JPH02253162A

JPH02253162A - 特異的結合能を有する物質と結合したエクオリンを用いる検出法

Info

Publication number: JPH02253162A
Application number: JP7474289A
Authority: JP
Inventors: Shuhei Yoshino; 修平善野; Satoshi Inoue; 敏井上
Original assignee: Chisso Corp
Current assignee: JNC Corp
Priority date: 1989-03-27
Filing date: 1989-03-27
Publication date: 1990-10-11

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔技術の分野〕本発明は、特異的結合能を有する物質と結合したエクオ
リンを用いた標的物の検出法に関する。

〔従来の技術とその問題点〕

発光蛋白エクオリンは、米国ワシントン州フライデーハ
ーバ−島近郊の海洋に生息する発光オワンクラゲより単
離されたカルシウム結合タンパク質である。エクオリン
は、自然界においてはタンパク貿部分のアポエクオリン
と、基質部分であるセレンテラジンが、分子状酸素を介
して複合体を形成しており、この複合体にカルシウムが
結合することにより発光することを特徴とする。この発
光を利用してカルシウム濃度を測定することができる。

本発明者は組換えＤＮＡの手法を用いて、発光オワンク
ラゲよりアポエクオリンのｃＤＮＡをクローニングし、
その１次構造を決定したく特開昭６１−１３５．５８６
　）。次いで、このｃＤＮＡを用いて大腸菌を宿主とし
、その菌体内及び菌体外でのアポエクオリンの生産に成
功した（特願昭６０−２８０．２５９．６１−２４９．
０９８　）。さらに、機能遺伝子と結合したエクオリン
遺伝子を作成し、その融合タンパク質の生産に成功した
く特願＠　６２−１９６．θ３１　）。また、エクオリ
ンの発光を利用した金属の検出方法を開発した（特願昭
６１−１０３，８４９　）。そして、特異的結合タンパ
ク質の遺伝子と結合したエクオリン遺伝子を作成し、そ
の融合タンパク貿の生産に成功した（特願昭［１３−３
０８，４２４）。

さらに、酵素免疫測定法に利用すべく、その融合タンパ
ク質の高純度精製標品の調製法を確立した（　　　　　
　）。

しかし、未だエクオリンの発光を利用した金属以外の検
出技術の報告はなく、本発明は特異的結合能を有する物
質と結合したエクオリンを用いた検出技術への応用を実
証した最初の報告である。

ところで、エクオリンの有用性は当業者に周知であり、
エクオリンを特異的結合能を有する物質を介して標的１
に結合することが可能になれば、標的物を特異的に発光
で検出することができる。

ここで、特異的結合とは抗原抗体反応、酵素反応、レセ
プターへの特異的結合、核酸とタンパク貿の特異的結合
、核酸のハイブリッド形成等を利用したものである。す
なわち、特異的結合能を有する物質と結合したエクオリ
ンは、酵素免疫測定法やＤＮＡプローブなどのあらゆる
測定系に応用できるものであり、上述した機能から診断
薬等の検査薬として有用であることが予測される。

本発明者は上述の技術的事情にかんがみ、研究の結果、
特異的結合能を有する物質と結合したエクオリンを用い
た発光による検出法を開発することができた。以上の説
明から明らかなように、本発明の目的はエクオリンを用
いた新しい検出技術を提供することである。

〔問題を解決するための手段〕

本発明（１発明）は、下記　（１）〜（５）の構成を有
する。

（１）　Ｖ異的結合能を有する物質とエクオリンを結合
させ、かくして得られた結合物を標的物質に結合させる
ことを特徴とする標的物質の検出法。

（２）結合物がエクオリン活性および抗体結合能を有す
る物質である前記第（＋、）項に記載の検出法。

（３）特異的結合能を有する物質が、酵素、抗体、プロ
ティンＡ、プロティンＧ、　ＤＮＡ　、　ＲＮＡ　、　
　ＤＮＡ結合タンパク貿若しくはレセプターである前記
第（１）項に記載の検出法。

（４）標的物質が、基質、補酵素、補欠分子族、抗原、
抗体、ＤＮＡ、　ＲＮＡ　、ホルモン若しくはトランス
ミツターである前記第（１）項に記載の検出法。

（５）プロティンＡをエクオリンと結合させ、かくして
得られた結合物を抗体と結合させることを特徴とする抗
体の検出法。

本発明の構成と効果につき以下に詳述する。

本発明はエクオリン活性を保持した特異的結合能を有す
る物質と結合したエクオリンを用いた標的物の検出法で
あり、例えば後述の実施例に示す方法で行うことができ
る。

本発明の方法において°°特異的結合能を有する°′物
質とは、標的物（後述）と特異的すなわち選択的に結合
する物質をいうのであって、例えば、抗原−抗体反応に
おける抗体を意味する。

また、標的物とは、本発明方法の対象となる被検出物を
いい、例えば、抗原−抗体反応における抗原を意味する
。

したがって、標的物と特異的結合能を有する物質（以下
特異結合能物質ということがある）とは、場合により相
対的に互換性がある。か＼る標的物と特異結合能物質と
の特異結合関係を例示すると下表のとおりである。

特異結合能物質とエクオリンとの結合については、本発
明者等の発明に係る特願昭６３−３０８．４２４号にも
述べられているが、次のとおりである。

１つの方法は、化学合成の手法を用いる場合で、たとえ
ば、マレイミド法やグルタルアルデヒド法などにより特
異結合能物質やエクオリンを修飾し、両者を結″合せし
める。この方法は特異結合能物質がタンパク質以外の物
質、たとえばＤＮＡやＲＮＡなとでも結合することがで
き、また、種々の特異結合能物質とエクオリンを容易に
短時間で結合することができ、応用範囲が広い結合方法
である。もう１つの方法は、組換えＤＮＡの手法を用い
る場合で、特異結合能物質はタンパク質にかぎられ、エ
クオリンとの結合は融合という形をとり、１分子の融合
タンパク質として発現される。特異結合能物質としてプ
ロティンＡを用いる場合、エクオリン発現ベクターｐｉ
ＰＨＥ（特開昭６３−１０２，６９５）からＥｃｏＲＩ
消化によりエクオリンｃＤＮＡの断片を分離する。次に
その断片をプロティンＡ融合発現ベクターｐＲＩＴ５　
　（ファルマシア社（株）製）のＥｃｏＲＩサイトに挿
入し、　ｐＡＡＱｌを作成する（特願昭６３−３０８，
４２４号の第１図参照）。プロティンＡ−エクオリン融
合タンパク質発現ベクターｐＡＡＱ１を大腸菌ＪＭ８３
株に形質転換して得られた形質転換株＋１ＡＡＱＩ／Ｊ
Ｍ８３を培養することにより発現されるプロティンＡ−
エクオリン融合タンパク質を以下に述べるエクオリン標
識プロティンとして使用する。

第１図は、エクオリン標識プロティンＡのエクオリン活
性に対するＩｇＧ濃度の影響を示したものである。

第２図は、エクオリン標識プロティンＡを用いた抗体の
検出法（サンドイツチ法）を模式的に示したものである
。

すなわち、固相（例えば、ポリスチレン）に、Ｆｃ断片
を含まないＦ（ａｂ’）２（抗原）を吸着させる。未吸
着Ｆ（ａｂ’）２を除いた後、ブロッキング剤（ＢＳＡ
）でブロッキングする。ブロッキング剤を除いた後、種
々の濃度のＩｇＧとＦ（ａｂ’）”を接触させる。未吸
着のＩｇＧを除いた後、エクオリン標識プロティンＡと
ＩｇＧを接触させる。未吸着のエクオリン標識プロティ
ンＡを除いた後、セレンテラジン及び２−メルカプトエ
タノール存在下で、エクオリンを再生させる。大過剰の
カルシウムを加えて発光させ、その発光量からＩｇＧを
定量できる。

第３図は、エクオリン標識プロティンＡを用いた酵素免
疫測定法（サンドイツチ法）の検出感度を示す。

〔実施例〕

（発明の効果）本発明の検出法によれば、対象物中の補酵素、抗原、抗
体、ＤＮＡ　、　ＲＮＡ　、ホルモン若しくはトランス
ミツター等の標的物質と特異的結合能を有する物質を選
択してエクオリンで標識し、該標識物を上述の標的物質
と結合せしめた後カルジム添加によりエクオリンを発光
せしめるので、被検体中の標的物質の濃度が極めて微量
であっても検出できる。

また、エクオリンで標識される物質は、標的物に対し、
特異的結合能を有する物質であるので、被検体中の標的
物質以外の物質と結合することがなく、検出感度が極め
て高い。

更にまた、標的物質の種類により、対応する特異的結合
能を有する物質を選択できるので、極めて広範囲の対象
（標的物質）に対して適用可能で、その利用範囲は極め
て広い。

以下に実施例によって本発明を説明する。

実施例１［エクオリン標識プロティンＡのエクオリン活
性に対するＩｇＧ濃度の影響コゲルろ過精製エクオリン標識プロティンＡ（９，６μｇ
　／ｌ１ｌｆｌ　）　１０μρ、抗ウサギＩｇＧである
ヤギｒｇＧ　　（種々濃度）１０μβ、２−メルカプト
エタノール１μ℃、セレンテラジン（２ｍｇ／ｍＪ２）
１μ℃、３０ｍＭ　ＴｒｉｓＪＩＣＪ２．１０ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ　（ｐＨ７，８）バッファー７８μにすなわち、
全容量１００μｋにて４℃、１５時間放置して、エクオ
リンを再生させた。

反応液の一部をルミフォトメーター（ＴＤ−４０００、
ラボサイエンス社）のキュベツト中に移し、３０ｍＭＣ
ａＣｊ２２を１００μρ注入して、その発光量を測定し
た。

その結果をまとめたものが、第１図である。エクオリン
活性はＩｇＧ濃度１０−’ｍｇ／ｍｌ付近から徐々に低
下するもののＩｇＧ濃度０．２８ｍｇ／ｍｕでも８５％
の活性を保持していた。これはエクオリン標識プロティ
ンＡがＩｇＧに結合した状態あるいはＩｇＧと共存した
状態でもゴエクオリン活性が十分であることを示すもの
であり、酵素免疫測定法への応用が可能であることを強
く示唆するものである。

実施例２［サンドイツチ法に基づいたエクオリン標識プ
ロティンＡによるＩｇＧの検出］ポリスチレン・チュー
ブ（１０φｘ　６５ｍｍ）を２ＮＮａＯＨ１６０℃に３
０分間浸して、洗浄した。水でＮａＯＨを洗い流した後
、５０℃にて乾燥した。第２図に示すようにＮａ０）Ｉ
処理ポリスチレン・チューブ中に２６μｇ／ｍＪ２ウサ
ギＦ　（ａｂ’）２抗ヤギＩｇＧ　、　１００　μｕを
側壁に付かないように添加し、３７℃で３時間インキュ
ベーションした。

ウサギＦ　（ａｂ’）２抗ヤギＩｇＧを除いた後、ブロ
ッキング・バッファー（１，０％牛血清アルブミンｉｎ
２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊＬ　ｐＨ７，５，５００ｍ
Ｍ　ＮａＣｌ［ＴＢＳ］　）　２．５＋ｎｆＬを添加し
、３７℃で２．５時間インキュベーションした。

ブロッキング・バッファーを除いた後、２０ｍＭＴｒｊ
ｓ−ＨＣｌ２　ｐ）１７．５．５００ｍ１Ｊ　　ＮａＣ
Ｊ２．０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０［ＴＴＢＳ］、２．
５ｍＪ２にて１０回洗浄した。

遠心して完全にＴＴＢＳを除いた後、種々濃度（２，５
μｇ　／ｍｆ１〜２５０μｇ／ＩＩＩＪｌ）のヤギＩｇ
Ｇ抗ウサギＩｇＧ、　１００μｋを添加し、３７℃で１
５時間インキュベーションした。ヤギＩｇＧ抗ウサギＩ
ｇＧを除いた後、ＴＴＢＳ　２．５　ｌｌ１ｉｔにて１
０回洗浄した。

遠心して完全にＴＴＢＳを除いた後、９ｆｉｎｇ／ｍｆ
！、エクオリン標識プロティンＡ（ゲルろ過精製サンプ
ル）１００μｍを添加し、３７℃にて１．５時間インキ
ュベーションした。エクオリン標識プロティンＡを除い
た後、ＴＴＢＳ　２．５　ｌｌｌ１．にて１０回洗浄し
た。

遠心して完全にＴＴＢＳを除いた後１０μｇ　７ｍ１ｌ
セレンテラジン、０．５％２−メルカプトエタノール、
　＋ｎ３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２　（ｐＨ７，６）
、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、　１００μ４１添加し、４℃に
１５時間放置した。

ルミフォトメーター（ＴＤ−４０００、ラボサイエンス
社）にチューブを移し、３０＋ｎＭ　ＣａＣ１２を１０
０μＪ２注入し、その発光量を測定した。その結果を第
３図に示した。抗体量（、ＩｇＧ　）が１０−’　〜１
　ｕ　ｇ／１ｕｂｅに関して、発光量との比例関係が認
められ、その範囲内において抗体の定量が可能であるこ
とがわかる。

本検出法は、種々の特異的結合を利用することにより、
広範囲に適用できる。また、エクオリン標識特異的結合
物質は、種々の結合法（マレイミド法やグルタルアルデ
ヒド法など）を用いることにより、容易に調製すること
が可能である。さらに基質（発光体）や、発光検出機の
改善に伴ない、より感度の高い検出システムになると考
えられる。

【図面の簡単な説明】

第１．２．３図は本発明の説明図である。第１図は、エクオリン標識プロティンＡのエクオリン活
性に対するＩｇＧ濃度の影響を示したものである。第２図は、エクオリン標識プロティンＡを用いたＩｇＧ
の検出法（サンドイツチ法）を模式的に示したものであ
る。第３図は、エクオリン標識プロティンＡを用いた酵素免
疫測定法（サンドイツチ法）の検出感度を示したもので
ある。以上

Claims

【特許請求の範囲】

（１）特異的結合能を有する物質とエクオリンを結合さ
せ、かくして得られた結合物を標的物質に結合させるこ
とを特徴とする標的物質の検出法。
（２）結合物がエクオリン活性および抗体結合能を有す
る物質である特許請求の範囲第（１）項に記載の検出法
。
（３）特異的結合能を有する物質が、酵素、抗体、プロ
テインＡ、プロテインＧ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ結合
タンパク質若しくはレセプターである特許請求の範囲第
（１）項に記載の検出法。
（４）標的物質が、基質、補酵素、補欠分子族、抗原、
抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ホルモン若しくはトランスミッ
ターである特許請求の範囲第（１）項に記載の検出法。
（５）プロテインＡをエクオリンと結合させ、かくして
得られた結合物を抗体と結合させることを特徴とする抗
体の検出法。