JPH02245191A - ６―α―ヒドロキシメチルロバスタチン誘導体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、６−α−ヒドロキシメチルロバスタチン誘導
体の製造方法に関するものである。

［従来の技術］ 過コレステリン血症は、西欧諸国における死亡および撥
疾の主因である動脈硬化症および冠状動脈性心臓病の主
たる危険因子の１種であることが知られている。胆汁酸
１］鎖剤は過コレステリン血症防止剤として一応有効で
あると思われるが、これらは多量に消費されくすなわち
１日に数Ｕも消費され）かつこれらは決してよい味のも
のではない。

現在市販されているＭＥＶＡＣＯＲ（登録商標）（ロバ
スタチン）は、酵素ＨＭＧ−ＣＯＡレダクターゼを阻止
することによりコレステロールの生合成を制限して機能
する極めて活性な過コレステリン血症防止剤の群の１種
である。天然の発酵生産物であるメバスタヂンおよびロ
バスタチンの伯に、その各種の半合成および完全合成の
同族体が存在する。たとえばδ−アシル部分が２，２−
ジメチルブチリルであるシムバスタチンは、ロバスタチ
ンよりもずっと強力なＨＭＧ−〇ＯＡレダクターゼ阻止
剤である。

天然に存在する化合物およびその半合成同族体は次の一
般的な構造式： ％式％ ［式中、Ｚは水素、Ｃ１−５アルキル、またはフェニル
、ジメチルアミノもしくはアセチルアミノよりなる群の
一員で置換されたＣ１−５アルキルであり、 Ｒ１は Ｒ３−ＣＨであり、Ｒ３はＨもしくはＯＨであり、さら
に Ｒ２は水素もしくはメチルであり、かつａ、ｂ。

Ｃおよびｄは二重結合であってもよいことを示し、特に
ｂおよびｄが二重結合を示すか、或いはａ、ｂ、ｃおよ
びｄが全て単結合である場合を含む、ただしａが二重結
合であれば、Ｑは−Ｃ＝もしくは一〇−であるコを有す
る。

ＣＨ３Ｈ を有する。

米国特許第４，５１７，３７３号公報は、上記一般式に
おいてＲ１が： ＣＨ３ によって示される半合成のヒドロキシ含有化合物を開示
している。

米国特許第４，５３７，８５９号および米国特許第４．
４４８，９７９号公報は、上記一般式においてＲ１が：
である半合成のヒドロキシ含有化合物を開示している。

これら化合物は、成る種の微生物を対応の非ヒドロキシ
ル化基質に作用させ製造される。米国特許第４，５３７
，８５９号公報に記載されたこの種の微生物の１種はＮ
ｏｃａｒｄｉａ属である。

１９８７年５月１５日付は出願の本出願人による米国特
許出願第０４８，１３６号は、６−ジスメチル−６−ヒ
ドロキシメチルおよび６−ジスメチル−６−カルホキシ
シムパスタチン同族体を包含すφＨＭＧ−ＣｏＡレダク
ターゼ阻止剤を開示している。これらの化合物は、微生
物Ｎｏｃａｒｄｉａａｕｔｏｔｒｏ　ｈｔｃａ　（ＭＡ
　６１８０およびＭＡ　６１８１）の菌株を用いてシム
バスタチンのす１ヘリウム塩の生物変換により生成され
た。しかしながら、この生物変換は、主として６一部分
がβ配位を有する異性体を生成した。

１９８８年９月２９日付は出願の本出願人による米国特
許出願第１６１，５３０号および第１６１，５７９号は
、ロバスタチンの６−α−ヒドロキシメチル同族体およ
びアシル側鎖におけるその同族体を合成するための化学
合成法を記載している。

１９８８年４月１５日付は出願の本出願人による米国特
許出願第１８１，８７７号および１９８８年４月１５日
付は出願の米国特許出願第１８１，８７８号は、６−ゾ
スメチルー６−β−ヒドロキシメチル−および６−ゾス
メチルー６−β−カルボキシ−ロバスタチン誘導体およ
びそのδ−アシル同族体を製造するための方法および微
生物を開示している。

［発明の要点コ 本発明は、未同定のＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ　（）Ｉ
Ａ　６４７４）を用いるロバスタチンの６−ゾスメチル
ー６−α−ヒドロキシメチル誘導体およびその同族体（
■）：の新規な製造方法に関する。

この方法は、未同定の＾ｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ（ＭＡ
　６４７４）を含有する培養物による基質（■）： （Ｉ工） の生物変換を含む。

アシル部分Ｃ１−１８アルキル−Ｃ−は分岐もしくは直
鎖とすることができ、好ましくは２−メチルブチリルも
しくは２．２−ジメチルブチリル、特に好ましくは２．
２−ジメチルブチリルである。

未同定のＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ（ＭＡ　６４７４）
の特性につき、以下説明する。

培養特性 オートミール寒天 植物性増殖：リバース：黄褐色、オブバース：黄褐色隆
起増殖 気　菌　糸：散在、白色、粉末状 可溶性色素：なし ツアペック−ドックス寒天（蔗　硝　塩基　）植物性増
殖：淡黄色、マット状（ｍａｔｔｅ）　、扁平。

１枚のプレートは、増殖の周辺にわ たり清澄化を示す。

気　菌　糸：なし 可溶性色素：なし 卵アルブミン寒天 植物性増殖：黄色、扁平、マット状。

気　菌　糸：なし 可溶性色素：なし グリセリン・アスパラギン寒天 植物性増殖：リバース：乳黄色、扁平、マット状。

オブバース二同じ 気　菌　糸：なし 可溶性色素：なし 塩−・粉寒天 植物性増殖：黄色、扁平マット状 気　菌　糸：なし 可溶性色素：なし 栄養チロシン寒天 植物性増殖：リバース：黄褐色 気　菌　糸：なし 可溶性色素：なし チロシンの分解二重度の増殖の領域に観察される。

スキムミルク寒天 植物性増殖：黄褐色、扁平、マット状 気　菌　糸：なし 可溶性色素：淡褐色 カゼインの加水分解：優秀 物−芽抽　物寒天 植物性増殖：リバース：黄褐色。オブバース：黄褐色、
隆起、皺 気　菌　糸：灰白色粉末 可溶性色素：なし 栄養寒天 植物性増殖：リバース：黄褐色。オブバース：黄褐色、
隆起、皺 気　菌　糸：なし 可溶性色素：なし 栄養澱粉寒天 植物性増殖：黄褐色、隆起、皺、マット状気　菌　糸：
なし 可溶性色素：なし 澱粉の加水分解：良好 トマトペースト−オートミール寒天 植物性増殖＝１枚のプレートはカラン黄色の植物性増殖
における皺の「隆起したＪ小 丘を示す。第２のプレートは融合し た黄褐色の皺増殖を示すと共に、分 １つ 離されたカラン黄色の皺「隆起」コ ロニーをも示す。

気　菌　糸：上記第２プレートにて散在した白色気菌糸 可溶性色素：なし ゼラチン穿刺 植物性増殖：なし 気　菌　糸：なし 可溶性色素：なし ペプトン−鉄−酵母抽出物寒天 植物性増殖：橙褐色の隆起した皺の不規則縁部、気　菌
　糸：なし 可溶性色素：なし メラニン：陰性 Ｈ２Ｓ　：陰性 ツアペック−ドックス寒天スラント 植物性増殖：無色 気　菌　糸：なし 可溶性色素：なし 形態学的特性 分校フィラメント、フィラメント直径的０．７６声。胞
子は短い連鎖にて螺旋状に２〜１０個の胞子を形成し、
かつ球形乃至卵型として出現する（０．７６Ｘ１．Ｏ−
）。胞子は、着生胞子裏（直径４〜１０Ｉｍ）内に担持
されると思われる。

生理学的および生化学的特性 酸素要求（Ｗ９．母抽出物−デキストロースー塩寒天に
おける穿刺培養）好気性 炭素利用 プリドハムーゴットリーブ基礎培地＋１％炭素源：　「
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ菌種の特性化方法」における
標準法により分類、 ［Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
　ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏ　　、　
ｖｏｌ、１６．　Ｎｏ、３　、　Ｊｕｌｙ　１９６６　
。

ｐｐｓ、３１３−３４０　　］ ＮＳ（炭素源なし） α−Ｄ−グルコース（陽性比較） Ｄ−アラビノース Ｌ−アラビノース Ｄ−フラクトース し−グルコース イノシトール α−Ｄ−ラクトース β−Ｄ−ラクトース Ｄ−マルトース Ｄ−マニトール Ｄ−マンノース Ｌ−マンノース Ｄ−ラフィノース し−ラムノース 蔗　　　糖 僅かな増殖 優れた増殖 ＋ 十 ＋　＋ ＋＋ ＋ 十＋ ＋ Ｄ−キシロース　　　　　　　　　　　＋＋し一キシロ
ース 特記しない限り、全ての測定は２８℃にて３週間後に行
ない、全ての培地のｐＨはほぼ中性（６，８〜７．２）
とした。

未同定のＡｃｔｉｎｏｎ＋ｙｃｅｔｅ（ＭＡ６４７４）
の寄託は、ブタペスト条約の下で１９８８年１１月１１
日に行なった。

ＡＴＣＣ５３８２８として受託された寄託培養物は、ア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（メリー
ランド州２０８５２　、ロックビル、バークローン・ド
ライブ１２３０１番）の永久カルチャー・コレクション
で入手できる。

化合物（Ｉ）はシムバスタチン、ロバスタチンまたは６
−メチル基を有する同族体のナトリウム塩から次の方法
の１種により本発明の方法で製造される： （ａ）未同定舷旦匹五」旦の増殖培養物に基質を適当な
培養期間にわたり添加し、次いで分離しかつ必要に応じ
誘導化（ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ）Ｌ、（ｂ）生
物変換用の微生物の培養物を集め、かつ集められた菌体
を基質と接触させる。

生物変換用微生物の培養は、この種の微生物につき使用
することが周知された栄養源を含有する慣用の培地にて
慣用手段により行なうことができる。すなわち、周知さ
れているように、この種の培地は資化性炭素および資化
性窒素の原料と、しばしば無機塩とを含有する。資化性
炭素の原料の例はグルコース、蔗糖、澱粉、グリセリン
、雑穀ゼリー、糖蜜および大豆油を包含する。

資化性窒素の原料の例は大豆固形物（大豆ミールおよび
大豆粉を包含する）、小麦胚芽、内袖出物、ペプトン、
コーンスチープリカー、乾燥酵母およびアンモニウム塩
、たとえば硫酸アンモニウムを包含する。必要に応じ、
たとえば塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸カルシウ
ムもしくは燐酸カルシウムのような無機塩も含ませるこ
とができる。さらに必要ならば、ヒドロキシル化酵素の
生産を促進しうる他の添加剤を適当に組合せて用いるこ
ともできる。特定の培養技術は本発明の方法に臨界的で
なく、微生物の培養につき従来使用されている任意の技
術を本発明に用いることができる。勿論、一般に用いる
技術は、工業的効率を考慮して選択される。たとえば液
体培養が一般に好適であり、さらに深部培養法が工業的
観点から最も便利である。

一般に培養は、好気性条件下にて２０〜３７℃、より好
ましくは２６〜２８℃の範囲の温度で行なわれる。

方法（ａ）は、基質を培地へ培養の期間中に添加して行
なわれる。出発化合物を添加する培養の際の正確な時点
は培養装置、培地の組成、培地の温度およびその他の因
子に依存するが、好ましくは微生物のヒドロキシル化能
力が増大し始める時点であり、これは一般に微生物の培
養を開始してから１日もしくは２日後である。添加する
基質の量は、好ましくは培地に対し０．０１〜５．０重
量％、より好ましくは０．０５〜０．５％、たとえば０
．０５〜０．１重量％である。

基質を添加した後、培養を好気的に、一般に上記範囲内
の温度で続ける。一般に、培養を基質を添加してから１
〜２日間にわたり継続する。

方法（ｂ）において微生物の培養は、先ず最初にたとえ
ばその最大ヒドロキシル化能力を達成するような条件下
で行なわれる。この能力は一般に培養を開始してから４
〜５日後に最大値に達するが、この期間は培地の性質お
よび温度、微生物の種類およびその他の因子に応じて変
化しうる。培養物のヒドロキシ化能力は、培養物の試料
を適当な時間間隔で採取しかつ試料のヒドロキシル化能
力をこれと基質との標準条件における接触により決定す
ると共に、得られた生成物の量を測定し、この能力を時
間に対しグラフとしてプロットすることにより監視する
ことができる。ヒドロキシル化能力がその最大点に達し
た際、培養を停止させかつ微生物菌体を集める。これは
、培養物を遠心分離、濾過または同様な公知の分離法に
かけて達成することができる。このように集められた培
養微生物の全菌体を、次いで好ましくは適当な洗浄液（
たとえば生理食塩水または適当な緩衝溶液）で洗浄する
。

未同定Ａｃｔ　１ｎｏｉ＋ｙｃｅｔｅの回収菌体と基質
との接触は、一般に水性培地中で、たとえば５〜９のｐ
Ｈ値における燐酸塩緩衝溶液中で行なわれる。好ましく
は、反応温度は２０〜４５℃、より好ましくは２５〜３
０℃の範囲である。反応媒体における基質の濃度は、好
ましくは０．０１〜５．０重量％の範囲であ２す る。反応を行ないうる時間は好ましくは１〜５日間であ
るが、これは反応混合物における基質の濃度、反応温度
、微生物のヒドロキシル化能力（これは、勿論、菌種毎
に変化し、さらに上記したように培養時間に依存する）
、およびその他の因子らに応じて変化することがある。

本発明による新規な方法に有用な微生物は未同定のＡｃ
ｔ　ｉ　ｎｏｍｙｃｅｔｅ（ＭＡ６４７４）である。培
養物命名ＡＴＣＣ５３８２８の試料はメリーランド州２
０８５２．ロックビル、パークローン・ドライブ１２３
０１番在、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョンの永久カルチャー・コレクションで入手することが
できる。

任意の上記方法による変換反応が完結した後、所望の化
合物を直接単離し、分離し或いは慣用手段により精製す
ることができる。たとえば分離および精製は、反応混合
物を濾過し、得られたＰ液を水不混和性の有機溶剤（た
とえば酢酸エチル）で抽出し、溶剤を抽出物から留去し
、得られた粗製化合物をカラムクロマトグラフィー（た
とえばシリカゲルもしくはアルミナ上）にかけ、ざらに
カラムを適当な溶出剤にて特にＨＰＬＣ装置で溶出させ
て行なうことができる。

［実施例］ 以下、実施例により、限定はしないが、たとえば上記化
合物の製造につき本発明を例示する。

以下の実施例に用いた培地の組成は、次の通りである。

ＫＥ培地 成　　　　　　　分　　　　　　　　　　　　　　　（
（］／　Ｌ）グルコース　　　　　　　　　　　　１．
０可溶性澱粉　　　　　　　　　　　１０．０牛肉抽出
分　　　　　　　　　　　３．０アルダミン　　　　　
　　　　　　５，０ＮＺアミンＥ ＭｑＳＯ４・７Ｈ，２０ 燐酸塩！ｌｉＩ液（下記参照） ａＣＯ３ 蒸留Ｈ２Ｏ１ ｐＨ＝　７．０−７．２（Ｎ　ａ、ｏ　Ｈにて調整）５
．０ ０、心５ ２、Ｏｄ ０．５ｇ ００〇− 魚１ｉａ［１ｉｉｉ員 ＨＰＯ４ Ｎａ　　ＨＰＯ４ 蒸留Ｈ２０ ｐＨ＝　　７，０ ９１．０ｇ ９５．０ｇ ０００＃１１！ 酵母抽出物 牛肉抽出分 １．０ １．０ カゼイン加水分解物　　　　　　　　２．０グルコース
　　　　　　　　　　　１０．０ｐＨ＝７．０（水酸化
テトラメチルアンモニウムにより調整） 寒天プラグ接種物を、ＭＡ６４７４の目に見える増殖物
を含有したＢＡＨ−２プレートから５０＃１１２の８Ａ
ト２ブロスを含有する２５０＃ｌ！！のバッフルフラス
コに無菌的に移した。この培養物を２８℃にて回転振ど
う機上で６日間にねたり２２０ｒｐｍで培養し、次いで
ナトリウム７−　［１，２，６，７，８，８ａ（Ｒ）−
へキザヒドロ２（Ｓ）−メチル−６（Ｒ）−メチル−８
（Ｓ）−（２，２−ジメチルブチリルオキシ）−１（Ｓ
）−ナフチル］−３（Ｒ）。

５（Ｒ）−ジヒドロキシヘプタノエート（ナトリウム塩
）を１００屑／ｄの最終濃度まで添加し、かつ培養を２
７℃にて４８時間続けた。

Ｂ６分離 上記のような作成した２０本のフラスコからの全ブロス
を集め、清澄させ（３０００ｒｐｍ、　１０分間）、サ
ラニｐＨ６，０ニｌｉ整シタ（２０％８３　ＰＯ４）。

４Ｉｌｉ！／ｍｉｎの流速にて、８００ｄ　ｆ７）清澄
されたブロスを５Ｐ−２０７カラム（１，５Ｘ　２５ｒ
、ｍ　、ミツビシ・ケミカル社）に添加し、この樹脂に
ついてはＣＨ３０Ｎで予め洗浄し、次いで１０ｍＨのＮ
Ｈ４１−（２ＰＯ４゜ｐＨ６，４（ＣＨ３ＣＮを含有せ
ず）で完全に平衡化させた。次いで、得られたブロスを
次の順序の溶剤混合物で溶出させた：水（２ＳＯｍｉり
　、　１０％水性Ｃ）ｌ　　ＣＮ（３００ｍ）　、　１
５％水性Ｃ）Ｉ３ＧＮ（２５０ｄ）および２５％水性Ｃ
Ｈ３０Ｎ　（２５０ｍｅ）。最終フラクションをＨ３Ｐ
Ｏ４により　ｐｌ−１＝　４．０に調整し、かつ代謝物
をＣＨ２Ｃｌ２（２ｘ　２５０ｍ　＞で２回抽出した。

溶剤を蒸発させた後（減圧、４０℃）、得られた油状物
を５ｄのＣＦ３ＣＯＯＨを含有する１００＠ｉｌのベン
ゼンに溶解させた。この混合物を４０℃で１５分間加熱
することにより、ラクトン化を行なった。ベンゼンを減
圧蒸発させ、かつ試料をＣＨ３０Ｎ（０，６ｄ）の最小
容積に溶解させた。半工業的製造にはＨＰＬＣはゾルパ
ックスＣｌ８（１×２５ｃｍ）のカラムを用い、これを
３４〜４６％水性ＣＨ３ＣＮの線状濃度勾配により２．
５ｍｅ／ｍｉｎの速度で溶出させ、２５５ｔ＋ｎ＋にて
検出した。標記化合物は１７．８分の保持時間を有する
ことが判明したのに対し、エピマーである６−（Ｓ）−
ヒドロキシメチル同族体は１９．０分の保持時間を有し
た。標記化合物を含有するフラクションを４ｍのベンゼ
ンで抽出した。

溶剤を蒸発させて標記化合物を得た。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）式（ I ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） により示される化合物を製造するに際し、窒素および炭
   素の資化性原料とナトリウム塩（II）：▲数式、化学式
   、表等があります▼（II） とを含有する栄養培地にて微生物ＭＡ６４７４（ＡＴＣ
   Ｃ　５３８２８）を好気性条件下で相当量の前記化合物
   が生成されるまで培養し、かつ生成した当該化合物を単
   離することを特徴とする前記式（ I ）を有する化合物
   の製造方法。
2. （２）微生物の培養を約７のｐＨにて行なう請求項１記
   載の方法。
3. （３）Ｃ＿１＿−＿１＿０アルキル▲数式、化学式、表
   等があります▼が２−メチルブチリルもしくは２，２−
   ジメチルブチリルである請求項２記載の方法。
4. （４）Ｃ＿１＿−＿１＿０アルキル▲数式、化学式、表
   等があります▼が２，２−ジメチルブチリルである請求
   項３記載の方法。
5. （５）Ｃ＿１＿−＿１＿０アルキル▲数式、化学式、表
   等があります▼が２−メチルブチリルである請求項３記
   載の方法。
6. （６）微生物が請求項１記載の方法にしたがって式（
   I ）の化合物を生成しうることを特徴とする生物学上純
   粋なＭＡ６４７４（ＡＴＣＣ５３８２８）の純粋培養物
   またはその活性突然変異種。
7. （７）式（ I ）の化合物を生成しうる請求項６記載の
   微生物の培養物。