JPH02242690A - Ｌ―アラニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、酵素法によるし−アラニンの製造法に間する
ものである。本発明によれば高収量で効率良くＬ−アラ
ニンを製造することが出来る。

Ｌ−アラニンは周知の如く、医薬、食品又は化学工業原
料として重要なアミノ酸であり、その需要が近年急激に
増加しつつある。

（従来の技術と課題） Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有するシュード
モナス・ダクネー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄａｃｕ
ｎｌ＋ａｅ）の菌体若しくはその破砕物の存在下し一ア
スパラギン酸を酵素反応させてＬ−アラニンを製造する
方法は、菌体内に存在するアラニンラセマーゼ活性によ
りＬ−アラニンがラセミ化する問題を有していた。

また、Ｌ−アラニンを効率良く製造する為には、β−脱
炭酸酵素反応の反応速度を向上させることが重要となる
が、反応速度を向丘する為反応温度を上げた場合には菌
体内に存在するアラニンラセマーゼ活性も向上すること
が認められた。

かかる問題を解決すべく菌体の前処理によりアラニンラ
セマーゼ活性を除去する方法が提案されている（持閏昭
５７−１３２８８２号公報、特間昭６２−８７０８８号
公報）が、菌体の前処理は煩雑であり、プロセスを出来
る限り簡素ｊこすることは製造コスト低減化に大きく影
響する為、本発明者らは、菌体の前処理を行うことなく
、高反応速度下でのＬ−アラニン生成反応中にラセマー
ゼ活性を抑ル１して効率良くＬ−アラニンを製造する方
法について鋭意検討した。その結果、反応を夜のｌ）Ｈ
を酸性域で、反応温度を４０′Ｃ〜４７℃に維持して酵
素反応することによりラセマーゼ活性を発現させること
なく、高収率でＬ−アラニンを製造可能なことを見い出
し本発明を完成するに到った。

（発明の構成及び効果） 本発明は、Ｌ−アスパラキン酸β−脱炭酸酵素活性を有
する微生物菌体又はその破砕物の存在下、水性溶媒中で
Ｌ−アスパラギン酸又はその塩を反応せしめ、該反応液
中に１４−アラニンを生成するに際し、反応γαのＩ）
　Ｈを４．３〜５．０且つ反応温度を４０〜４７℃に維
持することを特徴とするＬ−アラニンの製造方法を提供
するものである。

（発明の詳細な説明） 本発明に使用する微生物としては、Ｌ−アスパラギン酸
β−脱炭酸酵素を含有するシュードモナス・ダクネー（
Ｐｓｅｕｄｏｏ＋ｏｎａｓ　ｄａｃｕｒ＋ｈａｅ）　Ｉ
ＡＭ　１１５２が好適に用いられる。

本発明に用いられろ上記微生物菌体は、菌体のまま用い
ることも出来るし、超音波破砕等の処理により破砕した
破砕物も使用することが出来る。

本発明の方法に使用される上記の微生物菌体の調製に使
用するＩｇ地は、特に限定されるものではなく一般の微
生物に使用されるものでよい。

Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有する微生物菌
体の１！Ｉ製に使用する培地の炭素源は、特に限定され
るものではなく、例えばフマル酸、コハク酸、リンゴ酸
、Ｌ−アスパラギン酸等が使用できるが、その中でもフ
マル酸が好適に使用される。培地の窒素源としては、ア
ンモニア、　硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝
酸アンモニウム、尿素等の無機塩を用いることが出来る
し、また、ペプトン、酵母エキス、コンスティープリカ
ー　カザミノ酸等の有機栄養源も使用することが出来る
。無機塩としては、リン酸−水素カリウム、リン酸二水
素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。

培養は通気攪ｔ′ト、振盪等の好気的条件下で行い、培
養温度は２０℃〜４０℃、好ましくは２８℃〜３２゛Ｃ
で１テう。培養途中のｐＨは５〜１０、好ましくは７〜
８付近にて行い、培養中のｐ　Ｈの調整には、酸又はア
ルカリを添加して行う。培養開始時の培地中の炭素源の
濃度は０．０５〜１０重量％が用いられ、具体例として
フマル酸を使用する場合、フマル酸濃度は、好ましくは
０．　１〜５重１％、更に好ましくは０．５〜２重量％
が適する。

培養肋間は１０時間〜４日間、最適期間は１〜３日閏で
ある。

このようにして得られた培養物から各々菌体を集めて、
水又は適当な緩衝液で洗浄し、本発明の酵素反応に使用
する。

本発明の方法においては、上記で調製された微生物菌体
又はその破砕物の存在下、少なくともＬ−アスパラギン
酸又はその塩を含有する水溶液にて酵素反応させる。こ
こで該水溶液に添加されるＬ−アスパラギン酸又はその
塩の添加濃度は０゜５〜５０Ｍ１１に％、好ましくは３
〜３０重量％である。なお、［、−アスパラギン酸は、
反応１夜への溶解度の関係から溶解させた状態でも粉体
で存在（不溶解状Ｂ）していてもさしつかえない。反応
液のｐＨの：ＪＩ整はアルカリ溶液、例えばアンモニア
水、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等が好適に使用
されろ。

該水溶液には、さらにピリドキサール５′リン酸を０．
０００５〜０．０５重量％、好ましくは０．００１〜０
．０１重量％添加して用いることが出来る。さらに必要
な場合には非イオン性の界面活性剤、例えはポリオキシ
エチレンソルビタンモノオレエーｉ・、ポリオキシエチ
レンソルビタンモノラウレート等を０．０１〜０．　５
重量％、好ましくは０．０３〜０．２重量％を添加して
用いることが出来る。また必要な場合にはピルビン酸、
α−ケト酪酸等のα−ケト酸を０．０００１〜０゜５　
！Ｉｉ％、好マｔ、、＜ハ０．　００２〜０．　２ｍｊ
１％を添加して用いることが出来る。本発明において、
酵素反応時のｐＨは４．３〜５．０、好ましくは４．５
〜４．８であり、反応温度は４０〜４７℃、好ましくは
４２〜４５℃であり、反応は通常約３〜約４８時間行わ
れる。

上記のような反応方法によって得られる反応液中に生成
したＬ−アラニンの分離・精製は公知のイオン交喚樹脂
処理等により行うことが出来る。

実験例 以下の実験例において、Ｌ−アラニンの定性はペーパー
クロマトグラフのＲｆ値と高速液体クロマトグラフの保
持時間及び精製物の比旋光度により確認した。定量は、
高速液体クロマトグラフィー（島津ＬＣ−５Ａ）を用い
て行った。

Ｄ−アラニン生成量の定量は、豚の腎臓由来のＤ−アミ
ノ酸酸化酵素（ベーリンガー・マンハイムー山之内製薬
製）によりＤ−アラニンから生成するピルビン酸をヒド
ラゾンとして測定する方法により行った（Ｍｅｔｔ＋ｏ
ｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ、Ｘ　Ｖ
Ｕ　、　Ｐａｒｔ　Ａ、　Ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｈｅｒ
ｂｅｒｔ　Ｔａｂｏｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ａ　Ｗｈｉｔｅ
　Ｔａｂｏｒ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ
ｅｗ　Ｖｏｒｋ、１９７０Ｐ、　　１７！　　−１７０
）。

また、下記の実験例において％と表し°たのは重量％を
意味する。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。

実施例 （１〉微生物の調製 培地（フマル酸ナトリウム０．５％、フマル酸アンモニ
ウム１．０％、酵母エキス０．　５％、リン酸−カリウ
ム０．０５％、Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７　Ｈ２００，０５
％含有、ｐＨ７，（１）ｌｏｏｍｓ！を５００　ｍｇ容
三角フラスコに分注、滅菌した後シュードモナス・ダク
ネー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄａｃｕｎｂａｅ）Ｊ
ＡＭ　１１５２を植菌し、３０℃にて１日間振盪培養を
行った（前培養）０次に、上記培地と同様の培地１２を
２２容通気攪拌槽に仕込み、滅菌（１２０℃、２０分間
）後、前培養物の２０　ｍ　１２を添加して、回転数１
００　Ｏｒ　ｐ　ｍ、通気ｆｆｉ　１　ｖ　ｖ　ｍ、温
度３０℃、り）１７．３にて１日間培養を行った。

培養終了後、培養物１００ｍＲから遠心分離して集菌後
、該面体を０．９％ＮａＣ！溶液にて１回洗浄後、該洗
浄菌体を酵素反応に使用した。

（２）実験方法 上記で得られた菌体を、第１表に示した実施区にて、水
性反応液［し−アスパラギン酸３０％、ポリオキシエチ
レンソルビタンモノオレエート０．０５％、ピリドキサ
ール５′−リン酸０．０５％、ピルビン酸ソーダ０．０
２％含有、ｐ　Ｉ（調整はアンモニア水（２５％ＮＨＪ
含有）にて行う］２００　ｍ　１１に懸濁し、各温度で
５時間県盪した後の生成全アラニン量及び生成り一アラ
ニン屓を測定した。

なお、対照として温度３７゛Ｃ１１）Ｈ５，５で反応さ
せた場合の全アラニン生成量及びＤ−アラニン生成量を
１００とした。

（３）結果 結果は次の表に示す通りであり、本発明の方法により、
アラニンラセマーゼ活性を発現させることなくし一アス
パラギン酸β−・脱炭酸酵素の反応速度を高い状態で反
応させることが可能となった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有する微
   生物菌体又はその破砕物の存在下、水性溶媒中でＬ−ア
   スパラギン酸又はその塩を反応せしめ、該反応液中にＬ
   −アラニンを生成するに際し、反応液のｐＨを４．３〜
   ５．０且つ反応温度を４０〜４７℃に維持することを特
   徴とするＬ−アラニンの製造法。