JPH02242684A - グルタミン合成遺伝子及びグルタミン合成酵素 - Google Patents
グルタミン合成遺伝子及びグルタミン合成酵素Info
- Publication number
- JPH02242684A JPH02242684A JP1052798A JP5279889A JPH02242684A JP H02242684 A JPH02242684 A JP H02242684A JP 1052798 A JP1052798 A JP 1052798A JP 5279889 A JP5279889 A JP 5279889A JP H02242684 A JPH02242684 A JP H02242684A
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- Japan
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- glutamine synthetase
- glutamine
- gene
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はグルタミン合成遺伝子及びグルタミンシンテタ
ーゼ（グルタミン合成酵素）並びにそれらの利用方法に
関する。
ーゼ（グルタミン合成酵素）並びにそれらの利用方法に
関する。
（従来の技術及び発明が解決しようとする課題）従来、
プラスミド等を使って特定の形質を生物に導入する場合
の問題点として、導入したＤＮＡ及びそれに由来するタ
ンパク質が必要以上に過剰生産され、そのために二次的
な悪影響が現れる事が挙げられていＩ；。特に導入した
い形質が、導入ＤＮＡのジーンドーセージ及び導入ＤＮ
Ａがコードするタンパク質（酵素）の過剰生産に依存し
ている場合はその悪影響を避けることが出来なかった。
プラスミド等を使って特定の形質を生物に導入する場合
の問題点として、導入したＤＮＡ及びそれに由来するタ
ンパク質が必要以上に過剰生産され、そのために二次的
な悪影響が現れる事が挙げられていＩ；。特に導入した
い形質が、導入ＤＮＡのジーンドーセージ及び導入ＤＮ
Ａがコードするタンパク質（酵素）の過剰生産に依存し
ている場合はその悪影響を避けることが出来なかった。
マルチコピーのグルタミン合成遺伝子の導入（ジーンド
ーセージ）によってグルタミンシンテターゼ阻害物抵抗
性の生物を創製する場合にもこの問題が生じていた。例
えばグルタミンシンテターゼ阻害物である除草剤Ｌ−ホ
スフィノスリシンあるいはビアラホスを微生物によって
生産する場合、一般のグルタミン合成遺伝子をマルチコ
ピーベクタープラスミドに連結して微生物１こ導入する
と確かに耐性は増加するが、必ずしも生産性が向上する
とは言えなかった。その最大の原因は導入したＤＮＡ（
プラスミド）及びそれに由来するタンパク質（グルタミ
ンシンテターゼ）が必要以上に過剰生産される為に微生
物細胞内の代謝のバランスが崩れる為であった。
ーセージ）によってグルタミンシンテターゼ阻害物抵抗
性の生物を創製する場合にもこの問題が生じていた。例
えばグルタミンシンテターゼ阻害物である除草剤Ｌ−ホ
スフィノスリシンあるいはビアラホスを微生物によって
生産する場合、一般のグルタミン合成遺伝子をマルチコ
ピーベクタープラスミドに連結して微生物１こ導入する
と確かに耐性は増加するが、必ずしも生産性が向上する
とは言えなかった。その最大の原因は導入したＤＮＡ（
プラスミド）及びそれに由来するタンパク質（グルタミ
ンシンテターゼ）が必要以上に過剰生産される為に微生
物細胞内の代謝のバランスが崩れる為であった。
（課題を解決するための手段）
上記の問題点を解決するｔ；めに、グルタミン合成遺伝
子を増強せしめることによって生物の耐性化を図る技術
の開発を行なった。即ち、まずビアラホスの生産菌であ
るストレプトミセス・バイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ＳＦ１２
９３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３０：ＡＴＣＣ２１７０５
）の総ＤＮＡの中から、大腸菌及び放線菌のグルタミン
生合成欠損変異株の当該変異を相補する遺伝子を取り出
す（クローン化）ことに成功した。この遺伝子は第２図
（Ａ）で示されるプラスミドに存在するストレプトミセ
ス・バイグロスコピカス由来の第１図の制限酵素地図で
示される構造中に含まれ、明らかに公知であるグルタミ
ン合成遺伝子とは異なっていた。 このグルタミン合成
遺伝子はプラスミドｐＭＳＧ５に含まれる。本発明はク
ローン化された実質上の遺伝子に等価な遺伝子も含む。
子を増強せしめることによって生物の耐性化を図る技術
の開発を行なった。即ち、まずビアラホスの生産菌であ
るストレプトミセス・バイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ＳＦ１２
９３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３０：ＡＴＣＣ２１７０５
）の総ＤＮＡの中から、大腸菌及び放線菌のグルタミン
生合成欠損変異株の当該変異を相補する遺伝子を取り出
す（クローン化）ことに成功した。この遺伝子は第２図
（Ａ）で示されるプラスミドに存在するストレプトミセ
ス・バイグロスコピカス由来の第１図の制限酵素地図で
示される構造中に含まれ、明らかに公知であるグルタミ
ン合成遺伝子とは異なっていた。 このグルタミン合成
遺伝子はプラスミドｐＭＳＧ５に含まれる。本発明はク
ローン化された実質上の遺伝子に等価な遺伝子も含む。
等価とはＤＮＡコドンの縮重により異なりｔ；塩基配列
を持つがジェノタイプにおいては同一であるものも包含
することを意味する。実質上とはグルタミンシンテター
ゼをフードする遺伝子及びその発現に関与する遺伝子を
含むことを意味する。尚、この遺伝子を含むグラスミド
ｐＭＳＧ５は、これを含む菌株ストレプトミセス・リビ
ダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏａ＋ｙｃｓ １ｉｖｉｄａｎｓ
）６６／ｐＭＳＧ５として機工Ｔｉｆ４：寄託１．ｃア
ル＜ＦＥＲｕ ＢＰ−２３０２）。
を持つがジェノタイプにおいては同一であるものも包含
することを意味する。実質上とはグルタミンシンテター
ゼをフードする遺伝子及びその発現に関与する遺伝子を
含むことを意味する。尚、この遺伝子を含むグラスミド
ｐＭＳＧ５は、これを含む菌株ストレプトミセス・リビ
ダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏａ＋ｙｃｓ １ｉｖｉｄａｎｓ
）６６／ｐＭＳＧ５として機工Ｔｉｆ４：寄託１．ｃア
ル＜ＦＥＲｕ ＢＰ−２３０２）。
この遺伝子の性質を詳細に調べたところ、この遺伝子は
グルタミンシンテターゼ（グルタミン合成酵素）の発現
量が比較的低くても宿主微生物に極めて高いグルタミン
シンテターゼ阻害物（例えばＬ−ホスフィノスリシン）
抵抗性を付与することを見いだした。
グルタミンシンテターゼ（グルタミン合成酵素）の発現
量が比較的低くても宿主微生物に極めて高いグルタミン
シンテターゼ阻害物（例えばＬ−ホスフィノスリシン）
抵抗性を付与することを見いだした。
次に、この遺伝子が何故低いグルタミンシンテターゼ発
現量でも高いグルタミンシンテターゼ阻害物抵抗性を付
与出来るのか、そのメカニズムを調べた。その結果、こ
の遺伝子を含むハイコピープラスミドを有する放線菌が
特異的に４１ｋｄの菌体内タンパク賞を大量に生産する
ことが分かった。
現量でも高いグルタミンシンテターゼ阻害物抵抗性を付
与出来るのか、そのメカニズムを調べた。その結果、こ
の遺伝子を含むハイコピープラスミドを有する放線菌が
特異的に４１ｋｄの菌体内タンパク賞を大量に生産する
ことが分かった。
更にこの蛋白質の性質を調べ！こところ、それはグルタ
ミンシンテターゼ阻害物による阻害を極めて受けにくい
タイプのグルタミンシンテターゼであることがわかった
。
ミンシンテターゼ阻害物による阻害を極めて受けにくい
タイプのグルタミンシンテターゼであることがわかった
。
この酵素は、従来知られていた微生物由来の何れのグル
タミンシンテターゼともサブユニットの分子量及びアミ
ノ酸配列が明らかに異なっており、しかもこの遺伝子の
起源であるストレプトミセス・バイグロスコピカス（肛
■ｇ…ｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ＳＦ１２９
３株において通常見いだされるグルタミンシンテターゼ
（サブユニット分子量５５ｋｄ 、グルタミンシンテタ
ーゼ阻害物感受性）とも異なっており、明らかな新規酵
素であることが判明した。本明細書では、このグルタミ
ン合成遺伝子を以後口−ｈＲ（“ｇｉｎ”Ｇｌｕｔａｍ
ｉｎｅ ５ｙｎＬｈｅＬａｓｅ ｇｅｎｅ、 ”ｈ”５
ｔｒｅ吐姐■憇ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ、“Ｒ”ｒ
ｅｓｉｓｔａｎｃｅ）と表記する。またグルタミンシン
テターゼ阻害物抵抗性グルタミンシンテターゼをＧＳ−
ｈＲ（“ＧＳ”ｇｌｕｔａｍｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓ
ｅ、“ｈ”Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃ
ｏｐｉｃｕｓ。
タミンシンテターゼともサブユニットの分子量及びアミ
ノ酸配列が明らかに異なっており、しかもこの遺伝子の
起源であるストレプトミセス・バイグロスコピカス（肛
■ｇ…ｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ＳＦ１２９
３株において通常見いだされるグルタミンシンテターゼ
（サブユニット分子量５５ｋｄ 、グルタミンシンテタ
ーゼ阻害物感受性）とも異なっており、明らかな新規酵
素であることが判明した。本明細書では、このグルタミ
ン合成遺伝子を以後口−ｈＲ（“ｇｉｎ”Ｇｌｕｔａｍ
ｉｎｅ ５ｙｎＬｈｅＬａｓｅ ｇｅｎｅ、 ”ｈ”５
ｔｒｅ吐姐■憇ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ、“Ｒ”ｒ
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テターゼ阻害物抵抗性グルタミンシンテターゼをＧＳ−
ｈＲ（“ＧＳ”ｇｌｕｔａｍｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓ
ｅ、“ｈ”Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃ
ｏｐｉｃｕｓ。
“Ｒ”ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）と表記する。更に、スト
レプトミセス−バイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ＳＦ −１２
９３において通常見いだされるグルタミンシンテターゼ
阻害物感受性のグルタミンシンテターゼ（サブユニット
分子量５５ｋｄ）をＧＳ−ｈＳ（“ＧＳ” ｇｌｕｔａ
ｍｉｎｅ ５ｙｎｔｈｅｔａｓｅ、 ”ｈ”Ｓ、ｈｙｇ
ｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ。
レプトミセス−バイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ＳＦ −１２
９３において通常見いだされるグルタミンシンテターゼ
阻害物感受性のグルタミンシンテターゼ（サブユニット
分子量５５ｋｄ）をＧＳ−ｈＳ（“ＧＳ” ｇｌｕｔａ
ｍｉｎｅ ５ｙｎｔｈｅｔａｓｅ、 ”ｈ”Ｓ、ｈｙｇ
ｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ。
Ｓ”５ｅｎｓｉｔｉｖｅ）と表記する。
又本発明によりグルタミンシンテターゼ阻害物質にたい
して抵抗性のあるグルタミンシンテターゼを収率良く生
産、利用することができる。具体的な利用分野としては
、例えば （１）グルタミンシンテターゼ阻害を有する除草剤に対
する耐性植物の創製 （２）除草剤ビアラホス、Ｌ−ホスフィノスリシンを培
養法で製造する時に使用する微生物の品種改良（３）グ
ルタミンシンテターゼに対するインヒビターの作用機作
の研究素材 等が考えられる。
して抵抗性のあるグルタミンシンテターゼを収率良く生
産、利用することができる。具体的な利用分野としては
、例えば （１）グルタミンシンテターゼ阻害を有する除草剤に対
する耐性植物の創製 （２）除草剤ビアラホス、Ｌ−ホスフィノスリシンを培
養法で製造する時に使用する微生物の品種改良（３）グ
ルタミンシンテターゼに対するインヒビターの作用機作
の研究素材 等が考えられる。
本願遺伝子ｇｉｎ−ｈＲをローコピーベクタープラスミ
ドであるｐｌＪ６１（Ｊｏｈｎ Ｉｎｎａｓ Ｃｕ１ｔ
ｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ口より入手）にクローン化
して放線菌に導入すると、宿主内のグルタミンシンテタ
ーゼ活性はさほど変化しないにも関わらず、宿主のグル
タミンシンテターゼ阻害物抵抗性は極めて強くなること
が分かった。
ドであるｐｌＪ６１（Ｊｏｈｎ Ｉｎｎａｓ Ｃｕ１ｔ
ｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ口より入手）にクローン化
して放線菌に導入すると、宿主内のグルタミンシンテタ
ーゼ活性はさほど変化しないにも関わらず、宿主のグル
タミンシンテターゼ阻害物抵抗性は極めて強くなること
が分かった。
グルタミンシンテターゼ０Ｓ−ｈＲ及びａｓ−ｈｓの酵
素的、理化学的性質は下記の通りである。
素的、理化学的性質は下記の通りである。
グルタミンシンテターゼ
酵素作用安定温度４０℃以下 ５０°Ｃ以下実施例
ｌ グルタミン合成遺伝子のクローニング大腸菌のグ
ルタミン合成酵素欠損株（ＹＭＣＩ １株）（Ｅ、ｃｏ
ｌｉ ｇｅｎｅｔ、ｉｃ ５ｔｏｃｋ ｃｅｎｔｅｒ、
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｒＢｉｏｌｏｇｙ Ｙａｌｅ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙより入手）のグルタミン要求性
を相補する遺伝子をビアラホス生産菌であるストレプト
ミセス・ハイグロスコピクス（兆μ狂０：ＡＴＣＣ２１
７０５）の総ＤＮＡを供与体として次の手順でクローン
化した。
ｌ グルタミン合成遺伝子のクローニング大腸菌のグ
ルタミン合成酵素欠損株（ＹＭＣＩ １株）（Ｅ、ｃｏ
ｌｉ ｇｅｎｅｔ、ｉｃ ５ｔｏｃｋ ｃｅｎｔｅｒ、
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｒＢｉｏｌｏｇｙ Ｙａｌｅ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙより入手）のグルタミン要求性
を相補する遺伝子をビアラホス生産菌であるストレプト
ミセス・ハイグロスコピクス（兆μ狂０：ＡＴＣＣ２１
７０５）の総ＤＮＡを供与体として次の手順でクローン
化した。
まず、遺伝子操作で一般的に行なわれる手法に従って、
供与体ＤＮＡと大腸菌ベクタープラスミドｐＵＣ１９（
ファルマシア製）との組換えＤＮＡを作成した。
供与体ＤＮＡと大腸菌ベクタープラスミドｐＵＣ１９（
ファルマシア製）との組換えＤＮＡを作成した。
即ち、予め制限酵素ＥｃｏＲＩで処理した供与体ＤＮＡ
ｌ０μｇと、同じく予め制限酵素ＥｃｏＲＩで処理した
大腸菌ベクタープラスミドｐＵｃ１９．２μｇを混合し
フェノール処理（制限酵素の失活）、エーテル抽出（残
存仕るフェノールの除去）及びエタノール沈澱処理（Ｄ
ＮＡの沈澱）を施してから、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを作
用させた。 これによって、反応混合物の中にｐＵｃ１
９のマルチリンカ−サイト内のＥｃｏＲＩサイトに供与
体ＤＮＡのＥｃｏＲＩ分解物が挿入された組換えＤＮＡ
が、ある一定の頻度で供給される。
ｌ０μｇと、同じく予め制限酵素ＥｃｏＲＩで処理した
大腸菌ベクタープラスミドｐＵｃ１９．２μｇを混合し
フェノール処理（制限酵素の失活）、エーテル抽出（残
存仕るフェノールの除去）及びエタノール沈澱処理（Ｄ
ＮＡの沈澱）を施してから、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを作
用させた。 これによって、反応混合物の中にｐＵｃ１
９のマルチリンカ−サイト内のＥｃｏＲＩサイトに供与
体ＤＮＡのＥｃｏＲＩ分解物が挿入された組換えＤＮＡ
が、ある一定の頻度で供給される。
次に大腸菌の形質転換法で最もよく使われるマンデル（
Ｍａｎｄｅｌ）の方法（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、５３
．１５９．１９７０）に従って、この組換えＤＮＡを含
む反応混合物で上記ＹＩＪＣＩＩ株を形質転換した。ア
ンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む完全培地上（Ｌ −
ａｇａｒ）でコロニーを形成できるアンピシリン耐性の
形質転換株をグルタミンを含まないＷ−ｓａｌｔ寒天培
地（Ｋ、ＨＰＯ４１，０５％。
Ｍａｎｄｅｌ）の方法（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、５３
．１５９．１９７０）に従って、この組換えＤＮＡを含
む反応混合物で上記ＹＩＪＣＩＩ株を形質転換した。ア
ンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む完全培地上（Ｌ −
ａｇａｒ）でコロニーを形成できるアンピシリン耐性の
形質転換株をグルタミンを含まないＷ−ｓａｌｔ寒天培
地（Ｋ、ＨＰＯ４１，０５％。
ＫＨ２ＰＯ４０−４５％、 Ｍｇ５Ｏ＜ ０．００５％
、グル：Ｉ−スＱ、４％、 Ｔｈｉａｍｉｎｅ ｌＯＩ
ｔｇ／ｍｌ、アスパラギン酸０゜２％。
、グル：Ｉ−スＱ、４％、 Ｔｈｉａｍｉｎｅ ｌＯＩ
ｔｇ／ｍｌ、アスパラギン酸０゜２％。
ＮＨ，Ｃ１０，２％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、
寒天２％）にレプリカし、その培地上でコロニーを形成
できる形質転換株１０株からプラスミドを分離したとこ
ろ、第２図（Ａ）の共通構造を有していた。またこのプ
ラスミド（ｐＧＳＨ５−２９）でＹＭＣＩＩ株を再度形
質転換したらアンピシリン耐性の株はすべて上記Ｗ−５
ａｌｔ培地で成育出来た（グルタミン要求性がなくなっ
た）。
寒天２％）にレプリカし、その培地上でコロニーを形成
できる形質転換株１０株からプラスミドを分離したとこ
ろ、第２図（Ａ）の共通構造を有していた。またこのプ
ラスミド（ｐＧＳＨ５−２９）でＹＭＣＩＩ株を再度形
質転換したらアンピシリン耐性の株はすべて上記Ｗ−５
ａｌｔ培地で成育出来た（グルタミン要求性がなくなっ
た）。
次にこのプラスミドのＢａｍＨＩサイトからＥｃｏＲＩ
までの領域（ＹＭＣＩＩ株のグルタミン要求性を相補す
る活性を有する部分を含む）を遺伝子操作で一般的に行
なわれる方法で切り出した。即ち、制限酵素ＢａｍＨＩ
及びＥｃｏＲＩで処理した後、アガロース電気′泳動で
分画し、更にエレクトロエリューション法によってアガ
ロースゲルより抽出した。これをエタノール沈澱した後
、予め制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃ。
までの領域（ＹＭＣＩＩ株のグルタミン要求性を相補す
る活性を有する部分を含む）を遺伝子操作で一般的に行
なわれる方法で切り出した。即ち、制限酵素ＢａｍＨＩ
及びＥｃｏＲＩで処理した後、アガロース電気′泳動で
分画し、更にエレクトロエリューション法によってアガ
ロースゲルより抽出した。これをエタノール沈澱した後
、予め制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃ。
ＲＩ処理、フェノール処理、エーテル抽出及びエタノー
ル沈澱した放線菌ベクタープラスミドｐｌＪ４８６（Ｊ
ｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎより入手）と混合し、Ｔ４− ＤＮＡリガーゼを
作用させて連結した。これによって、反応混合物の中に
、ＹＭＣＩＩ株のグルタミン要求性を相補する活性を有
する部分を含むＢａｍＨＩ −’ＥｃｏＲＩ ＤＮＡ
断片（１，７ｋｂ）とｐＩＪ４８６（ＪｏｈｎＩｎｎｅ
ｓ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより入手）
との組換えＤＮＡが、ある一定の頻度で供給される。
ル沈澱した放線菌ベクタープラスミドｐｌＪ４８６（Ｊ
ｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎより入手）と混合し、Ｔ４− ＤＮＡリガーゼを
作用させて連結した。これによって、反応混合物の中に
、ＹＭＣＩＩ株のグルタミン要求性を相補する活性を有
する部分を含むＢａｍＨＩ −’ＥｃｏＲＩ ＤＮＡ
断片（１，７ｋｂ）とｐＩＪ４８６（ＪｏｈｎＩｎｎｅ
ｓ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより入手）
との組換えＤＮＡが、ある一定の頻度で供給される。
これをストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ １ｉｖｉｄａｎｓ）６６株（ＦＥＲＭ Ｈ
Ｐ−７３７）に導入し、まずチオストレプトン耐性の形
質転換株を選別した。
ｍｙｃｅｓ １ｉｖｉｄａｎｓ）６６株（ＦＥＲＭ Ｈ
Ｐ−７３７）に導入し、まずチオストレプトン耐性の形
質転換株を選別した。
さらにこの中から、ネオマイシン感受性のものを選別し
、当該形質転換株からプラスミドを再抽出した。このプ
ラスミドは第２図（Ｂ）の構造を持ちｐＭｓＧ３と名ず
けｔ；。
、当該形質転換株からプラスミドを再抽出した。このプ
ラスミドは第２図（Ｂ）の構造を持ちｐＭｓＧ３と名ず
けｔ；。
ｐＭＳＧ３から、同様の手法で（グルタミン要求性を相
補する活性を有する部分を含む）ＢａｍＨＩ −Ｂｇｌ
ＩＩ断片を切り出しｐｌＪ７０２（Ｊｏｈｎ ｆｎｎ
ｅｓ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１ｔａｃｔｉｏｎより入手
）の８ｇｌｌｌサイトに導入した。このプラスミドは第
２図（Ｃ）の構造を持ち９ＭＳＧ５と名ずけＩ；。
補する活性を有する部分を含む）ＢａｍＨＩ −Ｂｇｌ
ＩＩ断片を切り出しｐｌＪ７０２（Ｊｏｈｎ ｆｎｎ
ｅｓ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１ｔａｃｔｉｏｎより入手
）の８ｇｌｌｌサイトに導入した。このプラスミドは第
２図（Ｃ）の構造を持ち９ＭＳＧ５と名ずけＩ；。
放線菌へプラスミドを導入する方法、チオストレプトン
耐性の形質転換株を分離する方法、ネオマイシン感受性
の形質転換株を分離する方法及び放線菌からのプラスミ
ドの抽出法は村上等の方法（Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅ
ｔ ２０５：４２−５０．１９８６）に従って行なつｔ
：。ｐＭＳＧ３及びｐｕｓｃｓでストレプトマイセス・
セリカラーのグルタミン生合成欠損株（ＦＳＩＯ）（Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｋｅｎｔｕｃｋｙより入手
）を形質転換したところ、両プラスミドは当該菌株のグ
ルタミン要求性を相補した。
耐性の形質転換株を分離する方法、ネオマイシン感受性
の形質転換株を分離する方法及び放線菌からのプラスミ
ドの抽出法は村上等の方法（Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅ
ｔ ２０５：４２−５０．１９８６）に従って行なつｔ
：。ｐＭＳＧ３及びｐｕｓｃｓでストレプトマイセス・
セリカラーのグルタミン生合成欠損株（ＦＳＩＯ）（Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｋｅｎｔｕｃｋｙより入手
）を形質転換したところ、両プラスミドは当該菌株のグ
ルタミン要求性を相補した。
実施例 ２ ｐＭｓＧ５によるビアラホス耐性発現下
表に示す４菌株を、ビアラホスを含む最小寒天培地（可
溶性デンプン０．７５％、 ＫＨ，Ｐｏ、 ０．０７５
％Ｍｇ５Ｏｔ ０−００２５％、寒天１．５％、 ｐｕ
７．０）に植菌し、２８°０，３日間培養し、その成
育を調べた。
表に示す４菌株を、ビアラホスを含む最小寒天培地（可
溶性デンプン０．７５％、 ＫＨ，Ｐｏ、 ０．０７５
％Ｍｇ５Ｏｔ ０−００２５％、寒天１．５％、 ｐｕ
７．０）に植菌し、２８°０，３日間培養し、その成
育を調べた。
１ ＋−−−
菌株略称
Ａ： Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｌｉｖｉｄａｎｓ
６ＢＢ： ｔｔ ｔｔ ６６／ｐｌ
ＪｓＧ５Ｃ： Ｓむ、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ
５Ｆ１２９３ ＳＤＭｂａｒＤ： ／／
ｔｔ ＳＤＭｂａｒ−／ｐＭｓＧ５ＳＦ１２
９３ ＳＤＭｂａｒ−株は５Ｆ１２９３株のビアラホス
感受性ノ 変異株で特開昭６３−２６７２８４参照）上記表に示す
ように、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌ１ｖｉｄａｎｃ
ｅ６６株及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓ
ｃｏｐｉｃｕｓ ＳＦＬ２９３ＳＤＭｂａｒ−株はグル
タミン合成遺伝子を持つプラスミドｐＭｓＧ５の導入に
よってビアラホスに対して顕著な耐性を示した。
６ＢＢ： ｔｔ ｔｔ ６６／ｐｌ
ＪｓＧ５Ｃ： Ｓむ、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ
５Ｆ１２９３ ＳＤＭｂａｒＤ： ／／
ｔｔ ＳＤＭｂａｒ−／ｐＭｓＧ５ＳＦ１２
９３ ＳＤＭｂａｒ−株は５Ｆ１２９３株のビアラホス
感受性ノ 変異株で特開昭６３−２６７２８４参照）上記表に示す
ように、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌ１ｖｉｄａｎｃ
ｅ６６株及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓ
ｃｏｐｉｃｕｓ ＳＦＬ２９３ＳＤＭｂａｒ−株はグル
タミン合成遺伝子を持つプラスミドｐＭｓＧ５の導入に
よってビアラホスに対して顕著な耐性を示した。
実Ｍｌｌ’ｌ１３９ＭＳＧ５によるＬ−ホスフイノスリ
ンン耐性発現 下表に示す２菌株を、Ｌ−ホスフィノスリシンを含む最
小寒天培地（可溶性デンプン０．７５％。
ンン耐性発現 下表に示す２菌株を、Ｌ−ホスフィノスリシンを含む最
小寒天培地（可溶性デンプン０．７５％。
ＫＨｚＰＯ＋ ０．０７５％、 Ｍｇ５Ｏ＋ ０．００
２５％、寒天１．５％。
２５％、寒天１．５％。
ｐＨ７，０）に植苗し２８°０．３日間培養し、その成
育を調べた。
育を調べた。
菌株略称
Ａ： ＳｔｒｅｐＬｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐ
ｉｃｕｓ ＳＦ１２９３ＳＤＭｂａｒ− Ｂ： ｔｔ １１． ＳＦ１
２９３ＳＤＭｂａｒ−／ｐＭｓ０５ 表に示すように、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃａｓ ｈｙ３ｒ
ｏｓｃｏｐｚｃｕｓＳＦ１２９３ ＳＤＭｂａｒ−株は
グルタミン合成遺伝子を持つプラスミドｐＭｓＧ５の導
入によってＬ−ホスフィノスリシンに対して顕著な耐性
を示した。
ｉｃｕｓ ＳＦ１２９３ＳＤＭｂａｒ− Ｂ： ｔｔ １１． ＳＦ１
２９３ＳＤＭｂａｒ−／ｐＭｓ０５ 表に示すように、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃａｓ ｈｙ３ｒ
ｏｓｃｏｐｚｃｕｓＳＦ１２９３ ＳＤＭｂａｒ−株は
グルタミン合成遺伝子を持つプラスミドｐＭｓＧ５の導
入によってＬ−ホスフィノスリシンに対して顕著な耐性
を示した。
実施例 ４ ｇＩｎ−ｈＲ遺伝子のミドルコピープラ
スミドｐｌＪ６１へのサブクローニング ｇｌｎ−ｈＲ遺伝子を含むＤＮＡ断片をミドルコピープ
ラスミドｐｌＪ６１（Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｃｕ１ｔ
ｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）へサブクローニングし
た。
スミドｐｌＪ６１へのサブクローニング ｇｌｎ−ｈＲ遺伝子を含むＤＮＡ断片をミドルコピープ
ラスミドｐｌＪ６１（Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｃｕ１ｔ
ｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）へサブクローニングし
た。
まず、遺伝子操作で一般的に行われる手法に従って、ス
トレプトミセス・リビダンス６６／ｐμＳＧ５（ＦＥＲ
ＭＢＰ−２３０２）よりプラスミドｐＭＳＧ５を分離し
、それを制限酵素Ｂｇｌｌｒで処理（但し、制限酵素に
よる切断は故意に不完全に行う；パーシャルダイジェッ
’／ａン）した後、アガロース電気泳動で分画し、更に
エレクトロエリコーション法によってＢｇｌＩ［−Ｂｇ
ｌ…断片（インターナルなりｇｌｌＩｌｌ上を含む）を
抽出した。これをエタノール沈澱した後、予め制限酵素
ＢａｍＨＩ処理、フェノール処理、エーテル抽出及びエ
タノール沈澱した後、放線菌ベクタープラスミドｐＩ３
６１と混合しＴ４− ＤＮＡリガーゼを作用させて連結
した。これによって、反応混合物の中に組換えＤＮＡが
、ある一定の頻度で供給される。
トレプトミセス・リビダンス６６／ｐμＳＧ５（ＦＥＲ
ＭＢＰ−２３０２）よりプラスミドｐＭＳＧ５を分離し
、それを制限酵素Ｂｇｌｌｒで処理（但し、制限酵素に
よる切断は故意に不完全に行う；パーシャルダイジェッ
’／ａン）した後、アガロース電気泳動で分画し、更に
エレクトロエリコーション法によってＢｇｌＩ［−Ｂｇ
ｌ…断片（インターナルなりｇｌｌＩｌｌ上を含む）を
抽出した。これをエタノール沈澱した後、予め制限酵素
ＢａｍＨＩ処理、フェノール処理、エーテル抽出及びエ
タノール沈澱した後、放線菌ベクタープラスミドｐＩ３
６１と混合しＴ４− ＤＮＡリガーゼを作用させて連結
した。これによって、反応混合物の中に組換えＤＮＡが
、ある一定の頻度で供給される。
これをストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ １ｉｖｉｄａｎｓ） ６６株に導入した。
ｍｙｃｅｓ １ｉｖｉｄａｎｓ） ６６株に導入した。
組換え体を持つ形質転換株の選別は、チオストレプトン
耐性でリボスタマイシン（またはネオマイシン）感受性
様を選択した。この形質転換株からグラスミドを再抽出
し、制限酵素切断パターンから９ＭＳＧ９として構造を
確認した（第３図）。
耐性でリボスタマイシン（またはネオマイシン）感受性
様を選択した。この形質転換株からグラスミドを再抽出
し、制限酵素切断パターンから９ＭＳＧ９として構造を
確認した（第３図）。
放線菌へプラスミドを導入する方法、チオストレブトン
耐性の形質転換株を分離する方法、ネオマイシン感受性
の形質転換株を分離する方法及び放線菌からのプラスミ
ドの抽出法は村上等の方法（Ｍｏｌ Ｇａｎ Ｇｅｎｅ
ｔ ２０５：４２−５０．１９８６）に従って行った。
耐性の形質転換株を分離する方法、ネオマイシン感受性
の形質転換株を分離する方法及び放線菌からのプラスミ
ドの抽出法は村上等の方法（Ｍｏｌ Ｇａｎ Ｇｅｎｅ
ｔ ２０５：４２−５０．１９８６）に従って行った。
実施例 ５ ｇｉｎ−ｈＲ遺伝子およびそれに対応する
アミノ酸配列 プラスミドｐＭＳＧ ５を制限酵素ＥｃｏＲ１及びＢａ
ｍ旧で切断し、アガロースゲル電気泳動及びエレクトロ
エル−ジョン法でｇｌｎ−ｈＲ遺伝子を含む１．７ｋｂ
ＤＮＡ断片を分離した。この１．７ｋｂＤＮＡ断片を、
Ｍｌａ系−末鎖ＤＮＡファージへクローニングし、エキ
ソヌクレアーゼ■及びＭｕｎｇ ｂｅｅｎヌクレアーゼ
によりｇｉｎ−ｈＲ遺伝子部分の各種デレーションミュ
ータントを作成した。個々のデレーションミュータント
（ファージ）より１本鎖ＤＮＡを調整し、ダイデオキシ
法によるシーケンスを行った。その結果、得られたｇｌ
ｎ−ｈＲの塩基配列とＧＳ−ｈＲのアミノ酸配列は第４
図の通りであった。
アミノ酸配列 プラスミドｐＭＳＧ ５を制限酵素ＥｃｏＲ１及びＢａ
ｍ旧で切断し、アガロースゲル電気泳動及びエレクトロ
エル−ジョン法でｇｌｎ−ｈＲ遺伝子を含む１．７ｋｂ
ＤＮＡ断片を分離した。この１．７ｋｂＤＮＡ断片を、
Ｍｌａ系−末鎖ＤＮＡファージへクローニングし、エキ
ソヌクレアーゼ■及びＭｕｎｇ ｂｅｅｎヌクレアーゼ
によりｇｉｎ−ｈＲ遺伝子部分の各種デレーションミュ
ータントを作成した。個々のデレーションミュータント
（ファージ）より１本鎖ＤＮＡを調整し、ダイデオキシ
法によるシーケンスを行った。その結果、得られたｇｌ
ｎ−ｈＲの塩基配列とＧＳ−ｈＲのアミノ酸配列は第４
図の通りであった。
実施例 ６ グルタミンシンテターゼ阻害物抵抗性（培
養） ｐＭｓＧ５を含有するストレプトミセス・リビダンス６
６／ｐＭＳＧ５（Ｓｔｒｅ ＬＯｍ）＋ＣｅＳ Ｉｉｖ
ｉｄａｎｓ）（ＦＥＲＭ ＢＰ −２３０２）を澱粉２
．０％、ペプトン１．０％、肉エキス０，３％、燐酸２
カリウム０．５％、ｐＨ７，０の液体培地１０ｍ１に接
種し、２８°０で２４時間通気攪拌培養し、種母とした
。これを２％の接種量で次の組成の培地（グルコース７
．０％、小麦胚芽３．９％、ソリューブル・ベジタブル
・プロティン２．５％、リン酸ｌカリウム０．３％、塩
化コバルト０．０００１％、 ｐＨ６，８）に植菌した
。更に、２８℃で３日間通気攪拌培養を行った。
養） ｐＭｓＧ５を含有するストレプトミセス・リビダンス６
６／ｐＭＳＧ５（Ｓｔｒｅ ＬＯｍ）＋ＣｅＳ Ｉｉｖ
ｉｄａｎｓ）（ＦＥＲＭ ＢＰ −２３０２）を澱粉２
．０％、ペプトン１．０％、肉エキス０，３％、燐酸２
カリウム０．５％、ｐＨ７，０の液体培地１０ｍ１に接
種し、２８°０で２４時間通気攪拌培養し、種母とした
。これを２％の接種量で次の組成の培地（グルコース７
．０％、小麦胚芽３．９％、ソリューブル・ベジタブル
・プロティン２．５％、リン酸ｌカリウム０．３％、塩
化コバルト０．０００１％、 ｐＨ６，８）に植菌した
。更に、２８℃で３日間通気攪拌培養を行った。
（無細胞抽出液の作成）
培養液５０ｍ１を遠心チューブに取り３０００ｒｐｍで
１０分間遠心分離を行う。上澄みを捨てイミダゾールバ
ッファ −（２０ｍＭ イミダゾール、１ ｍＭ Ｍｎ
Ｃ１２、ｐＨ７，５）に懸濁し再度遠心分離を行う。こ
の操作を２回繰り返し菌体を洗浄する。湿菌体２０ｍ
ｌを３０＋ｎＭの同じバッファーに懸濁し、細胞を超音
波で破砕する。１２００Ｏｒｐｍ ２０分遠心分離を行
い、上澄みを透析する。
１０分間遠心分離を行う。上澄みを捨てイミダゾールバ
ッファ −（２０ｍＭ イミダゾール、１ ｍＭ Ｍｎ
Ｃ１２、ｐＨ７，５）に懸濁し再度遠心分離を行う。こ
の操作を２回繰り返し菌体を洗浄する。湿菌体２０ｍ
ｌを３０＋ｎＭの同じバッファーに懸濁し、細胞を超音
波で破砕する。１２００Ｏｒｐｍ ２０分遠心分離を行
い、上澄みを透析する。
（第一段階； Ｍｏｎｏ Ｑを担体とする精製）上記イ
ミダゾールバッファーで充分平衡化したイオン交換クロ
マト用カラムＭｏｎｏＱ ＨＲ５／ ５ （ファルマシ
ア社製）に前記の無細胞抽出液１０ｍ１をチャージし、
さらに河じイミダゾールバッファーをしばらく流す。吸
着した蛋白質をＮａＣ１２（０→ｌ ｍｏＱ）で溶離す
る。グルタミンシンテターゼ活性を有し、しかもＳＤＳ
電気泳動で分子：１４１ｋｄを示す蛋白を含む画分を分
取する。かくしてグルタミンシンテターゼ阻害物抵抗性
グルタミンシンテターゼＧＳ−ｈＲの粗標品が得られる
。
ミダゾールバッファーで充分平衡化したイオン交換クロ
マト用カラムＭｏｎｏＱ ＨＲ５／ ５ （ファルマシ
ア社製）に前記の無細胞抽出液１０ｍ１をチャージし、
さらに河じイミダゾールバッファーをしばらく流す。吸
着した蛋白質をＮａＣ１２（０→ｌ ｍｏＱ）で溶離す
る。グルタミンシンテターゼ活性を有し、しかもＳＤＳ
電気泳動で分子：１４１ｋｄを示す蛋白を含む画分を分
取する。かくしてグルタミンシンテターゼ阻害物抵抗性
グルタミンシンテターゼＧＳ−ｈＲの粗標品が得られる
。
（ＳＯＳ電気泳動の方法はＮａｔｕｒｅ ２２７：６８
０−６８５．１９７０を参照した。） （第二段階； ５ｕｐｅｒｏｓｅ ６を担体とする精製
）上記の第一段階（ＭｏｎｏＱを担体とする精製）で作
成したＧＳ−ｈＲ粗標品を５ｕｐｅｒｏｓｅ５ ＨＲ１
０／３０（ファルマシア社製；ゲル濾過を原理とする蛋
白分画担体）を担体とするカラム（イミダゾールバッフ
ァーで充分平衡化しておく）にチャージし、前記のイミ
ダゾールバッファーを流し、溶出液を分画する。
０−６８５．１９７０を参照した。） （第二段階； ５ｕｐｅｒｏｓｅ ６を担体とする精製
）上記の第一段階（ＭｏｎｏＱを担体とする精製）で作
成したＧＳ−ｈＲ粗標品を５ｕｐｅｒｏｓｅ５ ＨＲ１
０／３０（ファルマシア社製；ゲル濾過を原理とする蛋
白分画担体）を担体とするカラム（イミダゾールバッフ
ァーで充分平衡化しておく）にチャージし、前記のイミ
ダゾールバッファーを流し、溶出液を分画する。
グルタミンシンテターゼ活性を有し、しかもＳＤＳ電気
泳動で分子量４１ｋｄを示す蛋白を含む両分を分取する
。かくしてグルタミンシンテターゼ阻害物抵抗性グルタ
ミンシンテターゼＧＳ−ｈＲの精製標品が得られる。
泳動で分子量４１ｋｄを示す蛋白を含む両分を分取する
。かくしてグルタミンシンテターゼ阻害物抵抗性グルタ
ミンシンテターゼＧＳ−ｈＲの精製標品が得られる。
（培 養）
ビアラホス生産菌であるストレプトマイセス・ハイグロ
スビヵス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃ
ｏｐｉｃｕｓ）Ｓ Ｆ １２９３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−
１３０：ＡＴＣＣ−２１７０５）を澱粉２０％、ペプト
ン１．０％、肉エキス０．３％、燐酸２カリウム０．０
５％、ｐＨ７，０（’）液体培地１０ｍ１ｌ：接種シ、
２８℃で２４時間通気攪拌培養し、種母とした。これを
２％の接種量で次の組成の培地（グルコース ７．０％
、小麦胚芽３．９％、ソリューブル・ベジタブル・ブロ
ナイン２．５％、リン酸１カリウム０．３％、塩化コバ
ルト０．０００１％、ｐＨ６，８）に植菌した。更に、
２８℃で３日間通気攪拌培養を行った。
スビヵス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃ
ｏｐｉｃｕｓ）Ｓ Ｆ １２９３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−
１３０：ＡＴＣＣ−２１７０５）を澱粉２０％、ペプト
ン１．０％、肉エキス０．３％、燐酸２カリウム０．０
５％、ｐＨ７，０（’）液体培地１０ｍ１ｌ：接種シ、
２８℃で２４時間通気攪拌培養し、種母とした。これを
２％の接種量で次の組成の培地（グルコース ７．０％
、小麦胚芽３．９％、ソリューブル・ベジタブル・ブロ
ナイン２．５％、リン酸１カリウム０．３％、塩化コバ
ルト０．０００１％、ｐＨ６，８）に植菌した。更に、
２８℃で３日間通気攪拌培養を行った。
（無細胞抽出液の作成）
培養液５０ｍ１を遠心チューブに取り３０００ｒｐｍで
１０分間遠心分離を行う。上澄みを捨てイミダゾールバ
ッファ （２０ｆｆ１Ｍイミダゾール、１ｍＭ Ｍｎ
Ｃ１ｘ、ｐＨ７，５）に懸濁し再度遠心分離を行う。こ
の操作を２回線り返し菌体を洗浄する。湿菌体２０ｍ１
を３０ｍＭの同じバッファーに懸濁し、細胞を超音波で
破砕する。
１０分間遠心分離を行う。上澄みを捨てイミダゾールバ
ッファ （２０ｆｆ１Ｍイミダゾール、１ｍＭ Ｍｎ
Ｃ１ｘ、ｐＨ７，５）に懸濁し再度遠心分離を行う。こ
の操作を２回線り返し菌体を洗浄する。湿菌体２０ｍ１
を３０ｍＭの同じバッファーに懸濁し、細胞を超音波で
破砕する。
１２００Ｏｒｐｍ ２０分遠心分離を行い、上澄みを透
析する。
析する。
（第一段階：ブルーセファロースＣＬ−６Ｂを担体トす
る精製） 上記イミダゾールバッファーで充分平衡化したブルーセ
ファロースＣＬ−６Ｂ １２ｇを、上記無細胞抽出液９
０ｍ１に加え４℃、１昼夜弱く攪拌する。これをカラム
に詰めＬＭ ＮａＣ１を含むと記イミダゾールバッファ
ーをしばらく流す。次に、吸着した蛋白質をＮａＣ１を
含まないイミダゾールバッファーで溶離する。グルタミ
ンシンテターゼ活性を有し、しかもＳＤＳ電気泳動で分
子量５５ｋｄを示す蛋白を含む画分（Ｇｓ−ｈｓ粗標品
）を分取する。
る精製） 上記イミダゾールバッファーで充分平衡化したブルーセ
ファロースＣＬ−６Ｂ １２ｇを、上記無細胞抽出液９
０ｍ１に加え４℃、１昼夜弱く攪拌する。これをカラム
に詰めＬＭ ＮａＣ１を含むと記イミダゾールバッファ
ーをしばらく流す。次に、吸着した蛋白質をＮａＣ１を
含まないイミダゾールバッファーで溶離する。グルタミ
ンシンテターゼ活性を有し、しかもＳＤＳ電気泳動で分
子量５５ｋｄを示す蛋白を含む画分（Ｇｓ−ｈｓ粗標品
）を分取する。
（第二段階；逆相ＨＰＬＣを担体とする精製）第一段階
（ブルーセフ７０−スＣＬ−６Ｂ）で得たＧｓ−ｈｓ粗
標品を更に逆相ＨＰＬＣで精製した。逆相担体としては
Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ３００Ｃ８（ガスクロ工業Ｘ４．６
Ｘ１００ＬＩＩＩｎ）、移動相としては０．１％ＴＦＡ
（ｔｒｉｒｌｕｏｒｏ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を用
いた。ＧＳ−ｈＳ粗標品をチャージし流速０．１３ｍ１
／ｍｉｎで展開し、約３８分に溶出される主要蛋白質（
検出； ２８０％ｍ）を分取しＧＳ−ｈＳ純標品としＩ
こ。
（ブルーセフ７０−スＣＬ−６Ｂ）で得たＧｓ−ｈｓ粗
標品を更に逆相ＨＰＬＣで精製した。逆相担体としては
Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ３００Ｃ８（ガスクロ工業Ｘ４．６
Ｘ１００ＬＩＩＩｎ）、移動相としては０．１％ＴＦＡ
（ｔｒｉｒｌｕｏｒｏ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を用
いた。ＧＳ−ｈＳ粗標品をチャージし流速０．１３ｍ１
／ｍｉｎで展開し、約３８分に溶出される主要蛋白質（
検出； ２８０％ｍ）を分取しＧＳ−ｈＳ純標品としＩ
こ。
実施例 ８ ＧＳ−ｈＲ及びＧＳ−ｈＳのアミノ酸配列
グルタミンシンテターゼＧＳ−ｈｌ？及びＧＳ−ｈＳの
アミノ末端側アミノ酸についてアミノ酸シーケンサ−で
その種類を決定した。即ち、実施例 ６で得たＧＳ−ｈ
Ｒ純標品及び実施例 ７で得たＧＳ−ｈＳ純標品を０．
５％ＳＤＳに溶解してアミノ酸配列分析機（Ａｐｐｌｉ
ａｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７０Ａ ｔｙｐｅ）で
解析した。第１表はその結果を、公知のグルタミンシン
ターゼと比較したものである。
グルタミンシンテターゼＧＳ−ｈｌ？及びＧＳ−ｈＳの
アミノ末端側アミノ酸についてアミノ酸シーケンサ−で
その種類を決定した。即ち、実施例 ６で得たＧＳ−ｈ
Ｒ純標品及び実施例 ７で得たＧＳ−ｈＳ純標品を０．
５％ＳＤＳに溶解してアミノ酸配列分析機（Ａｐｐｌｉ
ａｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７０Ａ ｔｙｐｅ）で
解析した。第１表はその結果を、公知のグルタミンシン
ターゼと比較したものである。
この様にＧＳ−ｈＲ及びＧＳ−ｈＳのＮ末端アミノ酸配
列は公知のグルタミンシンターゼとは異なっていｔ二
。
列は公知のグルタミンシンターゼとは異なっていｔ二
。
実施例−９ｇＩｎ−ｈＲ導入菌株（放線菌）のビアラホ
ス耐性及びグルタミンシンテターゼ活性第２表に示す各
菌株を、ビアラホスを含む（０，１０３０、１００，３
００，１０００，３０００，１００００，１５０００，
２００００μｇ／ｍ１）最小寒天培地（可溶性デンプン
０．７５％、ＫＪＰＯ＋０．０７５％、Ｍｇ５Ｏｔ ０
−００２５％、ＮａＮＯｓ ０．１７％、ＧｏＣＩ。
ス耐性及びグルタミンシンテターゼ活性第２表に示す各
菌株を、ビアラホスを含む（０，１０３０、１００，３
００，１０００，３０００，１００００，１５０００，
２００００μｇ／ｍ１）最小寒天培地（可溶性デンプン
０．７５％、ＫＪＰＯ＋０．０７５％、Ｍｇ５Ｏｔ ０
−００２５％、ＮａＮＯｓ ０．１７％、ＧｏＣＩ。
０．００００２５％、寒天１．５％、ｐＨ７，０、水道
水使用）に植菌し２８°Ｃ１３日間培養し、その生育を
調べた（第２表）。グルタミンシンテターゼ活性はγ−
ＧＴ法（ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ Ｖｏｌ、１２９：１０
０１−１００８．１９７６参照）により３７℃で測定し
た。第２表中の活性値は蛋白１ｍｇ当りの活性を親株を
１００％とした比率で示した。
水使用）に植菌し２８°Ｃ１３日間培養し、その生育を
調べた（第２表）。グルタミンシンテターゼ活性はγ−
ＧＴ法（ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ Ｖｏｌ、１２９：１０
０１−１００８．１９７６参照）により３７℃で測定し
た。第２表中の活性値は蛋白１ｍｇ当りの活性を親株を
１００％とした比率で示した。
第２表に示すように、ｇｉｎ−ｈＲ導入菌株のビアラホ
ス耐性はグルタミンシンテターゼ活性の発現量にほぼ依
存している。特にｐｌ Ｊ７０２をベクタープラスミド
とするｐＭＳＧ５においては著しい活性の増加が認めら
れる。しかしｐＭＳＧ３、ｐＭＳＧ９の場合に認められ
るように、さほど当該活性が増加しなくてもビアラホス
耐性が発現している例も見られる。この理由は、次の実
施例 ｌＯに示すように、ｇｌｎ−ｈＲ遺伝子の導入に
よって生産されるグルタミンシンテターゼが、グルタミ
ンシンテターゼ阻害物（例えばＬ−ホスフィノスリシン
）に耐性になっている為と考えられる。
ス耐性はグルタミンシンテターゼ活性の発現量にほぼ依
存している。特にｐｌ Ｊ７０２をベクタープラスミド
とするｐＭＳＧ５においては著しい活性の増加が認めら
れる。しかしｐＭＳＧ３、ｐＭＳＧ９の場合に認められ
るように、さほど当該活性が増加しなくてもビアラホス
耐性が発現している例も見られる。この理由は、次の実
施例 ｌＯに示すように、ｇｌｎ−ｈＲ遺伝子の導入に
よって生産されるグルタミンシンテターゼが、グルタミ
ンシンテターゼ阻害物（例えばＬ−ホスフィノスリシン
）に耐性になっている為と考えられる。
実施例 ｌＯグルタミンシンテターゼＧＳ−ｈＲのＬ−
ホスフィノスリシン抵抗性 実施例６で精製したグルタミンシンテターゼＧＳ−ｈＲ
と、実施例７で精製したグルタミンシンテターゼＧＳ−
ｈＳのＬ−ホスフィノスリシンによる阻害をフォーワー
ドリアクシコン法（Ｊ、ＢａｃＬｅｒｉｏｌ、１２９゜
１００１−１００９．１９７７）で比較した。第５図は
その結果を示している。
ホスフィノスリシン抵抗性 実施例６で精製したグルタミンシンテターゼＧＳ−ｈＲ
と、実施例７で精製したグルタミンシンテターゼＧＳ−
ｈＳのＬ−ホスフィノスリシンによる阻害をフォーワー
ドリアクシコン法（Ｊ、ＢａｃＬｅｒｉｏｌ、１２９゜
１００１−１００９．１９７７）で比較した。第５図は
その結果を示している。
（発明の効果）
本発明により、グルタミンシンテターゼ（グルタミン合
成酵素）阻害作用を有する除草剤に対する耐性植物の創
製及びビアラホス、Ｌ−ホスフィノスリシンの製造に関
与する微生物の品種改良の可能性が認められた。
成酵素）阻害作用を有する除草剤に対する耐性植物の創
製及びビアラホス、Ｌ−ホスフィノスリシンの製造に関
与する微生物の品種改良の可能性が認められた。
第１図ニブラスミドルＭｓＨ５−２９中のグルタミン合
成遺伝子を含む制限酵素地図を示す。 第２図： プラスミドｐＧＳＨ５−２９、ｐＭＳＧ３及
び９ＭＳＧ５の制限酵素地図を示す。 第３図ニブラスミドルＭｓＧ９の制限酵素地図を示す。 第４図： ｇｌｎ−ｈＲ遺伝子の塩基配列及びＧＳ−ｈ
Ｒのアミノ酸配列を示す。矢印はヘアピン構造を有する
転写終結部位を示す。 第５図： グルタミンシンテターゼ０Ｓ−ｈＲとＧＳ−
ｈｓのＬ−ホスフィノスリシンによる阻害をフォーワー
ドリアクシタン法で比較した図を示す。 ４ｋｂ （Ａ） 第２図 （Ｂ） ＭｓＧ３ （Ｃ） ゛ｒ ７面の浄書（内容に変更なし） 第６図 ＭｓＧ９ 第４図 手 続 補 正 １土 目 （方式） ％式％ 補正をする者 代 理 人 住 所 〒１０４ 東京都中央区京橋２丁目４番１６号 補正の内容 別紙（第３．５図）、内容に変更なし
成遺伝子を含む制限酵素地図を示す。 第２図： プラスミドｐＧＳＨ５−２９、ｐＭＳＧ３及
び９ＭＳＧ５の制限酵素地図を示す。 第３図ニブラスミドルＭｓＧ９の制限酵素地図を示す。 第４図： ｇｌｎ−ｈＲ遺伝子の塩基配列及びＧＳ−ｈ
Ｒのアミノ酸配列を示す。矢印はヘアピン構造を有する
転写終結部位を示す。 第５図： グルタミンシンテターゼ０Ｓ−ｈＲとＧＳ−
ｈｓのＬ−ホスフィノスリシンによる阻害をフォーワー
ドリアクシタン法で比較した図を示す。 ４ｋｂ （Ａ） 第２図 （Ｂ） ＭｓＧ３ （Ｃ） ゛ｒ ７面の浄書（内容に変更なし） 第６図 ＭｓＧ９ 第４図 手 続 補 正 １土 目 （方式） ％式％ 補正をする者 代 理 人 住 所 〒１０４ 東京都中央区京橋２丁目４番１６号 補正の内容 別紙（第３．５図）、内容に変更なし
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、グルタミンシンテターゼ阻害物抵抗性のグルタミン
シンテターゼ（ＧＳ−ｈＲ）をコードするグルタミン合
成遺伝子（ｇｌｎ−ｈＲ）。 ２、請求項１記載の遺伝子によってコードされるグルタ
ミンシンテターゼ阻害物抵抗性グルタミンシンテターゼ
（ＧＳ−ｈＲ）。 ３、請求項１記載の遺伝子（ｇｌｎ−ｈＲ）を導入され
たグルタミンシンテターゼ阻害物抵抗性の生物。 ４、ストレプトミセス・ハイグロスコピカスＳＦ１２９
３株から抽出したグルタミンシンテターゼ阻害物感受性
グルタミンシンテターゼ（ＧＳ−ｈＳ）。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1052798A JPH02242684A (ja) | 1988-03-09 | 1989-03-07 | グルタミン合成遺伝子及びグルタミン合成酵素 |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63-53553 | 1988-03-09 | ||
| JP5355388 | 1988-03-09 | ||
| JP63-78095 | 1988-04-01 | ||
| JP1052798A JPH02242684A (ja) | 1988-03-09 | 1989-03-07 | グルタミン合成遺伝子及びグルタミン合成酵素 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02242684A true JPH02242684A (ja) | 1990-09-27 |
Family
ID=26393463
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1052798A Pending JPH02242684A (ja) | 1988-03-09 | 1989-03-07 | グルタミン合成遺伝子及びグルタミン合成酵素 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02242684A (ja) |
-
1989
- 1989-03-07 JP JP1052798A patent/JPH02242684A/ja active Pending
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