JPS62249049A - 分離されたオリゴヌクレオチド類を電気泳動的に検出する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般的に分子分離技術に関し、特にゲル電気泳
動により分離されたオリゴヌクレオチド類の同定技術に
関する。

分子生物学における多くの掻作はＤＮＡ或いはＲＮＡの
異種混合物が質量、電荷、立体配置、等電点などに従っ
て同種成分に電気泳動的に分離されるべきことを要求す
る。同種成分は次いで密度計量法或いは放射性、蛍光、
或いは発色標識付により検出される。各々のその様な同
定方法はそれ自身の利点及び欠点を有する０例えば、ゴ
ールド及びマシュース（Ｇｏｕｌｄ　ａｎｄ　Ｍａｔｌ
ｈｅｗｓ）　　’核酸及びオリゴヌクレオチド類の分離
方法（ＳｅｐａｒａｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　ａｎｄ　Ｏｌｉｇｏｎｕ
ｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）　Ｊ（Ｎｏｒｔｈ−ｆｌｏｌｌａ
ｎｄ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ５ｐａｎｙ、アムス
テルダム、１９７６）　３３７〜３４４頁。例えば、最
近までＤＮＡ配列決定技術は専ら電気泳動により分離さ
れたオリゴヌクレオチド類の区別のために放射性標識に
頼ってきた。放射性標識は極めて感度が高く、対象分子
中に容易に導入することができる。しかしながら、それ
らの用途には幾つかの固有の欠点がある。即ち、オート
ラジオグラフィにおいては、分離は崩壊粒子の飛跡の全
方向性、オートラジオグラフィエマルジョンの厚さ及び
距離、及びエマルジゴン内に記録される信号の累積的性
質により制限される。放射性標識は、標識が特別の取扱
い及び処分を受けることを要求する実験室的健康の危険
がある。及び、最後に放射性標識は適当な信号対騒音分
離のために長い曝露及び計数時間を必要とする。この後
者の欠点は標識が自動化技術例えば異った種類の標識付
られたヌクレオチドのバンドが単一の電気泳動レーンを
横切る際に迅速に同定されなければならない場合の自動
化ＤＮＡ配列決定等と共に用いられる場合には特に深刻
である。実際的同定のためのヌクレオチド−特異性放射
性標識がないのみならず、仮にあったにせよオートラジ
オグラフィ或いはシンチレーションなどの現在の検出技
術は余りにも時間がかかりすぎる。その結果、蛍光標識
付手段がＤＮＡ配列決定技術に使用するために探索され
ている。

蛍光標識は適用後直ちに検出することができ、それらは
取扱いが便利であり、且つそれらは標識付られた分子の
正確な位置付及び定量を可能にする。

ゲル電気泳動により分離されるオリゴマーの系列例えば
その構成員が塩基数においてのみ異るオリゴマーの系列
などに対する蛍光標識の選択には幾つかの要因が拘束す
る。先ず、標識は広範なバンドの広がりが生ずるような
電気泳動・易動性に悪影響を及ぼしてはならない。又、
電気泳動易動性に対する標識の相対的効果は一個以上の
バンド位置が逆転成いは重複してバンドの順序及びオリ
ゴマー系列の自然の順序の間の対応を破壊するようであ
ってはならない。不幸にして、ある任意に選ばれた結合
標識例えば有機染料に対するオリゴマーの電気泳動的挙
動を確実に予測する信頼できる方法は存在しない。電気
泳動的分離のための操作は通常経験的に到達されるが、
電気泳動的易動性を決定する二つの主たる要因は電荷及
び分子量である。その他の重要な因子としてはオリゴマ
ーの立体配置及びゲル重合体密度などが挙げられる、ゴ
ールド及びマシュース「核酸及びオリゴヌクレオチドの
分離方法Ｊ　（Ｎｏｒｔｈ−１１ｏ１１ａｎｄ　Ｉ’ｕ
ｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ、アムステルダム、１
９７６）　、３１３頁。

第二に、数個の区別された標識が必要とされる場合に、
染料の選択は相当に重複した発光バンドを存する。しか
しながら、有機蛍光染料に対する発光半値幅が典型的に
４０〜８０ナノメータであり、及び可視スペクトルの幅
が僅かに約３５０〜４００ナノメータであるとすると、
三個以上の区別された蛍光標識が必要とされる場合に相
当な重複なしに適当な蛍光染料の選択を見出すことは極
めて困難である。更に、数個の蛍光染料が用いられる場
合には、染料の吸収バンドがしばしば広く分離されるた
めに励起が困難となる。最も効率的な励起は各染料がそ
の吸収帯最大波長に対応する波長において照射された際
に生ずる。数種の染料が一緒に用いられた場合には、検
出計の感度と各染料に対する別々の励起源を与えるコス
トの増加の間に妥協を行うことが余儀なくされる。最後
に、蛍光標識は標識される分子を創出し、或いは操作す
るために用いられる化学と適合性がなければならない。

例えば、ＤＮＡの酵素的配列決定において、ブライマー
を標識付するために用いられる蛍光染料はＤＮＡポリメ
ラーゼの活性を妨害することができない。

スミス等（Ｓｓｆｔｈ　ｅｔ　ａｌ、）は［５′末端に
脂肪族アミノ基を含有するオリゴヌクレオチドの合成：
ＤＮＡ配列分析に使用するための蛍光ＤＮＡブライマー
の合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅｓＣｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ａｎ　Ａ１１
ｐｈａｔｉｃ　Ａｍ１ｎｏ　Ｇｒｏｕｐ　ａｔ　ｔｈｅ
　５’Ｔｅｒｍｉｎｕｓ　：　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏ
ｆ　Ｆｌｕａｒｅｓｃｅｎｔ　　ＤＮＡＰｒｉｍｅｒｓ
　ｆｏｒ　Ｕｓｅ　ｉｎ　ＤＮＡ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　
Ａｎａｌｙｓｉｓ）　Ｊ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｖｏｌ、　１３＋　２３９９−
２４１２頁、（１９８５）　）において、電気泳動によ
り分離されたオリゴヌクレオチド類を標識付けるための
酵素的ＤＮＡ配列分析に使用するための四つの蛍光染料
の組を開示している。この組の各染料を用いて同一の３
′末端ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド類の電
気泳動ゲルバンド上で同定が行われている。

１１Ｆυｉ叉 本発明の方法に従えば、四組の蛍光染料を用いて４種類
までのオリゴヌクレオチド類がゲル上で電気泳動的に分
離された場合には常にオリゴヌクレオチド類を検出する
。以下の組の染料の各々からの構成員は以下に説明する
ゲル電気泳動条件下においていづれの他の組の構成員に
関して分光学的に解離可能であることが判明した。

組ｌは次式により規定されるフルオレセイン誘導体より
なる： （式中、Ａは染料のフルオレセイン部分をオリゴヌクレ
オチド上の相補的官能基に結合するために使用すること
のできる５或いは６炭素位における結合官能基であり、
及びＢは酸性アニオン基、好ましくはカルボキシル基或
いはスルホン酸基、最も好ましくはカルボキシル基であ
る）。

次の表はＡにより表わされる結合官能基、それらの相補
的官能基及び本発明において使用するのに適した得られ
た結合基を例示する。

５ＯｚＸ　　　　　　　　Ｎ）ｌｘ　　　　　　５ＯＪ
Ｈ−好ましい結合官能基は相補的官能基がアミンである
場合には常にイソチオシアネート、スルホニルクロライ
ド、４．６−シクロロトリアジニルアミン或いはスクシ
ニミジルカルボキシレートである。及び、好ましくは結
合官能基は相補的官能基がスルフハイトリルである場合
には常にマレイミド或いはヨードアセトアミドである。

組■は次式により規定されるジクロロジメトキシフルオ
レセインの誘導体よりなる： （式中Ａ及びＢは上記と同義である）。

組■は次式により規定される５或いは６炭素位において
結合官能基で誘導されたテトラメチルローダミンよりな
る： （式中、Ａ及びＢは上記と同義である）。

組■は次式により規定されるローダミンＸ誘導体よりな
る： （式中、Ａ′は上記Ａにより表わされるような結合を官
能基或いは上記Ｂにより表わされるような酸性アニオン
基であり、及びＢ′はＡ′が結合官能基である場合には
常に酸性アニオン基であり、及びＢ′はＡ′が酸性アニ
オン基である場合には常に結合官能基である）。

より好ましくは、Ａ′はＡにより表わされるようなスル
ホン酸或いは結合官能基であり及びＢ′はＡ′が結合官
能基である場合には常にカルボン酸或いはスルホン酸で
あり、及びＡ′がスルホン酸である場合には常にＢ′は
結合官能基である。本発明に従えば分離に先立ち、各種
類のオリゴヌクレオチド内の構成員が同−組から選ばれ
た染料で標識付されて異った種類の構成員は異った組か
らの染料で標識付されるように染料、オリゴヌクレオチ
ド複合体を形成する。即ち、各種類は組Ｉ。

■、■或いは■（又それぞれ第一乃至第四の組とも称さ
れる）の異ったものに対応する。標識付後、全種類の構
成員が合体されて混合物を形成する。

この混合物を次いでオリゴヌクレオチドを１個或いは２
個の寸法的電気泳動分離の基礎を形成する質量、電荷、
立体配置及び／又はその他の特性に従って分離するため
にゲル電気泳動にかける。これらの種類内及び種類間の
その様な特性に関するオリゴマー系列は同様に分離され
た例えばゲル上のオリゴヌクレオチドのバンドの相対的
位置により決定される。最後に、同様に分離されたオリ
ゴヌクレオチドに結合した染料を蛍光を発せしめそれら
の種類の同定を結合した染料の蛍光或いは吸収スペクト
ルにより行う。

オリゴヌクレオチド類の種類は各種状況において生じ得
る。例えば、それらは制限酵素の消化物の生成物として
生じ得る。好ましくは、本発明に従って同定される種類
は四つの可能性のある末端塩基及び四組の分光学的に解
離可能な染料の組の間に対応が確立されるように核酸の
末端ヌクレオチド類の関係において規定される。より好
ましくは、これらの種類は核酸の化学的或いは酵素的配
列の関係において生じ、最も好ましくは、これらの種類
はＤＮＡの酵素的配列下の関係において生ずる。本発明
に従って同定可能であるための種類に対する必要条件は
、（１）その種類のオリゴヌクレオチド類がゲル電気泳
動により分離が可能であること、（２）それらが本発明
の染料による標識付が可能であること、及び（３）それ
らの種類がある一つのオリゴヌクレオチドが一つの種類
の構成員のみであり得るという点において相互に排他的
であることである。

ここにおいて用いられる「分光学的に解離可能」という
用語はある組における染料の蛍光発光バンドが他のいず
れの組の染料のそれとも染料が結合した種類のオリゴヌ
クレオチドが標準的光検知系統により区別することがで
きるように十分に区別されること即ち十分に非−重複的
であることを意味する。

ここにおいて用いられるオリゴヌクレオチドとは約１０
〜１０００塩基長（一本積の場合）或いは１０〜１００
０塩基対（二本鎖の場合）の大きさの範囲のＤＮＡ或い
はＲＮＡの一本積或いは二本鎖を意味する。

これらの組の染料の利点はそれらのゲル環境における分
′光学的特性の性質から生ずるものである。

特に、電気泳動的分離に適したゲル環境は組Ｉ及び■の
染料の吸収及び発光バンドにおける赤色方向への約１０
〜１５ｎｍのシフトを引起こす。吸収バンドのシフトは
相当に最もコスト有効性の励起源であるアルゴンイオン
レーザ−の主たる発光線である５１４ｎｍの光で染料が
励起されることのできる効率を増大させる。又、組Ｉか
らの染料の発光バンドは５１４ｎｍ発光からシフトして
相当に染料が５１４ｒｖの光で照射された場合に常にこ
れらの染料から発光信号で集められる散乱光の量を相当
に減少させる。

本発明の方法はゲル電気泳動により分離されたオリゴヌ
クレオチド類を蛍光的に標識付するための化学的及び酵
素的ＤＮＡ配列技術への直接の応用を見出すものである
。

光里（７）Ｊ１体煎糞里 本発明は同一ゲル上で質量、電荷、立体配置或いはその
他の性質に従って電気泳動的に分離された四つまでの予
め定められた種類のオリゴヌクレオチド類を検出するた
めの方法を含むものである。

この方法は各種類のオリゴヌクレオチド類を上記四つの
組の染料の別々の一つから選ばれた染料で標識付するこ
とにより達成される。その様な標識付は各種類が区別さ
れた且つ分光学的に解離可能な蛍光標識を有することを
確実にする。

組Ｉは５或いは６炭素位のいづれかにおいて（カラーイ
ンデックス付番系により決定）結合官能基でモノ−誘導
化されたフルオレセインよりなる。

組■の構成員の具体例としてはフレオレセイン−５−イ
ソチオシアネート、フルオレセイン−６−イソシアネー
ト（−５−及び−６−形態は集合的にＦＩＴＣと称され
る）、フルオレセイン−５−スクシニミジルカルボキシ
レート、フルオレセイン−６−スクシニミジルカルボキ
シレート、フルオレセイン−５−ヨードアセトアミド、
フルオレセイン−６−ヨードアセトアミド、フルオレセ
イン−５−マレイミド、及びフルオレセイン−６−マレ
イミドなどが挙げられる。これらの組Ｉの構成員の具体
例は市販されており例えばモレキュラープローブズ社（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ＋　Ｉｎｅ、）　　
（オレゴン州ジャンクション市）、或いは標準的技術を
用いて合成することができる。

組■は５或いは６炭素位（これらの炭素はカラーインデ
ックス付番系に従って同定される）において結合官能基
でモノ−誘導化された２′、７’−ジメトキシ−４′、
５’−ジクロロフルオレセインよりなる。組Ｈの構成員
は米国特許４，３１８，８４６号明細書に開示される２
、７−シメトキシー４゜５−ジクロロ−９−（２’　、
４’−ジカルボキシフェニル）−６−ヒドロキシ−３Ｈ
−キサンチン−３−オン及び２，７−シメトキシー４．
５−ジクロロ−９−（２’　、５’−ジカルボキシフェ
ニル）−６−ヒドロキシ−３Ｈ−キサンチン−３−オン
（ＩＵＰＡＣ表示）の標準的修正により得ることができ
る。従って、米国特許４，３１８．８４６号は本発明に
おいて準用する。例えば、これらの化合物の４′及び５
′カルボキシ類をＮ−ヒドロキシスクシニミドとジシク
ロへキシルカルボジイミドを用いて縮合させて上記特許
（２８〜２９欄）の具体例６及び８により例示されるよ
うなアミン−選択性結合基を形成することができる。カ
サイ等（Ｋａｓａｉ　　ｅｔ　　ａｌ、）（Ａｎａｌ、
　　Ｃｈｅｓ＋、　　Ｖｏｌ、　　４７＋　　　　　３
　４〜３７頁１９７５）はその様な縮合の基本的技術を
開示する。従ってカサイ等は本発明において準用する。

その様な反応から生ずる組■の染料は２′、７’−ジメ
トキシ−４′、５’−ジクロロフルオレセイン−５−ス
クシニミジルカルボキシレート及び２′、７’−ジメト
キシ−４′、５’−ジクロロフルオレセイン−６−スク
シニミジルカルボキシレート（−５−及び−６−形態は
集合的にＤＤＦＣ３と称される）である。

組■は５或いは６炭素位のいずれかにおいて結合官能基
でモノ−誘導化されたテトラメチルローダミンよりなる
０組■の構成員の具体例としてはテトラメチルローダミ
ン−５−イソチオシアネート、テトラメチルローダミン
−６−イソチオシアネート（−５−及び−６−形態は集
合的にＴＭＲＩＴＣと称される）、テトラメチルローダ
ミン−５−ヨードアセトアミド、テトラメチルローダミ
ン−６−ヨードアセトアミド、テトラメチルローダミン
−５−スクシニミジルカルボキシレート、テトラメチル
ローダミン−６−スクシニミジルカルボキシレート、テ
トラメチルローダミン−５−マレイミド及びテトラメチ
ルローダミン−６−マレイミドなどが挙げられる。これ
らの例示染料は市販されており、例えばモレキュラープ
ローブズ社、或いは標準的技術を用いて合成することが
できる。

組■は分子の酵素複素環に結合した二置換フェニルを有
するローダミンＸ誘導体よりなり、置換基の一つはフェ
ニルの４′或いは５′炭素（ＩＵＰＡＣ付番）に結合し
た結合官能基であり、他方は２′炭素に結合した酸性ア
ニオン基である。組■の構成員の具体例としてはテキサ
スレッド（ＴｅにａｓＲｅｄ）　（モレキエラーブロー
ブス社の商標名）、ローダミンＸ−５−イソチオシアネ
ート、ローダミンＸ−６−イツシオシアネート、ローダ
ミンＸ−５−ヨードアセトアミド、ローダミンＸ−６−
ヨードアセトアミド、ローダミンＸ−５−スクシニミジ
ルカルボキシレート、ローダミンＸ−６スクシニミジル
カルポキシレート、ローダミンＸ−５−マレイミド、及
びローダミンＸ−６−マレイミドなどが挙げられる。こ
れらの殆んどの例示染料は例えばモレキュラーブローブ
ズ社から市販されており、或いは標準的技術を用いて合
成することができる。例えばテキサスレッドの場合には
それはチッス等（Ｔｉｔｕｓ　ｅｔ　ａｌ、）、「テキ
サスレッド、二重パラメータ流微量蛍光計量及び蛍光顕
微鏡研究におけるフルオレセインと共に使用するための
親水性赤色発光性蛍光発色団（Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ、ａ
　Ｈｇｄｒ−ｏｐｈｉｌｉｃ、Ｒｅｄ−Ｅｍｉｔｔｉｎ
ｇ　　Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ　　ｆｏｒ　　Ｕｓｅｗ
ｉｔｈ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｉｎ　Ｄｕａｌ　Ｐ
ａｒａｍｅｔｅｒ　Ｆｌｏ−旧ｃｒｏ−ｆｌｕｏｒｏｍ
ｅｔｒｉｃ　ａｎｄ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｍｉ
ｃｒｏｓｃｏｐｉｓＳｔｕｄｉｅｓ）　Ｊ　　［Ｊ、Ｉ
ａ＋ａ＋ｕｎｏｌｏｇｉｃａ１．　　Ｍｅｔｌ＋ｏｄｓ
、　　Ｖｏｌ。

５０．１９３〜２０４頁（１９８２）　）に説明される
操作により合成される。５−及び６−カルボキシ誘導体
は例えば米国特許３，９３２，４１５号に開示される標
準的技術を用いて合成することができ、この特許は本発
明において準用する。この５−或いは６−カルボキシル
基は次いで標準的技術により結合官能基に転換される。

例えば、ローダミンＸ−スクシニミジルカルボキシレー
トはミュラー等（Ｍｕｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）、のＥ
ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
＋Ｖｏ１．１００．２１３〜２１７頁（１９７６）に開
示される技術により形成される。従って、この文献は本
発明において準用する。

染料はオリゴヌクレオチドに標準的方法を用いて結合さ
れる。例えば総説としてホーグランド（Ｈａｕｇｌａｎ
ｄ）、「共有蛍光プローブ（Ｃｏｖａｌｅｎｔ　Ｆｌｕ
ｏ−ｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｂｅｓ）　Ｊ、［バイオポ
リマーの励起状ｇ（Ｂｘｃｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　ｏ
ｆ　Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）　Ｊスタイナー（Ｓｔｅ
ｉｎｅｒ）　ＩＩ所収（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ＋ニ
ューヨーク、１９８３）　、２９〜５８頁。これらの頁
は本発明において準用する。最近、反応性官能基をオリ
ゴヌクレオチドに結合させてオリゴヌクレオチド類の反
応性官能基を染料の結合官能基と縮合させることにより
共有染料−オリゴヌクレオチド複合体を形成することを
可能にする幾つかの技術が開発された。例えば上記スミ
ス等（Ｓｓｉｔｈ　ｅＬａｌ、）はオリゴヌクレオチド
の５′末端にアミン基を結合させる方法を開示し、及び
コノ１バＣｏｎｎｏ　Ｉ　ｌｙ）及びライダー（Ｒｉｄ
ｅｒ）　、ｒ遊離スルフヒドリル基を含有するオリゴヌ
クレオチド類の化学合成及び引続くチオール特異プロー
ブの結合（Ｃｈｅｓ＋１ｃａｌＳｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏ
ｆ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　Ｃｏｎｔａｉ
ｎｉｎｇ　ａＦｒｅｅ　　５ｕｌｐｈｙｄｒｙｌＧｒｏ
ｕｐ　ａｎｄＳｕｂｓｅｑｕｅｎｔＡｔｔａｃｈｍｅｎ
ｔｏｆ　Ｔｈ１ｏｌ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　Ｐｒｏｂｅｓ
）　Ｊ、（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃ
ｈ、　１１０１．１３．４４８５−４５０２頁（１９８
５）　］ばスルフヒドリル基を結合する方法を開示して
いる。

従って、これらの二つの文献は本発明において準用する
。

好ましくは、オリゴヌクレオチド上の反応性、即ち相補
的官能基はアミンである。そして、好ましくは反応性ア
ミンは「アミノ−誘導化亜リン酸塩及びリン酸塩結合剤
、ホスホルアミダイト前駆体、及びその有用な複合体（
Ａｍｉｎｏ−ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄＰｈｏｓｐｈｉｔ
ｅ　　ａｎｄ　　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　　Ｌｉｎｋｉｎ
ｇ　　Ａｇｅｎｔｓ＋Ｐｈｏｓｐ−ｈｏｒａｍｉｄｉＬ
ｅ　　Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ＋　ａｎｄ　Ｕｓｅｆｕｌ
　ＣｏｎｊｕｇａｔｅｓＴｈｅｒｅｏｆ）　」という名
称の同時係属中の米国特許出願５ｅｒｉａ１．　Ｎｏ、
　７６９．１７０　（１９８５年８月２６日出願）に開
示される結合剤により結合されるのが好ましい。従って
、この出願は本発明において準用する。

最も好ましくは反応性アミンは２−メトキシ−３−トリ
フルオロアセチル−１，３，２−オキサザホスファシク
ロペンタンをオリゴヌクレオチドに反応させることによ
り結合される。標識付された核酸を分離するためには標
準的電気泳動方法が用いられる。例えば上記グールド及
びマシューズ（Ｇｏｕｌｄ　ａｎｄ　Ｍａｔｔｈｅｔｍ
ｓ）　、Ｒｉｃｋｗｏｏｄ　ａｎｄ　！ｌａｍｅｓ編、
［核酸のゲル電気泳動：実際的接近手法（ＧｅｌＥｉｅ
ｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　：八　ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ
）　　Ｊ　　（ＩＲＬ　　Ｐｒｅｓｓ　　Ｌｉｎ＋１ｔ
ｅｄ＋　　Ｌｏｎｄｏｎ　　１９８１）、或いはオスタ
ーマン（Ｏｓ　ｔｅｒｍａｎ）、「蛋白質及び核酸の研
究方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎ
ｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ八ｃｉｄ　　へｅ５ｅａｒｃｈ）Ｊ
　　、　Ｖｏｌ、　　１（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　　−Ｖｅ
ｒｌａｇ。

Ｂｅｒｌｉｎ　１９８４）を参照。好ましくは、分離さ
れる核酸はオリゴヌクレオチド類である。

好ましくは、ゲルの種類は約２〜２０％の濃度（重量乃
至容ｆ）を有するポリアクリルアミドである。より好ま
しくはポリアクリルアミドゲル濃度は約４〜８％である
。好ましくは、ゲル鎖分離或いは変性剤を含有する。そ
の様なゲルを構成するための詳細な操作はマニアナイス
等（ＭＢｌｌｉａｔｉｓｅｔ　ａｔ、）　　’９８％ホ
ルムアミド或いは７Ｍ尿素を含有するポリアクリルアミ
ドゲル中における低分子ｌＤＮＡ及びＲＮＡの分画（Ｆ
ｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ　ｏｆＬｏｗ　Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ　Ｗｅｉｇｈｔ　ＤＮＡ　　及びＲＮＡ　ｉｎ　
Ｐｏ１ｙ−ａｃｒｙｌａｓ＋ｉｄｅ　Ｇｅｔｓ　Ｃｏｎ
ｔａｉｎｉｎｇ　　９８％ＦｏｒｌＩＩａｍｉｄｅｏｒ
　７Ｍ　Ｕｒｅａ）　Ｊ　　［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　
Ｅｎｚｙ＋ｉｏｌｏｇｙ　、　　Ｖｏｌ。

６５、２９９−３０５頁（１９８０）所収］、マニアナ
イス等（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）　’ポリア
クリルアミドゲル電気泳動による小さな二本鎖及び一本
積ＤＮＡ分子の鎖長決定（Ｃｈａｉｎ　Ｌｅｎｇｔｈ　
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆＳ＋＊ａｌｌ　Ｄｏ
ｕｂｌｅ−ａｎｄ　Ｓｉｎｇｌｅ−５ｔｒａｎｄｅｄ　
ＤＮＡ　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｓｂｙ　Ｐｏｌｙａｃｒｙｌ
ａｍｉｄｅ　Ｇｅｔ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
）Ｊ　　（Ｂｉｏｃｈｅｓ＋１ｓｔｒｙ　Ｖｏｌ、　１
４．３７８７−３７９４頁（１９７５）　）　：及びマ
ニアナイス等（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）　　
ｒ分子クローニング：ラボラトリーマニュ７）Ｌｔ　（
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）　Ｊ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇｔｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎ
ｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９Ｂ２）、１７９〜１８５頁などに
より与えられている。従って、これらの文献は本発明に
おいて準用する。ある特別の分離において用いられる最
適ゲル濃度、ρＩＩ、温度、変性剤の濃度などは被分離
核酸の大きさの範囲、それらの塩基組成、それらが−重
鎖であるか或いは二本鎖であるか及びそのための常法が
電気泳動により探索される種類の性質などを含む多（の
要因に応じて異る。従って、本発明の適用は特別の分離
のための条件を最適化するために標準的な予備試験を必
要とする場合がある。例えば約２０〜３００塩基の範囲
の大きさを有するオリゴヌクレオチドは次のゲル内にお
いて本発明に従って分離され検出された、ｐＨ８，３（
２５℃で測定）においてトリス−ホウ酸ＥＤＴＡ緩衝液
内で４８％（重量／容量）尿素と共に形成されたビス−
アクリルアミドに対する２５部〜１部のアクリルアミド
から作られた５％ポリアクリルアミド。このゲルは５０
℃において操作された。

ゲル上の染料−オリゴヌクレオチド複合体は標準的手段
、例えば高強度水銀蒸気ランプ、レーザーなどにより照
射される。好ましくは、ゲル上の塗料−オリゴヌクレオ
チドはアルゴンイオンレーザ−１特にアルゴンイオンレ
ーザ−の４８８及び５１４ｎａ＋発光線により発生され
るレーザー光により照射されるのが好ましい。これらの
線において同時にレーザーを発する幾つかのアルゴンイ
オンレーザ−が市販されている。例えばＣｙｏｎｉｃｓ
　Ｌｔｄ。

（カリフォルニア州、サニーヴ工−ル）モデル２００１
など。

１、　　ましい七ム　：２−メトキシ−３−トリフルオ
ロアセチル−１３２−オキサザホスクロロ−Ｎ、Ｎ−ジ
イソプロピルアミツメ　トキシホスフィン（５，ＯＩｄ
、　Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ。

（ウィスコンシン州、ミルウォーキー）より市販〕を０
°Ｃにおいてアルゴン下においてジクロロメタン（約４
０ｍ）中のＮ−（２−ヒドロキシエチル）−２，２，２
−トリフルオロアセタミド（３，９ｇ）及びジイソプロ
ピルエチルアミン（５，０ｄ）の撹拌された溶液に滴加
した。（Ｎ−２−ヒドロキシエチル）−２，２，２−）
リフルオロアセタミドヲラサルス及びペンコピツク（Ｌ
ａｚａｒｕｓ　ａｎｄＢｅｎｋｏｖ　ｉｃ）によりＪ、
　Ａｎｄ、　Ｃｈｅｎ＋、　Ｓｏｃ、、　Ｖｏｌ、１０
１．４３００〜４３１２頁（１９７９）に開示された方
法に従って合成した。即ち、５０Ｉｄのクロロホルム中
のトリフルオロ酢酸エチルエステル（５６，８ｇ　、　
０．４モル）を５０−のクロロホルム中の２４．４ｇ　
（０，４モル）のエタノールアミンの撹拌された溶液に
滴加した。

この溶液を室温で５時間撹拌し、ロータリーエバポレー
ションにより溶媒を除去し、１１５°Ｃ（４，３Ｔｏｒ
ｒ）で蒸留して、５８．５ｇの油状物を得、これは引掻
くと結晶化した。）室温で０．５時間撹拌後、反応液を
０．２Ｍ炭酸カリウム溶液で２回及び塩水で１回洗浄し
、乾燥しくＭｇ５ＯＪ及び減圧濃縮してＮ−（２−Ｎ’
　、Ｎ’　−ジイソプロピルアミノメトキシホスフィニ
ルオキシ）エチル−２，２，２−トリフルオロアセタミ
ドを無色液体として得た（７．７７　ｇ　＞。

’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤｚＣｌｚ）　　：δ３．６（６ＨＳ
ｍ）、３．４（３Ｈ，ｄ、、Ｊ　−１２）　、１．２（
１２Ｈ，ｄ、Ｊ＝６．５） ”　Ｐ　−Ｎ　Ｍ　Ｒｃｃｏｚｃｔｚ、　′Ｈ脱脱フッ
プリング：δ１４９　（ｓ）。

Ｎ−（２−（Ｎ’　、Ｎ’　−ジイソプロピルアミノメ
トキシホスフィニルオキシ）エチル）−２゜２．２−ト
リフルオロアセタミド（７，７ｇ）を蒸留（０，８Ｔｏ
ｒｒにおいて５８〜５９°Ｃ）して、定量的に２−メト
キシ−３−トリフルオロアセチル〜１．３．２−オキサ
ザホスファシクロペンタンを無色液体として得た。

ＩＲ（膜）：１７０５．１４２０．１２３０．１２０ｏ
、１１６ｏ、１０２０．９６５　　ｃｒｓ−’ ’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤｚＣＩｚ）　　　：　　δ４．４５
　　（２Ｈ、ｍ　）　、３．６５　（２Ｈ，、ｍ）　、
３．６０　（３Ｈ，ｄ、Ｊ＝１２） ”　Ｐ　−Ｎ　Ｍ　Ｒ（ＣＤＺＣｈ、　′Ｈ脱脱フップ
リング：６１３２（ｓ）　　、１２５　　（ｑ、Ｊ＝６
１）ＭＳ：ｍ／ｅ　　２１７　　（Ｍ”）　　、１９７
．１４８．１３６．１２３．１２０　．１０９．９２．
７９．７０（１００）　　、６９．６２２−メトキシ−
３−トリフルオロアセチル−１゜３．２−オキサザホス
ファシクロペンタンのオリゴヌクレオチドの５′ヒドロ
キシルへの結合は八ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ＋
＊ｓ　３８０Ａ　ＤＮＡシンセサイザー（八ｐｐｌｉｅ
ｄ　ＢｉｏｓｙｓＬｅｍｓ、カリフォルニア州、フォス
ター市）或いは同様の機器上で行った。カルザス等（Ｃ
ａｒｕｔｈｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、）、米国特許４，４５
８．０６６号明細書、カルザス等（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ
　ｅｔ　ａｌ、）米国特許４．４１５，７３２号明細書
、及びカルザス等（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓｅｔ　ａｔ）　
ｒデオキシオリゴヌクレオチドの新しい合成方法（Ｎｅ
ｗ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎ
ｇ　Ｄｅｏｘｙｏ−１ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）
」（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｖｏｌ
。

４．１〜１７頁（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ　、ニュー
ヨーク、１９８２）　）は八ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ　３８０　Ａ　ＤＮＡシンセサイザーにより
用いられる化学の詳細な説明を与えている。従って、そ
れらの説明について、これらの文献を本発明において準
用する。ニーメトキシ−３−トリフルオロアセチル−１
，３，２−オキサザホスファシクロペンタンを０．２Ｍ
アセトニトリル溶液として０．５Ｍテトラゾール／アセ
トニトリル溶液と組合せて使用し、合成サイクルにおけ
る活性化試薬を形成した。通常のシンセサイザーサイク
ルは活性化試薬の添加に際してのみ次の様に修正された
。活性化試薬は各添加後の１時間の待時間をもって２回
添加された。カップリング収率は約９５％であった。チ
オフェノール／トリエチルアミン及び次いで水酸化アン
モニウムを用いる通常の脱保護は５′−アミノエチルホ
スフェートオリゴヌクレオチドを与えた。活性化試薬が
０．２Ｍ　　２−メトキシ−３−トリフルオロアセチル
−１，３，２−オキサザホスファシクロペンタン及び０
０１Ｍ　　４−ジメチルアミノピリジンを含有するアセ
トニトリル溶液よりなる場合も同様な収率が得られた。

この場合において、修正された活性化試薬は一度添加さ
れ、約２〜３分間反応させられた。

トリフルオロアセチル保護基を結合剤から濃水酸化アン
モニウムで処理して、５′−アミノエチルホスフェート
オリゴヌクレオチドを得た。染料の露出アミノ基への結
合は以下の具体例において説明されるような標準的操作
により達成された。

Ａ、ＦＩＴＣ Ｆ　Ｉ　ＴＣ（１０ｍｇ／ｍｌ濃度の２５μ尼、例えば
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｉ”ｒｏｂｅｓ社、オレゴン州、
ジャンクションティから市販されているもの）のＤＭＦ
溶液を水（２００μｌ及びＩ　Ｍ　　Ｎａｏｃｏｆｆ、
／Ｎａ２１１ｃｏ３緩衝液、ｐｉｌ　９．０　（２５μ
ｌ）中の５′−アミノエチルホスフェートオリゴヌクレ
オチドの溶液に添加した。

得られた溶液を暗所において６時間以上貯蔵した。

未複合化染料を除去するために反応液を平衡化された１
０Ｉｄの５ｅｐｈａｄｅｘ　　Ｇ　　２５　（媒体）　
（Ｐｈａｒ−ｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｇの商標名）のカラムを水と共に通過させた。排除容積
内に溶出する着色物質のバンドを集めた。粗製５′−フ
ルオレセインアミノエチルホスフェートオリゴヌクレオ
チドをポリアクリルアミドゲル電気泳動或いはＶｙｄａ
ｃ　Ｃ１８カラム（Ｎｏ、２１８　ＴＰ５４）上のＨＰ
ＬＣ（例、ＰｅｒｋｉｎＨｌｎｄｅｒ　　５ｅｒｉｅｓ
　４　、或いは同様の装置）などにより１０〜２０％ア
セトニトリル１０．１Ｍｌリエチルアンモニウムアセテ
ート、ｐＨ７，０の線形勾配中において精製した。

Ｂ、ＴＭＲＩＴＣ ＴＭＲＩＴＣ（２０■／Ｉ１１濃度の１０μｌ、例えば
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｏｒｇａｎｉｃｓ　Ｉｎｅ、オハイ
オ州クリープライド、或いはＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒ
ｏｂｅｓ、　Ｉｎｃ、オレゴン州ジャンクション市、よ
り市販されているもの）のＤＭＦ溶液を水（８８μｌ）
及びＩＭ　　ＮａＨＣＯｉ／ＮａｚＣＯｚ緩衝液、ｐＨ
９（２μｎ中の５′−アミノエチルホスフェートオリゴ
ヌクレオチド（１８−ｍａｒ）　（０，００４μモル）
の溶液に添加した。得られた溶液を暗所において６時間
以上貯蔵した。反応液を０．１Ｍ）リエチルアンモニウ
ムアセテート、ｐＨ７，０で平衡化された１　０　ｍｌ
　　５ｅｐｈａｄｅｘ　　Ｇ　−２５（媒体）カラムを
通した。排除容積内の着色物質のバンドをＦ　ＩＴＣと
同様に精製した。

Ｃ，Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄを５′アミノエチルホスフエートオ
リゴヌクレオチドに結合させる操作はＴＭＲＩＴＣにつ
いて用いたのと同一の操作に従って達成することができ
る。

Ｄ、ＤＤＦＣ５ ＤＤＦＣ３（０，３■）を１０μ２の水及びＬＭＮａｔ
ＨＣＯｚ／ＮａｚＣＯｚ　緩衝液、ｐＨ９，０（１０ｕ
ｆ）中の５′−アミノエチルホスフェートオリゴヌクレ
オチド（１８ｍａｒ）　（０，００６９モル）の溶液に
添加した。得られた溶液を暗所に５時間貯蔵し、ＦＩＴ
Ｃに対すると同様にして処理した。

ＤＮＡ配列分析は化学的且つ商業的に極めて有用である
。ＤＮＡ断片の配列決定のための二つの主たる技術は化
学的方法例えばマクサム及びギルバート（Ｍａｘａｍ　
ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ）、Ｐｒｏｃ　　Ｎａｔ、　Ａ
ｃａｄ。

Ｓｃｉ、、　Ｖｏｌ、　７４　、ｐ、５６０　　（１９
７０）　、及び酵素的複製方法例えばスミス（Ｓｎ＋１
ｔｈ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　Ｅｎｚｙ−ｍｏｌｏ
ｇｙ：Ｖｏｌ、　６５、Ｇｒｏｓｓｍａｎ及びＭｏｌｄ
ａｖｅ編、５６０−５８０頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ　ｒ’
ｒｅｓｓ　、ニューヨーク、１９８０）、及びサンガー
等（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　Ｖｏｌ、７４．５３６３−５
３６７頁（１９７７）などである。本発明の方法は放射
性標識の代りに蛍光標識を置換するためにいづれの技術
にも適用することができる。本例において、如何にして
本発明を、サンガー等（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）
　ｒ迅速ＤＮＡ配列化への一助としての一末鎖バタテリ
オファージにおけるクローニング（Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｉ
ｎ　Ｓｉｎｇｌｅ−５ｔｒａｎ−ｄｅｄ　Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｐｈａｇｅ　ａｓ　ａｎ　Ａｉｄ　ｔｏ　Ｒａｐｉ
ｄ　ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）　Ｊ、（Ｊ、　Ｍｏ
１．　Ｂｉｏｌ、、Ｖｏｌ、　１４３．１６１−１７８
頁（１９８０）　）　、及びシュライヤー及びコルテー
ス（Ｓｃｈｒｅｉｅｒ　ａｎｄ　Ｃｏｒｔｅｓａ　）　
ｒ−末鎖バクテリオファージＭ１３においてクローン化
されたＤＮＡの配列決定のための迅速簡易方法（＾Ｆａ
ｓ　ｔＳｉｍｐｌｅ　　Ｍｅｔｈｏｄ　　ｆｏｒ　　Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　　ＤＮＡ　　　Ｃ１ｏｎｅｄ　　
１ｎｔｈｅ　Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ　Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　Ｍ　１３　）　Ｊ（Ｊ、　Ｍｏ
１．　Ｂｉｏｌ、、　Ｖｏｌ、　１２９．１６９−１７
２頁（１９７９）　）の酵素的ＤＮＡ配列決定方法に使
用されるかが示される。これらの両文献は本発明におい
て準用する。これらの文献により記載されるＤＮＡ配列
決定方法は「サンガー法（Ｓａｎｇｅｒ　ＭｅＬｈｏｄ
）　」と称する。サンガー法を説明する前に以下の用語
を規定するのが有用であろう。

ＤＮＡポリメラーゼとは一本鎖ＤＮＡの合成を触媒する
大きな多機能酵素である。サンガー法において用いられ
る特別の種類のＤＮＡボリメラーゼは所謂エスシェリシ
ア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）　　ＤＮ
ＡポリメラーゼＩの所謂フレノウ（にＩｅｎｏｗ）断片
である。この断片は酵素の合成機能を存する。合成のた
めにＤＮＡポリメラーゼは鋳型、ブライマー、及びデオ
キシリボヌクレオチド源を必要とする。

鋳型はＤＮＡポリメラーゼにより合成される一本鎖ＤＮ
Ａ片におけるヌクレオチドの配列を決定する一本鎖ＤＮ
Ａ片である。合成時にＤＮＡポリメラーゼは鋳型に沿っ
て動き、その各々のヌクレオチド塩基に対してＤＮＡポ
リメラーゼは一本鎖ＤＮＡの成長類に相補的ヌクレオチ
ドを結合する。

相補的ヌクレオチド塩基は二本鎖ＤＮＡの形成に対する
塩基対形成則に従っである与えられたベースに随伴する
ものである。塩基対形成則は一方の鎖のアデノシンは常
に他方の鎖のチミジンと対形成し、又一方の鎖のシチジ
ンは他方の鎖のグアノシンと常に対形成すべきことを要
求する。郡ち、ＤＮＡポリメラーゼが鋳型上でアデノシ
ンと遭遇する場合には、それは合成される鎖にチミジン
を添加し、及びそれがシチジンに遭遇する場合にはそれ
がグアノシンを添加する。ＤＮＡポリメラーゼが移動後
、新たに合成された鎖及び鋳型の相補的部分は二本鎖形
態となる。

ブライマーは一本鎖Ｄ　Ｎ　Ａの断片である。ブライマ
ーはＤＮＡポリメラーゼが合成過程においてヌクレオチ
ドを添加することを開始するだめの出発位置を従供する
。ブライマーは二本鎖ＤＮＡの一部がＤＮＡポリメラー
ゼの出発点として与えられるように鋳型を含有する一本
鎖ＤＮＡ片にアニーリングされなければならない。

ジデオキシリボヌクレオチド類はそれらがデオキシリボ
ヌクレオチドについては２′ヒドロキシルのみである代
りにリボース部分において２′及び３′ヒドロキシル基
の両者を欠く以外はデオキシリボヌクレオチド類と同一
である。ジデオキシリボヌクレオチド類はＤＮＡポリメ
ラーゼがＤＮＡ合成過程において対応するデオキシリボ
ヌクレオチドの代りにジデオキシ誘導体を受入れる点に
おいてデオキシリボヌクレオチド類の類似体と称される
ことがある。その様な置換が生ずる場合にはＤＮＡポリ
メラーゼは引続くヌクレオチドを結合すべき３′ヒトワ
キジル基を有さないので合成が停止する。

サンガー法においては、配列化されるべきＤＮＡｔｊｆ
はエラセリシア・コリＤＮＡポリメラーゼＩに対する鋳
型として用いられる。ブライマーは鋳型を含有する一本
ｉｆｆ　Ｄ　Ｎ　Ａ片にアニーリングされ、次いでそれ
は放射標識を付されたデオキシリボヌクレオシドトリホ
スフェート例えば３Ｚｐ＝標識アデノシントリホスフエ
ート、及び四つのヌクレオチドの一つのジデオキシリボ
ヌクレオシドトリホスフェート類似体の存在下において
平均２０〜３００以上のヌクレオチドに酵素的延長され
る。

即ち、各々異ったジデオキシ類似体を含む四つの別々の
反応が行われる。ＤＮＡ鎖成長は３′ヒドロキシルへの
デオキシリボヌクレオチドの添加を必要とするので、ジ
デオキシリボヌクレオチドの導入は鎖成長を停止させる
。通常のヌクレオチドに代るジデオキシ類似体の導入は
ランダムに生ずるので、その結果、四つの反応の各々は
同一のヌクレオチドで停止される異種の標識付された鎖
を発生し、それらは鎖長さに従って電気泳動的に分離す
ることができる。即ち、四種類のオリゴヌクレオチド類
は存在する末端ジデオキシリボヌクレオシドの種類に基
づいて確立される。−末鎖ＤＮＡファージＭ１３を用い
て配列決定されるＤＮＡ断片のコピーをクローン化する
。十分な量のＭ１３がクローン化されるとＭ１３　　Ｄ
ＮＡを精製し、四つのアリコートに分離する。各アリコ
ートにおいて合成即ち鎖成長がそれぞれのジデオキシリ
ボヌクレオチドの存在下において起こる。

本発明に従えば、鎖酸長期に放射性ヌクレオチドの導入
によるオリゴヌクレオチドの標識付の代りにブライマー
を合成し、次いで結合官能基を結合し、及びそれを染料
と反応させることにより標識付される。好ましくは、ア
ミン結合官能基をブライマーを２−メトキシ−３−トリ
フルオロアセチル−１，３，２−オキサザホスファシク
ロペンタンと反応させて５′−（保護）アミノエチルホ
スフエートオリゴヌクレオチドを形成することにより結
合される。保護基を除去し、本発明の染料を脱保護され
た５′−アミンに結合して染料−プライマー複合体を形
成する。この染料−プライマー複合体を四つのアリコー
トからのオリゴヌクレオチドが一緒に混合されと同一の
電気泳動レーンに付加されることを除いてはサンガー法
に従って用いられる。オリゴヌクレオチドの相体的大き
さ及びそれらの末端ジデオキシリボヌクレオチド性質は
同種のオリゴヌクレオチドのバンドが電気泳動レーンを
下るに従って決定され、照射後蛍光メータ或いは分光光
度計により検出される。本発明に従えば、これらのバン
ドは順次或いは同時に５１４ｎｍ及び４８８ｒ＋ｓ＋の
レーザー光の両者により照射されるのが好ましい。

手Ｍと補正書（方式） 昭和６２年５り／ｅ日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ゲル電気泳動により分離された四種類までのオリゴ
   ヌクレオチド類を検出する方法において、下記工程を含
   んでなることを特徴とする方法：各種類内の各オリゴヌ
   クレオチドを第一の組の染料、第二の組の染料、第三の
   組の染料或いは第四の組の染料のいづれかの同一の一つ
   から選ばれた一種以上の染料で標識付して同一種類から
   のオリゴヌクレオチド類が同一の組からの染料で標識付
   され及び異った種類からのオリゴヌクレオチド類は異っ
   た組からの染料で標識付されるように各々の種類からの
   染料−オリゴヌクレオチド複合体を形成する工程であっ
   て、第一の組が次式により規定される染料よりなり； （式中、Ａは結合官能基であり、及びＢは酸性アニオン
   基である）、 第二の組が次式により規定される染料によりなり；▲数
   式、化学式、表等があります▼ （式中、Ａ及びＢは上記と同義である）、 第三の組が次式により規定される染料よりなり；▲数式
   、化学式、表等があります▼ （式中、Ａ及びＢは上記と同義）、及び 第四の組が次式により規定される染料よりなる；▲数式
   、化学式、表等があります▼ （式中、Ａ′は結合官能基或いは酸性アニオン基であり
   、及びＢ′はＡ′が酸性アニオン基である場合には常に
   結合官能基であり、及びＢ′はＡ′が結合官能基である
   場合には常に酸性アニオン基である） ものである工程、 これらの染料−オリゴヌクレオチド複合体を一種より多
   くの種類から形成する工程、 これらの染料−オリゴヌクレオチド複合体をゲル上で電
   気泳動的に分離する工程、 同様に分離された染料−オリゴヌクレオチド複合体の染
   料に照明をあてる工程、及び 同様に分離された染料−オリゴヌクレオチド複合体の種
   類を染料−オリゴヌクレオチド複合体の蛍光或いは吸収
   スペクトルにより同定する工程。 ２、該置換基Ａ′、Ｂ、或いはＢ′の該酸性アニオン基
   がカルボン酸或いはスルホン酸である特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ３、該同定工程が同様に分離された染料−オリゴヌクレ
   オチド複合体を染料−オリゴヌクレオチド複合体の染料
   の蛍光スペクトルにより同定することを含む特許請求の
   範囲第２項記載の方法。 ４、該標識付工程が該四種類のオリゴヌクレオチドの各
   々の各オリゴヌクレオチドに相補的官能基を結合させる
   ことを含む特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５、該ゲルが約２〜２５％の濃度を有するポリアクリル
   アミドゲルである特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６、Ａにより表わされる該結合官能基がアミン選択性で
   あり及び該相補的官能基がアミン類である特許請求の範
   囲第５項記載の方法。 ７、該第一の組がフルオレセイン−５−イソチオシアネ
   ート、フルオレセイン−６−イソチオシアネート、フル
   オレセイン−５−スクシニミジルカルボキシレート及び
   フルオレセイン−６−スクシニミジルカルボキシレート
   よりなり、該第二の組が２′，７′−ジメトキシ−４′
   ，５′−ジクロロフルオレセイン−５−スクシニミジル
   カルボキシレート及び２′，７′−ジメトキシ−４′，
   ５′−ジクロロフルオレセイン−６−スクシニミジルカ
   ルボキシレートよりなり、該第三の組がテトラメチルロ
   ーダミン−５−イソチオシアネート、テトラメチルロー
   ダミン−６−イソチオシアネート、テトラメチルローダ
   ミン−５−スクシニミジルカルボキシレート、及びテト
   ラメチルローダミン−６−スクシニミジルカルボキシレ
   ートよりなり、及び該第四の組がテキサスレット、ロー
   ダミンＸ−５−イソチオシアネート、ローダミンＸ−６
   −イソチオシアネート、ローダミンＸ−５−スクシニミ
   ジルカルボキシレート及びローダミンＸ−６−スクシニ
   ミジルカルボキシレートよりなる特許請求の範囲第６項
   記載の方法。 ８、該相補的官能基を結合させる該工程が２−置換−３
   −保護−１，３，２−オキサザホスファシクロアルカン
   を該オリゴヌクレオチド類と反応させることを含む特許
   請求の範囲第７項記載の方法。 ９、該２−置換−３−保護−１，３，２−オキサザホス
   ファシクロアルカンが２−メトキシ−３−トリフルオロ
   アセチル−１，３，２−オキサザホスファシクロペンタ
   ンである特許請求の範囲第８項記載の方法。 １０、該照射工程が５１４ｎｍの光で該染料を照射する
   ことを含む特許請求の範囲第７項記載の方法。 １１、該照射工程が４８８ｎｍの光で該染料を照射する
   ことを含む特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２、酵素的ＤＮＡ配列方法において異った末端ジデオ
   キシリボヌクレオチド類を有するオリゴヌクレオチドを
   区別する方法において、下記工程を含んでなることを特
   徴とする方法： 第一の染料を所定の配列のオリゴヌクレオチドの５′末
   端に結合させて第一の複数の標識付されたプライマーを
   形成する工程であって、第一の染料が次式により規定さ
   れる群から選ばれるものである工程： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ａは結合官能基であり及びＢは酸性アニオン基
   である）、 第二の染料を所定の配列のオリゴヌクレオチドの５′末
   端に結合させて第二の複数の標識付されたプライマーを
   形成する工程であって、第二の染料が次式により規定さ
   れる群から選ばれるものである工程： （式中Ａ及びＢは上記と同義）、 ▲数式、化学式、表等があります▼ 第三の染料を所定の配列のオリゴヌクレオチドの５′末
   端に結合させて第三の複数の標識付されたプライマーを
   形成する工程であって、第三の染料が次式により表わさ
   れる群から選ばれるものである工程： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ａ及びＢは上記と同義）、 第四の染料を所定の配列のオリゴヌクレオチド類の５′
   末端に結合させて第四の複数の標識付されたプライマー
   を形成する工程であって、第四の染料が次式により規定
   される群から選ばれるものである工程： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ａ′は結合官能基或いは酸性アニオン基であり
   、及びＢ′はＡ′が酸性アニオン基である場合には常に
   結合性官能基であり、及びＢ′はＡ′が結合官能基であ
   る場合には常に酸性アニオン基である） ものである工程、 第一、第二、第三及び第四の複数の標識付されたプライ
   マーを用いて酵素的ＤＮＡ配列操作に従ってこれらの複
   数の標識付されたプライマーと標識付されたオリゴヌク
   レオチドの３′末端に結合したジデオキシリボヌクレオ
   チドの種類との間に一対一の対応関係が確立されるよう
   に別々に標識付されたオリゴヌクレオチド類を発生させ
   る工程、これらの標識付されたオリゴヌクレオチド類を
   混合する工程、 これらの標識付されたオリゴヌクレオチド類をゲル上で
   大きさに応じて電気泳動的に分離する工程、同様に分離
   された標識付されたオリゴヌクレオチド類に光照射する
   工程、及び 同様に分離された標識付されたオリゴヌクレオチド類の
   ３′末端に結合したジデオキシリボヌクレオチドの種類
   を同様に分離された標識付されたオリゴヌクレオチド類
   のそれぞれの蛍光或いは吸収スペクトルを結合されたジ
   デオキシリボヌクレオチドと相関付けることにより同定
   する工程。 １３、該置換基Ａ′、Ｂ或いはＢ′の該酸性アニオン基
   がカルボン酸或いはスルホン酸である特許請求の範囲第
   １２項記載の方法。 １４、該同定工程が該同様に分離された標識付されたオ
   リゴヌクレオチド類を標識付されたオリゴヌクレオチド
   類の該標識付されたプライマーに結合した該染料の該蛍
   光スペクトルにより同定することを含むものである特許
   請求の範囲第１３項記載の方法。 １５、該結合工程が該所定の配列の該オリゴヌクレオチ
   ド類の該５′末端に相補的官能基を結合することを含む
   特許請求の範囲第１４項記載の方法。 １６、該ゲルが約２〜２５％の間の濃度を有するポリア
   クリルアミドゲルである特許請求の範囲第１５項記載の
   方法。 １７、Ａにより表わされる該結合官能基がアミン選択性
   であり、及び該相補的官能基がアミン類である特許請求
   の範囲第１６項記載の方法。 １８、該第一の染料がフルオレセイン−５−イソチオシ
   アネート、フルオレセイン−６−イソチオシアネート、
   フルオレセイン−５−スクシニミジルカルボキシレート
   及びフルオレセイン−６−スクシニミジルカルボキシレ
   ートよりなる群から選ばれ、該第二の染料が２′，７′
   −ジメトキシ−４′，５′−ジクロロフルオレセイン−
   ５−スクシニミジルカルボキシレート及び２′，７′−
   ジメトキシ−４′，５′−ジクロロフルオレセイン−６
   −スクシニミジルカルボキシレートよりなる群から選ば
   れ、該第三の染料がテトラメチルローダミン−５−イソ
   チオシアネート、テトラメチルローダミン−６−イソチ
   オシアネート、テトラメチルローダミン−５−スクシニ
   ミジルカルボキシレート及びテトラメチルローダミン−
   ６−スクシニミジルカルボキシレートよりなる群から選
   ばれ、及び該第四の染料がテキサスレッド、ローダミン
   Ｘ−５−イソチオシアネート、ローダミンＸ−６−イソ
   チオシアネート、ローダミンＸ−５−スクシニミジルカ
   ルボキシレート及びローダミンＸ−６−スクシニミジル
   カルボキシレートよりなる群から選ばれる特許請求の範
   囲第１７項記載の方法。 １９、該相補的官能基を結合させる該工程が、２−置換
   −３−保護−１，３，２−オキサザホスファシクロアル
   カンを該所定の配列の該オリゴヌクレオチド類と反応さ
   せることを含む特許請求の範囲第１８項記載の方法。 ２０、該２−置換−３−保護−１，３，２−オキサザホ
   スファシクロアルカンが２−メトキシ−３−トリフルオ
   ロアセチル−１，３，２−オキサザホスファシクロペン
   タンである特許請求の範囲第１９項記載の方法。