JPH0225461B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、その最も広い意味において、電気化
学的センサーに用いるのに適する膜の製造方法に
関する。該膜は、通常ポーラログラフイー用セル
（電解槽）と指称される電気化学的分析用の電解
電流測定法用セルに使用されるものである。以
下、この電解電流測定法をポーラログラフイーと
称する。これは、測定すべき分析対象物を、電解
槽からの電気的信号として測定可能な物質に酵素
で転化する反応を基礎とする。

色々な物質の分析測定に、多種多様な分析技術
およびセンサーが利用されている。血球のような
体液、体組織、食物、その他類似物中に含まれ
る、種々の物質の少量を測定することは、医療分
野において特に重要なことである。このような物
質には、グルコース、尿、尿酸、トリグリセリ
ド、リン脂質、クレアチニン、アミノ酸、乳酸、
キサンチン、コンドロイチンなどがある。血液そ
の他の体液中のグルコース濃度を制御もしくは監
視するセンサーの開発は、特に糖尿病患者の血液
を正常な血糖レベルに維持するために、格別、重
要である。

代表例を挙げるなら、上記患者から血液サンプ
ルを採取し、以つて、グルコース・オキシダーゼ
電極と、これによつて生成する過酸化水素を測定
するためのポーラログラフイー検知器を用いてグ
ルコース濃度のオン・ライン分析を行う。普通、
該検知器は、アノード付の過酸化水素定量用酵素
電極、カソード、電解液および固定された酵素を
含む特定組成の膜からなる。

測定すべき分析対象物それ自身は電気化学的に
不活性であるが、分析対象物と酵素との反応もし
くは転化によつて、電気化学的に測定可能な反応
生成物が得られる場合、すなわちポーラログラフ
イーによつて検知可能となる場合には、ポーラロ
グラフイー・セルに酵素が併用されてきた。上述
の通り、医療上重要なある最も一般的問題は血中
のグルコース測定に対する要望に答えることであ
る。この問題は、グルコースそれ自身が電気化学
的に活性でないという事にある。しかしながら、
酵素グルコース・オキシダーゼの存在下では、次
の反応が起る。

グルコース＋O₂グルコース ―――――――→ オキシダーゼグルコン酸 ＋過酸化水素（H₂O₂） この反応によつて生成する過酸化水素はポーラ
ログラフイー検知器によつて測定可能であるの
で、適当な校正もしくは計算によつて、遊離
H₂O₂量から、原試料もしくはサンプル中のグル
コース含有量を定量することができる。上述の説
明は一列であり、一般に他の酵素にも同様に適用
されるものである。

一般に、ポーラログラフイーセルは、電気絶縁
性容器と；膜と電気的に“接触”する検知器もし
くは感知電極と；該膜と電気的に接触する参照電
極とからなる。ここで、“接触”という意味は、
膜と電極との直接的な接触および電解液の層を介
しての接触の両状態を含むものである。色々な設
計の電解槽が周知技術となつており、技術的に広
く理解されている。本発明の目的に特に適する電
解槽はクレメンズ（Clemens）らによる米国特許
第4092233号に開示されている。

先行技術において、酵素膜構成体につき、上述
の第１の膜と一定の間隔を置いて親水性の第２の
膜を並べたものが知られている。第１と第２の両
膜間の空間には高濃度の酵素の層が存在してい
る。第２の膜の自由面は試験表面（testsurface）
となつており、そこに被検基質が施される。この
タイプの酵素膜についてはThe Annals of the
New York Academy of Science，Vol.102
（1962），29−49に記載されている。その論文に
は、反応生成物であるグルコン酸を検出するのに
PH感知電極を用いることができると教示してい
る。また、このような系内の酵素を二つの酢酸セ
ルローズ膜の間に拘束することができることが開
示されている。グルコースは膜を通つて拡散し、
酵素によつてグルコン酸に転化した後、一部はPH
感知電極へ、一部はグルコース供給液へ拡散す
る。

感知電極に接触する初めに述べた第１の膜は、
感知電極に活性な物質を透過することができる材
料で造られている。例えば、この膜は酵素反応の
生成物を透過するが、酵素それ自身を透過しな
い。膜はキユプロフアン（Cuprophane）製でも
よいが、反応生成物の１つが普通の温度・圧力で
気体であり、しかも該気体によつて被検物を測定
したい場合には、イオン非透過性であつて、酸
素、炭酸ガスもしくはアンモニアのような気体に
対して僅かに透過性を有する疎水性プラスチツク
からなるものであつてもよい。このような性質を
有するプラスチツクとしては、シリコーンゴム、
テトラフルオロエチレンその他類似物など、種々
のものが知られている。

米国特許第3539455号に開示されているクラー
ク（Clark）によつて開発されたより新しいタイ
プのポーラログラフイーセルでは、酵素が膜の電
極側に置かれ、生成した過酸化水素を白金アノー
ドで測定するようになつている。低分子種である
グルコースは膜を透過し、酵素と反応するが、カ
タラーゼやペルオキシダーゼのような妨害性高分
子物質は膜を透過しない。上記特許には、酵素分
子を保持することができる程度の広い空間を有す
る多孔質フイルムに酵素を固定することによつ
て、白金表面と膜との間の薄いフイルム内に直
接、酵素を保持することができると開示されてい
る。しかしながら、セロハン膜は尿酸もしくはア
スコルビン酸のような低分子の妨害性物質が感知
電極に到達することを防止することができない。
クラーク（Clark）はこの問題を解決するため
に、２組（dual）電極システムを提案している。
酸素の存在しない補償電極は妨害物質についての
信号を与え、一方、酵素電極は過酸化水素と妨害
物質の両者を検出するものである。そして、計算
によつて、グルコース濃度が求められる。しかし
ながら、このような２組のセンサー・システムは
２つのセルのバランスの調整に困難を伴うであろ
う。

そこで、尿酸やアスコルビン酸などの低分子の
妨害性物質の通過を防ぎ、しかも過酸化水素の通
過を可及的に妨害しない薄いフイルター膜を具備
する酵素電極の使用が提案されている。過酸化水
素を通過させるが、妨害性物質にとつては有効な
障壁となるシリコーン・ゴムや酢酸セルロースな
どの膜材料がある。このタイプの膜は感知電極と
感知システムの何らかの成分との間に配設されな
ければならないので、測定平衡を可及的に速くす
るべく、該膜は出来るだけ薄くせねばならず、な
お且つその透過選択性が失われないことを必要と
する。過酸化水素を感知するプローブ（probe）
では、この膜は厚さ2μm未満であることを要する
であろう。しかし、この厚さの膜は、その強度が
十分でなくなるので、実際に使用することは困難
である。

そこで、必要とする強度を得るため、多孔質の
下部基材の上に上記材料を付着させて薄層をつく
ると同時に、過酸化水素の通過障害をほとんど無
くするような、技術の変遷があつた。こうして、
応答速度を高めるべく、この弱い妨害物を阻止す
る層を薄くすることができる。

ニユーマン（Newman）の米国特許、第
3979274号に記載されているように、積層された
二層構造の膜では、二つの層を互に接着するため
に、酵素接着剤が使用されている。この膜は、基
質の拡散を制御すると共に高分子物質に対する障
壁として働く支持層と；未知物質との反応および
二つの層の接合用の酵素配合物と；妨害性低分子
物質に対する障壁として働くが、過酸化水素を通
過せしめる本質的に均質な層を有している。しか
しながら、この開発された技術にあつては、二つ
の膜と、これらの間に置かれる酵素層とからなる
サンドイツチを造る必要がある。ここでは、該酵
素は接着剤もしくは接合剤として働いている。こ
のタイプの構造では、酵素使用量が過多である
と、拡散種（Species）の拡散量が許容できない
量にまで減少してしまうことがある。より薄い酵
素層を使用すると、許容量の拡散が得られるが、
酵素の装荷量が不足することがある。

更に最近の技術的開発は英国特許第1442303号
（ラジオメーター）に見られる。そこでは、一つ
の構成体として形成された不均質な膜からなる複
合膜が提案されている。この膜は二つの異なる層
を有し、その一つは5μm未満の厚さを有してお
り、他は強度を付与のために十分厚いものであ
る。酵素は膜表面に結合している。上記以外の先
行技術は多くの欠点を有していた。

例えば、Analytice Chemica Acta，Vol.116，
307−311（1980）に記載のコヤマ（Koyama）ら
の方法は酢酸セルロース膜にグルコース・オキシ
ダーゼを固定するものであるが、この方法は更に
時間がかかる。すなわち、この方法はより多くの
工程を含み、しかも、到達可能な最大酵素装荷量
が単分子層であるにすぎない。

しかるに、本発明は、はるかに多量の酵素を膜
内に三次元的に分散せしめることができるので、
基質の拡散経路に沿つて起こる該基質の反応に、
はるかに多くの酵素を利用することができる。

The Journal of Biomedical Materials
Research，Vol.13，921−935（1979）において、
ウインガード（Wingard）らは酵素固定用の白金
網もしくはその線を開示している。この方法はコ
ヤマ（Koyama）の方法よりも結合に利用される
表面積をより大きくすることができるので、より
多数の酵素を用いることができるであろう。しか
しながら、ウインガード（Wingard）の方法も、
酵素単分子層に制限されており、しかも、白金線
表面近くで白金網の開空間を通つて拡散する基質
のみについて、その転化率を高水準に維持するこ
とができるにすぎない。このため、基質の透過拡
散する膜全体中に三次元的に分布した酵素によつ
て可能となる理論転化率を、上記先行技術では達
成することができない。ところで、以下に述べる
本発明では、膜内全域に三次元的に分布した酵素
によつて理論転化率を得ることができるのであ
る。

本発明は、互いに相溶しない極性溶媒と非極性
溶媒とを用いて、膜厚40〜100μmの膜を製造する
方法であつて、 (a) 極性溶媒中のグルコースオキシダーゼ溶液を
調製し； (b) 非極性溶媒中の酢酸セルロース溶液を調製
し； (c) 前記グルコースオキシダーゼ溶液と前記酢酸
セルロース溶液を、エタノールまたはメタノー
ルと一緒にし； (d) 次いで、前記(c)で得られた混合物を均一に混
ぜ合わせ； (e) しかる後、この酢酸セルロース均一混合材を
フイルムに流延し、非極性溶媒を蒸発させ； それにより、グルコースオキシダーゼを酢酸セ
ルロース膜全域に極性溶媒と共にポケツトに入つ
た形で分布させることを特徴とする酵素膜の製造
方法である。

本発明によれば、酵素を膜内全域に均質分布せ
しめ、かつ、これを保護するためにカプセルで包
んで膜内に固定せしめる方法で、これを膜中に直
接、組入れ、以つて、別個の部分からなる酵素層
を調製する必要性を解消する。

本発明は溶媒に対して反応性の酵素を保護し、
以つて、今までその使用が制限されてきた酵素の
使用を可能とし、また、グルコースオキシダーゼ
溶液と酢酸セルロース溶液を含有する膜形成材を
調製する際に、エタノールまたはメタノールを共
に用いることにより、膜形成材の流動性および粘
度特性を改善し、膜に流延するのを容易にするな
ど、多くの利点を有することを特徴とする。ま
た、本発明で得られる膜は、これを簡単な浸漬、
塗布もしくは散布によつて表面に付着させるのに
極めて適する。従つて、これらの方法で所望の酵
素を含む層が得られる。

また、本発明は膜構成体中に酵素分子の三次元
的分布集団を与え、以つて、基質分子の転化率を
高くし、しかも、その膜内拡散の障害を実質的に
無くすものである。

更には、膜内酵素の均質分布によつて、二層間
に酵素塊をサンドイツチ化することによつては達
成できない優れた均一酵素濃度を得ることができ
る。

グルコース濃度に関する血液分析について言及
することにより、本発明を包括する原理をより完
全に理解することができるであろう。血液の液体
部分は、蛋白質、脂質その他の物質からなつてい
る。また血液中には、グルコース等の非電解質；
カタラーゼ等の酵素；アスコルビン酸（ビタミン
Ｃ）並びに、ナトリウム、カルシウム、マグネシ
ウム、カルシウム、鉄、銅等のカチオンと塩素イ
オン、リン酸イオン、重炭酸イオン、炭酸イオン
等のアニオンとから造られる各種金属塩等の電解
質が存在する。リン酸塩、炭酸塩および重炭酸塩
は血液中のPHを正常状態の水準に保つための緩衝
液として働く。血液サンプルをセル内の膜の片側
に容れ、酵素グルコース・オキシダーゼと酸素の
水性溶液を該膜の他の側に容れるならば、ある種
の低分子量物質が血液から、膜を経てグルコー
ス・オキシダーゼ溶液に移動する。酵素のような
高分子量物質は膜を通過しないであろう。種々の
物質の膜透過速度は膜の性質によつて一定であ
る。本発明で得られる膜は、比較的薄い相は分子
量約300以上のものをセツトして除く。

このことは、約300を超える大きな分子量の物
質が膜を通過しないことを意味している。

低分子物質であるグルコースは膜を通過し、酸
素存在下で酵素グルコース・オキシダーゼと反応
し、グルコノラクトンと過酸化水素を生成するこ
とになる。水の存在下でグルコノラクトンは自発
的に加水分解して、グルコン酸を生成する。

酵素グルコース・オキシダーゼと比較して、比
較的低分子物質であるグルコン酸と過酸化水素は
膜を透過するであろう。生化学的流体内に存在
し、しかもH₂O₂を速やかに分解する能力を有し
た大きい酵素分子のカタラーゼやベルオキシダー
ゼは膜を透過することができない。

本発明で得られる膜は電気化学的分析用のセル
に使用することができる。このセルは、米国特許
第4092223号に示されている様に、一般に、電気
絶縁性容器と、アノードと、カソードとからなつ
ている。また、本発明で得られる膜は、より古い
タイプの装置にも使用することができる。このよ
うな装置は、感知電極から隔離した、電解液保持
用の容器の空間内で感知電極（アノード）、参照
電極（カソード）を使用するものである。米国特
許第3539455号に記載のクラーク（Clark）の装
置はこのタイプの一例である。膜はこれら電極と
電気的に接触している。電流の通路はアノードと
カソードとの間、または、参照電極と感知電極と
膜との間に亘つている。

本発明は、酵素を利用し、これと被検物との１
相互作用で電気化学的活性種を生成せしめて、被
検物を電気化学的に感知する一般的方法を提供す
るものである。

本発明は、酵素は溶媒から保護するべく、膜内
の少なくとも１層の全域において、酵素が多数の
“ポケツト”の形で三次的分布するように、酵素
を膜内に包含させることを特徴とする。酵素が膜
構造体内に収容され、このように分布せしめられ
た結果、その分布はより均一になる。この酵素包
合膜は極めて容易に調製される。また、この酵素
包合膜は浸漬成型法で製造するのに非常に適して
おり、該方法によつて膜を表面に直接付着させる
ことができる。更に、これは、より多量の酵素を
被検物の転化に作用せしめることができる。本発
明の更なる特徴は、溶媒によつて容易に損傷して
しまう酵素であつてもよいので、極めて多種の酵
素を使用することができることにある。

酵素分散層の調製に関する主要な問題は、酵素
含有膜材を酵素を損傷もしくは破壊する惧れのあ
る溶媒に溶かさなければならないことにある。本
発明は、例えば、緩衝剤で処理された水などの親
水性溶媒を収容する領域、すなわちポケツト内に
酵素を包含する手段を講ずることによつて、上記
問題を克服するものである。これらの領域、すな
わちポケツトは疎水性溶媒からなる膜形成材の溶
液の全域に分布せしめられる。ここで使用する
“疎水性”および“親水性”溶媒という用語は、
元来、それぞれ“非極性”および“極性”溶媒を
指称するものである。こうすることによつて、酵
素を混合物全域に分布せしめることができ、しか
も、これを無害な介在物雰囲気によつて保護すべ
くカプセルに包むことができる。

酵素含有疎水性溶媒は、攪拌、超音波混合、そ
の他の手段によつて、膜形成材含有親水性溶媒中
に微粒状に分散せしめることができる。こうし
て、成形前に、酵素を含有する“ポケツト”を均
質に分散せしめることができる。疎水性溶媒は酵
素を含有する水性領域には、当然、侵入すること
なく、仮命、侵入したとしても虞らく痕跡量に止
まるであろう。このため、これら水性領域は酵素
を溶媒から保護し、その結果、酵素の安定性およ
び有効寿命を確実に改善する。

本発明の実施において、膜は、膜形成材と親水
性の“ポケツト”中の酵素との混合物をキヤステ
イングもしくは塗布して造ることができる。この
場合混合物は、一般に、キヤステイング後にゲル
を形成することができる溶媒からなる。また、酵
素同士、もしくは酵素とゲル中に含まれる蛋白
質、もしくは酵素とゲル物質それ自身とを結び付
けるカツプリング剤又は固定剤（例；グルタルア
ルデヒド）を使用してもよい。

膜形成材からなる層を追加して用いると有用な
ことがある。例えば、より緻密な（孔がより小さ
い）層を上記酵素分散層の上面にキヤステイング
するか、または逆に、より緻密な層の上に酵素分
散層をキヤステイングしてもよい。この第２の層
は被検物の拡散を制御するのに必要となる場合も
あり、あるいは妨害種を除くために必要となる場
合もある。また、血中での使用期間延長のため
に、非トロンボゲン性を表面に与えるような保護
を目的として、追加の層を利用することもでき
る。

本発明で要求される性質を示す膜は、酢酸セル
ロースや酢酸セルロースの共重合体などの他の材
料から得ることができる。

測定時間を穏当な長さにするには、行う測定の
種類によつて要求される膜厚は異なるものの、好
ましくは、膜厚は全体として約70μmを超えては
ならぬことが既に判つている。膜を２層以上、例
えば、より薄く、より緻密な、2μmの層とより厚
く、より粗な、65μmの層からなるよう設計する
ことにより、例えば、過酸化水素の拡散平衡を許
容される短い応答時間にせしめることができるで
あろう。多層から形づくる場合には、本発明の膜
は、単独成形物に換算して比較的厚い相と；単独
成形物に換算して、比較的薄く、しかも複合膜に
おいてサンプル（例；血液試料）に面する相と；
を組合せることによつて造られるであろう。酵素
のポケツトは高多孔度の相の全域に均一に分布さ
れる。複合膜にあつては、この酵素を両相全域に
分布せしめてもよい。これらの相は、これを別々
に形成した場合、下記のようになる筈である。す
なわち、多孔度の比較的小さい相は分子量約300
以上のものを阻止する筈であり、多孔度の比較的
大きな相は、（成形基面近傍の面における）酵素
に向けて基質を自由に通過せしめるが、大きな蛋
白質などの巨大分子を通さない筈である。

こうした特性を得るためには、本発明の膜を以
下の方法で造ることができる。すなわち、酢酸セ
ルロース粉末を塩化メチレンなどの疎水性溶媒中
に添加し、全溶質が溶解するまで連続的に攪拌す
ることによつて、酢酸セルロースと疎水性溶媒と
からなる溶液を調製することができる。一般に、
６％酢酸セルロースを使用するが、３％程度の僅
かな量であつてもよい。この溶液に第２の溶液を
添加する。第２の溶液はゲル形成物質、緩衝剤お
よび酵素からなる。一般的な調製方法では、５部
の酢酸セルロース／塩化メチレン溶液を１部の第
２溶液に添加する。一般に、第２の溶液は、酵素
（例；液体グルコース・オキシダーゼ酵素）の適
当な緩衝溶液１mlと、１〜５％ゼラチン緩衝溶液
１〜10部からなる。緩衝剤には種々のものを使う
ことができる。例えば、リン酸塩で緩衝化された
塩化ナトリウム水溶液を用いてもよい。

ゼラチンは、そのゲル化が起らないように、ま
ず、これを高い温度に保持し、キヤステイングで
造膜した後、そのゲルを冷却する。もし、他のゲ
ル形成剤（例：アクリルアミド）を使用したなら
ば、膜をキヤステイングした後まで、ゲル形成プ
ロセスの反応活性化が遅れることになる。グルタ
ルアルデヒドその他の固定剤は親水性の相に直接
添加して使用することができる。本発明の目的
に、アガローズ、ゼラチン、ポリアクリルアミド
などの各種ゲル形成剤を用いることができる。

酢酸セルロース／疎水性溶媒の溶液と、ゲル形
成剤および酵素等の水性溶液と、エタノールまた
はメタノールとを組合せた混合物は渦巻型ミキサ
ーで回転せしめられ、均質な混合物となる。また
は、メカニカル・テイシユー・ホモジナイザー
（Mechanical tissue homoginizer）や超音波粉
砕器型ホモジナイザーを用いることができる。ま
た、膜成形性をより高めるために、混合処理前に
メタノールもしくはエタノールは幾らか添加する
必要がある。これは、流動性および粘度特性の情
況に依存して添加し、当業者に明らかな通り、変
更することができる。多くの場合、５％程度（し
かし、一般にはもつと少量の）エタノールまたは
メタノールが用いられている。

エタノールもしくはメタノールに起り得る限界
を克服した真に万能な方法を提供するべきもう一
つの方法は、酢酸セルロース用の疎水性溶媒の他
に、更に酢酸セルロースが不溶の第２の疎水性溶
媒を使用するものである。従つて、上記いずれの
溶媒も酵素を含有する親水性の相の中で溶けるこ
とがない。第２の溶媒は酢酸セルロースについて
の第１の溶媒（例：塩化メチレン）よりも低揮発
性であるのがよい。これは、第１の溶媒が部分的
に、もしくは完全に蒸発した後にも、第２の溶媒
を残存させ、以つて、相反転により膜内の孔生成
を助長せしめるためである。

上記方法のいずれにおいても、これら溶媒同士
の比重を可及的に近い値に整合させるのが最も好
ましい。こうすることによつて、成形前に、より
均質な混合物が得られる。

次に、疎水性膜混合物内の親水性ポケツト中に
分散された酵素の均質混合物を表面に塗布し、乾
燥せしめる。酵素含有溶液がゼラチンもしくはア
ガローズその他のゲル形成剤によつて調製されて
いるならば、乾燥プロセスは、酵素含有微小ポケ
ツトをゲル化させるのに必要な冷却工程を含むも
のであつてもよい。

分析測定中、浸入する被検物種の拡散を更に制
御し、または妨害種を排除するために、疎水性溶
媒（例；塩化メチレン）中、あるいは事情によ
り、極性溶媒中に溶けた膜形成材（例；酢酸セル
ロース）からなる第２の層を用いることができ
る。一般に、この第２の層は塩化メチレンもしく
はアセトン中に溶解された３重量％酢酸セルロー
スからなつており、これは、分散され、かつ保護
された酵素の層の上に塗布されてもよい。また、
この層は、第１の層が形成された後に、浸漬、塗
布、もしくは散布のプロセスによつて付着されて
もよい。

また、特別の機械的安定性を得るため、第２の
層と共に、または第２の層を用いることなく、多
孔度が高い耐久材料を含む第３の層を用いること
ができる。更に、非トロンボゲン性（非血液凝集
性）を：(a)（あるタイプのポリウレタンを用いる
場合のように）材質それ自身によつて、または(b)
ヘパリンを結合せしめる種（例；黒鉛）の含有に
よつて、または(c)血栓形成阻止能を有する補欠分
子族（ヘパリンなどの酸多糖類）の表面との共有
結合によつて、この第３の層に付与せしめてもよ
い。第３の層を用いない場合には、後者の方法
は、同様に、第２の層に適用することができる。

酢酸セルロース膜を成形する場合には、該膜と
相互作用もしくは結合を起さない、何らかの適当
な表面を利用することができる。キヤステイング
されたフイルムの支持体となる代表的な表面材と
しては、ガラスおよびポリエチレン等の幾つかの
プラスチツクが挙げられる。フイルムは従来の装
置によつて成形され、この装置によつて、得られ
るフイルムの厚さをコントロールすることができ
る。該表面に塗布された後、キヤステイングされ
たフイルムを乾燥する。乾燥は空調室を使用する
ことによつて、促進もしくは制御することができ
る。

多層膜を使用する場合、酵素を含む、より厚い
層の酢酸セルロース膜を超薄膜の上で直接成形す
ることができる。二つの成形用溶液は主成分ポリ
マーが同一であるのが好ましく、また同一の溶媒
を使用するのが好ましいので、その界面もしくは
境界には両相の拡散領域が形成され、その結果、
二つの層の間は明確に区別出来なくなる。そこで
は、両層の混和もしくは拡散が起きていると考え
られるので、“層”又は“相”という用語は、そ
れらの界面で相互作用を起していると思われる層
を意味し、互換性をもつて使用される。

まず最初に薄い層から成形を行うのが好ましい
が、成形の順序も、その順を逆にすることができ
る。フイルムは大気下で乾燥してもよく、また加
熱装置を用いてもよい。第２のフイルムを第１の
フイルムの上で成形する場合には、第１のフイル
ムの成形においてこれを絶乾する必要はない。す
なわち、第１のフイルムは触わると粘着するもの
であつてもよい。乾燥後、厚いフイルムの上面に
は皮膜が形成されていると信じられている。

薄くて、より緻密な膜成分を形成すべき酢酸セ
ルロース溶液はケトンなどの不活性有機溶媒に酢
酸セルロースを溶媒せしめて造られる。代表的な
ケトンとしては、アセトン、シクロヘキサノン、
メチルエチルケトン、その他の類似物が挙げられ
る。また相溶性を有する複数の溶媒の混合物も使
用できる。溶媒中のボリマーの濃度は１〜５％、
好ましくは２〜３％の範囲まで変動してもよい。
フイルムは、最終生成物を１〜10μmの厚さ、好
ましくは２〜5μmに調製できるような、適当なフ
イルム・アプリケーターで成形される。

本発明で得られた膜が使用される代表的な電気
化学的センサーとしては、マイルス・ラボラトリ
ーズ（Miles Laboratories）製のバイオステー
ター（BIOSTATOR）グルコース電極（米国特
許第4092233号参照）があげられる。

本発明で得られた膜の全体的な厚さは、約40〜
約100μの範囲であり、好ましくは約70μである。

以下、図面を参照して、本発明で得られた膜を
更に詳しく説明す。

第１図には、ポーラログラフイー用セルの構成
体が示されている。該セルは、合成樹脂、ガラス
又はその他の適当な物質から成る絶縁性容器１０
を構成要素とし、その断面積、断面形状はいかな
るものであつてもよいが、好ましくは円筒状であ
る。該セルは絶縁性蓋１１により被蓋されてい
る。容器内には、絶縁性ロツドすなわち導線１３
を内包する円筒状カラム１２が設置されている。
この導線は、白金、金、銀、黒鉛（グラフアイ
ト）等から成る活性露出部材１４に接続されてい
る。

ロツドもしくはカラム及びD.C電圧電源１５と
導通された蓋を介して、リード線が電極に付設さ
れている。

容器の下端部には、リング又はリテイナー
（retainer）等の支持部材１６が設けられ、また、
本発明で得られた膜１７が中央電極に最も近い支
持容器の端部全周に、電極の活性面からごく近接
した距離をおいて設けられている。膜は、あらゆ
る適宜の手段により固着されるがその手段として
は、例えば、容器の冠状溝にＯ−リングをはめ込
む等の適宜な手段があげられる。電流計（図示さ
れていない。）はセル（電解槽）と直列に接続さ
れている。

容器内圧が過度に上昇することを防止するた
め、例えば、容器にはガス排出孔１８が設けられ
ている。

中央ロツドと容器壁との間には輪状空間が設け
られ、そこに例えば、塩化銀で被覆された銀線等
の参照電極１９が配置されている。空間２０に
は、少なくとも一部に、好ましくは全部に混合液
体電解質が充填されており、電解質は開口から室
内に導入される。

ポーラログラフ分析法にあつては、通常２つの
電極が使用され、そのうちの一つは分極されてお
り、被検物質が減極される迄は通電されない。第
１図に示したセル構造において、電極１９は陰極
であり、分極されて、通常、参照電極として用い
られる。もう一方の電極、即ち第１図に示されて
いる電極１４は、陽極として機能し、被検物質存
在下では、分極しない。従つて、比較的大きな電
流でも、これを抑制することはなく、通常センサ
ー電極として用いられる。第１図に示された電極
は絶縁関係にあり、室内に充填された電解質は両
電極間で導通経路を形成する。代表的な電解質と
しては、例えば、塩化ナトリウムもしくは塩化カ
リウムが挙げられ、炭酸塩、リン酸塩、重炭酸
塩、酢酸塩、アルカリもしくは希土類塩を含む緩
衝液又は他の有機緩衝液又はこれらの混合物が用
いられる。かかる電解質の溶媒としては、当業者
であれば周知である水、グリコール類、グリセリ
ンおよびこれらの混合物があげられる。

第２図は、膜の詳細な横断面図である。この不
均質膜は高密度薄膜層２１と低密度多孔性厚膜層
２２とを有し、これらは一体化されて複合構造を
形成している。点符号で表わされた酵素は膜の厚
い部分すなわち層中に均一に分散されている。し
かしながら、酵素のあるものは、膜の調製中、酢
酸セルロースの溶媒が蒸発される前に薄膜層に拡
散する。膜表面２４は電極と電気的に接触してい
る。膜は２つの層と酵素との不均質な組合せから
成り、その外側の自由表面２３は被検溶液と接触
する試験表面となる。

好ましい態様においては、電極と電気的に接触
している内表面２４が厚さ約65μで、被検試料と
電気的に接触している反対側の層の厚さは約2μ
である。全膜厚は、好ましくは約70μである。

本発明で得られた膜は、全厚さが約40〜100μm
の範囲であつてもよく、好ましくは約70μmであ
る自己支持性（Self−supporting）のフイルムで
ある。この膜は如何なる態様の形状もしくは寸法
に成形されてもよく、また、適当な寸法のポーラ
ログラフイー用の容器もしくは電極に適合せしめ
るべく、いかなる方法で、裁断もしくは寸法加工
されてもよい。詳細には、該膜を、米国特許第
4092233号に記載されているような電極に使用す
るＯ−リングに固定することができる。

適当な寸法のゴム状Ｏ−リングに膜を固定する
には、接着法によつてもよい。また、膜を直接電
極表面に成形することもできる。

酢酸セルロースのほか、溶媒に可溶であり、且
つ、貧溶媒もしくは非溶媒の添加で相反転を生じ
させることができる他のポリマーが膜材料として
有望である。このようなポリマーには、硝酸セル
ロース、エチルセルロースその他のセルロース誘
導体が挙げられる。更に、アセトンその他のケト
ンの代りの溶媒として、塩化メチレンを用いる場
合は、ポリカーボネートが適切なポリマーとな
る。相反転混合体内に存在する低級アルコールの
代替物として、ホルムアミドを用いることができ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明で得られた膜を用いるポーラロ
グラフイー用セル（電解槽）の縦断面図である。
第２図は本発明で得られた膜の一態様を示す拡大
断面図である。 １０……電気絶縁性容器、１１……電気絶縁性
蓋、１２……円筒状カラム、１３……導線、１４
……活性露出部材、１５……直流電圧電源、１６
……支持手段、１７……膜、１８……ガス排出
孔、１９……電極（カソード）、２０……空間、
２１……緻密薄層、２２……多孔質層、２３……
試験表面、２４……膜表面。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 互いに相溶しない極性溶媒と非極性溶媒とを
   用いて、膜厚40〜100μmの膜を製造する方法であ
   つて、 (a) 極性溶媒中のグルコースオキシダーゼ溶液を
   調製し； (b) 非極性溶媒中の酢酸セルロース溶液を調製
   し； (c) 前記グルコースオキシダーゼ溶液と前記酢酸
   セルロース溶液を、エタノールまたはメタノー
   ルと一緒にし； (d) 次いで、前記(c)で得られた混合物を均一に混
   ぜ合わせ； (e) しかる後、この酢酸セルロース均一混合材を
   フイルムに流延し、非極性溶媒を蒸発させ； それにより、グルコースオキシダーゼを酢酸セ
   ルロース膜全域に極性溶媒と共にポケツトに入つ
   た形で分布させることを特徴とする酵素膜の製造
   方法。