JPH02247199A - ヒト血液凝固第ｘ３因子の製造法 - Google Patents
ヒト血液凝固第ｘ３因子の製造法Info
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- JPH02247199A JPH02247199A JP6666789A JP6666789A JPH02247199A JP H02247199 A JPH02247199 A JP H02247199A JP 6666789 A JP6666789 A JP 6666789A JP 6666789 A JP6666789 A JP 6666789A JP H02247199 A JPH02247199 A JP H02247199A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、ヒト血液凝固第ＸＩＩＩ因子、就中ヒト胎盤
由来血液擬固第ＸＩＩＩ因子の製造法に関する。
由来血液擬固第ＸＩＩＩ因子の製造法に関する。
ヒト血液凝固第ＸＩＩＩ因子（以下、単に第ＸＩＩＩ因
子と称する）は、血液凝固機構の最終段階である安定性
フィブリンポリマーの生成に関与するものであり、フィ
ブリン安定化因子とも呼ばれ、平常は不活性状態で血液
中に存在しているが、出血などで血液凝固が起こりトロ
ンビンの生成がみられると、このトロンビンとカルシウ
ムイオンとの作用によって活性化され、フィブリンの安
定化を図る。従って第ＸＩＩＩ囚子の減少もしくは欠損
している血液では、凝固時間は正常闇値を示すが、形成
されたフィブリン塊が脆弱であり、後出血などの特有の
現象を呈する。
子と称する）は、血液凝固機構の最終段階である安定性
フィブリンポリマーの生成に関与するものであり、フィ
ブリン安定化因子とも呼ばれ、平常は不活性状態で血液
中に存在しているが、出血などで血液凝固が起こりトロ
ンビンの生成がみられると、このトロンビンとカルシウ
ムイオンとの作用によって活性化され、フィブリンの安
定化を図る。従って第ＸＩＩＩ囚子の減少もしくは欠損
している血液では、凝固時間は正常闇値を示すが、形成
されたフィブリン塊が脆弱であり、後出血などの特有の
現象を呈する。
第ＸＩＩＩ因子の臨床適用については、先天的ないし後
天的筒ＸＩＩＩ因子欠損症および減少症はもちろんのこ
と、広く一般外科手術後の創傷治癒促進に用いられ得る
。
天的筒ＸＩＩＩ因子欠損症および減少症はもちろんのこ
と、広く一般外科手術後の創傷治癒促進に用いられ得る
。
第ＸＩＩＩ因子の製造は、これが血漿、血小板および胎
盤に比較的多く含まれていることから、これらを出発物
としてそれぞれから回収する方法が知られている。
盤に比較的多く含まれていることから、これらを出発物
としてそれぞれから回収する方法が知られている。
現在知られている第ＸＩＩＩ因子の製造法としては、硫
酸アンモニウム、アクリノール、アル・コールを用いて
の沈澱、ゲル濾過などの方法を組み合わせて胎盤より第
ＸＩ因子を精製する方法（ブルート、第２５巻、第２３
５頁、１９７２年）、胎盤由来の粗グロブリン画分から
ポリアルキレングリコール分画法により精製する方法（
特公昭６０−２９６８７号公報）、胎盤抽出物から硫安
分画法により精製する方法（特公昭６２−３６４８７号
公報）、硫酸アルカリ金属塩を添加することにより分画
を行う方法（特開昭５８−１２１２１９号公報）、陰イ
オン交換・体を用いることにより精製する方法（特開昭
５８−１８５５２５号公報、特開昭６０２５８１２３号
公報）、酸性ｐ）ｌにおいて低アルコール濃度で分離す
る方法（特開昭６３−１７８２９号公報）等がある。
酸アンモニウム、アクリノール、アル・コールを用いて
の沈澱、ゲル濾過などの方法を組み合わせて胎盤より第
ＸＩ因子を精製する方法（ブルート、第２５巻、第２３
５頁、１９７２年）、胎盤由来の粗グロブリン画分から
ポリアルキレングリコール分画法により精製する方法（
特公昭６０−２９６８７号公報）、胎盤抽出物から硫安
分画法により精製する方法（特公昭６２−３６４８７号
公報）、硫酸アルカリ金属塩を添加することにより分画
を行う方法（特開昭５８−１２１２１９号公報）、陰イ
オン交換・体を用いることにより精製する方法（特開昭
５８−１８５５２５号公報、特開昭６０２５８１２３号
公報）、酸性ｐ）ｌにおいて低アルコール濃度で分離す
る方法（特開昭６３−１７８２９号公報）等がある。
しかしながら、上記の各方法は得られた第ＸＩ因子の純
度が低いということ、その製造法では工程数が多く実製
造上利用することが困難であること、あるいは精製され
た第ＸＩＩＩ因子の回収率が低いということ等より、各
々に問題点を有する。
度が低いということ、その製造法では工程数が多く実製
造上利用することが困難であること、あるいは精製され
た第ＸＩＩＩ因子の回収率が低いということ等より、各
々に問題点を有する。
従って、本発明の目的は簡便な操作によって高純度、且
つ高回収率で第ＸＩＩＩ因子を精製ないしは製造する方
法を提供することである。
つ高回収率で第ＸＩＩＩ因子を精製ないしは製造する方
法を提供することである。
上記目的を解決するために本発明は、（１）ヒト血液凝
固筒ＸＩＩＩ因子および夾雑物を含有する水溶液から、
ヒト血液凝固筒ＸＩＩＩ因子を精製するに際し、その任
意の工程においてヒト血液凝固筒ＸＩＩＩ因子を疎水性
クロマトグラフィーで処理してその吸着画分を回収する
ことにより精製することを特徴とするヒト血液凝固節Ｘ
Ｉ［［因子の製造法を提供するものであり、またさらに
は（２）疎水性クロマトグラフィーで処理してその吸着
画分を回収した後にレクチン結合クロマトグラフィーで
処理してその未吸着画分にヒト血液凝固筒ＸＩＩＩ因子
を集めることを特徴とする上記（］）記載の製造方法を
提供するものである。
固筒ＸＩＩＩ因子および夾雑物を含有する水溶液から、
ヒト血液凝固筒ＸＩＩＩ因子を精製するに際し、その任
意の工程においてヒト血液凝固筒ＸＩＩＩ因子を疎水性
クロマトグラフィーで処理してその吸着画分を回収する
ことにより精製することを特徴とするヒト血液凝固節Ｘ
Ｉ［［因子の製造法を提供するものであり、またさらに
は（２）疎水性クロマトグラフィーで処理してその吸着
画分を回収した後にレクチン結合クロマトグラフィーで
処理してその未吸着画分にヒト血液凝固筒ＸＩＩＩ因子
を集めることを特徴とする上記（］）記載の製造方法を
提供するものである。
（１）出発原料：
本発明の製造法における出発原料は、ヒト血液凝固第Ｘ
Ｉ因子および夾雑物を含有する水溶液であれば特に制限
はない。当該原料としては、例えばヒト胎盤抽出液（例
えば、胎盤破砕物と同重量の生理食塩液を混合した懸濁
液）、血液、その他第ＸｎＩ因子を含有するヒト血液画
分の水溶液などが例示される。
Ｉ因子および夾雑物を含有する水溶液であれば特に制限
はない。当該原料としては、例えばヒト胎盤抽出液（例
えば、胎盤破砕物と同重量の生理食塩液を混合した懸濁
液）、血液、その他第ＸｎＩ因子を含有するヒト血液画
分の水溶液などが例示される。
（２）本発明法を実施するためのサンプルの前処理：本
発明の精製法を実施する前に前記出発原料に対して前処
理を行うことが好ましい。
発明の精製法を実施する前に前記出発原料に対して前処
理を行うことが好ましい。
当該前処理は、通常公知の方法を組み合わせて行う。好
ましくは、次に示すＡあるいはＢに述べる処理を行うこ
とが好ましい。
ましくは、次に示すＡあるいはＢに述べる処理を行うこ
とが好ましい。
Ａ、硫安分画→脱塩→陰イオン交換りロマトグラフィー
→濃縮 当該硫安分画によって簡単な精製と出発原料の濃縮が行
われる。その際、硫安濃度は３０〜４０％飽和（好まし
くは３５％飽和）が適当である。
→濃縮 当該硫安分画によって簡単な精製と出発原料の濃縮が行
われる。その際、硫安濃度は３０〜４０％飽和（好まし
くは３５％飽和）が適当である。
攪拌溶解後、４°Ｃ〜室温に静置し、遠心分離により沈
澱を取得する。
澱を取得する。
次に脱塩処理に付す。即ち、上記沈澱を２０ｍＭリン酸
−５ｍＭＥＤＴＡ （ｐｌ＋７．２）に溶解し、同緩衝
液で透析するか、あるいは等量の４０％（Ｗ／Ｖ ）ポ
リエチレングリコールを添加し、遠心分離により沈澱を
取得後、２０ｍＭリン酸−５ｍＭＥＤＴＡ （ｐＨ７，
２）に溶解させる。
−５ｍＭＥＤＴＡ （ｐｌ＋７．２）に溶解し、同緩衝
液で透析するか、あるいは等量の４０％（Ｗ／Ｖ ）ポ
リエチレングリコールを添加し、遠心分離により沈澱を
取得後、２０ｍＭリン酸−５ｍＭＥＤＴＡ （ｐＨ７，
２）に溶解させる。
次に陰イオン交換クロマトグラフィーに付す。
即ち、予め２０ｍＭリン酸−５ｍＭＥ Ｄ ＴＡ （ｐ
＋（７，２）で平衡化しておいた陰イオン交換クロマト
担体（好ましくはＤＥＡＥ−３ｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−
６Ｂ：Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）に脱塩後のサンプルをチ
ャージし、同緩衝液で洗浄した後、溶出する。溶出液と
しては洗浄用緩衝液に０．ＩＭＮａＣｆｉを添加したも
のを使用する。
＋（７，２）で平衡化しておいた陰イオン交換クロマト
担体（好ましくはＤＥＡＥ−３ｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−
６Ｂ：Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）に脱塩後のサンプルをチ
ャージし、同緩衝液で洗浄した後、溶出する。溶出液と
しては洗浄用緩衝液に０．ＩＭＮａＣｆｉを添加したも
のを使用する。
次に濃縮処理に付す。濃縮処理は、自体既知の操作によ
って行えばよく、好ましくは限外濾過、更に好ましくは
、分画分子量が１０万であるＰ ｅ ］ Ｉ ｉ ｃ
ｏ ｎ ｃ ａ ｓ ｓ ｅ ｔ、 ｔ ｅ （Ｍｉ
ｌｌｉｐｏｒｅ社製）が使用に供せられる。
って行えばよく、好ましくは限外濾過、更に好ましくは
、分画分子量が１０万であるＰ ｅ ］ Ｉ ｉ ｃ
ｏ ｎ ｃ ａ ｓ ｓ ｅ ｔ、 ｔ ｅ （Ｍｉ
ｌｌｉｐｏｒｅ社製）が使用に供せられる。
Ｂ、エタノール分画→脱塩→陰イオン交換りロマトグラ
フィー→濃縮 当該エタノール分画は０〜−１０°Ｃ（好ましくは一３
°Ｃ）でエタノールをＶ！濃度５〜１０％（Ｖ／Ｖ）（
好ましくは８％）になるよう添加し、上記温度で約３０
分間攪拌後、遠心分離により上清を取得し、続いて、０
〜−１０°Ｃ（好ましくは一５°Ｃ）でエタノールを終
濃度２０〜３０％（Ｖ／Ｖ） （好ましくは２５％）に
なるよう添加し、上記温度で約３０分間撹拌後、遠心分
離により沈澱を取得することによって実施される。
フィー→濃縮 当該エタノール分画は０〜−１０°Ｃ（好ましくは一３
°Ｃ）でエタノールをＶ！濃度５〜１０％（Ｖ／Ｖ）（
好ましくは８％）になるよう添加し、上記温度で約３０
分間攪拌後、遠心分離により上清を取得し、続いて、０
〜−１０°Ｃ（好ましくは一５°Ｃ）でエタノールを終
濃度２０〜３０％（Ｖ／Ｖ） （好ましくは２５％）に
なるよう添加し、上記温度で約３０分間撹拌後、遠心分
離により沈澱を取得することによって実施される。
続いて脱塩、陰イオン交換クロマトグラフィー濃縮に付
す。これらの操作は前記Ａにおけると同様にして実施さ
れる。
す。これらの操作は前記Ａにおけると同様にして実施さ
れる。
（３）本発明の方法
本発明において使用される疎水クロマトグラフィーは、
通常疎水性基の結合した担体によって行われる。疎水性
基としては、炭素数４〜１０個のアルキル基を有するも
の（例ニブチル、ヘキシル、オクチル基）或いはフェニ
ル基が好ましい。担体予め２０ｍＭリン酸−５ｍＭＥＤ
Ａ−ＬＭ Ｎａ Ｃ１（ｐＨ７，２）で平衡化しておい
たＢｕｔｙｌ ＴＯＹＯＰＥ＾ＲＬ６５０Ｍに、濃縮後
のサンプルをチャージし、同緩衝液で洗浄した後、溶出
。溶出液は２０ｍＭ’Ｊン酸−５ ｍ Ｍ Ｅ Ｄ Ａ
（ｐＨ７，２）にＮａ ＣＩ！、を０゜３０〜０．７
Ｍ（好ましくは０．５Ｍ）添加したものを使用。
通常疎水性基の結合した担体によって行われる。疎水性
基としては、炭素数４〜１０個のアルキル基を有するも
の（例ニブチル、ヘキシル、オクチル基）或いはフェニ
ル基が好ましい。担体予め２０ｍＭリン酸−５ｍＭＥＤ
Ａ−ＬＭ Ｎａ Ｃ１（ｐＨ７，２）で平衡化しておい
たＢｕｔｙｌ ＴＯＹＯＰＥ＾ＲＬ６５０Ｍに、濃縮後
のサンプルをチャージし、同緩衝液で洗浄した後、溶出
。溶出液は２０ｍＭ’Ｊン酸−５ ｍ Ｍ Ｅ Ｄ Ａ
（ｐＨ７，２）にＮａ ＣＩ！、を０゜３０〜０．７
Ｍ（好ましくは０．５Ｍ）添加したものを使用。
（ｉｉｉ）Ｈｅｘｙｌ ａｇａｒｏｓｅ予め２０ｍＭ
リン酸−５ｍＭＥＤＡ−２Ｍ Ｎａ （、ｅ（ｐｌ＋７
．２）で平衡化しておいたＨｅｘｙｌ ａｇａｒｏｓｅ
に、濃縮後のサンプルをチャージし、同緩衝液で洗浄し
た後、溶出。溶出液は２０ｍＭリン酸−５ｍＭＥ Ｄ
Ａ （ｐＨ７，２）にＮａＣＩＶ、を０．３０〜ＩＭ（
好ましくは０．５Ｍ）添加したものを使用。
リン酸−５ｍＭＥＤＡ−２Ｍ Ｎａ （、ｅ（ｐｌ＋７
．２）で平衡化しておいたＨｅｘｙｌ ａｇａｒｏｓｅ
に、濃縮後のサンプルをチャージし、同緩衝液で洗浄し
た後、溶出。溶出液は２０ｍＭリン酸−５ｍＭＥ Ｄ
Ａ （ｐＨ７，２）にＮａＣＩＶ、を０．３０〜ＩＭ（
好ましくは０．５Ｍ）添加したものを使用。
■レクチン結合担体
疎水クロマトグラフィーによって精製した両分について
、例えば限外濾過により緩衝液組成を２０ｍＭリン酸−
０，２ＭＮａ（１２（ｐｌ＋７．２）にし、かつ濃縮し
た両分につき、レクチン結合担体によるクロマトグラフ
ィーに付すことによって精製を行としでは、セファロー
ス、セファデックス、アガロース等の不溶性担体が使用
される。疎水性基の結合した担体としては、具体的には
Ｐｈｅｎｙ ｌ５ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４８（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ製）、Ｂｕｔｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲ
Ｌ ６５０Ｍ（東ソー社製）、Ｈｅｘｙｌ ａｇａ
ｒｏｓｅ（Ｍｉｌｅｓ社製）などが例示される。
、例えば限外濾過により緩衝液組成を２０ｍＭリン酸−
０，２ＭＮａ（１２（ｐｌ＋７．２）にし、かつ濃縮し
た両分につき、レクチン結合担体によるクロマトグラフ
ィーに付すことによって精製を行としでは、セファロー
ス、セファデックス、アガロース等の不溶性担体が使用
される。疎水性基の結合した担体としては、具体的には
Ｐｈｅｎｙ ｌ５ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４８（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ製）、Ｂｕｔｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲ
Ｌ ６５０Ｍ（東ソー社製）、Ｈｅｘｙｌ ａｇａ
ｒｏｓｅ（Ｍｉｌｅｓ社製）などが例示される。
以下にそれぞれの疎水性基の結合した担体について、そ
の操作条件を記載する。
の操作条件を記載する。
（ｉ）Ｐｈｅｎｙｌ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬＢ
予め２０ｍＭリン酸−５ｍＭＥＤＡ−０，１ＭＮ ａ
Ｃｌ （ｐＨ７，２）で平衡化しておいたＰｈｅｎｙｌ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂに、濃縮後のサンプ
ルをチャージし同緩衝液で洗浄した後、溶出。
Ｃｌ （ｐＨ７，２）で平衡化しておいたＰｈｅｎｙｌ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂに、濃縮後のサンプ
ルをチャージし同緩衝液で洗浄した後、溶出。
溶出液は洗浄用緩衝液に５〜２０％（Ｖ／Ｖ ）エタノ
ール（好ましくは１０％）を添加したものを使用。
ール（好ましくは１０％）を添加したものを使用。
（ｉｉ）Ｂｕｔｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ６５０う。こ
こで使用されるレクチン結合担体におけるレクチンは、
特に制限はなく、コンカナバリンＡ、レンチルレクチン
、ウイートジャムレクチンなどが例示される。担体とし
ては、セファロース、セファデックス、アガロースなど
の不溶性担体が使用される。レクチン結合担体としては
、例えばＣｏｎＡ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ （Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ社製）、Ｌｅｎｔｉｌ Ｌｅｃｔｉｎ−３ｅ
ｐｈａｒｏｓｅ４ Ｂ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、
Ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍＬｅｃｔｉｎ−３ｅｐｈａｒｏ
ｓｅ ６ＭＢ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）などが例示
される。
こで使用されるレクチン結合担体におけるレクチンは、
特に制限はなく、コンカナバリンＡ、レンチルレクチン
、ウイートジャムレクチンなどが例示される。担体とし
ては、セファロース、セファデックス、アガロースなど
の不溶性担体が使用される。レクチン結合担体としては
、例えばＣｏｎＡ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ （Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ社製）、Ｌｅｎｔｉｌ Ｌｅｃｔｉｎ−３ｅ
ｐｈａｒｏｓｅ４ Ｂ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、
Ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍＬｅｃｔｉｎ−３ｅｐｈａｒｏ
ｓｅ ６ＭＢ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）などが例示
される。
以下にＣｏｎＡ−３ｅｐｈａｒｏｓｅについて、その操
作条件を記載する。
作条件を記載する。
（ｉ）ＣｏｎＡ−３ｅｐｈａ ｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ社製） 予め２０ｍＭリン酸−０，２ＭＮａＣｊ２ （ｐＨ７，
２）で平衡化しておいたＣｏｎＡ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ
に、濃縮後のサンプルをチャージし、未吸着画分を集め
る。
ｃｉａ社製） 予め２０ｍＭリン酸−０，２ＭＮａＣｊ２ （ｐＨ７，
２）で平衡化しておいたＣｏｎＡ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ
に、濃縮後のサンプルをチャージし、未吸着画分を集め
る。
（４）本発明法を実施した後の４ノンプルの後処理：公
知の方法を組合せて行う。好ましくは、次に示す工程が
採用される。
知の方法を組合せて行う。好ましくは、次に示す工程が
採用される。
濃縮および緩衝液交換（限外濾過）→ゲル濾過（ＨＰＬ
Ｃ） 当該濃縮および緩衝液交換は自体既知の方法によって実
施例すればよい。好適には分画分子量が１０万であるＰ
ｅ１ｌｉｃｏｎ ｃａＳｓｅｔｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏ
ｒｅ社製）が使用に供せられる。
Ｃ） 当該濃縮および緩衝液交換は自体既知の方法によって実
施例すればよい。好適には分画分子量が１０万であるＰ
ｅ１ｌｉｃｏｎ ｃａＳｓｅｔｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏ
ｒｅ社製）が使用に供せられる。
この時、使用する緩衝液は、次の工程で使用できるため
のものがよい。例えば次工程でゲル濾過を行う時は、２
０ｍＭリン酸−０，２ＭＮａ ＣＩ！、（ｐＨ７，２）
などが使用できる。
のものがよい。例えば次工程でゲル濾過を行う時は、２
０ｍＭリン酸−０，２ＭＮａ ＣＩ！、（ｐＨ７，２）
などが使用できる。
次にゲル濾過に付す。この際、特にＨＰＬＣが使用に適
する。例えばＨＰ Ｌ ＣＴ Ｓ Ｋ Ｇ３０００Ｓ
Ｗ（東ソー）を用い２０ｍＭリン酸−０，２ＭＮａＣｆ
ｆ１（ｐｉ（７，２）を展開緩衝液として用いればよい
。
する。例えばＨＰ Ｌ ＣＴ Ｓ Ｋ Ｇ３０００Ｓ
Ｗ（東ソー）を用い２０ｍＭリン酸−０，２ＭＮａＣｆ
ｆ１（ｐｉ（７，２）を展開緩衝液として用いればよい
。
尚、本発明方法実施時、即ち前処理および後処理を含め
て、本発明の方法の処理温度は、好適には４°Ｃ〜室温
で行われる。特に、疎水クロマトグラフィー実施時につ
いては１０°Ｃ〜室温で行うことが好ましい。
て、本発明の方法の処理温度は、好適には４°Ｃ〜室温
で行われる。特に、疎水クロマトグラフィー実施時につ
いては１０°Ｃ〜室温で行うことが好ましい。
本発明法を用いることにより、従来の精製法によるより
も簡単な操作で、さらに高度に精製された第ＸＩＩＩ因
子濃縮画分を高回収率で得ることができる。かくして得
られた第ＸＩＩＩ因子の濃縮画分は、医療用製剤への製
剤化のために公知の方法に従い透析、除菌濾過、分注、
凍結乾燥することにより第ＸＩ［Ｉ因子からなる医療用
製剤とすることができる。
も簡単な操作で、さらに高度に精製された第ＸＩＩＩ因
子濃縮画分を高回収率で得ることができる。かくして得
られた第ＸＩＩＩ因子の濃縮画分は、医療用製剤への製
剤化のために公知の方法に従い透析、除菌濾過、分注、
凍結乾燥することにより第ＸＩ［Ｉ因子からなる医療用
製剤とすることができる。
本発明方法による精製を行うことにより、夾雑水溶液は
当該分画前に比べて比活性において７〜２７倍上昇する
。
当該分画前に比べて比活性において７〜２７倍上昇する
。
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発
明はこの実施例に限定されるものではない。
明はこの実施例に限定されるものではない。
なお、以下の実施例中における第Ｘｌｆｆ因子の活性は
、新鮮な正常人血漿１ｍｌ中に含まれている第ＸＩＩＩ
因子活性量を１単位（希釈テスト法、スロンボシス エ
ト デイアセシス ヘモルハギカ（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉ
ｓ ｅｔ ＤｉａｔｈｅｓｉｓＨａｅｍｏｒｒｈａ
ｇｉｃａ）、２３．４５５．１９７０）として計算した
。
、新鮮な正常人血漿１ｍｌ中に含まれている第ＸＩＩＩ
因子活性量を１単位（希釈テスト法、スロンボシス エ
ト デイアセシス ヘモルハギカ（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉ
ｓ ｅｔ ＤｉａｔｈｅｓｉｓＨａｅｍｏｒｒｈａ
ｇｉｃａ）、２３．４５５．１９７０）として計算した
。
実施例中に用いるＡ−Ｈ液とは以下の成分から成る液を
言う。
言う。
Ａ液：０．９％ＮａＣ！！、−０，２％ＥＤＴＡＢ液：
２０ｍ）ｌリン酸−５ｍＭＥＤＴＡ （ｐｌ＋７．２）
Ｃ液：２０ｍＭリン酸−５ｍＭＥＤＴＡ−０，１ＭＮａ
Ｃ１（ｐ）１７．２） Ｂ液： ２０ｍＭ’Ｊ ：／酸−５ｍＭＥＤＴＡ−１０
％（Ｖ／Ｖ）エタノール（ｐＨ７，２） Ｂ液：２０ｍＭリン酸−０，２ＭＮａ Ｃ１（ｐＨ７，
２）Ｂ液：２０ｍＭリン酸−５ｍＭＥＤＴＡ−ＬＭ Ｎ
ａ１ｌ（ｐＨ７，２） Ｇ液：２０ｍＭリン酸−５ｍＭＥＤＴＡ−０，５ＭＮａ
Ｃｆｆ１ （ｐＨ７，２） Ｈ液：２０１リン酸−５ｍＭＥＤＴＡ−２Ｍ ＮａＣ１
（ｐｌ＋７．２ ） 実施例１ 疎水クロマトグラフィー（ＰｈｅｎｙｌＳｅ
ｐｈａｒｏｓｅ）とレクチン結合クロマトグラフィーに
よる精製 胎盤２４個分１５ｋｇをホモジネートして破砕物とし等
重量のＡ液（１！Ｍりを添加し攪拌した。
２０ｍ）ｌリン酸−５ｍＭＥＤＴＡ （ｐｌ＋７．２）
Ｃ液：２０ｍＭリン酸−５ｍＭＥＤＴＡ−０，１ＭＮａ
Ｃ１（ｐ）１７．２） Ｂ液： ２０ｍＭ’Ｊ ：／酸−５ｍＭＥＤＴＡ−１０
％（Ｖ／Ｖ）エタノール（ｐＨ７，２） Ｂ液：２０ｍＭリン酸−０，２ＭＮａ Ｃ１（ｐＨ７，
２）Ｂ液：２０ｍＭリン酸−５ｍＭＥＤＴＡ−ＬＭ Ｎ
ａ１ｌ（ｐＨ７，２） Ｇ液：２０ｍＭリン酸−５ｍＭＥＤＴＡ−０，５ＭＮａ
Ｃｆｆ１ （ｐＨ７，２） Ｈ液：２０１リン酸−５ｍＭＥＤＴＡ−２Ｍ ＮａＣ１
（ｐｌ＋７．２ ） 実施例１ 疎水クロマトグラフィー（ＰｈｅｎｙｌＳｅ
ｐｈａｒｏｓｅ）とレクチン結合クロマトグラフィーに
よる精製 胎盤２４個分１５ｋｇをホモジネートして破砕物とし等
重量のＡ液（１！Ｍりを添加し攪拌した。
この時の比活性（Ｕ／Ａ２８０）は０．０４５で回収率
を１００％とする。遠心分離により上清を取得し濃縮操
作として３５％飽和硫酸アンモニウム（以下硫安と言う
）攪拌溶解後、遠心分離により沈澱を取得し、これをＢ
液４２に溶解した。この時の比活性は０．２２で回収率
は８６％であった。
を１００％とする。遠心分離により上清を取得し濃縮操
作として３５％飽和硫酸アンモニウム（以下硫安と言う
）攪拌溶解後、遠心分離により沈澱を取得し、これをＢ
液４２に溶解した。この時の比活性は０．２２で回収率
は８６％であった。
これに説塩操作として等量（４りの４０％（Ｗ／Ｖ ）
ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと言う）液を添
加攪拌後、遠心分離により沈澱を取得し、これをＢ液（
３ρ）に熔解した。遠心分離により上清を取得した。こ
の時の比活性は０．４０で回収率は８０％であった。
ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと言う）液を添
加攪拌後、遠心分離により沈澱を取得し、これをＢ液（
３ρ）に熔解した。遠心分離により上清を取得した。こ
の時の比活性は０．４０で回収率は８０％であった。
次に予めＢ液で平衡化しておいた陰イオン交換体ＤＥＡ
Ｅ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂに試料をチャー
ジし、同緩衝液Ｂ液で洗浄した後Ｃ液で溶出した。この
時の比活性は４．８１で回収率は７５％であった。これ
を分画分子量１０万のペリコンにて限外濾過・濃縮を行
った。
Ｅ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂに試料をチャー
ジし、同緩衝液Ｂ液で洗浄した後Ｃ液で溶出した。この
時の比活性は４．８１で回収率は７５％であった。これ
を分画分子量１０万のペリコンにて限外濾過・濃縮を行
った。
次にＰｈｅｎｙｌ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４Ｂを
用いた疎水クロマトグラフィーを行った。
用いた疎水クロマトグラフィーを行った。
即ち、予めＣ液で平衡化したカラムに試料をチャージし
、Ｂ液で洗浄した後り液で溶出した。この時の比活性は
４５．７で回収率は６０％であった。
、Ｂ液で洗浄した後り液で溶出した。この時の比活性は
４５．７で回収率は６０％であった。
これを分画分子量１０万のペリコンにて限外濾過・濃縮
を行った。また、この際緩衝液もＥ液に置換した。
を行った。また、この際緩衝液もＥ液に置換した。
さらに、ＣｏｎＡ−３ｅｐｈａｒｏｓｅを用いたレクチ
ン結合クロマトグラフィーを行った。即ち、予めＥ液で
平衡化したカラムに試料をチャージし、未吸着画分を取
得した。この時の比活性は６７．８で回収率は５１％で
あった。これを分画分子量１０万のペリコンにて限外濾
過・濃縮を行った。さらに、展開緩衝液をＥ液とするＨ
ＰＬＣＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷによるゲル濾過を行っ
た。
ン結合クロマトグラフィーを行った。即ち、予めＥ液で
平衡化したカラムに試料をチャージし、未吸着画分を取
得した。この時の比活性は６７．８で回収率は５１％で
あった。これを分画分子量１０万のペリコンにて限外濾
過・濃縮を行った。さらに、展開緩衝液をＥ液とするＨ
ＰＬＣＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷによるゲル濾過を行っ
た。
得られた精製ＸＩＩＩ因子の比活性は１９２．３で回収
で溶出した。この時の比活性は４．８１で回収率は７５
％であった。
で溶出した。この時の比活性は４．８１で回収率は７５
％であった。
これを分画分子量１０万のペリコンにて限外濾過・濃縮
を行った。また、この際緩衝液もＦ液に置換した。次に
Ｂｕ ｔ Ｖ １−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ６５０Ｍを用い
た疎水クロマトグラフィーを行った。即ち、予めＦ液で
平衡化したカラムに試料をチャージし、Ｆ液で洗浄した
後Ｇ液で溶出した。
を行った。また、この際緩衝液もＦ液に置換した。次に
Ｂｕ ｔ Ｖ １−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ６５０Ｍを用い
た疎水クロマトグラフィーを行った。即ち、予めＦ液で
平衡化したカラムに試料をチャージし、Ｆ液で洗浄した
後Ｇ液で溶出した。
この時の比活性は３７．６で回収率は５８％であった。
これを分画分子量１０万のペリコンにて限外濾過・濃縮
を行った。また、この際緩衝液もＥ液に置換した。さら
に、ＣｏｎＡ−３ｅｐｈａｒｏｓｅを用いたレクチン結
合クロマトグラフィーを行った。即ち、予めＥ液で平衡
化したカラムに試料をチャージし、未吸着画分を取得し
た。この時の比活性は５１．４で回収率は５０％であっ
た。これを分画分子量１０万のペリコンにて限外濾過・
濃縮を行った。さらに、展開緩衝液をＥ液とするＨＰＬ
ＣＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷによるゲル濾過を率は４１
％であった。
を行った。また、この際緩衝液もＥ液に置換した。さら
に、ＣｏｎＡ−３ｅｐｈａｒｏｓｅを用いたレクチン結
合クロマトグラフィーを行った。即ち、予めＥ液で平衡
化したカラムに試料をチャージし、未吸着画分を取得し
た。この時の比活性は５１．４で回収率は５０％であっ
た。これを分画分子量１０万のペリコンにて限外濾過・
濃縮を行った。さらに、展開緩衝液をＥ液とするＨＰＬ
ＣＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷによるゲル濾過を率は４１
％であった。
実施例２ 疎水クロマトグラフィー（Ｂｕｔｙｌ−ＴＯ
ＹＯＰＥＡＲＬ）とレクチン結合クロマトグラフィーに
よる精製 胎盤２４個分１５ｋｇをホモジネートして破砕物とし、
等重量のＡ液（１５！Ｖ、）を添加し攪拌した。
ＹＯＰＥＡＲＬ）とレクチン結合クロマトグラフィーに
よる精製 胎盤２４個分１５ｋｇをホモジネートして破砕物とし、
等重量のＡ液（１５！Ｖ、）を添加し攪拌した。
この時の比活性（Ｕ／Ａ２８０）は０．０２３で回収率
を１００％とする。遠心分離により上清を取得し濃縮操
作として３５％飽和硫酸アンモニウム攪拌溶解後、遠心
分離により沈澱を取得し、これをＢ液４ｊ２に溶解した
。この時の比活性は０，２２で回収率は８６％であった
。
を１００％とする。遠心分離により上清を取得し濃縮操
作として３５％飽和硫酸アンモニウム攪拌溶解後、遠心
分離により沈澱を取得し、これをＢ液４ｊ２に溶解した
。この時の比活性は０，２２で回収率は８６％であった
。
これに脱塩操作として等量（４ｉ）の４０％（Ｗ／Ｖ）
ポリエチレングリコール液を添加攪拌後、遠心分離によ
り沈澱を取得し、これをＢ液（３ｐ、）に溶解した。遠
心分離により上清を取得した。この時の比活性は０．４
０で回収率は８０％であった。
ポリエチレングリコール液を添加攪拌後、遠心分離によ
り沈澱を取得し、これをＢ液（３ｐ、）に溶解した。遠
心分離により上清を取得した。この時の比活性は０．４
０で回収率は８０％であった。
次に予めＢ液で平衡化しておいた陰イオン交換体ＤＥＡ
Ｅ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂに試料をチャー
ジし、同緩衝液Ｂ液で洗浄した後Ｃ液行った。得られた
精製ＸＩＩＩ因子の比活性は１８６．６で回収率は３５
％であった。
Ｅ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂに試料をチャー
ジし、同緩衝液Ｂ液で洗浄した後Ｃ液行った。得られた
精製ＸＩＩＩ因子の比活性は１８６．６で回収率は３５
％であった。
実施例３ 疎水クロマトグラフィ（Ｈｅｘｙｌ ａｇａ
ｒｏｓｅ）とレクチン結合クロマトグラフィーによる精
製胎盤２４個分１５ｋｇをホモジネートして破砕物とし
等重量のＡ液（１５ＩＶ、）を添加し撹拌した。
ｒｏｓｅ）とレクチン結合クロマトグラフィーによる精
製胎盤２４個分１５ｋｇをホモジネートして破砕物とし
等重量のＡ液（１５ＩＶ、）を添加し撹拌した。
この時の比活性（Ｕ／Ａ２８０）４才０．０２３で回収
率を１００％とする。遠心分離により上清を取得し濃縮
操作として３５％飽和硫酸アンモニウム攪拌溶解後、遠
心分離により沈澱を取得し、これをＢ液４！に溶解した
。この時の比活性は０．２２で回収率は８６％であった
。
率を１００％とする。遠心分離により上清を取得し濃縮
操作として３５％飽和硫酸アンモニウム攪拌溶解後、遠
心分離により沈澱を取得し、これをＢ液４！に溶解した
。この時の比活性は０．２２で回収率は８６％であった
。
これに脱塩操作として等量（４Ｉ！、）の４０％（Ｗ／
Ｖ）ポリエチレングリコール液を添加攪拌後、遠心分離
により沈澱を取得し、これをＢ液（３ｐ、）に溶解した
。遠心分離により上清を取得した。この時の比活性は０
．４０で回収率は８０％であった。
Ｖ）ポリエチレングリコール液を添加攪拌後、遠心分離
により沈澱を取得し、これをＢ液（３ｐ、）に溶解した
。遠心分離により上清を取得した。この時の比活性は０
．４０で回収率は８０％であった。
次に予めＢ液で平衡化しておいた陰イオン交換体ＤＥＡ
Ｅ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂに試料をチャー
ジし、同緩衝液Ｂ液で洗浄した後Ｃ液で溶出した。この
時の比活性は４．８１で回収率は７５％であった。
Ｅ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂに試料をチャー
ジし、同緩衝液Ｂ液で洗浄した後Ｃ液で溶出した。この
時の比活性は４．８１で回収率は７５％であった。
これを分画分子量１０万のペリコンにて限外濾過・濃縮
を行った。また、この際緩衝液もＨ液に置換した。次に
Ｈｅｘｙｌ ａｇａｒｏｓｅを用いた疎水クロマトグ
ラフィーを行った。即ち、予めＨ液で平衡化したカラム
に試料をチャージし、Ｈ液で洗浄した後Ｇ液で溶出した
。この時の比活性は３４．６で回収率は６２％であった
。
を行った。また、この際緩衝液もＨ液に置換した。次に
Ｈｅｘｙｌ ａｇａｒｏｓｅを用いた疎水クロマトグ
ラフィーを行った。即ち、予めＨ液で平衡化したカラム
に試料をチャージし、Ｈ液で洗浄した後Ｇ液で溶出した
。この時の比活性は３４．６で回収率は６２％であった
。
これを分画分子量１０万のペリコンにて限外濾過・濃縮
を行った。また、この際緩衝液もＥ液に置換した。さら
に、ＣｏｎＡ−３ｅｐｈａｒｏｓｅを用いたレフ子ン結
合クロマトグラフィーを行った。即ち、予めＥ液で平衡
化したカラムに試料をチャージし、未吸着画分を取得し
た。この時の比活性は４６．２で回収率は５８％であっ
た。これを分画分子量１０万のペリコンにて限外濾過・
濃縮を行った。さらに、展開緩衝液をＥ液とするＨＰＬ
ＣＴＳＫＧ３０００ＳＷによるゲル濾過を行った。得ら
れた精製ＸＩＩＩ因子の比活性は１７９．１の比活性は
４．８１で回収率は７５％であった。
を行った。また、この際緩衝液もＥ液に置換した。さら
に、ＣｏｎＡ−３ｅｐｈａｒｏｓｅを用いたレフ子ン結
合クロマトグラフィーを行った。即ち、予めＥ液で平衡
化したカラムに試料をチャージし、未吸着画分を取得し
た。この時の比活性は４６．２で回収率は５８％であっ
た。これを分画分子量１０万のペリコンにて限外濾過・
濃縮を行った。さらに、展開緩衝液をＥ液とするＨＰＬ
ＣＴＳＫＧ３０００ＳＷによるゲル濾過を行った。得ら
れた精製ＸＩＩＩ因子の比活性は１７９．１の比活性は
４．８１で回収率は７５％であった。
これを分画分子量ｌＯ万のペリコンにて限外濾過・濃縮
を行った。また、この際緩衝液もＧ液に置換した。次に
Ｐｈｅｎｙｌ−３ｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ、−４Ｂを用い
た疎水クロマトグラフィーを行った。即ち、予めＧ液で
平衡化したカラムに試料をチャージし、Ｂ液で洗浄した
後り液で溶出した。
を行った。また、この際緩衝液もＧ液に置換した。次に
Ｐｈｅｎｙｌ−３ｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ、−４Ｂを用い
た疎水クロマトグラフィーを行った。即ち、予めＧ液で
平衡化したカラムに試料をチャージし、Ｂ液で洗浄した
後り液で溶出した。
この時の比活性は４５．７で回収率は６０％であった。
これを分画分子量１０万のペリコンにて限外濾過・濃縮
を行った。また、この際緩衝液もＥ液に置換した。さら
に、展開緩衝液をＥ液とするＨＰＬＣＴＳＫ Ｇ３０
００ＳＷによるゲル濾過を行った。得られた精製ＸＩ［
［因子の比活性は１７２．６で回収率は４６％であった
。
を行った。また、この際緩衝液もＥ液に置換した。さら
に、展開緩衝液をＥ液とするＨＰＬＣＴＳＫ Ｇ３０
００ＳＷによるゲル濾過を行った。得られた精製ＸＩ［
［因子の比活性は１７２．６で回収率は４６％であった
。
実施例５ 疎水クロマトグラフィー（Ｂｕｔｙｌ−ＴＯ
ＹＯＰＥＡＲＬ）による精製 胎盤２４個分１５ｋｇをホモジネートして破砕物とし等
重量のＡ液（１５Ｎ）を添加し攪拌した。
ＹＯＰＥＡＲＬ）による精製 胎盤２４個分１５ｋｇをホモジネートして破砕物とし等
重量のＡ液（１５Ｎ）を添加し攪拌した。
この時の比活性（Ｕ／Ａ２８０）は０．０２３で回収率
を１００％とする。遠心分離により上清を取で回収率は
４３％であった。
を１００％とする。遠心分離により上清を取で回収率は
４３％であった。
実施例４ 疎水クロマトグラフィー（ＰｈｅｎｙｌＳｅ
ｐｈａｒｏｓｅ）による精製 胎盤２４個分１５ｋｇをホモジネートして破砕物とし等
重量のＡ液（１５β）を添加し撹拌した。
ｐｈａｒｏｓｅ）による精製 胎盤２４個分１５ｋｇをホモジネートして破砕物とし等
重量のＡ液（１５β）を添加し撹拌した。
この時の比活性（Ｕ／Ａ２８０）は０．０２３で回収率
を１００％とする。遠心分離により上清を取得し濃縮操
作として３５％飽和硫酸アンモニウム攪拌溶解後、遠心
分離により沈澱を取得し、これをＢ液４ｊ２に溶解した
。この時の比活性は０．２２で回収率は８６％であった
。
を１００％とする。遠心分離により上清を取得し濃縮操
作として３５％飽和硫酸アンモニウム攪拌溶解後、遠心
分離により沈澱を取得し、これをＢ液４ｊ２に溶解した
。この時の比活性は０．２２で回収率は８６％であった
。
これに脱塩操作として等１ｔ（４ｆｉ）の４０％（Ｗ／
Ｖ）ポリエチレングリコール液を添加攪拌後、遠心分離
により沈澱を取得し、これをＢ液（３ｉ）に熔解した。
Ｖ）ポリエチレングリコール液を添加攪拌後、遠心分離
により沈澱を取得し、これをＢ液（３ｉ）に熔解した。
遠心分離により上清を取得した。この時の比活性は０．
４０で回収率は８０％であった。
４０で回収率は８０％であった。
次に予めＢ液で平衡化しておいた陰イオン交換体ＤＥＡ
Ｅ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂに試料をチャー
ジし、同緩衝液Ｂｆｉで洗浄した後Ｂ液からＧ液のグラ
ジェントにより溶出した。この時得し濃縮操作として３
５％飽和硫酸アンモニウム攪拌溶解後、遠心分離により
沈澱を取得し、これをＢ液４Ｉ！、に溶解した。この時
の比活性は０．２２で回収率は８６％であった。
Ｅ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂに試料をチャー
ジし、同緩衝液Ｂｆｉで洗浄した後Ｂ液からＧ液のグラ
ジェントにより溶出した。この時得し濃縮操作として３
５％飽和硫酸アンモニウム攪拌溶解後、遠心分離により
沈澱を取得し、これをＢ液４Ｉ！、に溶解した。この時
の比活性は０．２２で回収率は８６％であった。
これに脱塩操作として等量（４１）の４０％（Ｗ／Ｖ）
ポリエチレングリコール液を添加攪拌後、遠心分離によ
り沈澱を取得し、これをＢ？ｆｆ１（３Ｎ）に溶解した
。遠心分離により上清を取得した。この時の比活性は０
．４０で回収率は８０％であった。
ポリエチレングリコール液を添加攪拌後、遠心分離によ
り沈澱を取得し、これをＢ？ｆｆ１（３Ｎ）に溶解した
。遠心分離により上清を取得した。この時の比活性は０
．４０で回収率は８０％であった。
次に予めＢ液で平衡化しておいた陰イオン交換体ＤＥＡ
Ｅ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂに試料をチャー
ジし、同緩衝液Ｂ液で洗浄した後Ｂ液からＧ液のグラジ
ェントにより溶出した。この時の比活性は４．８１で回
収率は７５％であった。これを分画分子量１０万のペリ
コンにて限外濾過・濃縮を行った。また、この際緩衝液
もＦ液に置換した。次にＢｕ ｔ Ｖ １−ＴＯＹＯＰ
ＥＡＲＬ６５０Ｍを用いた疎水クロマトグラフィーを行
った。即ち、予めＦ液で平衡化したカラムに試料をチャ
ージし、Ｆ液で洗浄した後Ｇ液で溶出した。
Ｅ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂに試料をチャー
ジし、同緩衝液Ｂ液で洗浄した後Ｂ液からＧ液のグラジ
ェントにより溶出した。この時の比活性は４．８１で回
収率は７５％であった。これを分画分子量１０万のペリ
コンにて限外濾過・濃縮を行った。また、この際緩衝液
もＦ液に置換した。次にＢｕ ｔ Ｖ １−ＴＯＹＯＰ
ＥＡＲＬ６５０Ｍを用いた疎水クロマトグラフィーを行
った。即ち、予めＦ液で平衡化したカラムに試料をチャ
ージし、Ｆ液で洗浄した後Ｇ液で溶出した。
この時の比活性は３７．６で回収率は５８％であった。
これを分画分子量１０万のペリコンにて限外濾過・濃縮
を行った。また、この際緩衝液もＥ液に置換した。さら
に、展開緩衝液をＥ液とするＨＰＬＣＴＳＫ Ｇ３０
００ＳＷによるゲル濾過を行った。得られた精製ＸＩＩ
Ｉ因子の比活性は１７３．０で回収率は４３％であった
。
を行った。また、この際緩衝液もＥ液に置換した。さら
に、展開緩衝液をＥ液とするＨＰＬＣＴＳＫ Ｇ３０
００ＳＷによるゲル濾過を行った。得られた精製ＸＩＩ
Ｉ因子の比活性は１７３．０で回収率は４３％であった
。
実施例６ 疎水クロマトグラフィ（Ｈｅｘｙｌ ａｇａ
ｒｏｓｅ）による精製 胎盤２４個分１５ｋｇをホモジネートして破砕物とし等
重量のＡ液（１５Ｎ）を添加し攪拌した。
ｒｏｓｅ）による精製 胎盤２４個分１５ｋｇをホモジネートして破砕物とし等
重量のＡ液（１５Ｎ）を添加し攪拌した。
この時の比活性（ｔＪ／Ａ２８０）は０．０２３で回収
率を１００％とする。遠心分離により上清を取得し濃縮
操作として３５％飽和硫酸アンモニウム攪拌溶解後、遠
心分離により沈澱を取得し、これをＢ液４ｉ！、に溶解
した。この時の比活性は０．２２で回収率は８６％であ
った。
率を１００％とする。遠心分離により上清を取得し濃縮
操作として３５％飽和硫酸アンモニウム攪拌溶解後、遠
心分離により沈澱を取得し、これをＢ液４ｉ！、に溶解
した。この時の比活性は０．２２で回収率は８６％であ
った。
これに脱塩操作として等量（４２）の４０％（Ｗ／Ｖ）
ポリエチレングリコール液を添加攪拌後、遠心分離によ
り沈澱を取得し、これをＢ液（３１）に溶解した。遠心
分離により上清を取得した。この時の比活性は０．４０
で回収率は８０％であった。
ポリエチレングリコール液を添加攪拌後、遠心分離によ
り沈澱を取得し、これをＢ液（３１）に溶解した。遠心
分離により上清を取得した。この時の比活性は０．４０
で回収率は８０％であった。
次に予めＢ液で平衡化しておいた陰イオン交換体ＤＥＡ
Ｅ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂに試料をチャー
ジし、同緩衝液Ｂ液で洗浄した後Ｂ液からＧ液のグラジ
ェントにより溶出した。この時の比活性は４．８１で回
収率は７５％であった。
Ｅ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂに試料をチャー
ジし、同緩衝液Ｂ液で洗浄した後Ｂ液からＧ液のグラジ
ェントにより溶出した。この時の比活性は４．８１で回
収率は７５％であった。
これを分画分子量１０万のペリコンにて限外濾過・濃縮
を行った。また、この際緩衝液もＨ液に置換した。次に
Ｈｅｘｙｌ ａｇａｒｏｓｅを用いた疎水クロマトグ
ラフィーを行った。即ち、予めＨ液で平衡化したカラム
に試料をチャージし、■■液で洗浄した後Ｃ液で溶出し
た。この時の比活性は３４．６で回収率は６２％であっ
た。これを分画分子量１０万のペリコンにて限外濾過・
濃縮を行った。また、この際緩衝液もＥ液に置換した。
を行った。また、この際緩衝液もＨ液に置換した。次に
Ｈｅｘｙｌ ａｇａｒｏｓｅを用いた疎水クロマトグ
ラフィーを行った。即ち、予めＨ液で平衡化したカラム
に試料をチャージし、■■液で洗浄した後Ｃ液で溶出し
た。この時の比活性は３４．６で回収率は６２％であっ
た。これを分画分子量１０万のペリコンにて限外濾過・
濃縮を行った。また、この際緩衝液もＥ液に置換した。
さらに、展開緩衝液をＥ液とするＨＰＬＣＴＳＫ Ｇ
３０００ＳＷによるゲル濾過を行った。得られた精製Ｘ
ＩＩＩ因子の比活性は１６６．５で回収率は４５％であ
った。
３０００ＳＷによるゲル濾過を行った。得られた精製Ｘ
ＩＩＩ因子の比活性は１６６．５で回収率は４５％であ
った。
実施例７ 疎水クロマトグラフィー（ＰｈｅｎｙｌＳｅ
ｐｈａｒｏｓｅ）とレクチン結合クロマトグラフィーに
よる精製 胎盤２４個分１５ｋｇをホモジネートして破砕物とし等
重量のＡ液（１５Ｉ！、）を添加し攪拌した。
ｐｈａｒｏｓｅ）とレクチン結合クロマトグラフィーに
よる精製 胎盤２４個分１５ｋｇをホモジネートして破砕物とし等
重量のＡ液（１５Ｉ！、）を添加し攪拌した。
この時の比活性（Ｕ／Ａ２８０）は０．０２３で回収率
を１００％とする。遠心分離により上清を取得し濃縮操
作としてエタノール分画を行った。即ち、終濃度８％と
なるようにエタノールを添加し、３°Ｃ１３０分間撹拌
した後、遠心分離により上清を取得し、再度、終濃度２
５％となるようにエタノールを添加し一５°Ｃ１３０分
間攪拌した後、遠心分離により沈澱を取得し、これをＢ
液５ρに溶解した。この時の比活性は０．１７で回収率
は７２％であった。
を１００％とする。遠心分離により上清を取得し濃縮操
作としてエタノール分画を行った。即ち、終濃度８％と
なるようにエタノールを添加し、３°Ｃ１３０分間撹拌
した後、遠心分離により上清を取得し、再度、終濃度２
５％となるようにエタノールを添加し一５°Ｃ１３０分
間攪拌した後、遠心分離により沈澱を取得し、これをＢ
液５ρに溶解した。この時の比活性は０．１７で回収率
は７２％であった。
次に予めＢ液で平衡化しておいた陰イオン交換体ＤＥＡ
Ｅ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂに試料をチャー
ジし、同緩衝液Ｂ液で洗浄した後Ｃ液で溶出した。この
時の比活性は２．９６で回収率は６４％であった。これ
を分画分子量１０万のペリコンにて限外濾過・濃縮を行
った。次にＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−
４Ｂを用いた疎水クロマトグラフィーを行った。即ち、
予めＣ液で平衡化したカラムに試料をチャージし、Ｂ液
で洗浄した後り液で溶出した。この時の比活性は３０．
１で回収率は５０％であった。これを分画分子量１゜万
のペリコンにて限外濾過・濃縮を行った。また、この際
緩衝液もＥ液に置換した。さらに、ＣｏｎＡ−３ｅｐｈ
ａｒｏｓｅを用いたレクチン結合クロマトグラフィーを
行った。即ち、予めＥ液で平衡化したカラムに試料をチ
ャージし、未吸着画分を取得した。この時の比活性は４
７．２で回収率は４２％であった。これを分画分子量１
０万のペリコンにて限外濾過・濃縮を行った。さらに、
展開緩衝液をＥ液とするＨ Ｐ Ｌ ＣＴ Ｓ Ｋ
０３０００５籾によるゲル濾過を行った。得られた精製
ｘ■因子の比活性は１８６．３で回収率は３２％であっ
た。
Ｅ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂに試料をチャー
ジし、同緩衝液Ｂ液で洗浄した後Ｃ液で溶出した。この
時の比活性は２．９６で回収率は６４％であった。これ
を分画分子量１０万のペリコンにて限外濾過・濃縮を行
った。次にＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−
４Ｂを用いた疎水クロマトグラフィーを行った。即ち、
予めＣ液で平衡化したカラムに試料をチャージし、Ｂ液
で洗浄した後り液で溶出した。この時の比活性は３０．
１で回収率は５０％であった。これを分画分子量１゜万
のペリコンにて限外濾過・濃縮を行った。また、この際
緩衝液もＥ液に置換した。さらに、ＣｏｎＡ−３ｅｐｈ
ａｒｏｓｅを用いたレクチン結合クロマトグラフィーを
行った。即ち、予めＥ液で平衡化したカラムに試料をチ
ャージし、未吸着画分を取得した。この時の比活性は４
７．２で回収率は４２％であった。これを分画分子量１
０万のペリコンにて限外濾過・濃縮を行った。さらに、
展開緩衝液をＥ液とするＨ Ｐ Ｌ ＣＴ Ｓ Ｋ
０３０００５籾によるゲル濾過を行った。得られた精製
ｘ■因子の比活性は１８６．３で回収率は３２％であっ
た。
実施例８ 疎水クロマトグラフィー（ＰｈｅｎｙｌＳｅ
ｐｈａｒｏｓｅ ）による精製 胎盤２４個分１５ｋｇをホモジネートして破砕物とし等
重量のＡ液（１５Ｉ！、）を添加し攪拌した。
ｐｈａｒｏｓｅ ）による精製 胎盤２４個分１５ｋｇをホモジネートして破砕物とし等
重量のＡ液（１５Ｉ！、）を添加し攪拌した。
この時の比活性（Ｕ／Ａ２８０）は０．０２３で回収率
を１００％とする。遠心分離により上清を取得し濃縮操
作としてエタノール分画を行った。即ち、終濃度８％と
なるようにエタノールを添加し、３°Ｃ１３０分間攪拌
した後、遠心分離により上清を取得し、再度、終濃度２
５％となるようにエタノールを添加し一５°Ｃ１３０分
間撹拌した後、遠心分離により沈澱を取得し、これをＢ
液５ＩＶ、に溶解した。この時の比活性は０．１７で回
収率は７２％であった。
を１００％とする。遠心分離により上清を取得し濃縮操
作としてエタノール分画を行った。即ち、終濃度８％と
なるようにエタノールを添加し、３°Ｃ１３０分間攪拌
した後、遠心分離により上清を取得し、再度、終濃度２
５％となるようにエタノールを添加し一５°Ｃ１３０分
間撹拌した後、遠心分離により沈澱を取得し、これをＢ
液５ＩＶ、に溶解した。この時の比活性は０．１７で回
収率は７２％であった。
次に予めＢ液で平衡化しておいた陰イオン交換体ＤＥＡ
Ｅ−３ｅｐｈａｒｏｓａ ＣＬ−６Ｂに試料をチャー
ジし、同緩衝液Ｂ液で洗浄した後Ｂ液からＧ液のグラジ
ェントにより溶出した。この時の比活性は２．９６で回
収率は６４％であった。
Ｅ−３ｅｐｈａｒｏｓａ ＣＬ−６Ｂに試料をチャー
ジし、同緩衝液Ｂ液で洗浄した後Ｂ液からＧ液のグラジ
ェントにより溶出した。この時の比活性は２．９６で回
収率は６４％であった。
これを分画分子量１０万のペリコンにて限外濾過・濃縮
を行った。また、この際緩衝液もＣ液に置換した。次に
Ｐｈｅｎｙｌ−３ｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂを用いた
疎水クロマトグラフィーを行った。即ち、予めＣ液で平
衡化したカラムに試料をチャージし、Ｂ液で洗浄した後
り液で溶出した。
を行った。また、この際緩衝液もＣ液に置換した。次に
Ｐｈｅｎｙｌ−３ｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂを用いた
疎水クロマトグラフィーを行った。即ち、予めＣ液で平
衡化したカラムに試料をチャージし、Ｂ液で洗浄した後
り液で溶出した。
この時の比活性は３０，１で回収率は５０％であった。
これを分画分子量１０万のペリコンにて限外濾過・濃縮
を行った。また、この際緩衝液もＥ液に置換した。さら
に、展開緩衝液をＥ液とするＩ（ＰＬＣＴＳＫ Ｃ３
０００ＳＷによるゲル濾過を行った。得られた精製ＸＩ
因子の比活性は１７４．８で回収率は３８％であった。
を行った。また、この際緩衝液もＥ液に置換した。さら
に、展開緩衝液をＥ液とするＩ（ＰＬＣＴＳＫ Ｃ３
０００ＳＷによるゲル濾過を行った。得られた精製ＸＩ
因子の比活性は１７４．８で回収率は３８％であった。
Claims (2)
- （１）ヒト血液凝固第ＸIII因子および夾雑物を含有す
る水溶液から、ヒト血液凝固第ＸIII因子を精製するに
際し、その任意の工程においてヒト血液凝固第ＸIII因
子を疎水性クロマトグラフィーで処理してその吸着画分
を回収することにより精製することを特徴とするヒト血
液凝固第ＸIII因子の製造法。 - （２）疎水性クロマトグラフィーで処理してその吸着画
分を回収した後にレクチン結合クロマトグラフィーで処
理してその未吸着画分にヒト血液凝固第ＸIII因子を集
めることを特徴とする請求項（１）記載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6666789A JPH02247199A (ja) | 1989-03-17 | 1989-03-17 | ヒト血液凝固第ｘ３因子の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6666789A JPH02247199A (ja) | 1989-03-17 | 1989-03-17 | ヒト血液凝固第ｘ３因子の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02247199A true JPH02247199A (ja) | 1990-10-02 |
Family
ID=13322483
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6666789A Pending JPH02247199A (ja) | 1989-03-17 | 1989-03-17 | ヒト血液凝固第ｘ３因子の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02247199A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5612456A (en) * | 1988-11-14 | 1997-03-18 | Zymogenetics, Inc. | Factor XIII compositions |
| JP2008510476A (ja) * | 2004-08-27 | 2008-04-10 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト | 生物学的材料からのｘｉｉｉ因子ポリペプチドの精製 |
| JP2008520220A (ja) * | 2004-11-23 | 2008-06-19 | ジモジェネティクス、インコーポレイテッド | 組換え型ヒトｘｉｉｉ因子の精製 |
-
1989
- 1989-03-17 JP JP6666789A patent/JPH02247199A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5612456A (en) * | 1988-11-14 | 1997-03-18 | Zymogenetics, Inc. | Factor XIII compositions |
| JP2008510476A (ja) * | 2004-08-27 | 2008-04-10 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト | 生物学的材料からのｘｉｉｉ因子ポリペプチドの精製 |
| JP2008520220A (ja) * | 2004-11-23 | 2008-06-19 | ジモジェネティクス、インコーポレイテッド | 組換え型ヒトｘｉｉｉ因子の精製 |
| US8461302B2 (en) | 2004-11-23 | 2013-06-11 | Zymogenetics, Inc. | Purification of recombinant human factor XIII |
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