （５）段階（ｃ）の光励起がレーザービームで行なわれ
   ることを特徴とする請求項１記載の方法。
6. （６）前記レーザービームが広帯域レーザーから発生さ
   れることを特徴とする請求項５記載の方法。
7. （７）前記光励起及び検出段階（ｃ）及び（ｄ）に先立
   って、電気泳動後のハイブリダイゼーション混合物を膜
   に移すことを更に含む請求項１に記載の方法。
8. （８）電磁波放出源； 一つ以上の蛍光発色団ラベル化制限断片多型性プローブ
   プライマーと制限ＤＮＡ試料とのハイブリダイゼーショ
   ンから得られた電気泳動ゲルパターンであって、前記放
   出源がその放出を前記電気泳動ゲルパターンに向けるよ
   うに配置されているもの；出力信号を発生する、前記電
   気泳動ゲルパターン中の蛍光を検知する手段；及び 前記蛍光に応答する前記検知器によって発生した信号を
   受信する手段から成る、蛍光発色団ラベル化制限断片長
   多型性プローブプライマー及び延長プライマーを検出す
   る装置。
9. （９）更に、一つ以上の集束レンズを前記電磁波放出源
   及び前記電気泳動ゲルパターンの間に有することを特徴
   とする請求項８記載の装置。
10. （１０）更に、前記電磁波放出源と前記電気泳動ゲルパ
    ターンとの間に電磁波を消去するための手段を有し、前
    記電磁波放出源から選択された放出波長のみが前記電気
    泳動ゲルパターンに向けられることを特徴とする請求項
    ８に記載の装置。
11. （１１）出力信号を発生する、前記電気泳動ゲルパター
    ン中の蛍光を検知する前記手段が放出スペクトログラフ
    及び高感度リニアフォトダイオードアレイ検出器を含む
    ことを特徴とする請求項８に記載の装置。
12. （１２）少なくとも二種の核酸試験試料間の核酸配列に
    おける変化を検出する方法であって、 （ａ）適当なハイブリダイゼーシヨン条件下で、前記核
    酸試験試料を制限断片長多型性プローブの一部分と充分
    に相補的でありプライマーとして用いる少なくとも一つ
    のオリゴヌクレオチドと接触させ； （ｂ）前記ハイブリダイゼーシヨン混合物を増強させ；
    そして （ｃ）前記ハイブリダイゼーシヨン混合物の増強生成物
    を検出する； ことを含む、前記方法。
13. （１３）前記核酸試験試料が真核ゲノムＤＮＡを含むこ
    とを特徴とする請求項１２に記載の方法。
14. （１４）前記核酸試験試料にハイブリダイズしたときに
    、プライマー間の領域において核酸試験試料と相補的な
    核酸鎖を作成するためにＴａｑＤＮＡポリメラーゼが使
    用できるように配向されている二つの前記プライマーを
    使用することを特徴とする請求項１２に記載の方法。
15. （１５）前記増強がポリメラーゼ鎖反応法を用いて実施
    されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
16. （１６）前記ハイブリダイゼーシヨン生成物の増強生成
    物の検出がゲル電気泳動によつてなされることを特徴と
    する請求項１２に記載の方法。
17. （１７）前記ハイブリダイゼーション混合物の増強生成
    物がラベルされていることを特徴とする請求項１２に記
    載の方法。
18. （１８）前記ハイブリダイゼーシヨン生成物の配列決定
    を更に含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
19. （１９）更に、前記ハイブリダイゼーシヨン混合物の増
    強生成物を変性し、そして非相補的配列間の検出可能な
    ハイブリダイゼーシヨンは許さないようなハイブリダイ
    ゼーシヨン条件下で、既知の配列変化に対応するラベル
    化オリゴマーを用いて再びハイブリダイズさせ、そして
    前記すでに変性された増強生成物とハイブリダイズした
    ラベル化オリゴマーを検出する段階を含むことを特徴と
    する請求項１２に記載の方法。
20. （２０）前記核酸試験試料を （ａ）固定プライマー；及び （ｂ）少なくとも二つの可変プライマーと接触させ、（
    ｂ）の各プライマーはその３′末端において少なくとも
    １つの塩基が異っており、そして各々が異なるラベルで
    ラベル化されており、前記接触が非相補的配列間の検出
    可能なハイブリダイゼーシヨンを許さないハイブリダイ
    ゼーシヨン条件下で行なわれ、そして（ｂ）のラベルの
    存在を検出することを特徴とする請求項１２に記載の方
    法。
21. （２１）前記可変プライマーが前記核酸試験試料の異な
    る遺伝子座に対応することを特徴とする請求項２０に記
    載の方法。
22. （２２）核酸試験試料の少なくとも二つの領域間の核酸
    配列変化を決定する方法であつて、 （ａ）各々が制限断片長多型性プローブの異なる部分に
    充分相補的である二つの異なるオリゴマーと核酸試験試
    料をハイブリダイゼーションに適当な条件下で接触させ
    ； （ｂ）前記ハイブリダイゼーシヨン混合物を増強し； （ｃ）増強生成物を単離し；そして （ｄ）増強生成物を配列決定する； ことから成る前記方法。
23. （２３）前記増強がポリメラーゼ鎖反応によつて行なわ
    れることを特徴とする請求項２２に記載の方法。