JPS61110059A - 免疫学的分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （技術分骨） 本発明は免疫学的分析方法に関するものである。

（従来技ｗｉ） 血液、体液等に含まれるグロブリン、酵素等のタンパク
質、またはホルモン、細菌、ウィルス等はその分子構造
が類似していたり、極く微量であるために通常の分析方
法では同定、定量が内鍵である。そこで、これらの物質
の分゛析には、一般に゛す抗体、抗原あるいはレクチン
等を利用した免疫学的な分析方法が用いられている。

このような抗原抗体反応を利用する免疫学的分析方法に
は、大別して標識物質を用いる標識免疫分析法と、標識
物質を用いずに抗原抗体複合物を直接測定する非標識免
疫分析法とがあるが、非標識免疫分析法は簡便であるが
感度、定量性、再現性の点で精密測定としては不充分で
あるため、最近では標識免疫分析法が主流を成している
。この標識免疫分析法は、標識物質の違いによってラジ
オイムノアッセイ、エンザイムイムノアッ七イ、フルオ
ロイムノアッセイに大別され、また測定系において標識
物質で標識した抗体（抗原）とサンプル中の抗原（抗体
）とが抗原抗体反応を起した抗原抗体複合物（ｇｏｕｎ
ｄ　）と、抗原抗体反応に関与しない標識抗体（抗原）
（Ｆｒｅｅ　）とを分離する操作、いわゆるＢ−Ｆ分離
を必要とするヘテロジニアス法と必要としないホモジュ
ニアス法とに分類される。ホモジニアス法はＢ−Ｆ分離
を必要としないところから操作が簡単であり、したがっ
てそれを、自動的に行なうようにした装置も従来種々提
案されているが、ヘテロジニアス法はＢ−Ｆ分離を必要
とするところから、分析手順が煩雑であり、このためそ
れを自動的に行なうようにした装置の提案もホモジニア
ス法に比べて少ない。

このヘテロジニアス法を採用する免疫学的分析法として
、特開昭５８−１０４９５号公報においてカラムクロマ
トグラフィーを利用してＢ−Ｆ分離を行なうようにした
自動化に適した分析法が提案されている。この分析法に
おいて、カラムに充填される吸着剤としては溶液中の遊
離抗原を選択的に吸着し、抗原抗体複合物を吸着しない
、例えばアニオン、カチオンイオン交換樹脂や、分子ふ
るい効果のあるゲルクロマトグラフィー用の充填剤を用
いている。しかしながら、ゲルクロマトグラフィーによ
るＢ−Ｆ分離は、競合法による戸ブテン、七ミハプテン
等の低分子抗原の分析においては有効なものの、分子量
敵方以上の抗原になると、・遊離抗原と抗原抗体複合物
との大きさが近接したり、抗原抗体複合物の大きさや形
状にばらつきがある等して、そのＢ−Ｆ分離が困鑓とな
る。

このため、例えば免疫グロブリン等の試薬として用いる
抗体と同じ分子や、化学的、物理的に類似した分子の測
定には使用できず、分析項目が極めて制限される不具合
がある。

（発明の目的） 本発明の目的は上述した不具合を解決し、ゲルクロマト
グラフィーによるＢ−Ｆ分離を、分析項目に制限される
ことなく低分子から高分子に至るまで常に確実に行なう
ことができ、所要の分析を高精度でかつ高速にできる免
疫学的分析方法を提供しようとするものである。

（発明の概要） 本発明の免疫学的分析方法は、サンプルと、所定の物質
で標識した標識抗原または抗体と、表面に固相化した抗
原または抗体を有し、少く共前記標識抗原または抗体よ
りも大きさまたは分子量が大きい担体とを反応させた後
、その反応液中の前記担体に結合した標識抗原または抗
体と、結合しないそれとをゲルクロマトグラフィーによ
り分離することを特徴とするものである。

本発明において、抗体または抗原を固相化する担体とし
ては、標識抗体または抗原よりも大きさが大きく、かつ
粒径の均一なラテックス粒子、あるいは標識抗原または
抗体よりも分子量が大きくかつ均一なポリスチレン、デ
キストラン、チトクロム０等の巨大分子等を用いること
ができるが、好適には形状および大きさを均一にしやす
いラテックス粒子が有効である。ラテックス粒子の太き
さけ分析項目やゲルクロマトグラフィーにおける充填剤
等の条件によって異なるが、粒径が０．０８μｍ〜５μ
ｍ程度までの任意の大きさのものが使用でき、また材質
や表面の化学的性状も同様に種々選択できる。この担体
に固相化する抗原または抗体は、例えばサンプル中の抗
原を、これを介して担体と識識抗体とを結合させるいわ
ゆるサンドイツチ法により分析する場合には、抗体とし
てモノクローナル抗体のＦａｂもしくはＦ（ａｂｚ）　
　フラクメントが望ましく、これを物理的吸着や共有結
合等の伏字的結合によって固相化する。また、この場合
の標識抗体としては、モノクローナルもしくはぎリフロ
ーナル抗体のＦａｂ７ラグメントが望ましく、これを酵
素、螢光特賞、放射性物質、色素、金属等の所定の標識
物質に結合させる。なお、例えば抗体に酵素を標識する
場合には、抗体および酵素の分子を１分子ずつ結合させ
ることが望ましい。また、Ｂ−Ｆ分離を行なうゲルクロ
マトグラフィーにおけるゲルは、分析項目、担体等によ
って適宜選択でき、そのゲル粒子の材質、大きさ、分子
分画範囲等は任意にフントロールできる。

（実施例） 第１実施例 第１実施例としてヒ）　ＩｇＥの分析について説明する
。第１図はヒ）　ＩｇＥを分析する際の反応模式図であ
る。本例では、担体１として粒径が０．４１μｍのポリ
スチレンラテックスを使用し、この担体１に固相抗体２
としてモノクローナル抗ヒトエｇＥ抗体を物理的吸着に
より固相化する。また、標識抗体８として担体１よりも
大きさの小さいヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体のＦａｂフラグメ
ントを使用し、これに標識物質４としてフルオレ七イン
イソチオシアネート（ＦＩＴＯ）の螢光物質を結合させ
る。先ず、上記の固相抗体２を有する担体１を含むラテ
ックス試薬６０μｌと、標識物質番で標識された標識抗
体３を含む標識試薬６０μｔと、サンプル抗原５を・含
むヒ）　ＩｇＥ溶液１０μｔとを、０．ＯＩＭりん酸緩
衝液（ＰＢＳ）ＰＨ＝７．５　／　０．Ｉ　Ｍ　ＨａＣ
Ｊｔ　／　０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）１０．
ｏｚ％ＮａＮ、　Ｊ：り成るｚ００μｔの反応用緩衝液
に添加して、サンドイツチ法により８７°Ｃ１１０分間
抗抗原体反応を起させる。なお、各溶液は全て同時に添
加してもよいし、先ず固相抗体２とサンプル抗原５とを
反応させた後、サンプル抗原５と標識抗体δとを反応さ
せるように各溶液を順次添加してもよい。

その後、上記の反応液中の抗原抗体複合物すな：わちＢ
ｏｕｎｄ　６と、抗原抗体反応に関与しなかったＩＩ識
動物質４有する標識抗体３すなわち１ｒｒｅｅ　７とを
、第２図に示すクロマト装置でＢ−Ｆ分離してサンプル
抗原濃度を測定する。第２図に示すクロマト装置は、ゲ
ルクロマトグラフィー用カラム１１の入口をインジェク
タ１２およびゼンプ１３を介して溶出液タンク１４に連
結し、出口を検出器１５を介して廃液タンク１６に連結
して、検出器ｘ５の出力を記録計１７で記録するように
したもので、本例では、溶出液タンク１４に０．０１　
ＭＰＢＳ　ｐＨ＝　７．５　／　０．　Ｉ　Ｍ　Ｎ＆Ｏ
ｔより成る溶出液を収容し、またカラム１１への充填剤
としてはセルロファインＧＣＬ−２０００８ｆ（商品名
；生化学工業株式会社製）を用いる。このクロマト装置
のカラム１１にインジェクタ１２から上記の反応液を注
入してポンプｌδにより溶出液を供給すると、Ｂｏｕｎ
ｄ　６は標識抗体８よりも大きい担体１を有するから高
速に溶出し、遅れてｙｒｅｅ　７が溶出してＢ−Ｆ分離
が確実に行なわれる。したがって、検出器１５において
散乱光および透過光量の変化を螢光強度と同時に検出し
て記録計１７で記舜すると、第８図に示すように最初に
Ｂｏｕｎｄ　６のきわめてシャープな螢光ビークａが得
られ、遅れてＦｒｅｅ７の螢光ビークｂが得られるから
、最初の螢光ビークａに基いて、予じめ既知濃度抗原か
ら求めた゛螢光強度と抗原濃度との関係を表わす検量線
から鵠サンプル抗原濃度を高精度かつ高速に求めること
ができる。

なお、本実施例ではサンプル抗原をサンドイツチ法によ
り分析するようにしたが、標識抗原と適切なカラム充填
剤とを用いることによって、ハプテン等の分析において
適用される競合法によっても分析することができる。

第２実施例 第２実施例としてヒトインシュリンの分析について説明
する。本例では、担体として粒径が０．２２μｍのポリ
スチレンラテックスを使用し、この担体に［１ｍ抗体と
してモルモット抗ＩＶ−トインシュリン抗体を物理的吸
着により固相化する。また、標識抗原として担体よりも
大きさの小さいブタインシュリンを用い、これをＦＩＴ
Ｃの螢光物質で標識する。上記の固相抗体を有する担体
を含むラテックス試薬６０μｔと、ＦＩＴＯで標識した
標識抗原を含む標ｍ試薬５０　ｐｔと、サンプル抗原の
ヒトインシュリン溶液１０μｔと）ｔを、０．０１　Ｍ
　ＰＢＳ　ＰＨ＝７．０　／　０．Ｉ　Ｎ　Ｍａｉｌ　
／　０．１　％　ＢＳＡ　／　０．０２％ＮａＮ３より
成る２００μｔの反応用緩衝液に添加して、競合法によ
る抗原抗体反応を８７°Ｃで１０分間行なわせた後、第
１実施例と同様に第２図に示す構成のクロマト装置によ
りＢ−Ｆ分離を行なって、ＢｏｕｎｄとＦｒｅｅとのそ
れぞれの螢光強度を測定し、それらの螢光強度に基いて
サンプル中のインシュリン濃度を求める。なお、本例に
おいては、カラＡの充ＩＥＩとしてセルロファイ／Ｇｏ
−２００ｍ（商品名；生化学工業株式会社製）を用いる
。

本実施例においても、Ｂｏｕｎｄは標識抗原よりも大き
い担体を有するから、その反応液を第２図に示す構成の
クロマト装置に通すと、最初にＢｏｕｎｄが高速に溶出
し、遅れてＦｒｅｅが溶出してＢ−７分離が確実に行な
われ、第８図と同様な螢光強度が得られる。したがって
、Ｂｏｕｎｄのピーク値とＦｒｅｅのピーク値とに基い
てサンプル中のインシュリン濃度を高精度かつ高速に求
めることができる。

第δ実施例 第８実施例としてヒトエｇＧの分析について説明・す、
る。本例では、担体として分子量３０万のデキストラン
を用い、これを臭化シアン（０ＮＢｒ　）　ｒ活性化し
て過剰量の６・アミノカプロン酸を反応させることによ
り、デキストラン分子内にカルボキシル基を導入し、更
にカルボジイミドを用いてデキストランとモノクローナ
ル抗ヒトＩｇＧ　抗体の’ａｂ　’ラグメントを架橋す
る。また、標識抗体として担体よりも分子量の小さいヤ
ギ抗ヒ）　ＩｇＧのＦａｂ７ラグメントを使用し、これ
をＦＩＴＣの螢光物質で標識する。上記の固相抗体を有
する担体を含むデキストラン試薬５０μｔと、ＦＩＴＣ
で標識した標識抗体を含む標識試薬６０μｔと、サンプ
ル抗原のヒトＩｇＧ溶液６μｔとを、０．０１　Ｍ　Ｐ
ＢＳ　ｐＨ＝７，５　／　０．２　　Ｍ　Ｈａ（３ｔ／
　０．１　　％ＢＳＡ　／　０．０５　　％Ｔｗ−ｅｅ
ｎ　２０　／　Ｏ−０２％　ＮａＮ、より成る２　００
　Ｐ＆の反応用緩衝液に添加して、サンドイツチ法によ
る抗原抗体反応を８７゛Ｃで５分間行なわせた後、第１
実施例と同様に第２図に示す構成のクロマト装置により
Ｂ−Ｆ分離を行なって、ＢＯ二ｕｎｄと７ｒｅｅとのそ
れぞれの螢光強度を測定し、サンプル中のＩｇＧ濃度を
求める。なお、本例においては、カラムの充填剤として
セルロファインにＣ−Ｃ−７Ｏ０商品名；生化学工業株
式会社１１！Ｉりを用いる。

本実施例においては、Ｂｏｕｎｄは標識抗体よりも分子
量が大きい担体を有するから、その反応液を第２図に示
す構成のクロマト装置に通すと、最初にＢｏｕｎｄが高
速に溶出し、遅れて１ｒｒｅｅが溶出してＢ−Ｆ分離が
確実に行なわれ、第８図と同様な螢光強度が得られる。

したがって、本例においてもサンプル中のＩｇＧ濃度を
、上述した実施例と同様に高精度かつ高速に求めること
ができる。

なお、本発明は上述したヒトＩｇＥ　、ヒトインシュリ
ン、と）　ＩｇＧの分析のみでなく、酵素等のタンパク
質、ホルモン、細菌、ウィルス等の種々の分析にも有効
に適用することができると共に、標識物質も螢光物質に
限らず、酵素、放射性物質、色素、金属等の種々のもの
を用いるごとができる。

（発明の効果） 以上述べたように、本発明によればゲルクロマトグラフ
ィーによりＢ−Ｆ分離を行なう標識免疫・分析法におい
て、標識抗原または抗体よりも大きさまたは分子量の大
きい担体を用いるようにしたから、分析項目に制限され
ることなく低分子から高分子に至るまで常に確実にＢ−
Ｆ分離することができ、これにより所要の分析を高精度
かつ高速に行なうことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は標識免疫分析法の一例の反応模式図、第２図は
本発明によってＢ−Ｆ分離を行なうクロマト装置の一例
の構成を示す図、 第８図は第２図に示すクロマト装置から得られる出力波
形の一例を示す図である。 １・・・担体　　　　　　　　２・・・抗体８・・・標
識抗体　　　　　令・・・標識物質５・・・サンプル抗
原　　　６・・・Ｂｏｕｎｄ７・・・Ｆｒｅｅ　　　　
　　　　１１・・・カラム１２・・・インジェクタ　　
　１８・・・ポンプ１４・・・溶出液タンク　　　１５
・・・検出器１６・・・廃液タンク　　　　１７・・・
記録計第１図 第２図　　　　第３図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、サンプルと、所定の物質で標識した標識抗原または
   抗体と、表面に固相化した抗原または抗体を有し、少く
   共前記標識抗原または抗体よりも大きさまたは分子量が
   大きい担体とを反応させた後、その反応液中の前記担体
   に結合した標識抗原または抗体と、結合しないそれとを
   ゲルクロマトグラフィーにより分離することを特徴とす
   る免疫学的分析方法。