JPH02253163A - 生理活性物質の固相化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 り粟上図机刑分顆 本発明は、生理活性物質の固相化方法に関し、詳しくは
、抗原、抗体等の免疫活性物質を容易に且つ高密度にて
担体としての親水性重合体のマトリックスに含有させて
、固相化する方法に関する。

従来ｐ丑斐 血清、尿等の体液に含まれる種々の成分や薬物の検出及
び測定は、臨床上、極めて重要であって、従来、種々の
方法によって行なわれている。かかる方法として、代表
的には、体液中の被検物質である抗原又は抗体と、これ
らに対して特異的結合性を有する抗体又は抗原を利用す
る免疫学的測定法が知られており、なかでも、抗原抗体
間の反応の有無やその程度を知るために、酵素標識した
抗体や抗原等、酵素標識免疫体を用いる酵素免疫測定法
がその高感度性及び測定の安定性から広く用いられてい
る。

この酵素免疫測定法には、例えば、石川栄治ら著「酵素
免疫測定法」　（医学書院■１９８７年発行）に記載さ
れているように、種々の方法が知られている。−船釣に
は、ポリスチレンビーズ、試験管内壁面、プレート、膜
等、水不溶性固相担体の表面に、例えば被検物質と抗体
抗原反応を行なわせるための抗体を固定し、先ず、これ
に測定すべき被検物質としての抗原を含む被検液を加え
て、抗原抗体反応によって上記抗原を上記抗体を介して
、上記固相担体上に結合させる。次いで、未反応の抗原
を緩衝液等にて洗浄除去し、上記抗原に対応して、酵素
標識した抗体を反応させて、これを前記抗原に結合させ
た後、未反応の酵素標識抗体を洗浄除去し、この後、固
相担体上に結合された標識酵素の量から測定すべき前記
被検物質としての抗原の量を求める。上記標識酵素量は
、例えば、酵素に対応する基質や、或いは基質と発色剤
とを反応させ、反応生成物の生成に基づく液相の色変化
を肉眼にて測定して抗原を検出し、或いは光学的に測定
する。

上述したように、酵素免疫測定法においては、水不溶性
固相担体の表面に抗体や抗原のような免疫活性物質を固
定する操作を含み、既に、限られた測定対象については
、適宜の担体に固相化してなる抗体や抗原も測定装置乃
至キットのなかの試薬として市販されている。

ここに、担体への抗原や抗体の固定化量は、抗原抗体反
応の量に影響を及ぼし、延いては、測定感度に大きい影
響を及し、他方、抗原抗体反応によらない酵素標識した
抗原や抗体の担体への吸着は、非特異反応を招き、測定
感度を低下させる。

従来、抗原や抗体を担体に固定するには、物理的吸着法
が多用されており、従って、かかる方法においては、抗
体や抗原の固定化量は、担体の材質によってほぼ決定さ
れることが多く、かくして、固定化量を任意に増減、特
に、増加することは困難である。

更に、このように、物理的吸着法による固相化抗原や抗
体を測定に用いるときは、例えば、かかる固相化抗原や
抗体自体に酵素標識した抗原や抗体も吸着しやすく、そ
の結果、非特異反応が起こりやすく、免疫学的測定の精
度を著しく低下させ、場合によっては、不可能とする。

このような非特異反応を低減させるために、担体に免疫
活性物質を担体に固定化した後、動物血清やアルブミン
等のタンパク質にて担体を後処理する方法も提案されて
いる。しかし、かかる後処理は、所要の抗原抗体反応量
を低減させ、測定の感度を損なうこととなる。また、固
相化抗体や抗原の調製において、それらの固定化量にば
らつきを生じることが多い。

そのために、抗体や抗原を担体に共有結合にて固定化す
る方法も知られている。例えば、ガラスの表面をシラン
カップリング剤によってアミン化して、これを担体とし
、これにジアルデヒドを架橋試薬とて用いて、抗体や抗
原を架橋して、ガラス表面に固定化する方法が知られて
おり、また、上記したガラスに代えて、ポリアミノスチ
レン樹脂成形物を用いることによっても、同様に、これ
に抗体や抗原を架橋によって固定化することができる。

これらの方法は、例えば、千畑一部ら著「実験と応用ア
フイニテイクロマトグラフイー」　（講談社１９７６年
発行）や、千畑一部著「固定化酵素」　（講談社１９７
５年発行）等に記載されている。

しかし、かかる方法によれば、担体表面に導入し得る官
能基の種類や密度が限られており、更に、官能基を導入
することによって、非特異反応が増大することがあり、
或いは免疫活性物質の固定化量にばらつきを生じやすい
。

他方、担体の比表面積を高めるために、担体として、多
孔質材料を用いる方法も、既に提案されている。例えば
、特開昭６１−１７３１６０号公報には、多孔質材料を
疎水性重合体にて被覆し、抗体や抗原をかかる多孔質材
料に吸着させる方法が記載されている。また、特公昭６
１−１６２８９号公報や特開昭６１−２９２０５９号公
報や特開昭６２−２２８１６７号公報には、多孔質材料
中に疎水性重合体からなる合成ラテックスを担持させる
方法が記載されている。

これらの方法によれば、いずれも、担体の高比表面積化
は図ることができるが、免疫学的測定において、非特異
反応が起こりやすいことや、抗体や抗原の固定化量を高
めることができない点は、先の方法と同じく、依然とし
て解決されていない。

更に、酵素の固定化の技術分野においては、酵素の固定
化の方法として、所謂包括法が知られている。この方法
によれば、通常、アクリルアミドのような重合性単量体
と酵素の混合物に架橋試薬を加え、アクリルアミドを重
合させると同時に、架橋試薬によって酵素をマトリック
スとしてのアクリルアミド重合体に架橋して、固定化す
るものである。しかし、このように、酵素の包括法にお
いては、酵素を架橋によって固定化するために、酵素活
性が低下し、目的とする酵素反応を効率よく行なわせる
ことができない。

また、上記包括法の変形として、硝酸セルロースやポリ
ビニルアルコールを有機溶剤に溶解させ、これに酵素を
加え、この溶液を乾燥させることによって、酵素固定化
膜を調製する方法も知られている。しかし、この方法に
よれば、・マトリックスである硝酸セルロースやポリビ
ニルアルコールが均質なフィルムを形成するので、重合
体の内部に包括された酵素は、所要の酵素反応に寄与し
ない。

シよ゛と　る 以上のように、抗体や抗原を水不溶性固相担体に固定化
する従来の方法によれば、物理的吸着法、共有結合法の
いずれによる場合でも、固定化量にばらつきを生じるこ
とが多く、更に、免疫学的測定において、非特異反応が
起こりやすく、安定して高感度の免疫学的測定を行なう
ことができない。

本発明は、水不溶性固相担体への抗体や抗原の固定化に
おける上記したような従来の問題を解決するためになさ
れたものであって、抗体や抗原を容易に高密度に、且つ
、ばらつきなく、水不溶性固相担体に固定化する方法を
提供することを目的とする。

量　を”ンするための 本発明による生理活性物質の固相化方法は、生理活性物
質及び親水性重合体を含む水溶液を乾燥させて、上記重
合体を固化させることを特徴とする。

また、本発明によれば、生理活性物質及び親水性重合体
を含む水溶液を上記重合体を凝固させる凝固溶剤に接触
させて、上記重合体を固化させた後、乾燥させてもよい
。

特に、本発明の方法においては、生理活性物質及び親水
性重合体を含む水溶液を水不溶性支持体に塗布し、又は
含浸し、次いで、乾燥させて、上記重合体を上記支持体
上で固化させるのが好ましい。

更に、本発明の方法によれば、生理活性物質及び親水性
重合体を含む水溶液を水不溶性支持体に塗布し、又は含
浸し、次いで、上記重合体を凝固させる溶剤に接触させ
て、上記重合体を上記支持体上で凝固させた後、乾燥さ
せることによっても、生理活性物質を固相化することが
できる。

本発明において、生理活性物質とは、生体由来の反応性
をもつタンパク質であって、代表的には、抗体や抗原等
の免疫活性物質をいう。

また、本発明においては、上記親水性重合体としては、
親水性セルロース誘導体や酢酸ビニル重合体ケン化物、
即ち、ポリビニルアルコールのほか、ポリエチレングリ
コール、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、アガロース
、エチレン−酢酸ビニル共重合体、水溶性ポリアミド等
を挙げることができる。上記親水性セルロース誘導体と
しては、具体例としては、例えば、メチルセルロース、
エチルセルロース等の低級アルキルセルロース、ヒドロ
キシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、
ヒトロギシプロピルセルロース等のヒドロキシ低級アル
キルセルロース、又はこれらの混合物を挙げることがで
きる。

上記したなかでは、後述する凝固溶剤によって容易に凝
固し、固化し、しかも、マトリックス内に免疫活性物質
をそれとの親和性が強いために、強固に保持し得ると共
に、免疫学的測定において非特異反応が少なく、高感度
の免疫学的測定を可能とする親水性セルロース及びポリ
ビニルアルコールが特に好ましく用いられる。

本発明の方法によれば、前記した免疫活性物質と親水性
重合体を含む溶液（以下、単に重合体溶液ということが
ある。）を直接にシートやフィルム状、又は粒状に成形
し、凝固固化させてもよいが、好ましくは、水不溶性支
持体を基材とし、この基材上で重合体を凝固、固化させ
て、固相化免疫活性物質とするのが、その免疫学的測定
における使用上、有利である。

このような水不溶性支持体としては、ガラス、合成樹脂
等からなるシート、フィルム、粒状物等、任意形状のも
のが用いられるが、特に、比表面積が大きい親水性多孔
質材料が好ましく用いられる。

かかる親水性多孔質材料からなる水不溶性支持体として
は、例えば、ガラス繊維からなる濾紙、即ち、ガラスフ
ィルターを挙げることができる。また、このような親水
性多孔質材料からなる水不溶性支持体を用いるときは、
免疫活性物質及び親水性重合体を含む溶液を多孔質材料
に塗布し、又は含浸させ、通常、室温にて乾燥させれば
よい。また、免疫活性物質及び親水性重合体を含む溶液
を多孔質材料に塗布し、又は含浸させた後、凝固溶剤に
浸漬して、重合体を凝固固化させ、乾燥させてもよい。

生理活性物質と親水性重合体を含む重合体溶液において
、親水性重合体の濃度は、用いる親水性重合体の性質、
特に、水溶性や、或いは溶液における粘度のほか、用い
る抗体や抗原の濃度によって、適宜に選択されるが、通
常、０．０１〜２０重量％、好ましくは、０．１〜１０
重量％の範囲である。上記重合体溶液における親水性重
合体の濃度が余りに小さいときは、免疫活性物質の固定
化量を高めることが困難であり、他方、親水性重合体の
濃度が余りに大きいときは、親水性重合体の親水性が低
下する。この理由は明らかではないが、親水性重合体の
間の水素結合が強固になりすぎるためであるとみられる
。

固相化するに用いる抗体や抗原等の免疫活性物質の重合
体溶液における濃度は、それらの反応性や、或いは用い
る親水性重合体の親水性等によって適宜に選択されるが
、通常、親水性重合体１００重量部に対して、１〜１０
０重量部の範囲が好適である。免疫活性物質の濃度が余
りに小さいときは、得られる固相化免疫活性物質の活性
が低（、反対に余りに高くしても、免疫活性物質の固相
化量に限界があるので、経済上、操作上、不利である。

本発明の方法においては、重合体溶液は、シリカ粉末、
ガラス粉末、活性炭粉末等の添加剤を含有していてもよ
い。特に、「アエロジル」　（登録商標）として知られ
ているシリカ微粉末が好適に用いられる。

特に、上記シリカ微粉末は、表面に親水性シラノール基
を有して、溶液を増粘させるチキソトロピー性を有し、
得られる固相化免疫活性物質は高活性を示す。かかる固
相化免疫活性物質の高活性化の理由は必ずしも明らかで
はないが、シリカ微粉末の表面に親水性重合体をマトリ
ックスとして、免疫活性物質が固相化され、抗原抗体反
応の有効表面積の増加をもたらすのであろう。例えば、
前述したように、固相担体上に結合された標識酵素の量
を酵素に基質と発色剤とを反応させたとき、反応生成物
の生成に基づく液相の色変化が一層明瞭であり、測定を
容易ならしめる。

このような添加剤の配合量は、用いる添加剤にもよるが
、通常、親水性重合体１００重量部について、０．１〜
１００重量部の範囲である。前記したシリカ微粉末の場
合は、通常、親水性重合体１００重量部について、０．
１〜１０重量部の範囲が好適である。

本発明の方法によれば、上記したような親水性重合体と
生理活性物質とを含む重合体溶液を、好ましくは、前述
したような水不溶性支持体に塗布し、又は含浸させた後
、上記親水重合体を凝固させる凝固溶剤に接触させ、上
記親水性重合体凝固させ、固体化させ、次いで、乾燥さ
せることによって、生理活性物質をかかる重合体のマト
リックス内に固定化することができる。

上記凝固溶剤としては、用いる親水性重合体を溶解させ
ず、且つ、水混和性を有する有機溶剤を用いることがで
きるが、特に、固相化する免疫活性物質の活性を低下さ
せず、且つ、低沸点であって、例えば、水不溶性担体に
塗布し、又は含浸させた後の乾燥除去が容易であること
、更に、親水性重合体を容易に凝固させる観点から、メ
タノール、エタノール、プロパツール等の脂肪族低級ア
ルコール、アセトン、エーテル又はこれらの混合物が好
ましく用いられる。

重合体溶液を塗布し、又は含浸させた支持体をかかる凝
固溶剤に浸漬して、重合体を凝固させるに際しては、重
合体中の水を凝固溶剤にて置換するに十分な時間、浸漬
することが必要である。この浸漬操作及び浸漬後の乾燥
に際しては、必要に応じて、加熱してもよいが、免疫活
性物質の失活を招かない温度範囲とすべきである。通常
、浸漬操作及び浸漬後の乾燥は、２〜３０℃の範囲にて
、数分から数十時間、行なうのが好適である。

また、別の凝固溶剤として、無機塩の水溶液を用いるこ
ともできる。無機塩としては、塩化ナトリウム、塩化カ
ルシウム等のアルカリ金属の塩化物や、硫酸アンモニウ
ム、硫酸ナトリウム等の硫酸塩が好適に用いられる。こ
れらの水溶液は、免疫活性物質の活性を損なわないよう
に、ｐ）１５〜９の範囲であることが望ましい。凝固溶
剤における無機塩の濃度は、用いる親水性重合体や、溶
液におけるその濃度、凝固性等によって適宜に選択され
る。

凝固溶剤として、無機塩の水溶液を用いる場合も、重合
体を凝固させるために、十分な時間にわたって、重合体
溶液を凝固溶剤と接触させることが必要である。従って
、浸漬操作及び浸漬後の乾燥に際しては、必要に応じて
、加熱してもよいが、免疫活性物質の失活を招かない温
度範囲とすべきであって、通常、浸漬操作及び浸漬後の
乾燥は、２〜３０°Ｃの範囲にて、数分から数十時間、
行なうのが好適である。

更に、本発明の方法においては、用いる親水性重合体に
よっては、必要に応じて、凝固溶剤は、適宜の界面活性
剤を含有していてよい。特に、親水性重合体として、ポ
リビニルアルコールを用いるとき、かかる界面活性剤の
使用は有利である。

しかし、本発明の方法においては、凝固溶剤は、架橋試
薬を含有しない。前述したように、本発明の方法によれ
ば、親水性重合体のマトリックス中に免疫活性物質を包
含させ、固相化するので、架橋試薬は、これを用いる必
要がないのみならず、却って、免疫活性物質の活性を低
下させるので、有害である。

又里■力来 以上のように、本発明の方法によれば、抗体や抗原等の
免疫活性物質と親水性重合体を含む溶液を乾燥させ、又
は凝固溶剤に接触させて、免疫活性物質を重合体のマト
リックス内に固相化するので、固相化免疫活性物質の量
を任意に調整することができ、特に、免疫活性物質を高
密度に、また、多量に親水性重合体のマトリックス内に
固相化することができる。従って、本発明による固相化
免疫活性物質を用いることによって、免疫学的測定にお
いて、所要の抗原抗体反応の起こる確率を高めることが
でき、高感度の測定を行なうことができる。

また、本発明の方法によれば、固相化免疫活性物質を数
少ない操作にて簡単に、しかも、短時間にて調製できる
。

更に、本発明の方法によれば、固定化量にばらつきが生
じず、しかも、免疫学的測定に際しては、得られる固相
化免疫活性物質には、望ましくない免疫活性物質の物理
的吸着が少なく、また、かかる望ましくない免疫活性物
質の物理的吸着があっても、それら免疫活性物質を洗浄
によって容易に除去することができる。かくして、本発
明の方法による固相化免疫活性物質を用いる免疫学的測
定においては、非特異反応が少なく、高い測定感度を得
ることができる。

また、本発明の方法に従って、免疫活性物質と親水性重
合体を含む水溶液にシリカ微粉末のような添加剤を配合
することによって、−層、高感度の固相化免疫活性物質
を得ることができる。

夫旌■ 以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこ
れら実施例により何ら限定されるものではない。

実施例１ （ヒドロキシプロピルメチルセルロースによる抗α−Ｆ
ｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ抗体の固相化）抗ｒｘ−Ｆｅｔｏ
ｐｒｏｔｅｉｎ抗体（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ社製、ウサギ
ＩｇＧ分画）を０，１Ｍリン酸緩衝液（ｐ）１７．４　
）にて希釈し、ヒドロキシプロピルメチルセルロース３
重量％の存在下に最終濃度１ｍｇ／ｍｌの水溶液に調整
した。

この水溶液を室温下、十分に混合し、ＥＩＡ用マイクロ
プレート（９６穴）の各ウェルに１００■ずつ分注した
後、直ちに、エタノール中にマイクロプレートごと静か
に浸漬した。室温で３時間静置した後、エタノール中か
らマイクロプレートを取り出し、室温にてエタノールを
蒸発させて、抗α−Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ抗体マイク
ロプレートを得た。

実施例２ （ポリビニルアルコールによる抗α−Ｆｅｔｏｐｒｏｔ
ｅｉｎ抗体の固相化） 」二足と同し抗α−Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ抗体を０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ＋７．４　）にて希釈し、ポリ
ビニルアルコール（ケン化度９９モル％以上、粘度２５
ＣＩ）Ｓ）３重量％の存在下に最終濃度１ｍｇ／ｍｌの
水溶液に調整した。

この水溶液を実施例１と同様に処理して、抗αＦｅｔｏ
ｐｒｏｔｅｉｎ抗体マイクロプレートを得た。

実施例３ （ポリビニルアルコールによる抗α−Ｆｅｔｏｐｒｏｔ
ｅｉｎ抗体の固相化） 上記と同じ抗ｒｘ−Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ抗体を０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）にて希釈し、ポリビニ
ルアルコール（ケン化度９９モル％以上、粘度２８ｃｐ
ｓ）３重量％の存在下に最終濃度１ｍｇ／ｍｌの水溶液
に８周整した。

この水溶液を実施例１と同様に処理して、抗αＦｅｔｏ
ｐｒｏｔｅｉｎ抗体マイクロプレートを得た。

比較例１ （物理的吸着法による抗α−Ｐｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ抗
体の固相化） 実施例１と同じ抗ａｔ−Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ抗体を
０．１Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，４）にて希釈し、
最終濃度１ｍｇ／ｍｌの水溶液に調整した。

この水溶液を室温下、十分に混合し、ＥＩＡ用マイクロ
プレート（９６穴）の各ウェルに１００μβずつ分注し
た。４　’Ｃの温度にて一晩静置した後、上記と同じ緩
衝液にて３回洗浄し、次いで、１％ＢＳＡ溶液（同緩衝
液）を各ウェルに２００μｉずつ分注し、３７°Ｃで５
時間静置した。この後、更に、上記と同じリン酸緩衝液
で３回洗浄した後、０．１％ＢＳＡ溶液（同緩衝液）に
浸漬して、物理的吸着法による抗α−Ｆｅｔｏｐｒｏｔ
ｅｉｎ抗体マイクロプレートを得た。

比較例２ 比較例１において、１％ＢＳＡ溶液による後処理をしな
い以外は、比較例１と同様にして、物理的吸着法による
抗α−Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ抗体マイクロプレートを
得た。

尚、上記実施例１〜３及び比較例１による固相の製造に
ついて、免疫活性物質の固相化量の日内再現性（同時測
定における定量値のばらつきの検定）及び日差再現性（
測定日が異なる場合の定量値のばらつきの検定）をそれ
ぞれ第１表及び第２表に示す。

実施例４ （ヒドロキシプロピルメチルセルロースによる抗ｃｘ−
Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ抗体の固相化）実施例１と同じ
抗ｃｘ−Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ抗体を０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，４）にて希釈し、ヒドロキシプロピル
メチルセルロース５重量％の存在下に最終濃度５■／ｍ
ｌの水溶液に調整した。

この水溶液を室温下、十分に混合し、ガラスフィルター
（２５胴径）の中心部に５０ｍｇずつ滴下した後、直ち
に、アセトン中にガラスフィルターを静かに浸漬した。

室温で３時間静置した後、アセトン中からガラスフィル
ターを取り出し、室温にてアセトンを蒸発させて、抗α
−Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ抗体フィルターを得た。

実施例５ （ポリビニルアルコールによる抗α−Ｆｅｔｏｐｒｏｔ
ｅｉｎ抗体の固相化） 上記と同じ抗α−Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ抗体を０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）にて希釈し、ポリビニル
アルコール（ケン化度９９モル％以上、粘度２８ｃｐｓ
）５重量％の存在下に最終濃度５ｍｇ／ｍｌの水溶液に
調整した。

この水溶液を実施例４と同様に処理して、抗αＦｅｔｏ
ｐｒｏｔｅｉｎ抗体フィルターを得た。

実施例６ （ポリビニルアルコールによる抗α−Ｆｅｔｏｐｒｏｔ
ｅｉｎ抗体の固相化） 実施例１と同じ抗α−Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ抗体を０
．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）にて希釈し、ポリビ
ニルアルコール（ケン化度８８モル％以上、粘度３０　
ｃｐｓ）　５重量％の存在下に最終濃度５■／　ｍ　ｌ
の水溶液に調整した。

この水溶液を室温下、十分に混合し、ガラスフィルター
（２５ｍｍ径）の中心部に５０ｍｇずつ滴下した後、直
ちに、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート１
重量％を含むアセトン中にガラスフィルターを静かに浸
漬した。室温で３時間静置した後、アセトン中からガラ
スフィルターを取り出し、室温にてアセトンを蒸発させ
て、抗αＦｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ抗体フィルターを得た
。

実施例７ （測定） 上記実施例１〜３及び比較例１及び２で得た固相化抗α
−Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ抗体を用いて、以下の方法に
てα−Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎの測定操作を行なった。

ａ−Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ標準品を０．１％ＢＳＡと
０．９％塩化ナトリウムを加えた０、１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）にて希釈して、それぞれ所要の抗原濃度
に調整した。

実施例１〜３、及びアスピレータにて予め緩衝液を除い
た比較例１及び２にて得た固相の各ウェルに上記α−Ｆ
ｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ溶液を１００ｕｆずつ加え、室温
にて１時間静置した。

抗ｃｘ−Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ抗体（Ｄａｋｏｐａｔ
ｔｓ社製）を過ヨウ素酸法にてパーオキシダーゼ標識し
、所定濃度に希釈して、パーオキシダーゼ標識抗αＦｅ
ｔｏｐｒｏｔｅｉｎ抗体溶液を調製した。

上記各ウェルにパーオキシダーゼ標識抗αＦｅｔｏｐｒ
ｏｔｅｉｎ抗体溶液１００μｊｌ！を加え、室温にて１
時間静置した。上記と同し緩衝液にて再度、各ウェルを
洗浄した後、酵素基質発色液（０，０６％過酸化水素と
０．０４％０−フェニレンジアミンを０．１Ｍリン酸−
クエン酸緩衝液（ｐＨ６，０）に加えて調製した。）を
加え、遮光下、室温にて３０分間静置した後、２Ｎ硫酸
溶液を１００μ！加えて、反応を停止させ、４９２ｎｍ
にて吸光度を測定した。

結果を第１図及び第２図に示すように、本発明にて得た
固相化抗α−Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ抗体を用いること
によって、短時間での測定にもかかわらず、高感度の定
性反応を得ることができる。

実施例８ （測定） 前記実施例４〜６で得た固相化抗α−ｐｅｔｏｐｒ。

ｔｅｉｎ抗体を用いて、以下の方法にて測定操作を行な
った。

ａ　−Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ標準品を０．１％ＢＳＡ
と０．９％塩化ナトリウムを加えた０、　１　Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，０）にて各抗原濃度に調整した。

固相をフィルターホルダーに固定し、これに上記ａ−Ｆ
ｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ溶液を１００μｊ２ずつ通過させ
た後、直ちに、前記と同じパーオキシダーゼ標識抗α−
Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ抗体溶液１００μｆｆｉを通過
させた。

次いで、上記と同じ緩衝液にて固相を洗浄した後、酵素
基質発色液（０，０６％過酸化水素と０．０４％ジアミ
ノベンチジンを０．１Ｍリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ
６，０）に加えて調製した。）を加え、室温にて２分間
静置した後、直ちに、発色を観察した。

結果を第３表に示すように、本発明にて得た固相化抗α
−Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ抗体を用いることによって、
短時間での測定にもかかわらず、高感度の定性反応を得
ることができる。

第３表 （注）発色なしは、酵素基質発色液の自然発色を差し引
いたものである。

実施例９ （ヒドロキシプロピルメチルセルロースによる抗ｈｃｃ
抗体の固相化） 抗ｈｃｃ抗体（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ社製、ウサギＩｇＧ
分画）を蒸留水にて希釈し、ヒドロキシプロピルメチル
セルロース５重量％の存在下に最終濃度５ｍｇ／ｍｌの
水溶液に調整した。

この水溶液を室温下、十分に混合し、ガラスフィルター
（２５ｍｍ径）の中心部に５０ｍｇ滴下した後、直ちに
、３８％硫酸アンモニウム水溶液に静かに浸漬した。室
温で３時間静置した後、硫酸アンモニウム水溶液からガ
ラスフィルターを取出し、３０°Ｃにて５時間乾燥させ
て、抗ｈＣＧ抗体固相化フィルターを得た。

実施例１０ （ポリビニルアルコールによる抗ｈＣＧ抗体の固相化） 実施例９と同じ抗ｈＣＧ抗体を蒸留水にて希釈し、ポリ
ビニルアルコール（ケン化度９９モル％、粘度２８ｃｐ
ｓ）５重量％の存在下に最終濃度５■／ｍｌの水溶液に
調整した。

この水溶液を室温下、十分に混合し、ガラスフィルター
（２５ｍｍ径）の中心部に５０ｍｇ滴下した後、直ちに
、４０％硫酸ナトリウム水溶液に静かに浸漬した。室温
で３時間静置した後、硫酸アンモニウム水溶液からガラ
スフィルターを取出し、３０°Ｃにて５時間乾燥させて
、抗ｈＣＧ抗体固相化フィルターを得た。

比較例３ （物理的吸着法による抗ｈＣＧ抗体の固相化）実施例９
と同じ抗ｈＣＧ抗体を蒸留水にて希釈し、最終濃度５■
／ｍｌの水溶液に調整した。

この水溶液をガラスフィルター（２５ｍｍ径）の中心部
に５０μ！滴下し、室温にて３時間乾燥させた後、０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）にて洗浄し、次いで、
１％ＢＳＡ溶液（同緩衝液）に浸漬し、４℃で一晩静置
した。この後、再度、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，
４）にて洗浄した後、乾燥させて、抗ｈＣＧ抗体固相化
フィルターを得た。

比較例４ 比較例３において、抗ｈＣＧ抗体をガラスフィルターに
固相化後、１％ＢＳＡ溶液による後処理をしない以外は
、比較例３と同じ操作を行なって、抗ｈＣＧ抗体固相化
フィルターを得た。

実施例１１ （測定） 上記実施例９及び１０、及び比較例３及び４で得た固相
抗ｈＣＧ抗体を用いて、以下の方法にてｈＣＧの測定操
作を行なった。

ｈｃｃ標準品（Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔ社製）を０．１％
ＢＳＡと０．９％塩化ナトリウムを加えた０、１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）にて希釈して、所要の各抗原濃
度に調整した。

上記それぞれの固相に上記ｈＣＧ溶液を１００μβずつ
通過させた後、直ちにパーオキシダーゼ標識抗ｈＣＧ抗
体溶液（抗ｈＣＧ抗体（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ社製）を過
ヨウ素酸法にてパーオキシダーゼ標識し、所定濃度に希
釈して、調製した。）１００μ！を更に通過させた。

上記と同じ緩衝液にて固相を洗浄した後、酵素基質発色
液（０，０６％過酸化水素と０．０４％ジアミノベンチ
ジンを０．１　Ｍリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ６，０
）に加えて調製した。）を加え、室温にて２分間静置し
た後、発色を観察した。

結果を第４表に示すように、比較例４による固相化抗体
を用いる免疫学的測定においては、非特異反応が強く、
陰性での発色が観察される。比較例３による固相化抗体
を用いるときは、測定感度が低い。これに対して、本発
明にて得た固相化抗抗体を用いるときは、非特異反応が
なく、高感度の定性反応を得ることができる。

実施例１２ （ヒドロキシプロピルメチルセルロースによる抗ｈｃｃ
抗体の固相化） 抗ｈｃｃ抗体（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ社製、ウサギＩｇＧ
分画）を０．１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）にて希
釈し、ヒドロキシプロピルメチルセルロース５重量％の
存在下に最終濃度５ｍｇ／ｍｌの水溶液に調整した。

更に、この水）容液にシリカ微粉末（「アエロジル」ｌ
商１）をヒドロキシプロピルメチルセルロースに対して
１重量％加えた。

この水溶液を室温下、十分に混合し、ガラスフィルター
（２５ｍｍ径）の中心部に５０ｍｇ滴下した後、室温で
静置し、乾燥させて、抗ｈｃｃ抗体固相化フィルターを
得た。

比較例５ 実施例１２において、重合体溶液にシリカ微粉末を加え
ない以外は、実施例１２と同様にして、抗ｈｃｃ抗体固
相化フィルターを得た。

実施例１３ （ポリビニルアルコールによる抗ｈＣＧ抗体の面相化） 実施例１２と同じ抗ｈＣＧ抗体を０．１　Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７，４）にて希釈し、ポリビニルアルコール（
ケン化度８８モル％、粘度３０　ｃｐｓ）　５重量％の
存在下に最終濃度５ｍｇ／ｍｌの水溶液に調整した。更
に、この水溶液にシリカ微粉末（「アエロジル」登録商
標）をヒドロキシプロピルメチルセルロースに対して１
重量％ｊｌｌｌえた。

この水溶液を室温下、十分に混合し、ガラスフィルター
（２５ｍｍ径）の中心部に５０■滴下した後、室温で静
置し、乾燥させて、抗ｈＣＧ抗体固相化フィルターを得
た。

比較例６ 実施例１３において、重合体溶液にシリカ微粉末を加え
ない以外は、実施例１３と同様にして、抗ｈＣＧ抗体固
相化フィルターを得た。

実施例１４ （ヒドロキシプロピルメチルセルロースによる抗ｈｃｃ
抗体の固相化） 実施例１２と同じ抗ｈＣＧ抗体を０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７，４）にて希釈し、ヒドロキシプロピルメチル
セルロース５重量％の存在下に最Ｉ８濃度５ｍｇ／ｍｌ
の水溶液に調整した。更に、この水溶液にシリカ微粉末
（「アエロジルＪ登録商標）をヒドロキシプロピルメチ
ルセルロースに対して１重量％加えた。

この水溶液を室温下、十分に混合し、ガラスフィルター
（２５ｍｍ径）の中心部に５０ｍｇ滴下した後、直ちに
、エタノールに浸漬し、室温で３時間静置した。次いで
、エタノールからガラスフィルターを取出し、乾燥させ
て、抗ｈｃｃ抗体固相化フィルターを得た。

比較例７ 実施例１４において、重合体溶液にシリカ微粉末を加え
ない以外は、実施例１４と同様にして、抗ｈＣＧ抗体固
相化フィルターを得た。

実施例１５ （ポリビニルアルコールによる抗ｈＣＧ抗体の固相化） 実施例１と同じ抗ｈｃｃ抗体を０６１Ｍリン酸緩衝液（
、ｐＨ７，４）にて希釈し、ポリビニルアルコール（ケ
ン化度８８モル％、粘度３０ｃｐｓ）５重量％の存在下
に最終濃度５ｍｇ／ｎ＋１の水溶液に調整した。

更に、この水溶液にシリカ微粉末（「アエロジルＪ登録
商標）をヒドロキシプロピルメチルセルロースに対して
１重量％加えた。

この水溶液を室温下、十分に混合し、ガラスフィルター
（２５ｍｍ径）の中心部に５０■滴下した後、直ちに、
エタノールに浸漬し、室温で３時間静置した。次いで、
エタノールからガラスフィルターを取出し、乾燥させて
、抗ｈＣＧ抗体固相化フィルターを得た。

比較例８ 実施例１５において、重合体溶液にシリカ微粉末を加え
ない以外は、実施例１５と同様にして、抗ｈｃｃ抗体固
相化フィルターを得た。

実施例１６ （ヒドロキシプロピルメチルセルロースによる抗ｈｃｃ
抗体の同相化） 実施例１２と同じ抗ｈＣＧ抗体を０．１　Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７，４）にて希釈し、ヒドロキシプロピルメチ
ルセルロース５重量％の存在下に最終濃度５ｍｇ／ｍｌ
の水溶液に調整した。更に、この水溶液にシリカ微粉末
（「アエロジル」登録商標）をヒドロキシプロピルメチ
ルセルロースに対して１重量％加えた。

この水溶液を室温下、十分に混合し、ガラスフィルター
（２５胴径）の中心部に５０ｍｇ滴下した後、直ちに、
３８％硫酸アンモニウム水溶液に浸漬し、室温で３時間
静置した。ガラスフィルターを硫酸アンモニウム水溶液
から取り出し、乾燥させて、抗ｈＣＧ抗体固相化フィル
ターを得た。

比較例９ 実施例１６において、重合体溶液にシリカ微粉末を加え
ない以外は、実施例１６と同様にして、抗ｈＣＧ抗体固
相化フィルターを得た。

実施例１７ （ポリビニルアルコールによる抗ｈＣＧ抗体の固相化） 実施例１２と同じ抗ｈｃｃ抗体を０．１　Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７，４＞にて希釈し、ポリビニルアルコール（
ケン化度８８モル％、粘度３０ｃｐｓ）５重量％の存在
下に最終濃度５ｍｇ／ｍｌの水溶液に調整した。更に、
この水溶液にシリカ微粉末（「アエロジル」登録商標）
をヒドロキシプロピルメチルセルロースに対して１重量
％加えた。

この水溶液を室温下、十分に混合し、ガラスフィルター
（２５ｍｍ径）の中心部に５０■滴下した後、直ちに、
３８％硫酸アンモニウム水溶液に浸漬し、室温で３時間
静置した。ガラスフィルターを硫酸アンモニウム水溶液
から取り出し、乾燥させて、抗ｈＣＧ抗体固相化フィル
ターを得た。

比較例１０ 実施例１７において、重合体溶液にシリカ微粉末を加え
ない以外は、実施例１７と同様にして、抗ｈＣＧ抗体固
相化フィルターを得た。

比較例１１ （物理的吸着法による抗ｈｃｃ抗体の固相化）実施例１
３と同じ抗ｈｃｃ抗体を０．１　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（
ｐＨ７，４）にて希釈し、最終濃度５ｍｇ／ｍｌの水溶
液に調整した。

この水溶液をガラスフィルター（２５ｍｍ径）の中心部
に５０μ！滴下し、室温にて３時間乾燥させた後、０．
１　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，４）にて洗浄し、次
いで、１％ＢＳＡ溶液（同緩衝液）に浸漬し、４°Ｃで
一晩静置した。この後、再度、０．１Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７，４）にて洗浄した後、乾燥させて、抗ｈＣＧ抗
体固相化フィルターを得た。

比較例１２ （物理的吸着法による抗ｈｃｃ抗体の固相化）比較例１
１において、抗ｈＣＧ抗体をガラスフィルターに固相化
後、１％ＢＳＡ溶液による後処理をしない以外は、比較
例１１と同じ操作を行なって、抗ｈＣＧ抗体固相化フィ
ルターを得た。

実施例１日 （測定） 上記実施例１２〜１７、及び比較例５〜１２で調製した
固相化抗ｈＣＧ抗体を用いて、以下の方法にてｈＣＧの
測定操作を行なった。

ｈｃｃ標準品（Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔ社製）を０．１％
ＢＳＡと０．９％塩化ナトリウムを加えた０、　１　Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）にて各抗原濃度に調整した
。

それぞれの固相に上記ｈＣＧ溶液を１００μｌずつ通過
させた後、直ちにパーオキシダーゼ標識抗ｈｃｃ抗体溶
液（抗ｈｃｃ抗体（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ社製）を過ヨウ
素酸法にてパーオキシダーゼ標識し、所定濃度に希釈し
て、調製した６）１００μ！を更に通過させた。

上記と同じ緩衝液にて固相を洗浄した後、酵素基質発色
液（０，０６％過酸化水素と０．０４％ジアミノベンチ
ジンを０．１Ｍリン酸−クエン酸緩衝液（ｐ）１６．０
）に加えて調製した。）を加え、室温にて２分間静置し
た後、発色を観察した。

結果を第５表に示すように、シリカ微粉末を重合体溶液
に配合して調製した固相化抗ｈｃｃ抗体色あり、を示す
。

を用いる免疫学的測定においては、シリカ微粉末を用い
ないで調製した固相化抗ｈＣＧ抗体を用いる場合に比べ
て、発色が強く、測定感度が高い。

他方、物理的吸着法による比較例の固相化抗体を用いる
測定においては、感度が低く、特に、ＢＳＡによる後処
理をしないときは、非特異反応が著しく、固相化抗体と
しての実用に耐えない。

【図面の簡単な説明】

第１図は及び第２図は、いずれも、本発明又は比較例に
よる固相化抗原を用いて抗原抗体反応を行なわせた後、
酵素標識抗体の基質との反応によって生じた発色を吸光
度測定したグラフを示す。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）生理活性物質及び親水性重合体を含む水溶液を乾
   燥させて、上記重合体を固化させることを特徴とする生
   理活性物質の固相化方法。
2. （２）生理活性物質及び親水性重合体を含む水溶液を上
   記重合体を凝固させる凝固溶剤に接触させて、上記重合
   体を固化させた後、乾燥させることを特徴とする生理活
   性物質の固相化方法。
3. （３）生理活性物質及び親水性重合体を含む水溶液を水
   不溶性支持体に塗布し、又は含浸し、次いで、乾燥させ
   て、上記重合体を上記支持体上で固化させることを特徴
   とする生理活性物質の固相化方法。
4. （４）生理活性物質及び親水性重合体を含む水溶液を水
   不溶性支持体に塗布し、又は含浸し、次いで、上記重合
   体を凝固させる溶剤に接触させて、上記重合体を上記支
   持体上で凝固させた後、乾燥させることを特徴とする生
   理活性物質の固相化方法。
5. （５）親水性重合体が親水性セルロース誘導体、酢酸ビ
   ニルケン化物及びエチレン−酢酸ビニル共重合体よりな
   る群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とす
   る請求項第１項乃至第４項いずれかに記載の生理活性物
   質の固相化方法。
6. （６）水不溶性支持体が多孔質体であることを特徴とす
   る請求項第３項又は第４項記載の生理活性物質の固相化
   方法。
7. （７）凝固溶剤が脂肪族低級アルコール、アセトン、エ
   ーテル又はこれらの混合物であることを特徴とする請求
   項第２項又は第４項記載の生理活性物質の固相化方法。
8. （８）凝固溶剤が無機塩の水溶液であることを特徴とす
   る請求項第２項又は第４項記載の生理活性物質の固相化
   方法。
9. （９）無機塩がアルカリ金属の塩化物又は硫酸塩である
   ことを特徴とする請求項第８項記載の生理活性物質の固
   相化方法。
10. （１０）生理活性物質及び親水性重合体を含む水溶液が
    更に無機粉末を含有することを特徴とする請求項第１項
    乃至第４項いずれかに記載の生理活性物質の固相化方法
    。
11. （１１）無機粉末がガラス粉末、シリカ粉末又は活性炭
    粉末であることを特徴とする請求項第１０項記載の生理
    活性物質の固相化方法。
12. （１２）生理活性物質が抗体又は抗原であることを特徴
    とする請求項第１項乃至第４項又は第１０項いずれかに
    記載の生理活性物質の固相化方法。