JPH0564744B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明は免疫学的診断試薬に関し、詳しくは、
免疫活性物質を固定化した水分散型高分子重合体
粒子の水性分散液からなり、ラテツクス凝集反応
において非特異的凝集反応がなく、且つ、凝集反
応の判定が容易であると共に、保存安定性にすぐ
れる免疫学的診断試薬に関する。 （従来の技術） 近年、人間や動物の病理的状態或いはその他の
状態の医学的診断のために、血液、尿その他の体
液中の生理活性物質が有する免疫活性を利用する
免疫学的診断方法が広く用いられている。この方
法は、免疫学的な反応を起こす抗原又は抗体のい
ずれか一方、又は両者を組合せて体液等の被検液
と反応させ、抗原又は抗体と、これらに対応する
抗体又は抗原との間の特異的な反応、即ち、抗原
抗体反応に基づく凝集反応又は凝集阻止反応によ
つて、上記のような免疫活性成分の存在を測定す
る方法である。この場合、肉眼による観察を容易
にするために、一般に、抗原又は抗体は微粒子状
の担体、例えば、ラテツクス、赤血球等に担持さ
れて診断試薬とされ、このような粒子の凝集反応
を利用して、血清等の体液中の被検成分が測定さ
れる。 例えば、微粒子がラテツクスからなる診断試薬
の凝集反応について説明すると、抗原又は抗体を
担持させた微粒子を含有する水性分散液からなる
診断試薬を被検液と混合すると、上記抗原又は抗
体に対応する被検液中の抗体又は抗原は、微粒子
上の抗原又は抗体と特異的に反応し、ラテツクス
凝集反応、即ち、肉眼的に観察し得る微粒子の凝
集反応が生じる。しかし、被検液中に測定すべき
抗体又は抗原が存在しない場合は、肉眼的に観察
し得る凝集は起こらない。このようにして、抗原
又は抗体を担持させた微粒子の凝集反応の有無に
よつて、被検液中の抗体又は抗原の存在を決定す
ることができる。 このような免疫学的診断試薬は、免疫活性物
質、即ち、抗原又は抗体が微量にでも被検液中に
存在すれば、これを検出し得る高い感度と、目的
とする免疫活性物質とのみ反応する高い特異性を
有することが要求される。更に、長期間の保存に
よつても、高い検出感度及び特異性を保持するこ
とが要求される。 このような免疫学的診断試薬としては、従来、
ポリスチレンラテツクス粒子表面に抗原及び抗体
を物理吸着により固定化してなる診断試薬や、カ
ルボキシル化ラテツクス粒子にカルボジイミド、
ジアルデヒド等を用いて共有結合により固定化し
てなる診断試薬等が提案されている。しかし、従
来のかかる診断試薬は、いずれも、血清と反応さ
せたとき、対応する抗体又は抗原を含む陽性血清
のみならず、対応する抗体又は抗原を含まない陰
性血清に対しても凝集反応を起こすことがある。
このような凝集反応は非特異的凝集反応と呼ばれ
ており、しばしば診断を誤まらせることがある。
このような非特異的凝集反応が起こる理由は必ず
しも明らかではないが、一つには血清中に含まれ
る補体等の因子によるものと考えられる。 従つて、従来、ラテツクス粒子の非特異的凝集
を防ぐことを目的として、ラテツクス凝集反応の
有無の判定を行なう際に、血清をグリシン等の緩
衝液で希釈したり、或いは血清中の補体を失活さ
せる非働化処理を施すことが行なわれている。し
かし、このような処理によつては、非特異的凝集
を十分に抑制することは困難であり、また、手間
を要して、診断に時間がかかるという問題があ
る。 このような免疫学的診断試薬における問題を解
決するために、従来より、非特異的凝集反応を抑
制することを目的として、診断試薬に添加剤を添
加することが一般に行なわれており、かかる添加
剤として、例えば、グリコール類や、ゼラチン、
アルブミン等のタンパク質、或いはポリアニオン
等が知られている。しかし、これらの添加剤の効
果は一般に十分ではないので、近年、添加剤とし
て、例えば、シヨ糖及び塩化コリン（特開昭54−
026327号公報）、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミドやジ
低級アルキルスルホキシド（特開昭55−160853号
公報）等が提案されている。 更に、近年になつて、種々の無機塩類が非特異
的凝集を抑制する効果をもつ添加剤として提案さ
れている。例えば、特開昭56−158947号公報に
は、グアニジン、グアニジン塩酸塩、グアニジニ
ウムチオシアン酸塩、尿素等を代表例とするケイ
オトロピツク（chaotropic）剤と共に、似ケイオ
トロピツク剤として塩化リチウム、臭化リチウ
ム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、ヨウ化リチ
ウムのようなハロゲン化アルカリ金属や、塩化カ
ルシウムのようなハロゲン化金属が記載されてお
り、また、特開昭57−35754号公報にも同様にハ
ロゲン化アルカリ金属が記載されている。 しかし、ハロゲン化アルカリ金属は、一般に陰
性血清に対する非特異的凝集が顕著であり、ま
た、塩化カルシウムも陰性血清に対する非特異的
凝集が顕著であるのみならず、診断に際して、例
えば、陰性血清と混合して数分後の初期の凝集の
程度が疑陽性であるとき、時間の経過につれて非
特異的凝集が強くなり、凝集の程度が時間によつ
て変動するので、正確な診断を行なうことが不可
能である。更に、塩化カルシウムを添加剤として
含有する免疫学的診断試薬は。長期間にわたつて
保存するとき、診断試薬に沈殿を生じ、使用に際
しては診断試薬を十分に震盪して均一にする必要
がある等、保存性や使用性に劣る。このように、
従来、種々の無機塩が添加剤として提案されてい
るが、尚、非特異的凝集を抑制する効果が劣ると
共に、診断試薬が保存安定性に劣る問題がある。 （発明の目的） 本発明者らは、免疫学的診断試薬における上記
の問題を解決するために鋭意研究した結果、共有
結合により免疫活性物質を固定化した水分散型高
分子重合体粒子の水性分散液からなる免疫学的診
断試薬において、これに臭化カルシウムを共存さ
せることにより、前記無機塩類系の添加剤を含め
て、従来より知られている添加剤に比較して、非
特異的凝集を抑制する効果に格段にすぐれ、且
つ、凝集反応の有無が容易であると共に、保存安
定性にも格段にすぐれる免疫学的診断試薬を得る
ことができることを見出して、本発明に至つたも
のである。 従つて、本発明は、血清を希釈することなく、
しかも、非働化処理も行なわずに、非特異的凝集
反応が抑制され、且つ、凝集反応の有無の判定が
容易であると共に、保存安定性にすぐれた免疫学
的診断試薬を提供することを目的とする。 （発明の構成） 本発明による免疫学的診断試薬は、免疫活性物
質が共有結合にて固定化された水分散型高分子重
合体粒子の水性分散液からなる免疫学的診断試薬
において、上記水性分散液に臭化カルシウムが配
合されてなることを特徴とする。 本発明による免疫学的診断試薬において、免疫
活性物質を固定化するための担体である水分散型
高分子重合体粒子の平均粒径は、好ましくは0.03
〜2μｍ、特に好ましくは0.1〜1μｍである。平均
粒径が小さすぎると、免疫活性物質を固定化した
水分散型高分子重合体粒子の抗原抗体反応による
凝集を肉眼で観察することが困難であり、一方、
大きすぎるときは、重合体粒子に安定な分散状態
を保持させるのが困難となるからである。また、
重合体粒子の比重は、0.9〜1.5の範囲にあること
が好ましく、更に、後述するように、免疫活性物
質を固定化した後の比重が1.0〜1.3の範囲にある
ことが好ましい。重合体粒子が免疫活性物質の固
定化の前後に上記範囲よりも小さい比重を有する
ときは、重合体粒子がその水性分散液における水
性媒体表面に浮遊して、分散安定性に劣るように
なり、一方、上記範囲よりも大きいときは、粒子
が分散液の水性媒体中に沈降し、凝集しやすくな
つて、同様に分散安定性に劣るようになるからで
ある。 本発明において用いる水分散型高分子重合体粒
子は、後述するように、免疫活性物質が共有結合
にて結合するための官能基を有することが必要で
ある。また所謂スペーサ基を介して重合体粒子に
免疫活性物質を固定化する場合にも、重合体粒子
は官能基を有することが必要である。かかる官能
基としては、例えば、カルボキシル基、アミノ
基、水酸基、グリシジル基、ヒドラジド基等が好
ましい。従つて、例えば、カルボキシル基を有す
る水分散型高分子重合体粒子の水性分散液は、ア
クリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、クロトン
酸、マレイン酸、フマル酸、モノアルキルマレイ
ン酸、モノアルキルフマル酸、モノアルキルイタ
コン酸等の一塩基酸や多塩基酸等のようなカルボ
キシル基を有するビニル単量体を必要に応じてこ
れら単量体とラジカル共重合性を有するその他の
単量体と乳化共重合させることにより得ることが
できる。また、例えば、水酸基やグリシジル基を
有する水分散型高分子重合体粒子の水性分散液
は、、例えば、ヒドロキシエチルアクリレート、
２−ヒドロキシメチルメタクリレートのような水
酸基を有する単量体、又はグリシジルメタクリレ
ートのようなグリシジル基を有する単量体を必要
に応じて他のラジカル共重合性単量体と乳化共重
合させることによつて得ることができる。 上記したラジカル共重合性単量体としては、例
えば、エチレン、プロピレン等のα−オレフイン
系単量体、酢酸ビニル、塩化ビニル等のビニル系
単量体、スチレン、メチルスチレン、クロロスチ
レン等のスチレン系単量体、アクリル酸メチル等
のアクリル酸エステル系単量体、メタクリル酸メ
チル等のメタクリル酸エステル系単量体、ブタジ
エン、イソプレン等のジエン系単量体、アクリロ
ニトリル、メタクリロニトリル、アクリルアミ
ド、メタクリルアミド等の単量体を挙げることが
できる。 また、所要の単量体成分を重合させた後、得ら
れた水分散型高分子重合体粒子に官能基を導入す
ることもできる。このための方法としては、例え
ば、アクリル酸エステルを単量体成分として重合
させて得た重合体粒子を加水分解することによ
り、カルボキシル基を有する重合体粒子を得るこ
とができる。 また、アミノ基やヒドラジド基を有する水分散
型高分子重合体粒子を調製するには、例えば、ア
クリルアミドのようなアミド基を有する単量体、
又はアクリル酸メチルのようなメチルエステル基
を有する単量体をそれぞれ他の単量体と乳化共重
合し、得られた共重合体中のアミド基をホフマン
分解し、又はメチルエステル基をヒドラジンと反
応させることにより得ることができる。 更に、上記単量体と共に、単量体成分として多
官能性単量体を内部架橋剤として乳化共重合させ
て、架橋させた水分散型高分子重合体粒子を得る
こともできる。内部架橋剤は、重合体に架橋構造
を導入するので、診断試薬中に含まれれば好まし
くない水溶性重合体の生成を抑制すると共に、得
られる重合体粒子のガラス転移温度を高めること
ができる。更に、内部架橋剤は、水分散型高分子
重合体粒子を非膨潤化して、重合体粒子の水性媒
体中での分散安定性を高めるのに効果がある。 かかる内部架橋用多官能性単量体としては、例
えば、脂肪族多価アルコールのポリ（メタ）アク
リレートが好ましく用いられる。具体例として、
例えば、エチレングリコールジメタクリレート、
ジエチレングリコールジメタクリレート、トリエ
チレングリコールジメタクリレート、ジプロピレ
ングリコールジメタクリレート、１，３−ブチレ
ングリコールジメタクリレート、トリエチレング
リコールジアクリレート、トリメチロールプロパ
ントリメタクリレート、トリメチロールプロパン
トリアクリレート、テトラメチロールメタンテト
ラアクリレート等が好ましく用いられる。また、
ジビニルベンゼンやＮ，Ｎ−メチレンビスアクリ
ルアミド等も内部架橋剤として用いることができ
る。 尚、個々の単量体の具体的な種類は、得られる
水分散型高分子重合体粒子が免疫活性物質を固定
化した診断試薬として、保存時に融着、凝集を起
こさないように、所要のガラス転移点を有するよ
うに選ばれる。重合体粒子のガラス転移点は、診
断試薬の保存温度及び診断試薬の使用温度を考慮
して、好ましくは10℃以上、特に室温以上であ
る。 本発明による免疫学的診断試薬においては、免
疫活性物質は、水分散型高分子重合体粒子に共有
結合にてスペーサ基を介して固定化されているこ
とが好ましい。即ち、重合体粒子に共有結合によ
つてスペーサ基が結合され、このスペーサ基に共
有結合によつて免疫活性物質が固定化されている
のが好ましい。スペーサ基を介さずに、直接に免
疫活性物質を重合体粒子に固定化し、この水性分
散液に臭化カルシウムを添加するときは、免疫活
性物質によつては、その活性を殆ど失ない、陽性
血清に対しても凝集反応を示さない場合があるか
らである。 上記スペーサ基として用い得る化合物は、少な
くとも二官能性の有機化合物であり、多官能性の
重合体を排除するものではないが、特に、炭素数
１〜12の炭素鎖基を有する二官能性の有機化合物
が好ましい。このようなスペーサ基として機能す
る化合物の具体例として、例えば、ヘキサメチレ
ンジアミン、ドデカメチレンジアミン、キシリレ
ンジアミン等のジアミン類、グリシン、β−アミ
ノプロピオン酸、γ−アミノ酪酸、ε−アミノカ
プロン酸、ε−アミノカプリル酸等のアミノアル
キルカルボン酸、リジン、グルタミン酸、β−ア
ラニン、アルギニン、グリシルグリシルグリシン
等のアミノ酸類等が好ましく用いられるが、これ
らに限定されるものではない。このスペーサ基
は、予め重合体粒子に結合させ、この後にこのス
ペーサ基と免疫活性物質とを結合させてもよく、
或いはスペーサ基を予め免疫活性物質に結合さ
せ、これを重合体粒子に結合させてもよい。更
に、必要に応じて、重合体粒子及び免疫活性物質
の両方に予めスペーサ基を結合させ、これらを相
互に結合させることもできる。 但し、免疫活性物質を共有結合にて直接に固定
化した水分散型高分子重合体粒子の水性分散液に
所定濃度の臭化カルシウムを配合したとき、免疫
活性物質が所期の活性を有する場合には、水分散
型高分子重合体粒子に免疫活性物質を直接に固定
化してもよいのはいうまでもない。 前記した官能基を有する水分散型高分子重合体
粒子に直接に免疫活性物質を共有結合にて固定化
し、又は重合体粒子にスペーサ基を結合し、ま
た、このスペーサ基に免疫活性物質を共有結合に
て固定化するための方法は、特に制限されず、従
来より知られている任意の方法によることができ
る。例えば、好ましい方法の一つとして、架橋剤
として水溶性カルボジイミドを用いる方法を挙げ
ることができる。例えば、ジアミンをスペーサ基
として用いる場合であれば、水溶性カルボジイミ
ドの存在下に、ジアミンの有するアミノ基と水分
散型高分子重合体粒子の有するカルボキシル基と
を反応させ、アミド結合を形成させることによ
り、スペーサ基を重合体粒子に結合させ、次い
で、同様に水溶性カルボジイミドを用いてこのス
ペーサ基の有するアミノ基に免疫活性物質を共有
結合にて固定化することができる。 かかる方法において用いる水溶性カルボジイミ
ドとしては、例えば、１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、
１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチ
ル）カルボジイミド−メト−ｐ−トルエンスルホ
ネート等を挙げることができる。このような水溶
性カルボジイミドを用いて、スペーサ基を介し
て、又は介さずして直接に、共有結合によつて免
疫活性物質を重合体粒子に固定化するには、従来
より知られている通常の方法及び条件によること
ができる。例えば、スペーサ基を用いる場合であ
れば、重合体粒子の水性分散液にスペーサ基と共
に適宜量、例えば、水性分散液の単位容量当りに
0.01〜10mg／mlとなるように水溶性カルボジイミ
ドを添加し、通常の条件、例えばPHを４〜10に保
持して、５〜60℃程度の温度で数分乃至数十時
間、通常、１〜５時間程度反応させればよい。次
いで、このスペーサ基を結合させた重合体粒子に
同様にして免疫活性物質を固定化すればよい。 また、官能基が水酸基であるときは臭化シアン
法により、また、アミノ基であるときはジアルデ
ヒドと反応させ、これら官能基を活性化すること
によつて、スペーサ基を結合させ、次いで、上記
と同様にして免疫活性物質を重合体粒子に共有結
合にて固定化することができる。また、重合体粒
子に直接に免疫活性物質に固定化することもでき
る。 本発明において用いる免疫活性物質としては、
特に制限はなく、抗原、抗体及びハプテン等いず
れを用いてもよい。例えば、ヒト及び動物免疫グ
ロブリン、変性免疫グロブリン、α−フエトプロ
テイン、Ｃ反応性タンパク（CRP）や肝炎ウイ
ルス関連抗原、風疹HA抗原等の各種ウイルス抗
原、トキソプラズマ、マイコプラズマ、梅毒トレ
ポネーマ等の種々の細菌、真菌、毒素等の微生物
抗原、アルブミン、補体成分等の各種血漿タンパ
ク成分、エストロゲン、ヒト絨毛性ゴナドトロピ
ン（HCG）等の各種ホルモン等が挙げられ、ま
た、これらの抗原成分に対する抗体等も使用する
ことができる。 本発明による免疫学的診断試薬は、上記のよう
に固定した免疫活性物質の失活が起こらないよう
に、水分散型高分子重合体粒子が適当なPH及び濃
度のグリシン緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝
液等の緩衝液に分散されていると共に、この重合
体粒子の水性分散液に粒子の非特異的凝集を抑制
するための添加剤として臭化カルシウムが配合さ
れてなる。 臭化カルシウムは、免疫活性物質を固定化した
水分散型高分子重合体粒子の水性分散液におい
て、0.01〜1.5モル／、好ましくは0.1〜1.25モ
ル／の濃度で含有される。水性分散液における
臭化カルシウムの濃度が0.01モル／よりも少な
いときは、陰性血清に対する非特異的凝集の抑制
効果が乏しく、一方、濃度が1.5モル／を越え
るときは、却つて陽性血清に対する特異的凝集が
抑制されることとなるからである。 更に、本発明による免疫学的診断試薬におい
て、上記緩衝液の濃度は、通常、0.005〜0.2Mの
範囲が適当であり、好ましくは0.01〜0.1Mの範
囲である。また、緩衝液のPHは、水分散型高分子
重合体粒子の分散安定性及び抗原抗体反応の活性
を考慮して、通常、６〜９、好ましくは７〜8.5
の範囲である。また、診断試薬における重合体粒
子の濃度は、通常、0.01〜５重量％の範囲である
が、好ましくは0.1〜３重量％の範囲である。尚、
本発明による免疫学的診断試薬には、防腐効果を
与えるために、アジ化ナトリウム等の防腐剤を添
加してもよい。 本発明による免疫学的診断試薬は、臭化カルシ
ウムを緩衝液に溶解含有させ、PHを調整した後、
免疫活性物質を固定化した水分散型高分子重合体
粒子の水性分散液に添加混合し、必要に応じて更
にPHを調整することにより得ることができる。 本発明による免疫学的診断試薬を使用する免疫
学的診断は、例えば、診断試薬と被検液とをガラ
ス板又はプラスチツク板の窪み又は平面板上又は
マイクロプレートにおいて混合し、肉眼又は顕微
鏡観察によつて、重合体粒子の凝集の有無を判定
することにより行なわれる。また、凝集の有無を
光学的な変化として判定するこもできる。 （発明の効果） 以上のように、本発明の免疫学的診断試薬は、
免疫活性物質を固定化した水分散型高分子重合体
粒子の水性分散液からなると共に、臭化カルシウ
ムを含有し、この結果、その理由は必ずしも明ら
かではないが、重合体粒子の非特異的凝集が完全
に阻止されるので、診断に際して、血清を緩衝液
で希釈したり、或いは非働化処理しなくとも、迅
速に正確な判定を行なうことができる。更に、本
発明による診断試薬は、例えば、ガラス板上で血
清と均一に混じりやすく、また流動性にすぐれる
ので、凝集の有無判定が容易で且つ正確ある。ま
た、診断試薬が臭化カルシウムを含むために、そ
の比重が大きくなつて、粒子の比重に近くなるた
めとみられるが、従来の診断試薬に比較して、長
期間にわたつて何らの沈殿を生じることなく、重
合体粒子の均一分散性が保持され、その保存安定
性に著しくすぐれる。 また、免疫活性物質の担体として用いる水分散
型高分子重合体粒子は、粒径を含む品質が均一で
あるうえに、それ自体は免疫活性をもたないの
で、固定化操作が容易であると共に、固定化粒子
は高い検出感度と高い特異的とを有し、かくし
て、高精度での診断を可能とする診断試薬を与え
る。 （実施例） 以下に本発明の実施例を示し、具体的に説明す
るが、本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない。尚、以下においては、重合体粒子に免疫
活性物質を固定化した後、必要に応じて濾紙（No.
５）にて濾過し、得られた分散液に添加剤を添加
して、診断試薬とした。 実施例 １ (a) 水分散型合成高分子重合体粒子の調製 メタクリル酸メチル8.0ｇ、メタクリル酸イソ
ブチル5.0ｇ、アクリル酸1.0ｇ、メタクリロニト
リル3.0ｇ及びトリエチレングリコールジメタク
リレート0.7ｇを蒸留水370ｇに加え、更に蒸留水
10ｇに過硫酸カリウム0.1ｇを溶解させた重合開
始剤水溶液を加えた後、窒素気流下、75℃の温度
で攪拌速度190rpmで攪拌しつつ、８時間重合を
行なつた。重合率99％にて平均粒径0.30μｍの水
分散型高分子重合体粒子を含む水性分散液を得
た。 この重合体粒子の水性分散液を最初、蒸留水に
て４回遠心洗浄し、次いで、0.01Mホウ酸緩衝液
（PH7.5）にて２回遠心洗浄して、水相中の水溶性
高分子を除去し、重合体粒子を精製した後、この
重合体粒子を0.01Mホウ酸緩衝液（PH7.5）に固
形分が５重量％となるように再分散させた。 (b) 重合体粒子へのスペーサ基の結合 上で得た水分散型高分子重合体粒子の水性分散
液100mlとε−アミノカプロン酸水溶液（0.02M）
100mlとを混合し、1N水酸化ナトリウム水溶液に
てPH7.5に調製した。0.01Mホウ酸緩衝液（PH7.5）
に溶解させた１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩水溶液（25
mg／ml）20mlを上記水性分散液に加え、室温で３
時間、攪拌下に反応させた。一夜、冷蔵庫に放置
した後、0.01Mホウ酸緩衝液（PH8.2）にて３回
遠心洗浄して、スペーサ基を結合された重合体粒
子を得、これを0.01Mホウ酸緩衝液（PH8.2）に
固形分５重量％となるように再分散させた。 (c) ウサギIgGの固定化 上で得たスペーサ基を有する水分散型高分子重
合体粒子の水性分散液５ml、0.01Mホウ酸緩衝液
（PH8.2）２ml及び蒸留水11mlを混合し、これに１
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド塩酸塩水溶液（５mg／ml）２mlを
加え、10分後にウサギIgG水溶液（５mg／ml）を
５ml添加し、15℃で２時間反応させた。次に、反
応混合物中の余剰の水溶性カルボジイミドを消費
するために、10重量％Ｌ−アルギニン水溶液（PH
7.5）５mlを加え、１時間インキユベートした。
次いで、0.01Mホウ酸緩衝液（PH8.2）にて遠心
洗浄を３回行なつた後、0.01Mホウ酸緩衝液（PH
8.2）に分散させて全量10mlに調整し、かくして、
ウサギIgGを前記スペーサ基を介して共有結合に
て固定化した水分散型高分子重合体粒子の水性分
散液を得た。固定化量は重合体粒子１ｇ当り約50
mgであつた。 (d) 免疫学的診断試薬の調製 種々の量の臭化カルシウムを0.01Mホウ酸緩衝
液（PH8.2）に溶解させた後、1N水酸化ナトリウ
ム水溶液に加えて、緩衝液のPHを約8.2に調製し
た。 これらの臭化カルシウムを含有する緩衝液と前
記したウサギIgG固定化粒子分散液とを混合し
て、臭化カルシウムを種々異なるの濃度にて含有
すると共に、重合体粒子濃度1.0重量％の免疫学
的診断試薬を調製した。 (e) 免疫学的診断試薬の評価 免疫活性物質としてウサギIgGを固定化した本
試薬は、リウマチ因子検出試薬として用いること
ができる。 この診断試薬と関節リウマチ因子陽性血清及び
陰性血清を原液のままそれぞれガラス板上にて等
容量混合攪拌しながら、２分後に凝集状態を肉眼
判定した。その結果を第１表に示す。

【表】

【表】 本発明による診断試薬においては、非特異的凝
集反応が起こらないが、臭化カルシウムを含有し
ない対照診断試薬では非特異的凝集が生じた。 また、臭化カルシウム濃度がそれぞれ0.85モ
ル／及び0.1モル／である上記リウマチ因子
検出試薬について、４℃の温度にて経日安定性を
調べた。評価方法は上記と同じである。結果を第
２表に示す。 本発明の診断試薬によれば、６ケ月後にも均一
な外観を有すると共に、陰性血清に対して何ら非
特異的な凝集を起こさず、保存安定性にすぐれる
ことが明らかである。更に、本発明の診断試薬に
よれば、凝集の程度は反応時間によらずに実質的
に一定している。しかし、臭化カルシウムを含有
しない診断試薬によれば、早期に沈殿が生じ、ま

【表】 た、非特異的凝集が認められる。 また、添加剤として塩化カルシウムを含有する
対照診断試薬によれば、陰性血清に対して非特異
的凝集反応は生じるのみならず、早期に沈殿を生
じて、保存安定性に著しく劣る。但し、この沈殿
が粒子が沈降して生じるものであり、粒子が凝集
するのではないので、十分に震盪して均一にする
れば、診断試薬として使用することができる。更
に、塩化カルシウムを含有する診断試薬によれ
ば、陰性血清と混合して数分後の初期の凝集の程
度が（±）、即ち、疑陽性であるとき、時間の経
過につれて非特異的凝集が強くなり、例えば、約
10分後には凝集の程度が（＋＋）程度となつて、
凝集の程度が時間によつて変動し、かくして、正
確な診断が不可能である。 更に、上記リウマチ因子検出試薬を４℃の温度
で保存したときの陽性活性の変化を調べた。結果
を第３表に示す。凝集の判定基準は前記と同じで
ある。 次に、前記(a)の方法にて調製した水分散型高分

【表】 子重合体粒子にスペーサ基を結合させず、直接に
(c)の方法に従つてウサギIgGを固定化した後、(d)
の方法に従つて種々の濃度で臭化カルシウムを含
有する対照診断試薬Ａを調製した。また、臭化カ
ルシウムを含有しないほかは、本発明診断試薬と
同じ対照診断試薬Ｂを調製した。 本発明による診断試薬及びこれらの対照診断試
薬を(e)の方法に従つて活性を判定した。結果を第
４表に示す。本発明による診断試薬によれば、非
特異的凝集が起こらず、且つ、検出感度も高い
が、スペーサ基を介してウサギIgGが固定化され
ていない対照診断試薬Ａは陽性血清に対しても明
瞭な凝集反応を示さず、また、対照診断試薬Ｂは
非特異的凝集が顕著である。 実施例 ２ (a) 水分散型合成高分子重合体粒子の調製 単量体としてメタクリル酸メチル15.0ｇ、アク
リル酸1.0ｇ及びトリエチレングリコールジメタ
クリレート0.7ｇを用いた以外は、実施例１と同
様にして、重合率98％にて平均粒径0.36μ

【表】 ｍの水分散型高分子重合体粒子の水性分散液を得
た。 この分散液を実施例１と同様に精製処理し、得
られた重合体粒子を0.01Mホウ酸緩衝液（PH7.5）
に固形分濃度５重量％となるように分散させて、
水分散型高分子重合体粒子の水性分散液を得た。 (b) 重合体粒子へのスペーサ基の結合 実施例１と同様にして、上で得た重合体粒子に
スペーサ基を結合させた。 (c) ウサギIgGの固定化 上で得たスペーサ基を結合した重合体粒子に実
施例１と同様にして、ウサギIgGを共有結合にて
固定化し、この後、実施例１と全く同様に処理し
て、重合体粒子を0.01Mホウ酸緩衝液（PH8.2）
に分散させて、全量10mlに調製し、ウサギIgGを
固定化した水分散型高分子重合体粒子分散液を得
た。ウサギIgGの固定化量は、重合体粒子１ｇ当
り46mgであつた。 (d) 免疫学的診断試薬の調製 上で得たウサギIgG固定化水分散型高分子重合
体粒子分散液を用いて、実施例１と同様にして、
種々の濃度で臭化カルシウムを含有する本発明に
よる免疫学的診断試薬を調製した。 比較のために、臭化カルシウムに代えて、添加
剤として臭化ナトリウム、臭化カルシウム、臭化
リチウム、塩化カルシウム又は酢酸カルシウムを
用いて、対照免疫学的診断試薬を調製した。 (e) 免疫学的診断試薬の評価 上で得た各種の免疫学的診断試薬について、実
施例１と同様にして活性の判定を行なつた。結果
を第５表に示す。本発明による診断試薬によれ
ば、非特異的凝集は全く起こらないが、対照診断
試薬の場合は、非特異的凝集が顕著に認められ
る。 実施例 ３ 実施例２において調製したスペーサ基を有する
水分散型高分子重合体粒子に、実施例１と同様に
してカルボジイミドを用いてヒトIgGを固定化し
た後、臭化カルシウム0.75モル／を含有する本
発明による免疫学的診断試薬Ａを調製した。重

【表】

【表】 合体粒子１ｇ当りのヒトIgG固定化量は55mgであ
つた。 次に、実施例２において調製した水分散型高分
子重合体粒子にスペーサ基を結合させず、カルボ
ジイミドを用いて直接にヒトIgGを固定化し、こ
の重合体粒子の水性分散液に臭化カルシウムを
0.5モル／濃度にて溶解させて、本発明による
免疫学的診断試薬Ｂを調製した。尚、この診断試
薬におけるヒトIgGの固定化量は、重合体粒子１
ｇ当り62mgであつた。 このように、ヒトIgGを固定化しても、リウマ
チ因子検出試薬として用いることができる。 これらの本発明による診断試薬Ａ及びＢを何ら
の処理もしていない種々の血清と混合攪拌し、２
分後の凝集状態を判定した結果を第６表に示す。
臭化カルシウムを含有しない対照診断試薬につい
ての結果も併せて示す。本発明の診断試薬は非特
異的凝集がなく、且つ、検出感度も高い。 実施例 ４ (a) 水分散型合成高分子重合体粒子の調製 メタクリル酸メチル50ｇ、アクリロニトリル
8.0ｇ及びメタクリル酸2.5ｇを用いた以外は実施
例１と同様にして、重合率99.5％にて平均粒径
0.28μｍの水分散型高分子重合体粒子の水性分散
液を得た。 この分散液を実施例１と同様に精製処理し、得
られた重合体粒子を0.01Mホウ酸緩衝液（PH7.5）
に固形分濃度５重量％となるように分散させて、
水分散型高分子重合体粒子の水性分散液を得た。 (b) 重合体粒子へのスペーサ基の結合 スペーサ基化合物としてグルタミン酸を用い、
カルボジイミド法により、実施例１と同様にし
て、上で得た重合体粒子にスペーサ基を結合させ
た。 (c) 抗ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン抗体の固定化 上で得たスペーサ基を結合した重合体粒子５重
量％を含む水性分散液５ml、0.1Mホウ酸緩衝液
（PH7.5）２ml及び蒸留水11mlを混合し、これに１
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド塩酸塩水溶液（５mg／ml）２mlを
加えた後、抗ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン抗体溶
液（抗HCG、５mg／ml）を５ml添加し、15℃で
３時間反応を行なつた。 この後、実施例１と全く同様に処理して、重合
体粒子を0.01Mホウ酸緩衝液（PH8.2）分散させ
て、全量10mlに調整し、抗HCG固定化水分散型
高分子重合体粒子分散液を得た。抗HCGの固定
化量は重合体粒子１ｇ当り35mgであつた。 (d) 免疫学的診断試薬の調製 実施例１と同様に方法により、臭化カルシウム
をそれぞれ0.75モル／及び0.50モル／濃度に
て含有すると共に、重合体粒子濃度1.5重量％で
ある本発明による免疫学的診断試薬を得た。 (e) 免疫学的診断試薬の評価 免疫活性物質として抗HCGを固定化した本試
薬は妊娠診断試薬として用いることができる。こ
の診断試薬と血清を原液のままガラス板上にて等
量混合し、３〜５分後の凝集の有無を判定したと
こと、血清１ml中に１国際単位のHCGがあれば
凝集が起こり、容易に且つ正確に妊娠の有無を判
定することができた。非特異的凝集は全く起こら
なかつた。 他方、臭化カルシウムを含有しない対照診断試
薬によれば、妊娠していないヒト血清の場合も、
疑陽性と判定される非特異的凝集が生じた。 実施例 ５ (a) 水分散型合成高分子重合体粒子の調製 グリシジルメタクリレート10ｇ、スチレン50
ｇ、メタクリル酸メチル18ｇ、ジビニルベンゼン
2.0ｇ及びアクリロニトリル20ｇを蒸留水230ｇに
加え、更に蒸留水10ｇに過硫酸カリウム0.3ｇを
溶解させた重合開始剤水溶液を加えた後、窒素気
流下、PHを7.0に維持しつつ、70℃の温度で攪拌
速度120rpmで攪拌しつつ、８時間重合させて、
固形分約30％、平均粒径0.25μｍの水分散型高分
子重合体粒子を含む水性分散液を得た。尚、凝集
物は0.03％であつた。 (b) 重合体粒子へのスペーサ基の結合 上で得た水分散型高分子重合体粒子を遠心分離
し、0.05M酢酸ナトリウム−水酸化ナトリウム水
溶液（PH10）100mlに再分散させ、これにｍ−キ
シリレンジアミン２ｇを添加し、30℃で24時間反
応させた。この後、未反応のｍ−キシリレンジア
ミンを除くために遠心分離し、次いで、このよう
にしてスペーサ基の結合された重合体粒子を
0.01Mホウ酸緩衝液（PH8.2）に固形分５重量％
となるように再分散させた。 (c) ウサギIgGの固定化 上で得た重合体粒子に実施例１と同様にしてウ
サギIgGを固定化した。重合体粒子１ｇ当りの固
定化量は35mgであつた。 (d) 免疫学的診断試薬の調製 上で得たウサギIgG固定化量重合体粒子の水性
分散液に実施例１と同様にして臭化カルシウムを
添加し、本発明による免疫学的診断試薬を調製し
た。 (e) 免疫学的診断試薬の評価 この診断試薬とリウマチ因子陽性血清及び陰性
血清を原液のままそれぞれガラス板上にて等容量
混合攪拌しながら、２分後に凝集状態を判定し
た。その結果を第７表に示す。

【表】 また、臭化カルシウムを添加しない対照免疫学
的診断試薬についての結果も併せて示す。 本発明による診断試薬によれば、非特異的凝集
反応が起こらないが、臭化カルシウムを含有しな
い対照診断試薬によれば、非特異的凝集が著し
い。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 免疫活性物質が共有結合にて固定化された水
   分散型高分子重合体粒子の水性分散液からなる免
   疫学的診断試薬において、上記水性分散液に臭化
   カルシウムが配合されてなることを特徴とする免
   疫学的診断試薬。 ２ 免疫活性物質がスペーサ基を介して共有結合
   にて水分散型高分子重合体粒子に固定化されてい
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
   免疫学的診断試薬。 ３ 臭化カルシウムが0.01〜1.5モル／の範囲
   の濃度で配合されてなることを特徴とする特許請
   求の範囲第１項記載の免疫学的診断試薬。 ４ PHが６〜９であることを特徴とする特許請求
   の範囲第１項記載の免疫学的診断試薬。