JPH0224562A - 免疫測定法 - Google Patents
免疫測定法Info
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- JPH0224562A JPH0224562A JP17601588A JP17601588A JPH0224562A JP H0224562 A JPH0224562 A JP H0224562A JP 17601588 A JP17601588 A JP 17601588A JP 17601588 A JP17601588 A JP 17601588A JP H0224562 A JPH0224562 A JP H0224562A
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- JP
- Japan
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- antigen
- antibody
- gel
- reaction
- dissolution
- Prior art date
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、検体中゛に存在する特定の抗原または抗体を
定量分析するための免疫測定法の改良に関する。
定量分析するための免疫測定法の改良に関する。
〔従来の技術・発明が解決しようとする課題〕従来の免
疫測定法として、たとえばラジオイムノアッセイ法（Ｒ
ＩＡ法）、エンザイムイムノアッセイ法（ＥＴＡ法）等
がある。
疫測定法として、たとえばラジオイムノアッセイ法（Ｒ
ＩＡ法）、エンザイムイムノアッセイ法（ＥＴＡ法）等
がある。
ＲＩＡ法は定量的ではあるが、放射性同位元素を用いる
ので使用場所が制限され、また設備が大損りとなるとい
う問題点がある。
ので使用場所が制限され、また設備が大損りとなるとい
う問題点がある。
ＥＩＡ法は操作が煩雑であるという問題点を有する。
さらに、上記いずれの測定法とも分析に数時間から数十
時間を要するという問題点がある。
時間を要するという問題点がある。
これに対して補体等による溶解作用を利用した免疫測定
法は、簡便にしかも短時間（２０分間〜２時間）の内に
抗原または抗体を定量出来るという利点を有する。具体
的にはマイクロカプセルとして内部に定量可能なマーカ
ー物質を封入し、表面に抗体または抗原を結合し、かつ
補体活性により溶解作用を受けるものを用い、抗原また
は抗体濃度の定量を行なう、まず、上記マイクロカプセ
ルに検体であるヒト血清または血漿を接触させる。
法は、簡便にしかも短時間（２０分間〜２時間）の内に
抗原または抗体を定量出来るという利点を有する。具体
的にはマイクロカプセルとして内部に定量可能なマーカ
ー物質を封入し、表面に抗体または抗原を結合し、かつ
補体活性により溶解作用を受けるものを用い、抗原また
は抗体濃度の定量を行なう、まず、上記マイクロカプセ
ルに検体であるヒト血清または血漿を接触させる。
仮にマイクロカプセルに結合した抗体または抗原に対応
する抗原または抗体が検体中に含まれている場合、特異
的に抗原抗体反応が起こり、更に二次抗体を反応させる
と結合した抗原または抗体に対し二次抗体が結合する。
する抗原または抗体が検体中に含まれている場合、特異
的に抗原抗体反応が起こり、更に二次抗体を反応させる
と結合した抗原または抗体に対し二次抗体が結合する。
この二次抗体の結合したマイクロカプセルは補体活性に
よる溶解作用を受けて、そこに包含されているマーカー
物質が溶出される。この？８出されたマーカー物質を定
量し、検体中の抗原または抗体の定量が行われる。尚、
検体中にマイクロカプセルに結合した抗体または抗原に
対する抗原または抗体が含まれていない場合には二次抗
体は結合しないので、補体活性によるマイクロカプセル
の溶解は生起せず、マーカー物質の溶出も起こらない。
よる溶解作用を受けて、そこに包含されているマーカー
物質が溶出される。この？８出されたマーカー物質を定
量し、検体中の抗原または抗体の定量が行われる。尚、
検体中にマイクロカプセルに結合した抗体または抗原に
対する抗原または抗体が含まれていない場合には二次抗
体は結合しないので、補体活性によるマイクロカプセル
の溶解は生起せず、マーカー物質の溶出も起こらない。
ところが、上記マイクロカプセルよりなる試薬を用いて
ヒト血清や血漿、蛋白含有検体の分析を行う場合、目的
の抗原抗体反応に起因する膜溶解以外にマイクロカプセ
ルの非特異溶解が起こることがわかった。この非特異溶
解は検体中の補体等のタンパク質や微量化学物質とマイ
クロカプセル上の官能基との反応によるものと考えられ
る。このため従来は血清やタンパク質含有検体を希釈ま
たは加熱した後分析を行っていた。
ヒト血清や血漿、蛋白含有検体の分析を行う場合、目的
の抗原抗体反応に起因する膜溶解以外にマイクロカプセ
ルの非特異溶解が起こることがわかった。この非特異溶
解は検体中の補体等のタンパク質や微量化学物質とマイ
クロカプセル上の官能基との反応によるものと考えられ
る。このため従来は血清やタンパク質含有検体を希釈ま
たは加熱した後分析を行っていた。
たとえば、従来マイクロカプセル試薬を用いてヒト血清
中のＡＦＰを分析する際には、ヒト血清を１００倍希釈
、または加熱処理している。ところが正常人の血清中に
はＡＦＰが１０−”ｎｇ／ｍｌ以下しか含有されておら
ず、１００倍希釈するとその含量は１０ ”１ｏｎ ｇ
７ｍｌ以下となってしまい、精密な定量が困難であっ
た。また、加熱処理の場合、加熱工程が加わるので操作
が煩雑になり、しかも熱不安定性の抗原または抗体には
適用できないという問題があった。
中のＡＦＰを分析する際には、ヒト血清を１００倍希釈
、または加熱処理している。ところが正常人の血清中に
はＡＦＰが１０−”ｎｇ／ｍｌ以下しか含有されておら
ず、１００倍希釈するとその含量は１０ ”１ｏｎ ｇ
７ｍｌ以下となってしまい、精密な定量が困難であっ
た。また、加熱処理の場合、加熱工程が加わるので操作
が煩雑になり、しかも熱不安定性の抗原または抗体には
適用できないという問題があった。
本発明者らは上記の実情に鑑み種々研究を重ねて来た結
果、検体をゲルで前処理すると上記問題点が解決できる
ことを見いだした。
果、検体をゲルで前処理すると上記問題点が解決できる
ことを見いだした。
本発明は抗原または抗体を結合し、抗原抗体反応により
膜の溶解を誘起する物質の働きにより溶解作用を受ける
膜からなり、かつその内部に定量可能なマーカー物質を
包含するマイクロカプセルと、抗原抗体反応により前記
膜の溶解を誘起する物質、および前記抗原または抗体と
抗原抗体反応を生ずる抗体または抗原を有する検体を混
合し、抗原抗体反応により生じる膜溶解作用によるマイ
クロカプセルの破壊によって放出されるマイクロカプセ
ル内のマーカー物質を検出することにより、前記検体中
の抗体量または抗原量を測定する免疫測定法において、
検体をゲルで前処理することを特徴とする免疫測定法に
関する。
膜の溶解を誘起する物質の働きにより溶解作用を受ける
膜からなり、かつその内部に定量可能なマーカー物質を
包含するマイクロカプセルと、抗原抗体反応により前記
膜の溶解を誘起する物質、および前記抗原または抗体と
抗原抗体反応を生ずる抗体または抗原を有する検体を混
合し、抗原抗体反応により生じる膜溶解作用によるマイ
クロカプセルの破壊によって放出されるマイクロカプセ
ル内のマーカー物質を検出することにより、前記検体中
の抗体量または抗原量を測定する免疫測定法において、
検体をゲルで前処理することを特徴とする免疫測定法に
関する。
即ち、本発明は検体をゲルで前処理することによりマイ
クロカプセルに対する検体中の非特異溶解因子を除去す
ることによる免疫測定用法に関する。
クロカプセルに対する検体中の非特異溶解因子を除去す
ることによる免疫測定用法に関する。
本発明で使用されるマイクロカプセルは、抗原抗体反応
により膜の溶解を誘起する物質（補体等）の働きにより
溶解作用を受ける膜からなるものであれば特に制限はな
く、好適にはリポソーム（特開昭６１−９９８６７号）
等が挙げられる。
により膜の溶解を誘起する物質（補体等）の働きにより
溶解作用を受ける膜からなるものであれば特に制限はな
く、好適にはリポソーム（特開昭６１−９９８６７号）
等が挙げられる。
当該リボゾームは、本発明の目的を達成しえる限り特に
制限はなく、たとえばリン脂質〔たとえば、レシチン（
ホスファチジルコリン）、ホスファチジルエタノールア
ミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセ
リン、スフィンゴミエリン、ホスファチジン酸等が例示
される〕よりなるもの、リン脂質にさらに官能基脂質、
たとえばジチオスレイトール−ジパルミトイルホスファ
チジルエタノールアミン、Ｎ−（４−（ρ−マレイミド
フェニル）ブチリルゴージパルミトイルホスファチジル
エタノールアミン等、必要に応じて更にｔａ類、たとえ
ばデキストラン、プルラン、マンナン、アミロペクチン
等を添加したもの等が例示され、その構造にも特に制限
はなく、たとえばマルチラメラベシクル（ＭＬＶ）、ス
モールユニラメラベシクル、ラージコ、−，ラメラベシ
クル、すバースフェーズエバポレーションベシクル等が
例示される。
制限はなく、たとえばリン脂質〔たとえば、レシチン（
ホスファチジルコリン）、ホスファチジルエタノールア
ミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセ
リン、スフィンゴミエリン、ホスファチジン酸等が例示
される〕よりなるもの、リン脂質にさらに官能基脂質、
たとえばジチオスレイトール−ジパルミトイルホスファ
チジルエタノールアミン、Ｎ−（４−（ρ−マレイミド
フェニル）ブチリルゴージパルミトイルホスファチジル
エタノールアミン等、必要に応じて更にｔａ類、たとえ
ばデキストラン、プルラン、マンナン、アミロペクチン
等を添加したもの等が例示され、その構造にも特に制限
はなく、たとえばマルチラメラベシクル（ＭＬＶ）、ス
モールユニラメラベシクル、ラージコ、−，ラメラベシ
クル、すバースフェーズエバポレーションベシクル等が
例示される。
マイクロカプセル内部に包含される定量可能なマーカー
物質としては、マーカー機能を有し、かつ本発明の目的
を達成し得るものであれば特に制限はなく、たとえばカ
ルポキシフルオレイセン（ＣＦ）のような蛍光化合物、
ルミノールやルシフェリンの様な発光性化合物、特異的
吸収帯を存する吸光性化合物（水溶性色素）等が好適に
用いられる。
物質としては、マーカー機能を有し、かつ本発明の目的
を達成し得るものであれば特に制限はなく、たとえばカ
ルポキシフルオレイセン（ＣＦ）のような蛍光化合物、
ルミノールやルシフェリンの様な発光性化合物、特異的
吸収帯を存する吸光性化合物（水溶性色素）等が好適に
用いられる。
マイクロカプセルに感作させる抗体または抗原は被検目
的物（被検抗原または抗体）に応じて適宜選択される。
的物（被検抗原または抗体）に応じて適宜選択される。
たとえば、α−フェトプロティン、（ＡＦＰ）、がん胎
児性抗原（ＣＥＡ） 、β、−ミクログロビン、カルボ
ハイドレート・アンチゲン１９−９ （ＣＡ１９−９）
等の各種癌抗原、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ、Ａｎｔｉ
ＨＢｓ、ヒユーマン・Ｔセル・ロイケミア・ウィルス
−Ｉ型（ＨＴＬＶ−１）、ヒユーマン・Ｔセル・ロイケ
ミア・ウィルス−■型（ＨＴＬＶ−Ｉ［１）等のウィル
ス関連の抗原抗体、更には血中の各種ホルモンやＩｇＧ
等の血漿タンパク質が好適に例示される。
児性抗原（ＣＥＡ） 、β、−ミクログロビン、カルボ
ハイドレート・アンチゲン１９−９ （ＣＡ１９−９）
等の各種癌抗原、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ、Ａｎｔｉ
ＨＢｓ、ヒユーマン・Ｔセル・ロイケミア・ウィルス
−Ｉ型（ＨＴＬＶ−１）、ヒユーマン・Ｔセル・ロイケ
ミア・ウィルス−■型（ＨＴＬＶ−Ｉ［１）等のウィル
ス関連の抗原抗体、更には血中の各種ホルモンやＩｇＧ
等の血漿タンパク質が好適に例示される。
抗体は動物への免疫、モノクローナル抗体の通常技術〔
「免疫学実験入門」３５頁、（学会出版センター、昭和
５６年発行）、「モノクローナル抗体」ｌＬ（講談社、
昭和６１年発行）等参照〕等によって製造される。また
、抗体はそのまま結合させてもよく、また抗原認識部位
を含む断片〔たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’ 、Ｆ （ａ
ｂ’）ｚ ）であってもよい。
「免疫学実験入門」３５頁、（学会出版センター、昭和
５６年発行）、「モノクローナル抗体」ｌＬ（講談社、
昭和６１年発行）等参照〕等によって製造される。また
、抗体はそのまま結合させてもよく、また抗原認識部位
を含む断片〔たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’ 、Ｆ （ａ
ｂ’）ｚ ）であってもよい。
抗体または抗原のマイクロカプセルへの結合（感作）は
公知の方法に従って行えばよい、たとえば、Ｌｅｓｅｒ
＋ｗａｎ等の方法（Ｎａｔｕｒｅ、 ２ＭＬＬ６０４〜
６０６．１９８０）、Ｍａｒｔｉｎ等の方法（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ、 凹、４２２９〜４２３８．１９８
１）により行われる。
公知の方法に従って行えばよい、たとえば、Ｌｅｓｅｒ
＋ｗａｎ等の方法（Ｎａｔｕｒｅ、 ２ＭＬＬ６０４〜
６０６．１９８０）、Ｍａｒｔｉｎ等の方法（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ、 凹、４２２９〜４２３８．１９８
１）により行われる。
本発明において、抗原または抗体をマイクロカプセルに
結合させる際、架橋剤を使用することが好ましい、架橋
剤としは公知のもの、たとえばＮ−サクシンイミジル３
−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）
、Ｎ−（Ｔ−マレイミドブチリルオキシ）サクシンイ
ミド、グルタルアルデヒド等が使用される。
結合させる際、架橋剤を使用することが好ましい、架橋
剤としは公知のもの、たとえばＮ−サクシンイミジル３
−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）
、Ｎ−（Ｔ−マレイミドブチリルオキシ）サクシンイ
ミド、グルタルアルデヒド等が使用される。
本発明で使用されるゲルは、分画分子量範囲１０００〜
２００万のゲル濾適用担体であれば特に限定されないが
、種々の官能基を結合させるのが容易であることが好ま
しく、具体的にはデキストラン、アガロース、セルロー
ス、ポリアクリルアミド、ポリビニル、ポリスチレン等
公知のものが挙げられる。
２００万のゲル濾適用担体であれば特に限定されないが
、種々の官能基を結合させるのが容易であることが好ま
しく、具体的にはデキストラン、アガロース、セルロー
ス、ポリアクリルアミド、ポリビニル、ポリスチレン等
公知のものが挙げられる。
また、ゲルはりガントに結合した８ｉ様で使用され、そ
のリガンドとしては、感作マイクロカプセル上の官能脂
質と同一の官能基を有するものが使用され、具体的には
、たとえばチオプロピル基、活性型チオール基、ホルミ
ル基、アプロチニン、ゼラチン、リジン、コンカナバリ
ンＡ、キレート剤（たとえばイミノジ酢酸等）、ベンズ
アミジン、プロタミン、ヘパリン、 抗体等が挙げられ
る。
のリガンドとしては、感作マイクロカプセル上の官能脂
質と同一の官能基を有するものが使用され、具体的には
、たとえばチオプロピル基、活性型チオール基、ホルミ
ル基、アプロチニン、ゼラチン、リジン、コンカナバリ
ンＡ、キレート剤（たとえばイミノジ酢酸等）、ベンズ
アミジン、プロタミン、ヘパリン、 抗体等が挙げられ
る。
従って、本発明で使用されるゲルとしては具体的には５
ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（ｍｅｄｉａｍ）（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ社）、Ｔｈ１ｏｐｒｏｐｙｌ−３ｅｐｈａｒ
ｏｓｅ ６Ｂ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、八ｃｔｉｖ
ａｔｅｄ Ｔｈ１ｏｌ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、Ｆｏｒ＋ｍｙｌ−Ｃｅ
ｌｌｕｌｏｆｉｎｅ（生化学工業社）、Ｍａｔｒｅｘ
ＧｅｔＲｅｄ Ａ （Ａｍ＋ｃｏｎ社） 、Ｂｌｕｅ
５ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
社） 、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ ５ｅｐｈａｒｏｓｅ
（ミドリ十字社） 、Ｇｅ１ａｔｉｎｅ ５ｅｐｈａｒ
ｏｓｅ ４Ｂ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、Ｌｙｓｉｎ
ｅ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、
ＣｏｎＡ ５ｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ社） 、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ
６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社） 、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ
５０１ （Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎ
ｅ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ
社）、Ｐｒｏｔａｍｒｎｅ ５ｅｐｈａｒｏｓｅ （ミ
ドリ十字社）、Ｈｅｐａｒｉｎ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ
ＣＬ−６８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社） 、Ａｎｔｉ−１
ｇ＾５ｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ （ミドリ十字社）等が
例示され、使用する抗体または抗原感作マイクロカプセ
ルの官能基脂質を考慮した上で適宜選択される。
ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（ｍｅｄｉａｍ）（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ社）、Ｔｈ１ｏｐｒｏｐｙｌ−３ｅｐｈａｒ
ｏｓｅ ６Ｂ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、八ｃｔｉｖ
ａｔｅｄ Ｔｈ１ｏｌ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、Ｆｏｒ＋ｍｙｌ−Ｃｅ
ｌｌｕｌｏｆｉｎｅ（生化学工業社）、Ｍａｔｒｅｘ
ＧｅｔＲｅｄ Ａ （Ａｍ＋ｃｏｎ社） 、Ｂｌｕｅ
５ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
社） 、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ ５ｅｐｈａｒｏｓｅ
（ミドリ十字社） 、Ｇｅ１ａｔｉｎｅ ５ｅｐｈａｒ
ｏｓｅ ４Ｂ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、Ｌｙｓｉｎ
ｅ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、
ＣｏｎＡ ５ｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ社） 、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ
６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社） 、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ
５０１ （Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎ
ｅ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ
社）、Ｐｒｏｔａｍｒｎｅ ５ｅｐｈａｒｏｓｅ （ミ
ドリ十字社）、Ｈｅｐａｒｉｎ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ
ＣＬ−６８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社） 、Ａｎｔｉ−１
ｇ＾５ｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ （ミドリ十字社）等が
例示され、使用する抗体または抗原感作マイクロカプセ
ルの官能基脂質を考慮した上で適宜選択される。
検体をゲルにて処理する場合、通常検体血清１重量部に
対しゲル０．０００１〜１重量部（リガンドの重量を含
む）、好ましくは０５０１〜０，１重量部の割合で添加
し０°Ｃ〜６０°Ｃ１好ましくは２０°Ｃ〜４０゛Ｃで
１分間から１晩、好ましくは１時間反応させる。その処
理後、ゲルを含有したまま、あるいは遠心、濾過等の手
段によりゲルを除去しゲル処理検体とする。
対しゲル０．０００１〜１重量部（リガンドの重量を含
む）、好ましくは０５０１〜０，１重量部の割合で添加
し０°Ｃ〜６０°Ｃ１好ましくは２０°Ｃ〜４０゛Ｃで
１分間から１晩、好ましくは１時間反応させる。その処
理後、ゲルを含有したまま、あるいは遠心、濾過等の手
段によりゲルを除去しゲル処理検体とする。
このゲル処理検体を抗体または抗原感作マイクロカプセ
ルと反応させた後、更に二次抗体と、抗原抗体反応によ
り膜の溶解を誘起する物質を反応させる。
ルと反応させた後、更に二次抗体と、抗原抗体反応によ
り膜の溶解を誘起する物質を反応させる。
本発明において、抗原抗体反応により膜の溶解を誘起す
る物質としては、たとえば補体等が使用される。補体は
、特に限定されず、たとえばモルモット補体、ウサギ補
体、マウス補体、ヒト補体が、通常血清に含存された態
様として使用される。
る物質としては、たとえば補体等が使用される。補体は
、特に限定されず、たとえばモルモット補体、ウサギ補
体、マウス補体、ヒト補体が、通常血清に含存された態
様として使用される。
本発明において、二次抗体としては被検目的物に応じて
、自体既知のものを使用すればよい。
、自体既知のものを使用すればよい。
〔効果］
本発明の免疫測定法によれば、抗体または抗原感作リポ
ソームの非特異溶解を惹起する所の検体中の非特異反応
因子は、ゲルにて処理することによりあらかじめ除去さ
れているので、マイクロカプセルが非特異反応により溶
解することはない。
ソームの非特異溶解を惹起する所の検体中の非特異反応
因子は、ゲルにて処理することによりあらかじめ除去さ
れているので、マイクロカプセルが非特異反応により溶
解することはない。
従って、本発明によれば検体の過剰な希釈を行なう必要
がなく、また検体を加熱する必要もない。
がなく、また検体を加熱する必要もない。
よって、本発明の測定方法は操作が簡便で、かつ精度が
高く、しかも熱不安定性の抗原または抗体の測定にも適
用できる。
高く、しかも熱不安定性の抗原または抗体の測定にも適
用できる。
以下の記載において各略号はそれぞれ次のことを意味す
る。
る。
ＰＥ：フォスファチジルエタノールアミンＤＴＰ−ＤＰ
ＰＥ ：ジチオピリジルプロピオン酸アミド−ジパルミ
トイル ホスファチジルエタノール アミン ＭＬＶ：マルチラメラベシクル ＤＰＰＣニジバルミトイルホスファチジルコリン ＣＦ：カルボキシフルオレセイン ５ＰＤＰ：Ｎ−サクシンイミジル３−（２−ピリジルジ
チオ）プロピオネート ＡＦＰ：α−フェトプロティン 実施例１ 抗体感作リポソームは次のように調製した。リポソーム
中に組み込む架橋剤として５ＰＤＰを用いＰＥと結合さ
せＤＴＰ−ＤＰＰＥとする。このＤＴＰ−ＤＰＰＥを用
いリポソーム組成りＰＰＣ：コレステロール： ＤＴＰ
−ＤＰＰＥ＝１ ： １ ：０．０５として常法に従い
０．１ＭのＣＦを封入したＭ Ｌ Ｖを調製する。この
ＭＬＶに５ＰＤＰ処理抗ＡＦＰモノクロ一ナル抗体を結
合させた。
ＰＥ ：ジチオピリジルプロピオン酸アミド−ジパルミ
トイル ホスファチジルエタノール アミン ＭＬＶ：マルチラメラベシクル ＤＰＰＣニジバルミトイルホスファチジルコリン ＣＦ：カルボキシフルオレセイン ５ＰＤＰ：Ｎ−サクシンイミジル３−（２−ピリジルジ
チオ）プロピオネート ＡＦＰ：α−フェトプロティン 実施例１ 抗体感作リポソームは次のように調製した。リポソーム
中に組み込む架橋剤として５ＰＤＰを用いＰＥと結合さ
せＤＴＰ−ＤＰＰＥとする。このＤＴＰ−ＤＰＰＥを用
いリポソーム組成りＰＰＣ：コレステロール： ＤＴＰ
−ＤＰＰＥ＝１ ： １ ：０．０５として常法に従い
０．１ＭのＣＦを封入したＭ Ｌ Ｖを調製する。この
ＭＬＶに５ＰＤＰ処理抗ＡＦＰモノクロ一ナル抗体を結
合させた。
正常血清にＴｈ１ｏｐｒｏｐｙｌ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ
６Ｂ。
６Ｂ。
Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔｈ１ｏｌ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ
４Ｂ、、ＦｏｒｍｙｌＣｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ 、、
Ｍａｔｒｅｘ Ｇｅｌ Ｒｅｄ Ａ、 Ｌｙｓｉｎｅ−
５ｅｐｈａｒｏｓｅ 、 ＣｏｎＡ ５ｅｐｈａｒｏｓ
ｅ、 Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ ５０１、Ｈｅｐａｒｉｎ−３
ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂの８種のゲルを各々等量
混合し４ ”Ｃ１２時間撹拌した。その後、ゲルを濾過
で除去しゲル処理血清を得た。この血清を１０倍希釈し
測定に供した。測定方法は次の通り。
４Ｂ、、ＦｏｒｍｙｌＣｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ 、、
Ｍａｔｒｅｘ Ｇｅｌ Ｒｅｄ Ａ、 Ｌｙｓｉｎｅ−
５ｅｐｈａｒｏｓｅ 、 ＣｏｎＡ ５ｅｐｈａｒｏｓ
ｅ、 Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ ５０１、Ｈｅｐａｒｉｎ−３
ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂの８種のゲルを各々等量
混合し４ ”Ｃ１２時間撹拌した。その後、ゲルを濾過
で除去しゲル処理血清を得た。この血清を１０倍希釈し
測定に供した。測定方法は次の通り。
１０倍希釈したゲル処理血清１０μｒとＣＦを封入した
抗体未感作リポソーム（ＤＴＰ−ＤＰＰＥを５モル％含
む、脂￥ｒ濃度０．０５ ｕｍｏ ｌ ） １０μ２、
および２ＣＨ，。／…１としたモルモット補体５０μ２
を加え、３７°Ｃ１３０分間反応させた。
抗体未感作リポソーム（ＤＴＰ−ＤＰＰＥを５モル％含
む、脂￥ｒ濃度０．０５ ｕｍｏ ｌ ） １０μ２、
および２ＣＨ，。／…１としたモルモット補体５０μ２
を加え、３７°Ｃ１３０分間反応させた。
次にＥＤＴＡ溶液１００ＩＪｊ！を加え反応を停止させ
た後、励起波長４９０ ｎｍ、蛍光波長５３０ｎｍで蛍
光強度を測定した。モルモット補体の代わりにエタノー
ルを加えリポソームを完全溶解させた場合の蛍光強度を
１００％として各々の溶解程度を表１に示した。ゲル未
処理血清中におけるリポソームの溶解率が４８．８％で
あるのに対し、特にＴｈ１ｏｐｒｏｐｙｌ−５ｅｐｈａ
ｒｏｓｅ ６Ｂ 、 Ｍａｔｒｅｘ Ｇｅｌ Ｒｅｄ
Ａ。
た後、励起波長４９０ ｎｍ、蛍光波長５３０ｎｍで蛍
光強度を測定した。モルモット補体の代わりにエタノー
ルを加えリポソームを完全溶解させた場合の蛍光強度を
１００％として各々の溶解程度を表１に示した。ゲル未
処理血清中におけるリポソームの溶解率が４８．８％で
あるのに対し、特にＴｈ１ｏｐｒｏｐｙｌ−５ｅｐｈａ
ｒｏｓｅ ６Ｂ 、 Ｍａｔｒｅｘ Ｇｅｌ Ｒｅｄ
Ａ。
Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ ５０１の３種のゲル処理血清では溶
解率が３．５％〜８．７％と大きく抑制された。
解率が３．５％〜８．７％と大きく抑制された。
表１ 各種ゲル処理血清によるリポソームの溶解率ゲル
の種類 溶解率（％） Ｈｅｐａｒｉｎ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６８３
２，７ 実施例２ 既知濃度のＡＦＰを含むヒト血清を各々Ｔｈ１ｏｐｒｏ
ｐｙｌ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ 、 Ｍａｔｒｅｘ
Ｇｅｌ Ｒｅｄ Ａ。
の種類 溶解率（％） Ｈｅｐａｒｉｎ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６８３
２，７ 実施例２ 既知濃度のＡＦＰを含むヒト血清を各々Ｔｈ１ｏｐｒｏ
ｐｙｌ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ 、 Ｍａｔｒｅｘ
Ｇｅｌ Ｒｅｄ Ａ。
Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ ５０１の３種のゲルで処理した。処
理法は次の通りである。即ち、各濃度ＡＦＰ抗原含有ヒ
ト血清５００μｌにゲル５０μｌを添加し３０°Ｃ１１
０分間反応させた後、濾過でゲルを除去しゲル処理血清
とした。この血清を最終的に原血清の１０倍希釈として
測定に供した。
理法は次の通りである。即ち、各濃度ＡＦＰ抗原含有ヒ
ト血清５００μｌにゲル５０μｌを添加し３０°Ｃ１１
０分間反応させた後、濾過でゲルを除去しゲル処理血清
とした。この血清を最終的に原血清の１０倍希釈として
測定に供した。
測定方法は次の通りである。即ち、１０倍希釈したゲル
処理血清１０μ２とＣＦを封入した抗ＡＦＰモノクロー
ナル抗体怒作リポソーム（ＤＴＰ−ＤＰＰＥを５モル％
含む、脂質濃度０．０５μｍｏｌ）１０μｌを混合し３
７°Ｃ１１０分間反応させた。
処理血清１０μ２とＣＦを封入した抗ＡＦＰモノクロー
ナル抗体怒作リポソーム（ＤＴＰ−ＤＰＰＥを５モル％
含む、脂質濃度０．０５μｍｏｌ）１０μｌを混合し３
７°Ｃ１１０分間反応させた。
次に二次抗体として抗ＡＦＰポリクローナルウマ抗体２
５μ１１および４ＣＨ２゜／ ｍ Ｉとしたモルモット
補体２５μｌを加え、３７°Ｃ１３０分間反応させた。
５μ１１および４ＣＨ２゜／ ｍ Ｉとしたモルモット
補体２５μｌを加え、３７°Ｃ１３０分間反応させた。
最後にＥＤＴＡ溶液１００μ２を加え反応を停止させた
後、励起波長４９０ ｎｍ、蛍光波長５３０ｎｍで強度
を測定した。モルモット補体の代わりにエタノールを加
えリポソームを完全溶解させた場合の蛍光強度を１００
％として各々の溶解程度をパーセントに換算した。その
結果を第１〜３図に示した。なお、第４図はゲル処理を
しなかった血清（コントロール）である。
後、励起波長４９０ ｎｍ、蛍光波長５３０ｎｍで強度
を測定した。モルモット補体の代わりにエタノールを加
えリポソームを完全溶解させた場合の蛍光強度を１００
％として各々の溶解程度をパーセントに換算した。その
結果を第１〜３図に示した。なお、第４図はゲル処理を
しなかった血清（コントロール）である。
第１〜４図に示した結果から明らかなように、ゲル未処
理血清の場合、非特異溶解反応のためＡＦＰ抗原濃度特
異的な反応曲線が全く得られなかった。これに対し３種
のゲルのいずれかで処理した血清においてはＡＦＰ抗原
に依存した反応曲線が得られ定量が可能となった。
理血清の場合、非特異溶解反応のためＡＦＰ抗原濃度特
異的な反応曲線が全く得られなかった。これに対し３種
のゲルのいずれかで処理した血清においてはＡＦＰ抗原
に依存した反応曲線が得られ定量が可能となった。
実施例３
ＡＦＰ陽性ヒト血清に関し、ゲルとしてＴｈ１ｏｐｒｏ
ｐｙｌ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂを用いた場合の本発
明法で求めた含有ＡＦＰｉｌを、ＲＩＡ法で求めたそれ
と比較した。測定法は実施例２に示した方法に準じて標
準曲線から定量した。その結果を表２に示した。この結
果から明らかなように本発明の方法で求めた値は、ＲＩ
Ａ法で求めた値とよく一致した。このことから、本発明
方法においてはリポソーム非特異溶解に起因する測定値
変動の全（ないことが明らかである。
ｐｙｌ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂを用いた場合の本発
明法で求めた含有ＡＦＰｉｌを、ＲＩＡ法で求めたそれ
と比較した。測定法は実施例２に示した方法に準じて標
準曲線から定量した。その結果を表２に示した。この結
果から明らかなように本発明の方法で求めた値は、ＲＩ
Ａ法で求めた値とよく一致した。このことから、本発明
方法においてはリポソーム非特異溶解に起因する測定値
変動の全（ないことが明らかである。
第１図は、Ｔｈ１ｏｐｒｏｐｙｌ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ
６Ｂで処理した血清を用いた場合の反応曲線を示す。 第２図は、Ｍａｔｒｅｘ Ｇｅｌ Ｒｅｄ Ａで処理し
た血清を用いた場合の反応曲線を示す。 第３図は、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ ５０１で処理した血清を
用いた場合の反応曲線を示す。 第４図は、ゲル未処理の血清を用いた場合の反応曲線を
示す。 第１図 Ｔｈ１ｏｐｒｏｐｙＬ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ＢＡＦ
Ｐ（ｎｇ／ｍｌ） 第３図 八ｆｆ１−Ｇｅｌ ５０１ １ １０ ｊｏ。 ＡＦＰ（ｎｇ／ｍｌ） 第２図 Ｍａｔｒｅｘ Ｇｅｔ Ｒｅｄ Ａ ＡＦＰ （ｎｇ／ｍＬ ） 第４図 コントロール ＡＦＰ （ｎｇｙｍＬ ）
６Ｂで処理した血清を用いた場合の反応曲線を示す。 第２図は、Ｍａｔｒｅｘ Ｇｅｌ Ｒｅｄ Ａで処理し
た血清を用いた場合の反応曲線を示す。 第３図は、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ ５０１で処理した血清を
用いた場合の反応曲線を示す。 第４図は、ゲル未処理の血清を用いた場合の反応曲線を
示す。 第１図 Ｔｈ１ｏｐｒｏｐｙＬ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ＢＡＦ
Ｐ（ｎｇ／ｍｌ） 第３図 八ｆｆ１−Ｇｅｌ ５０１ １ １０ ｊｏ。 ＡＦＰ（ｎｇ／ｍｌ） 第２図 Ｍａｔｒｅｘ Ｇｅｔ Ｒｅｄ Ａ ＡＦＰ （ｎｇ／ｍＬ ） 第４図 コントロール ＡＦＰ （ｎｇｙｍＬ ）
Claims (2)
- （１）抗原または抗体を結合し、抗原抗体反応により膜
の溶解を誘起する物質の働きにより溶解作用を受ける膜
からなり、かつその内部に定量可能なマーカー物質を包
含するマイクロカプセルと、抗原抗体反応により前記膜
の溶解を誘起する物質、および前記抗原または抗体と抗
原抗体反応を生ずる抗体または抗原を有する検体を混合
し、抗原抗体反応により生じる膜溶解作用によるマイク
ロカプセルの破壊によって放出されるマイクロカプセル
内のマーカー物質を検出することにより、前記検体中の
抗体量または抗原量を測定する免疫測定法において、検
体をゲルで前処理することを特徴とする免疫測定法。 - （２）ゲルがリガンドとして感作マイクロカプセル上の
官能脂質と同一の官能基を有するゲルである請求項（１
）記載の免疫測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17601588A JPH0224562A (ja) | 1988-07-13 | 1988-07-13 | 免疫測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17601588A JPH0224562A (ja) | 1988-07-13 | 1988-07-13 | 免疫測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0224562A true JPH0224562A (ja) | 1990-01-26 |
Family
ID=16006229
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17601588A Pending JPH0224562A (ja) | 1988-07-13 | 1988-07-13 | 免疫測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0224562A (ja) |
-
1988
- 1988-07-13 JP JP17601588A patent/JPH0224562A/ja active Pending
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