JPH02243945A - 全血分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は、生物体液中、たとえば血液中の特定物質の定
量に用いる乾式化学分析要素の製造方法に関する。

［技術的背景］ 臨床医学上重要な体液中各種代謝成分、例えばグルコー
ス、とリルビン、尿素窒素、尿酸、コレステロール、各
種酵素（クレアチンキナーゼ、ＡＳＴ、ＡＬＴ等）の定
量分析には、溶液試薬を用いる湿式法と、乾式化学分析
、すなわち乾燥状態の分析試薬系を導入した試験片、分
析スライド、分析テープ等の分析要素を用いた分析法と
がある。乾式化学分析は湿式法に比し、操作の簡易性と
分析の迅速さの点で優れている。

微量の液体試料で精度の高い化学分析を迅速に行うこと
ができる分析手段として乾式多層分析要素がｒＭ発され
、例えば特公昭５３−２１６７７号、特開昭５５−１６
４３５６号、特開昭６０−２２２７６９号で知られてい
る。乾式多層分析要素は例えば、透明支持体、試薬層、
反射層、展開層から構成されている。透明支持体、例え
ばプラスチックフィルムの上に、塗布された試薬層には
、液体試料中に含まれる被検成分と反応し、その成分景
に応じた光学濃度に発色する試薬が含まれる。展開層は
、点着された液体試料を均一に、液の量にほぼ比例する
面積に広げる。このような乾式分析要素の展開層の面に
液体試料、例えば全血を一定旦滴下すると、展開層で展
開された血液は、反射層を通って試薬層に達し、ここで
試薬と反応し、発色する１分析要素を適当な時間、一定
温度に保って発色反応を進行させた後、透明支持体側か
ら、特定波長域で反射光学濃度を測定し、検量線に基づ
いて定量分析を行う。

反射層は、光学測定の際展開層中の液体試料の影響を受
けないようにする役割を持つ。

従来、湿式法、乾式化学分析いずれにおいても、血球成
分を除去した血清または血漿を試料として用いることが
多かった。しかし血液から血球成分を分離する操作には
多くの労力と装置のコストを伴うので、全血をそのまま
分析できることが望ましい。

全血を試料とする乾式化学分析では、血球成分と血漿を
分析要素中で何らかの手段で分離しなければならない。

特公昭５３−２１６７７号に記載された乾式分析要素は
、血球および全血の高分子量成分を分離するために、ろ
過層を設けている。しかし特開昭６０−１１１９６０号
に記載されているように、分析要素中に設けたろ過層に
より血球成分を除去する場合には非常に時間がかかり、
また血漿中の分析物質の一部がろ過層中で失われて、分
析が不正確になるおそれがあった。

［従来技術とその欠点］ 血球を分析要素中で分離し、しがち血漿中の被検成分の
試薬層への拡散が速やかに行なわれる軟式分析要素が、
特開昭６２−１３８７５６号で提案された。この分析要
素は、第１の非繊維質多孔性層、第２の非繊維質多孔性
層、繊維質多孔性層がこの順に一体に積層されており、
前記３層の多孔性層がそれぞれ隣接する面の間で、液体
の均一透過が実質的に妨げられないような微少貫通部を
形成するように部分的に配置された接着剤により実質的
に密着して接着され一体化された多層分析要素で、特定
成分の存在下で発色を生ずる試薬組成物が前記多孔性層
のいずれかに含まれている。

このような全血分析要素を製造するには、隣合う２つの
多孔性層が隣接する面の間に、接着剤を部分的に配置し
、接着剤が存在しない部分に微少貫通部（連続していて
もよい）が形成されるようにする。そのための方法とし
て特開昭８２−１３８７５８号には、液状の接着剤をグ
ラビア印刷と同じ方法で一方の多孔性層の表面に部分的
に付着させ、他方の多孔性層と重ね合わせて接着させる
方法が提案されている。しかし、この多層分析要素を用
いて全血の分析を行うとき、血液のへマドクリット値（
血液中に占める血球の容積百分率）の大小により、血漿
中の成分含量が同じ血液でも分析結果にがなり差が出る
ことが経験された。

特願昭６２−１７０４６８号において、上記へマドクリ
ット依存性を減少するために、支持体に近い多孔性層の
空隙体積をその上にある多孔性層の空隙体積の１／２以
下とすることが提案されているが、その効果はまだ充分
ではなかった。

［解決しようとする技術的課題〕 本発明は、分析要素中で全血中の赤血球を血漿がら分離
除去して赤血球による妨害を回避し、しがち血漿中の被
検成分の試薬層への拡散が速やかに行なわれ、全血試料
中の特定成分を血液のへマドクリット値に拘わらず高い
精度で分析することができる乾式分析要素の提供を、技
術的ＢＨとする。

［技術的課題の解決手段コ 本発明の上記課題は、水不透過性光透過性支持体の上に
、水浸透性層を介し、又は介することなく、第１の多孔
性層、第２の多孔性層、第３の多孔性層がこの順に一体
に積層されており、被検成分の存在下に検出し得る光学
的変化を生ずる試薬組成物が前記３層の多孔性層および
前記水浸透性層のうち少なくとも１つに含まれ、前記３
層の多孔性層がそれぞれ隣接する面の間で、液体の均一
透過が実質的に妨げられない程度に微少貫通部が形成さ
れるよう、部分的に配置された接着剤により実質的に密
着して接着され一体化されている多層分析要素であって
、前記接着された部分が１　ｃｍ’当たり平均２００未
満の密度で分布する不連続の多数の点状部分から成り立
つことを特徴とする多層分析要素により、解決された。

［発明の具体的構成の詳細コ 本発明の分析要素で部分的に接着される３つの多孔性層
は、１層以上が非繊維質であってもよく、あるいは１層
以上が繊維質であってもよい０ｍｍ資質多孔性が非繊維
質多孔性層の上に設けられてもよいし、その逆にするこ
ともできる。

非繊維多孔性層としては、特公昭５３−２１８７７号、
米国特許１，４２１，３４１号等に記載されたセルロー
スエステル類、例えば、セルロースアセテート、セルロ
ースアセテート／ブチレート、硝酸セルロースからなる
プラッシュ・ポリマーの層が好ましい、６−ナイロン、
　６，６−ナイロン等のポリアミド、ポリエチレン、ポ
リプロピレン等の微多孔、性膜でもよい６特開昭６２−
２７００６号に記載されたポリスルホンから成る微孔性
膜でもよい、その池、特公昭５３−２１６７７号、特開
昭５５−９０８５９号等に記載された、ポリマー小粒子
、ガラス粒子、けい藻土等が親水性または非吸水性ポリ
マーで結合された連続空隙をもつ多孔性層も利用できる
。しかし上記のうち溶血を起こす材料は、試料血液中の
赤血球を破壊し、ヘモグロビンの試薬層への透過を許す
ので、好ましくない。

非繊維多孔性層として相分離法により作られたいわゆる
プラッシュ・ポリマーから成るメンブランフィルタ−を
用いる場合、厚さ方向の液体通過経路は、膜の製造の際
の自由表面側（即ち光沢面）で最も狭くなっているのが
普通で、液体通過経路の断面を円に近似したときの孔径
は、自由表面の近くで最も小さくなっている。単位の通
過経絡における厚さ方向に関する最小孔径は、さらにフ
ィルターの面方向について分布を持っており、その最大
値が粒子に対するろ（濾）過性能を決定する０通常、そ
れは限界泡圧法で測定される０本発明の分析要素の多孔
性層にこの種の膜を用いる場合には、多孔性層の液受各
面から遠い側にメンブランフィルタ−の光沢面を向ける
ことが好ましい、複数の非繊維多孔性層を有する場合は
、いずれも渣受容層から遠い側にメンブランフィルタ−
の光沢面を向けることが好ましい。

繊維質多孔性層を構成する材料としては、Ｐ紙、不織布
、織物生地（例えば平織生地）、編物生地（例えばトリ
コツ？−ｍ）、ガラス繊維１紙等を用いることができる
。

これらのうち織物、編物等が好ましい、織物等は特開昭
５７−６６３５９号に記載されたようなグロー放電処理
をしてもよい、展開層には、ｒｆ＆開面櫃、展開速度等
を調節するため、特開昭６０−２２２７７０号、特開昭
６３−２１９３９７号、６３−１１２９９９号、６２−
１８２６５２号に記載したような親水性高分子あるいは
界面活性剤を含有してもよい。

本発明の分析要素では、３層の多孔性層がそれぞれ隣接
する面の間で、液体の均一透過が実質的に妨げられない
ような微少貫通部を形成するように、部分的に配置され
た接着剤により実質的に密着して接着され一体化される
。即ち、隣合う２つの多孔性層が隣接する面の間に、接
着剤を部分的に配置し、接着剤が存在しない部分に微少
貫通部（連続していてもよい）が形成されるようにする
。

そのためには、特開昭６２−１３８７５６号に記載され
たように、液状の接着剤をグラビア印刷と同じ方法で一
方の多孔性層の表面に部分的に付着させ、他方の多孔性
層と重ね合わせて接着させる方法がある。グラビアロー
ラーの代わりに凹版版胴を用い凹版印刷法で接着剤を部
分付着させることもできる。グラビアローラーまたは凹
版版胴の上の接着剤付着部分の形状、大きさ、間隔、面
積比等は特開昭６２−１３８７５６号に記載されている
如くである。

接着剤として種々のものを用いることができ、それらに
ついては特開昭６２−１３８７５６号の記載を参照する
ことができる０例えばでん粉糊等の水性の糊が有用であ
る。

ポリビニルアルコール、デキストリン、カルボキシメチ
ルセルロース等の水溶液、酢酸ビニル−ブチルアクリレ
ート共重合体エマルジョン等でもよい、有機溶剤型の接
着剤も用い得るが、溶剤の蒸発のおそいものが適する。

熱接着性の接着剤は特に有用である。

ホ７）・メルト型、すなわち熱接着性の接着剤としては
、工業材料　第２６巻、第１１号、第４ページより第５
ベージに記載されたようなホットメルト材を用いること
ができる。即ち、エチレン−酢酸ビニル共重合体、エチ
レン−アクリル酸エチル共重合体、エチレン−アクリル
酸共重合体等のエチレン共重合体、低分子量ポリエチレ
ンやアククチツクポリプロピレンのようなポリオレフィ
ン類、ナイロン等のポリアミド、ポリエステル系共重合
体、ＳＢＳなどのスチレンブロック共重合体のような熱
可塑性ゴム、スチレンブタジェンゴム、ブチルゴム、ウ
レタンゴム、ロジン、石油樹脂、テルペン樹脂、パラフ
ィン、合成ワックス等、種々のものを用いることができ
る。

本発明の方法に従い接着される２つの多孔性層の厚さは
同じでも異なってもよく、通常５０ないし６００μｍ、
好ましくは８０ないし３００μ鍋である。

本発明の分析要素では、多孔性層が隣接する面の間で接
着された部分が、１ｃｔｎ２当たり平均２００未満の密
度で分布する不連続の多数の点状部分から成り立つ０点
状部分が一定の間隔で分布する場合、その間隔が約０．
７−菌以上であればこの条件を満足する。

接着された部分の面積の全体に占める割合、即ち面積率
は、通常１０％から３０％の範囲が適当である。

本発明の分析要素は種々の構成を有することができる。

例えば米国特許３，９９２，１５８号、特開昭５５−１
６４３５６号（米国特許４，２９２，２７２号）、！ｌ
ＶｒＭ昭６２−１３８７５６号、同６２１：１１８７５
７号、同６２−１３８７５８号の記載を参考にできる。

実用的には例えば、 （１）液体不浸透性光透過性支持体の上に、非繊維第１
多孔性層、非繊維質多孔性層、繊維質第３多孔性層をこ
の順に、 （２）支持体の上に、接着層（または吸水層）、非繊維
第１多孔性層、非繊維第２多孔性層、繊維質第３多孔性
層を、この順に、 （３）支持体の上に、検出層、非繊維第１多孔性層、非
繊維第２多孔性層、ｍＭ！質第３多孔性層を、この順に
、（４）支持体の上に、試薬層、非繊維第１多孔性層、
非繊維第２多孔性層、繊維質第３多孔性層を、この順に
、それぞれ有するものが、有用である（支持体は下塗り
層を含んでいてもよい）、検出層は一般に、被検成分の
存在下で生成した色素等が拡散し、光透過性支持体を通
して光学的に検出され得る層で、親水性ポリマーにより
構成することができる。検出層は本発明における液体浸
透性層に相当する。検出層は媒染剤、例えばアニオン性
色素に対してカチオン性ポリマーを、含んでもよい、吸
水層は一般に、被検成分の存在下で生成する色素が実質
的に拡散しないような層を言い、膨潤しやすい親水性ポ
リマーにより構成することができる。上記（３）および
（４〉において、支持体と検出層または試薬層との間に
吸水層を設けてもよい。

光透過性水不透過性支持体の材料として好ましいものは
ポリエチレンテレフタレートである。セルローストリア
セテート等のセルロースエステル類でもよい、親水性層
を強固に接着させるため通常、下塗り層を設けるか、親
水化処理を施す。

試薬組成物は、被検成分の存在下に、光学的に検出し得
る物質、例えば染料を、生成し得る組成物であって、被
検成分と直接に反応して、あるいは被検成分と他の試薬
との反応により生成する中間体との反応の結果、光学的
に検出し得る物質、例えば染料を、生成し得る組成物（
指示薬）を含む、ロイコ色素の酸化によって染料を生成
する組成物（例えば、米国特許４，０８９，７４７号、
特開昭５９−１９３３５２号等に記載されたようなアリ
ールイミダゾールロイコ色素）、ジアゾニウム塩、酸化
されたときに他の化合物とカップリングにより染料を生
成する化合物を含む組成物（例えば４−アミノアンチピ
リン類と、フェノール類またはナフトール類）、還元型
補酵素と電子伝達剤の存在下で染料を生成することので
きる化合物から成るもの等を、用いることができる。ま
た、酵素活性を測定する分析要素の場合には、例えばｐ
−ニトロフェノールのような有色物質を遊離しうる自己
顕色性基質を、試薬層や展開層に含むことができる。

被検成分の存在下に発色を生ずる試薬組成物を前記の非
繊維質多孔性層の少なくとも１つに含有させるには、試
薬組成物の適当な溶液または分散液を予め含浸または塗
布した多孔性展開層を、他の水浸透性層、例えば試薬層
の上に特開昭５５−１８４３５８号のような方法で接着
させる方法も有用である。

多孔性層を、他の水浸透性層（例えば下塗り層、接着層
、吸水層）の上に前記特開昭５５−１６４３５６号のよ
うな方法で接着させた後、試薬組成物の溶液または分散
液を多孔性層に塗布してもよい。

多孔性層への含浸または塗布には公知の方法を利用でき
る。塗布には例えばデイツプ塗布、ドクター塗布、押し
出し塗布、ホッパー塗布、カーテン塗布等を適宜選択し
て用いる。

試薬組成物は、総てを第１の多孔性層に含んでもよく、
別の多孔性または無孔性層（例えば検出層）に分けて含
有させてもよい０例えば被検成分と試薬との反応により
中間体を生成する組成物を第２の多孔性層に、生成した
中間体と反応して染料等を与える組成物（指示薬）を第
１の多孔性層に含んでもよい。

試薬組成物は、その一部を親水性ポリマーを結合剤とす
る実質的に均一な層（例えば検出層）に含ませてもよい
。

親水性ポリマーとして例えば、ゼラチンおよびこれらの
誘導体く例えばフタル化ゼラチン）、セルロース誘導体
（１３’１えばヒドロキシエチルセルロース）、アガロ
ース、アクリルアミド重合体、メタアクリルアミド重合
体、アクリルアミドまたはメタアクリルアミドと各種ビ
ニル性モノマーとの共重合体等が利用できる。

親水性ポリマーを結合剤とし試薬組成物を含む均一層を
塗布した後、試薬組成物を含まない多孔性層を特開昭５
５−１６４３５６号に記載されたような方法で接着させ
ることによって、試薬組成物を第１の多孔性層に実質的
に含有させることができる。

試薬組成物には必要に応じ、活性化剤、緩衝剤、硬膜剤
、界面活性剤等を含有させることができる０本発明の分
析要素の試薬層に含有させることができるＭｍ剤の例と
しては、炭酸塩、ホウ酸塩、ｇＪ酸塩や［１ｉｏｃｈ相
１ｓＬｒｙ誌　第５巻　第２号、４６７ページより４７
７ページ（１９６６年）に記載されているグツド（Ｇ　
ｏｏｄ）氏のＫｍ剤などを挙げることができる。これら
の緩衝剤は「蛋白質・酵素の基礎実験法Ｊ（堀尾武−ほ
か著、南江堂、１９８１年）、前記Ｂｉｏｅｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ誌第５巻等の文献を参考にして選択することかで
きる。

試薬組成物は酵素を含むものでもよく、例えば特開昭６
２、−１３８７５６号明細書第１８ページから第２０ペ
ージに記載されたものを用いることができる。

ｔ１ｃ利液を受容する多孔性層は、液体試料の展開層と
して利用されることが多く、液体計量作用を有する層で
あることが好ましい、液体計量作用とは、その表面に点
着供給された液体試料を、その中に含有している成分を
実質的に偏在させることなく、面の方向に単位面積当り
ほぼ一定量の割合で広げる作用である。展開層を目的と
する繊維質多孔性層を構成する材料としては、ｒ紙、不
織布、ｍ物生地（Ｓえば平織生地）、Ｈ４物生地（例え
ば、トリコット編）、ガラス繊維２紙等を用いることが
できる。

これらのうち織物、編物等が好ましい、織物等はｖｊ開
昭５７−６６３５９号に記載されたようなグロー放電処
理をしてもよい、展開層には、展開面積、展開速度等を
調節するため特開昭６０−２２２７７０号、特開昭６３
−２１９３９７号、同６３−１１２９９９号、同６２−
１８２６５２号に記載したような親水性高分子あるいは
界面活性剤を含有してもよい。

多孔性層を接着し積層するための接着層を、支持体、下
塗り層、吸水層、検出層等の連続層の上に設けてもよい
、接着層は水で膨潤したときに多孔性層を接着すること
ができるような親水性ポリマー、例えばゼラチン、ゼラ
チン誘導体、ポリアクリルアミド、澱粉等からなること
が好ましい。

第２の多孔性層は、検出層、試薬層等に生じた検出可能
な変化（色変化、発色等）を光透過性の支持体側から反
射測光する際に、全血中の赤血球のヘモグロビンの赤色
を遮蔽するとともに、光反射層または背景層として機能
させることができる。第２の多孔性層に親水性ポリマー
をバインダーとして分散された酸化チタン、硫酸バリウ
ム等の光反射性粒子を含有させてもよい、さらに第３の
多孔性層にも光反射性粒子を含ませてもよい。

［実施例１］ １−１．竪（ジ色歌別改鹿Ｏ耳叉 巨瓜ユ匹襄皿液 下記組成Ａのロイコ色素；８液を調製した。

Ａ。

２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）
４−（４−（ジメチルアミノ）フェニル〕５−フェネチ
ルイミダゾール　酢酸塩　　　　５．７ｇ２−（４−ヒ
ドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）−４−Ｃ４−
（ジメチルアミノ）フェニル〕５−フェネチルイミダゾ
ール　塩酸塩　　　　０．８ｇＮ、Ｎ−ジエチルラウリ
ルアミド　　　　　　　　１０４８ｙうｊシ合亀Ｎ 下記組成りのゼラチン溶液を作成した。

Ｂ　： アルカリ処理ゼラチン　　　　　　　　　３００ｇ水　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１９０
０　ｇビス〔（ビニルスルホニルメチル カルボニル）アミノコメタン　　　　　　　３．０ｇ１
ｔ１＠Ｊ設 Ｂ液をＴＫオートホモミキサー（特殊機械工業社製乳化
器）で約５７００回転／分でかくはんしながらＡ液を添
加し、約３０分間分散して、乳化物を調製した。

１−２元匹区１坪＠鼻垂 上記乳化物を、ゼラチン下塗りされている厚さ１８０μ
肩の透明ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィル
ム（支持体）の上にｌｅａ”当たり１５０ｇの割合で塗
布し、乾燥させ、発色試薬層とした。

１−３．９１−　−　　の　　　と几理上記発色試薬層
の表面を約２５℃の水で一様に湿らせ（約３０ｇ／Ｉ２
の割合）、有効孔径１．２μ転厚さ１４０μ繭、空隙率
約８０％のセルロースアセテートメンブレンフィルター
（富士写真フィルム（株）製ミクロフィルターＦＭ３０
０）を重ね合わせ、乾燥させて、発色試薬層にメンブレ
ンフィルターを接着させた。

次にこのメンブレンフィルターの上から、別にＴｆＱ製
しておいた下記組成物Ｃを１ｍ２当たりＬＬｏｎｌの割
合で塗布し、乾燥させて、第１多孔質層とした。

Ｃ： 水　　　　　　　　　　　　　　　　　１２２３゜コレ
ステロールエステラーゼ　　　１．７ｇコレステロール
オキシダーゼ　　　１０．＋８゜リボプロティンリパー
ゼ　　　　　１．９４゜ペルオキシダーゼ　　　　　　
　　８．８６Ｆｉフエロシアン１ヒカリウム　　　　　
　５．６ｇ界面活性剤　　　　　　　　　　　　４．６
゜（下記式［Ｉ］においてｎ＝ｐ−ノニル、ｎ−１０、
ｍ＝２およびｍ＝３の混合物）［１］ 第２多孔ττｇＦＪとするための有効孔径３μｍ、厚さ
１４０μ鴎、空隙率約８０％のセルロースアセテートメ
ンブレンフィルター（富士写真フィルム（抹）製ミクロ
フィルターＦＭ３００）と、試Ｔ１展開層とするための
、５０デニール相当のＰＥＴ紡績糸を３６ゲージ編みし
たトリコット編物布地（厚さ約２５０μＲ）を、それぞ
れ上記［＋１式の化合Ｔｈ（ただしＲで示される置換基
がｐ−ノニル基、ｎ＝１０．ｍ：２およびｍ＝３の混合
物）の２重量％水溶液に浸漬し、空隙に液を満たした後
取り出して、乾燥させた。

１−５８，２　　　　および　　　の 次に含浸処理済みのトリコット編物生地の温度８０℃に
予熱した表面に、温度１３０℃に加熱熔融したホットメ
ルト型接着剤を、グラビア印刷法を利用して、グラビア
ローラーからの転写により点状に付着させた。グラビア
ローラーのドツト直径０．４５ｍａｉ、ドツト中心間隔
０．９１、ドツト面積率は約２０％、付着した固形成分
ｊｔ（単位面積当たり）は約３ビ／ｌ１１２であった。

高温の接着剤が付着した布地（展開層となる）の表面に
、直ちに含浸処理済みの前記メンブレンフィルター（第
２多孔質層となる）の非光沢面を向かい合わせ、両者を
ラミネートローラーの間を通してラミネート・〈接着一
体化）した。

１−６．　　１　　　　　　と重　　との−前記重層物
（展開層および第２多孔質層）を前記と同じ点状接着法
により前記第１多孔質層の面上に接着し、一体止させた
。すなわち上記重層物のメンブレンフィルター面に、加
熱したホットメルト型接着剤をグラビア印刷法を利用し
てグラビアローラーからの転写により網点状に付着させ
た後、直ちに前記第１多孔質層（支持体および発色試薬
層の上にある）の面を向かい合わせ、両者をラミネート
ローラーの間を通し、ラミネートしたく接着一体止）し
た。

用いたグラビアローラーのドツト直径は０．４ｍｍ、ド
ツト中心間隔は０．８ｍｍ、ドツト面Ｔ？ｉ率は約２０
％、付着した固形成分Ｊｉ（単位面精当り）は約３ｇ／
ａ２であった。

こうして完成した総コレステロール活性測定用分析フィ
ルムは、支持体、発色試薬層、第１多孔質層、第２多孔
質層、布展開層の順に一体に積層されている。布展開層
と第２多孔質層とは協同して、血球ろ重層として作用す
る。第１多孔質層は、コレステロールの存在下に第２鉄
イオンを生成する反応層として作用する６発色試薬層は
、コレステロールの存在下に第１多孔質層で生成した第
２鉄イオンにより色素を形成し、色素は透明支持体を通
して光学的に検出される。

１−７６分析２う／」受γ耽酌 得られた総コレステロール定量分析用分析フィルムを一
辺１５１の正方形チップに裁断し、特開昭５８−３２３
５０号に記載のスライド枠に収めて総コレステロール定
量用生化学分析スライドを完成した。

［比較例］フ 実施例１の１−６、第１多孔質層と重Ｎ物との一体化で
用いたグラビアローラーの代わりに、ドツト直径０．３
ｍｍ、ドツト中心間隔０　、６　ｍ＋＊、ドツト面積率
約２０％のグラビアローラーを使用した他は、実施ｒＩ
Ａ１と同様の手順で、総コレステロール定量用生化学分
析スライドを完成した。

［比較例２］ 実施例１の１−６．第１多孔質層と重層物との一体化で
用いたグラビアローラーの代わりに、ドツト直径ｏ、２
１、ドツト中心間隔０．４ｍｍ、ドツト面積率約２０％
のグラビアローラーを使用した他は、実施例１と同様の
手順で、総コレステロール定量用生化学分析スライドを
完成した。

［測定例１］ 分析スライドの全血中総コレステロールによる発色を、
下記のようにして評価した。

血漿中総コレステロール１８３ｍｇ／ｄ１を含むヘマト
クリット値３９％のヒト全血試料と、これを遠心分離を
行うことにより採取したヒト血漿試料とを用怠し、まず
は前記全血に前記血漿を加えヘマトクリット値２５％全
血とし、次に前記全血を遠心分離し赤血球部分（下層）
と血漿部分（上澄）に分け、上澄から血漿を除き、ヘマ
トクリット値５５％全血とした。すなわち、総コレステ
ロール１８３　ｍｇ／　ｄｉを含み、ヘマトクリット値
がそれぞれ２５％、３９％、５５％の３種のヒト全血試
料を用意した。

次に、前記３種のヒト全血試料１０μｌを実施例１、比
較例１、および比較ＰＡ２で作成した分析スライドの展
開層上にそれぞれ点着した０点着後、３７℃にて６分間
インクベーション後、中心波長６４０ｎｍの可視光でＰ
ＥＴ支持体側から反射測光により、分析スライドの発色
光学濃度を測定し、ＯＤｔ　（透過光学濃度）に換算し
た値（Ｃ目ｎｉｃａｌＣｂｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｖｏｌ、
２４．１３３５（１９７８）の原理による）を用いて前
記３種の人全血試料中の総コレステロール値（ｍｇ／ｄ
Ｎ）を算出した。結果を第１表に示す。

第１表 第１表より、ドツト直径が０．４＋ｗｍ、ドツト中心間
隔が０．８１であるグラビアローラー（ドツト面槓率約
２０％）を用いた実施例１の分析スライドは、ドツト直
径０．３ｍ転ドツト中心間隔０．６ｍｍのグラビアロー
ラーを使用した比較例１およびドツト直径０．２ｍｍ、
ドツト中心間隔０．４ｍｍのグラビアローラーを使用し
た比較例２（いずれもグラビアローラーのドツト面積率
約２０％）の分析スライドに比して、化コレステロール
値測定に対し試料血液のへマドクリット値の影響を受け
にくいことが明らかである。

［実施例２］ ２−１．吸水ｍ笹 ゼラチン下塗りされた厚さ１８０μｍの無色透明ポリエ
チセンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルムく支持体）の
上に、乾燥後の膜厚が７μ耐こなるようにゼラチン水溶
液を塗布し、乾燥して吸水層を形成した。

２−２．１　　　のノと 上記吸水層の表面を約２５℃の水で一様に湿らせ（約３
０ｇ／ｍ２）、有効孔径３μ転厚さ１４０μ鴎、空隙率
約８０％のセルロースアセテートメンブランフィルタ−
（富士写真フィルム（株）製ミクロフィルターＦＭ３０
０）を重ね合わせ、乾燥させて、吸水層にメンブランフ
ィルタ−を接着させた。

次にこのメンブランフィルタ−の上から下記組成物［１
］を表示の割合で塗布し、乾燥させた。

組成物［１］： ゼラチン　　　　　　　　　　　　　　　　１．２ｇ／
ｌａ’ポリオレフィン粒子　　　　　　　　　　　４１
　　ｇ７ｍ’（三井石油化学工業（株）ケミパールＭ２
Ｏ０、粒子径約５μ転密度０．９２） 界面活性剤　　　　　　　　　　　　　　　０．２２ｇ
／ｓ２（ポリオキシエチレンノニルフェニル エーテル） トリスヒドロキシメチルアミノメタン　　　０．３２ｇ
／ｍ２リン酸ｌカリウム　　　　　　　　　　　　　０
．３２　、／噛２α−ケトゲルタール酸　　　　　　　
　　　０．１　ｇ／ｖａ２Ｌ−アスパラギン酸ナトリウ
ム　　　　　　０．５　ｇ７ｍ２オキザロ酢酸デカルボ
キシラーゼ　　　２５２０１Ｕ／ｍ’ＦＡＤ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　６鏑ｇ／積２Ｔ　Ｐ　Ｐ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　２４　　ｍｇ７ｍ２ピルビン酸オ
キシダーゼ　　　　　　　７０００　ＩＩ／ｍ２ペルオ
キシダーゼ　　　　　　　　　　　１２８０１Ｕ／鵠２
色素（下記構造＞　　　　　　　　　　　　　０．３６
ｇ／ｍ２（希Ｎ　ａ　ＯＨ溶液でｐｉを７．５に調整し
て塗布しな）色素：　　２−（３，５−ｄｉｍｅＬｈｏ
ｘｙ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）４−ｐｈｅｎ
ｅｔｈｙ　ト５−　（４−ｄ　１ｓｌｅ　ｔｈｙ　ｌ　
ａ＋＊　１ｎｏｐｂｅｎｙ　ｌ　）　１Ｔａｉｄａｚｏ
　ｌ　ｅさらに下記組成物［２コを、乾煤後の塗布量が
記載の通りになるように塗布し、乾燥して、第１多孔質
層とした（光反射／遮蔽層）。

組成物［２］ 酸化チタンマイクロカプセル（下記）　　　３９　ｇ７
ｍ２メチルセルロース　　　　　　　　　　２ｇ／譲２
（信越化学（株）製６５ＳＨ５０） メチルセルロースの溶媒：　メタノール組成！ｉ！Ｊ［
２］に用いた酸化チタンマイクロカプセルは以下のよう
にして調製した。

モノイソブチルジフェニルエタン１２ｇ、メタクリル酸
エステル／アクリル酸共重合体く分子ｊ１１０万）８ｇ
を８０℃で溶解し、これに酸化チタン粉末（石屋産業（
株）ＰＦ６５６、平均粒子径０．２μ鋤〉１５ｇを加え
、電動にゆう鉢で８時間分散した。この分散物に下記の
混合物を加え、ガラス棒でよく混合した。

メタクリル酸エステル／アクリル酸 共重合体＊（分子量約１０万ン　　　　１２ｇ酢酸エチ
ル　　　　　　　　　　　　　１８．５　ｇパラフィン
オイル （平均炭素原子数１２）　　　　　　　　１２ｇ＊藤倉
化成アクリベースＭＭ２００２−２次にこの中に下記混
合物を加え、ガラス棒でよく混合し、これを液（Ｉ）と
した。

酢酸エチル　　　　　　　　　　　　　　　１４ｇシリ
コーンオイル （信越化学（株）製　ＫＦ９６　１０００）　　　　　
４ｇ１．１．１−）す（ｐ−インシアナトメチルベンジ
ルアミノカルボニルオキシメチル）プロパン　２８ｇメ
チルセルロース４％水溶液１８０ｇにジエチレントリア
ミン２，５％水溶液Ｌｏｇを加え、家庭用ミキサー中で
撹拌しつつ、この中に前記液（Ｉ）を加え、分散した０
分散には、検子電器産業（株）製クツキングミキサーＭ
Ｘ９１５Ｃ’を用い、電圧調整器で電圧を４０Ｖとし、
マヨネーズモード（低速）で２０秒撹拌後、電圧１００
Ｖ、粉ひきモード（高速）で３分３０秒分散させた。さ
らにジエチレントリアミン５％水溶液６４ｇを加え、６
０°Ｃで３時間反応させた０反応を麦、水洗し、乾燥し
て、酸化チタンマイクロカプセルを得た。

２−３、２　　　および　　の　゛　理実施例１の１−
４に同じ ２−４．　２　　　　　および　　　の実施例１の１−
５に同じ ２−５．　　１　　　　　　　　　　との−前記重層物
（ｒｙＬ開層および第２多孔賞層）を前記実施例１−６
とまったく同じ点状接着法により前記第１多孔質層の面
上に接着し、一体止させた。

こうして完成したＧＯＴ活性測定用分析フィルムは、支
持体、吸水層、第１多孔質層（発色試薬層を兼ねる）、
第２多孔質層、布展開層の凧に一体に積層されている。

布展開層と第２多孔質層は協同して、血球ろ重層として
作用する。第１多孔質層は、ＧＯＴの存在下において反
応および色素の形成（発色）層として作用する０色素は
透明支持体を通して光学的に検出される。

２−６１分分析うΔコシη（阻 得られたＧＯＴ活性測定用分析フィルムを一辺１５１の
正方形チップに裁断し、特開昭５８−３２３５０号記載
のスライド枠に収めて、ＧＯＴ活性測定用生化学分析ス
ライドを完成した。

［比較例３］ 実施例２の２−５．第１多孔層と重層物との一体化で用
いたグラビアローラーの代わりに、ドツト直径０．３ｍ
ｍ、ドツト中心間隔０．６Ｉ、ドツト面積率約２０％の
グラビアローラーを使用した他は、実施例２と同様の手
順で、ＧＯＴ活性測定用生化学分析スライドを完成した
。

［比較例４コ 実施例２の２−５．第１多孔層と重層物との一体化で用
いたグラビアローラーの代わりに、ドツト直径０．２ｍ
＋ｓ、ドツト中心間隔０．４＋ａｍ、ドツト面積率約２
０％のグラビアローラーを使用した他は、実施例２と同
様の手順で、ＧＯＴ活性測定用生化学分析スライドを完
成した。

［測定例２］ 分析スライドの全血中ＧＯＴによる発色を、下記のよう
にして評価した。

ヘマトクリット値３６％のヒト全血試料にブタ由来のＧ
ＯＴ（米国シグマ社製）をＧＯＴ活性が２８０単位／ｌ
になるように加えたものと、これを遠心分離を行うこと
により採取した血漿試料とを用意し、まずは前記全血に
前記血漿を加えヘマトクリット値２５％全血とし、次に
前記全血を遠心分屋し赤血球部分（下層）と血漿部分（
上澄）に分け、上澄から血漿を除きヘマトクリット値５
５％全血とした。すなわち、ＧＯＴ活性が２８０単位／
１であり、ヘマトクリット値がそれぞれ２５％、３６％
、５５％の３種のヒト全血試料を用意した。

次に、前記３種のヒト全血試料１０μｌを実施例１、実
施例２および実施１３１３で作成した分析スライドの展
ｒＭＮ上にそれぞれ点着した０点着後、３７℃で６分間
インクベーション後、中心波長６４０止の可視光でＰＥ
Ｔ支持体側から反射測光により５分析スライドの発色光
学濃度を測定し、０Ｄｔ（透過光学濃度）に換算した値
（ＣｌｉｎｉｃａＩＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｖｏｌ、２
４．１３３５　（１９７８）の原理による）を用いて前
記３ａｉの人全血試料中のＧＯＴ活性値（単位／ｌ）を
算出した。結果を第２表に示す。

び比較例４の分析スライドに比して、ＧＯＴ活性測定に
対し試料血液のへマドクリット値の影響を受けにくいこ
とが明らかである。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）水不透過性光透過性支持体の上に、水浸透性層を
   介し、又は介することなく、第１の多孔性層、第２の多
   孔性層、第３の多孔性層がこの順に一体に積層されてお
   り、被検成分の存在下に検出し得る光学的変化を生ずる
   試薬組成物が前記３層の多孔性層および前記水浸透性層
   のうち少なくとも１つに含まれ、 前記３層の多孔性層がそれぞれ隣接する面の間で、液体
   の均一透過が実質的に妨げられない程度に微少貫通部が
   形成されるよう、部分的に配置された接着剤により実質
   的に密着して接着され一体化されている多層分析要素で
   あつて、 前記接着された部分が１ｃｍ＾２当たり平均２００未満
   の密度で分布する不連続の多数の点状部分から成り立つ
   ことを特徴とする多層分析要素。
2. （２）前記接着された部分の面積率が１０％から３０％
   である特許請求の範囲（１）の分析要素。
3. （３）前記試薬組成物の全部が第１の多孔性層および介
   在することのある水浸透性層のうち少なくとも１つに含
   まれる特許請求の範囲（１）または（２）の分析要素。
4. （４）前記試薬組成物のうち少なくとも発色に直接寄与
   する成分が第１の多孔性層に含まれる特許請求の範囲（
   １）または（２）の分析要素。
5. （５）第２の多孔性層が非繊維質多孔性層である特許請
   求の範囲（１）ないし（４）いずれかの分析要素。
6. （６）第１の多孔性層が非繊維質多孔性層である特許請
   求の範囲（１）ないし（５）いずれかの分析要素。
7. （７）第１の多孔性層が繊維質多孔性層である特許請求
   の範囲（１）ないし（５）いずれかの分析要素。
8. （８）第３の多孔性層が繊維質多孔性層である特許請求
   の範囲（１）ないし（７）いずれかの分析要素。
9. （９）第３の多孔性層が非繊維質多孔性層である特許請
   求の範囲（１）ないし（７）いずれかの分析要素。
10. （１０）他の水浸透性層を前記支持体と第１の多孔性層
    との間に有する、特許請求の範囲（１）ないし（９）い
    ずれかの分析要素。
11. （１１）さらに他の水浸透性層を第３の多孔性層より支
    持体から遠い位置に有する、特許請求の範囲（１）ない
    し（１０）いずれかの分析要素。