JPH02255091A - 変異型ヒトリゾチーム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、組み換えＤＮＡ技術による変異型ヒトリゾチ
ームおよびその製造に関するものである。

さらに詳しくは、天然型ヒトリゾチーム（以下、単にヒ
トリソチームともいう）のアミノ酸配列の第８６位のグ
ルタミンおよび第９２位のアラニンがアスパラギン酸で
置き換えられた変異型ヒ１、リゾチームをコードしてい
る変異ヒトリゾチーム遺伝子を、シグナルペプチドをコ
ードしているヌクレオチド配列と共に含有してなる変異
型ヒトリゾチーム発現ベクター、該発現ベクターを用い
てヒトリゾチーム活性を有するタンパク質を製造する方
法、該発現ベクターで形質転換された形質転換体、並び
に該形質転換体により生産された変異型ヒトリゾチーム
に関するものである。

従来技術とその問題点 リゾチームは細菌細胞壁のペプチドグルカンに作用して
Ｎ−アセチルムラミン酸とＮ−アセチルグルコサミンの
β−１，４−結合を加水分解する酵素である。該酵素を
細菌に作用させると溶菌を引き起こし、その反応生成物
である少糖を同定することによって細胞壁の化学構造の
研究における手懸かりを得ることができる。従って、リ
ゾチームは、細菌学、蛋白質化学、生化学等、様々な研
究分野において有用な酵素である。リゾチームは、ヒト
をも含めた動物の各種組織、分泌液、卵白等に広く分布
しており、一部の植物にも見出されている。

卵白からは比較的容易に純度の高いリソチームが単離で
きるため、この酵素は食品保存の目的て、チーズ、ソー
セージ、水産食品などに添加されたり、あるいはまた、
牛乳のヒト母乳化の目的で使用されている［林勝哉、井
本泰冶、リゾチーム、南江堂（＋９７４）］。リゾチー
ムはまた、止血、抗炎症、組織再生、抗腫瘍活性などの
薬理活性を有することも知られており（例えば“最近の
新薬３４集゛１０７頁、薬事日報社、東京、＋９８３）
、消炎酵素剤として市販されている。

これらニワトリ卵白由来のりゾチームを医薬目的で使用
する場合には、しばしば発疹、発赤なとの過敏症状の現
れることかあり、これらは異種蛋白による免疫応答によ
る副作用であると考えられている。従って、特に医薬用
途に用いる場合には、ヒトリソチームを使用することか
好ましい。

ヒトリゾチームのアミノ酸配列は公知であり（第１図）
、１３０個のアミノ酸からなる［日本生化学全編・生化
学データブック巻１．１８９頁（１９７９）］。またこ
のアミノ酸配列に基づき、ヒトリゾチームをコー１ぜす
るＤＮＡが化学合成されている［　１　ｋｅｈａｒａ、
　Ｍ、ら、ケミカル・アンド・ファーマシューティカル
・プリテン（Ｃｈｅｍ、　Ｐ　ｈａｒｍ、　Ｂ　ｕｌｌ
、　）３４．２２０２（１９８６）］。

ヒトリゾチームの生産については、組み換えＤＮＡ法を
用いてムラキ（Ｍｕｒａｋｉ）らが大腸菌での発現を試
みたか、この発現系ては活性のあるヒドリンチーｌ＼が
得られていない［Ｍｕｒａｋｉ、　Ｍ、ら、アグリカル
チュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａ
ｇｒｉｃ、　Ｂ　ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）５０．７１３
（１９８６）］。一方、酵母を用いて培地中にリゾチー
ムを分泌させる分泌生産では、活性のあるヒトリゾチー
ムか得られることが明らかにされたが［Ｊｉｇａｍｉ、
　Ｙ　　ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）上置、２７３（１９８
６）］、その生産量（菌体内外の総和）は十分なもので
はなく、かつ、生産量に対する分泌量も５５〜６５％と
十分なものではない。

本発明者らは、ヒトリゾチーム活性を有するタンパク質
を効率良く生産することを目的として、卵白リゾチーム
のシグナルペプチドに修飾を施し、形質転換された酵母
宿主内で発現された該タンパク質を効率よく分泌させる
リーター配列を得た（特願昭６２−０６９７６４号およ
び特願昭６２−６９７６５号）。次いで、本発明者らは
、天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列に修飾を施し、
第７７位と第９５位のシスティンをアラニンで置き換え
ることにより、分泌効率が高く、生産性の増大された変
異型ヒトリゾチームを得るに成功したく特願昭６２−２
４５２８４号）。更に本発明者らは、より高いヒトリゾ
チーム活性を有しかつその構造が安定なヒトリゾチーム
を得るために継続して検討を重ねてきた。本発明はかか
る検討の結果得られた知見を基に完成されたものである
。

多くの金属含有タンパク質において、金属がタンパク質
の立体構造の保持に重要な役割をしていることが知られ
ている。金属結合タンパク質であるα−ラクトアルブミ
ンとヒトリゾチームの−次構造の比較から、ヒトリゾチ
ームのＧｌｎ−８６とＡｌａ−９２をアスパラギン酸に
置換すれば、αラクトアルブミンと同様の金属結合部位
が形成され、ヒトリゾチームの安定性が向上すると考え
られる。この様にしてもし高活性でより安定なヒトリソ
チームが得られれば、医療分野はもとより該酵素の生理
学的役割の研究等様々な分野に太いに貢献しうると考え
られる。

課題を解決するための手段 本発明者らは、上記の観点から、より安定な変異型ヒト
リソチームを得ることを目的として、天然型ヒトリゾチ
ームのアミノ酸配列の第８６位のグルタミンおよび第９
２位のアラニンがアスパラギン酸に置き換えられた変異
型ヒトリゾチームをコードする変異遺伝子を得、該変異
遺伝子を適当な発現ベクターに組込んで組換え発現ベク
ターを構築し、この発現ベクターで酵母宿主を形質転換
して得られた形質転換体を培養することにより、培養物
中に高活性でかつ安定性の高いヒトリゾチーム活性を有
するタンパク質を分泌させることに成功した。

即ち、本発明は、天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列
の第８６位のグルタミンおよび第９２位のアラニンがア
スパラギン酸で置き換えられたポリペプチドをコードし
ている変異ヒトリゾチーム遺伝子を提供するものである
。

更に、本発明は、該遺伝子を、シグナルペプチドをコー
ドしているヌクレオチド配列と共に含有している変異型
ヒトリゾチーム発現ベクターを提供するものである。

また本発明は、上記発現ベクターを用いて酵母宿主を形
質転換し、得られた形質転換体を培養し、培養液中に分
泌されたヒトリゾチーム活性を有するタンパク質を分離
することからなる変異型ヒトリゾチームの製造方法、お
よびこの様にして製造された変異型ヒトリゾチームを提
供するものである。

本発明の変異ヒ）　ＩＪゾチーム遺伝子は、後述の実施
例に記載の如く、当業者既知の方法で調製された。

天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列およびそれをコー
ドしている化学合成したＤＮＡのヌクレオチド配列を第
６図に示す。

本発明の変異型ヒトリゾチーム発現ヘクター即ちプラス
ミドｐＥＲ１８８１１の構築における出発プラスミドと
して、天然のヒトリソチームアミノ酸配列をコードして
いる合成遺伝子を含有する公知のプラスミドｐＧＥＬ１
２５［ヨシムラ（ＫＹ　ｏｓｈｉｍｕｒａ）バイオケミ
カル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーンヨ
シ（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ′、　Ｒｅ
ｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　）土４５．７１２（１９８７）
］から、シグナルペプチドの上流にのみＸｈｏｌ制限部
位を有するプラスミドｐＥＲＩ　　８６０２か得られる
。

天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列の第８６位のグル
タミンおよび第９２位のアラニンがアスパラギン酸で置
換された変異型ヒトリゾチームをコードしているヌクレ
オチド配列を得るために、プラスミドｐＥＲＩ　　８６
０２から、シグナルペプチドとヒトリゾチームとをコー
ドしているヌクレオチド配列を含んたＸｈｏｌ−８ｍａ
ｌ制限断制限績り出し、これを、Ｍ　１３ｍｐｌ　９　
ＲＦ　［Ｍ　ｌ　３ｍｐファージＤＮＡの複製型（ＲＦ
）］にＸｈｏｌ制限部位を挿入したファージＤＮＡの大
きい方のｘｈＯＩ−８ｍａｌ制限断制限績合（ライケー
ト）させることにより、シグナルペプチドとヒトリソチ
ームとをコードしている一本鎖ファーシＤＮＡ、Ｍ１３
ｍｐｌ　９ＸｈＬＺＭを得る。Ｍ１３ｍｐｌ　９ＸｈＬ
ＺＭの組立て模式図を第２図に示す。

一方、アミノ酸配列の第８６位のグルタミンおよび第９
２位のアラニンがアスパラギン酸で置換された短いアミ
ノ酸配列をコードしている２本のオリゴヌクレオチドを
合成し、これら、変異を含んだオリゴマーの５”末端を
りん酸化し、Ｍ１３ｍｐ１９ＸｈＬＺＭを含む一本鎖Ｄ
ＮＡと混合し、常法に従い、アニーリングおよびライゲ
ーションに付す。次いで、変異していないＤＮＡを除去
した後、得られた変異ヒトリソチームＤＮＡを含有する
混合物を用い、大腸菌、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＴＧ　１をトラ
ンスフェクション（感染）した。プラークを形成させだ
後、さらにこのプラークをＥ、ｃｏｌｉ　ＴＧ　ｌに感
染させ、その形質転換体を培養し、その培養」１清から
ＰＥＧ／ＮａＣρ沈澱、フェノール抽出、エタノール沈
澱により単鎖ＤＮＡを分離し、ジデオキシヌクレオチド
合成鎖停止法による塩基配列決定に付し、所望の変異Ｄ
ＮＡの生成を確認する。

次いで、常法に従い、−本鎖ＤＮＡをＥ　、　ｃｏｌ　
１ＴＧＩに導入して２本鎖ＤＮＡを得、このＤＮＡから
シグナルペプチドと変異型ヒトリゾチームをコートして
いるＸ、ｈｏｌ−３ｍａｌ制限断片を切り出し、」二記
プラスミｌ”ｐＥＲＴ　　８６０２の９．５ｋｂＸｈｏ
Ｉ−３ｍａｌ制限断片とのライゲーション反応に付す。

得られた混合物を用いてＥ、ｃｏｌｉ　ＤＨ１を形質転
換し、形質転換体から所望の変異型ヒトリゾチーム発現
ヘクター、プラスミドｐＥＲＩ８８１１を単離する。プ
ラスミドｐＥＲ＋　　８８１１の組立て模式図、並びに
制限酵素切断地図を第４図に示す。

以上の一連の操作における個々の操作は当業者によく知
られており、例えば、大腸菌の形質転換は、コーエン（
Ｃｏｈｅｎ）らの方法［Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ　、　Ｎ　　
ら、プロシージング・オブ・ザ・ナンヨナル・アカデミ
−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌΔｃａｄ、
　Ｓ　ｃｉ、ＵｓＡ）６９．２１．１０（１９７２）］
によって行うことかできる。宿主としてはＥ、ｃｏｌｉ
２９４、Ｅ、ｃｏｌｉＤＨＩ、Ｅ、ｃｏｌｉＷ３１１０
．　Ｅ、ｃｏｌｉＣ６００なとを用いることができる。

また、形質転換体から、所望の遺伝子が挿入されたプラ
スミドＤＮＡを単離するには、アルカリ抽出法［Ｂ　ｉ
ｒｎｂｏｉｍ、　Ｈ，Ｃ，およびＤｏｌｙ、　Ｊ　、、
ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　
Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、）７．１５１３（１９７９）］等を
利用することができる。次いて、プラスミドＤＮＡを適
当な制限酵素で処理することによって、挿入された該遺
伝子を切り出し、たとえばアガロースゲル電気泳動ある
いはポリアクリルアミド電気泳動によってこれを単離す
る。これらの一連の操作は公知であり、文献、例えば「
モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇＸ　１９８２　）、　Ｃｏ１ｄ　Ｓ　ｐｒ
ｉｎｇ　）（ａｒｂｏｒ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＪに詳
しく記載されている。

またＤＮＡの化学合成は、たとえばＣｒｅａらの方法［
Ｃｒｅａ、　Ｒら、プロシージング・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ）７５．７６５（１９
７８）］なとに従って行うことができる。

またＤＮＡの所望の部位に、特異的に変異を起こさせる
ためには、市販のキット（例えばアマ−ジャム社製キッ
トなど）か用いられ、その配列の確認には、ジデオキシ
ヌクレオチド合成鎖停止法［Ｓ　ａｎｇｅｒ、　Ｆ　　
ら、プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
、ｓｃｉ、）ＵＳＡ、　　７４．５４６３（１９７７）
］が用いられる。

発現プラスミドは、真核細胞内で自律的に複製可能な発
現ベクター群の内から選択されたベクターのプロモータ
ーの下流に、シグナルペプチドをコードしている遺伝子
と変異ヒトリゾチーム遺伝子を連結させて挿入すること
により組立てられる。

本明細書中では、Ｇ　Ｌ　Ｄプロモーターを用いて天黙
視のヒトリゾチームをコードしている発現プラスミドｐ
ＥＲＩ　　８６０２の構築を用いて例示したが、その他
、プラスミドｐＰＨＯ１７、ｐｃＤ　Ｘ　［Ｏｋａｙａ
ｍａ、　ＨおよびＢｅｒｇ、Ｐ、、モレキュラー・アン
ド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．　Ｃｅｌ　１．
　Ｂ　ｉ。

１）旦、２８０（１，９８３）］、Ｉ）ＫＳＶ−１０（
７フルマシア社製）なども好適に使用される。

宿主として酵母を用いた場合には、プロモーターとして
、たとえばＰ　Ｈ０５プロモーター、ＧＬＤプロモータ
ー、ＰＧＫプロモーター、Ａ　Ｄ　Ｈプロモーター、Ｐ
Ｈ０８１プロモーター、ＧＡＬＩプロモーター、ＧＡＬ
１０プロモーターなどが、宿主として動物細胞を用いた
場合には、プロモーターとして、たとえば５Ｖ４Ｑ初期
遺伝子プロモーター、メタロチオネインプロモーター、
ヒートショックプロモーターなどがそれぞれ利用できる
。

なお発現にエンハンサ−の利用も効果的である。

発明の作用および効果 本発明のプラスミドｐＥＲＩ　　８８１１は、酵母宿主
内で変異型ヒトリゾチームを発現させ、分泌させるのに
好適である。とくに好ましい宿主はサッカＣ１？イセス
・セレビンエ（Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）Ａ　Ｈ２２Ｒ−である。その外、動物
細胞用ベクターを用いれば、マウスＬ細胞、チャイニズ
ハムスター卵母細胞（ＣＨＯ）、さらには他の真核細胞
も用い得る。酵母の形質転換は当業者既知の方法のいず
れによっても行うことができ、例えば、ヒ不ン（Ｈｉｎ
ｎｅｎ）らの方Ｌ［プロシージンゲス・オブ・す・ナシ
ョナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）７５．１９２７、
（１９７８）］を採用することかできる。

真核細胞の形質転換も当業者に既知であり、例えば［蛋
白質・核酸・酵素・２８巻、１９８３年、゛組み換え遺
伝子の細胞への導入と発現′”（共立出版）」記載の方
法で行うことかできる。

形質転換体の培養は、当業者既知の方法のいずれを用い
ても行うことかできる。

酵母を使用する場合、培地としては、例えばパークホル
タ−（Ｂ　ｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地［ポスチャン
（Ｂｏｓｔｉａｎ、　Ｋ、　Ｌ、）ら、プロシージンゲ
ス・オブ・す・ナショナル・アカテミー・オブ・サイエ
ンスＵＳＡ、７７．４５０５（１９８０）コか挙げられ
る。

培養は通常１５°Ｃ〜４０°Ｃ１好ましくは２４°Ｃ〜
３７°Ｃで１０〜１４４時間、好ましくは２４〜９６時
間行い、必要に応じて通気や撹拌を加えてもよい。

動物細胞なとの真植生物細胞を宿主とした形質転換体を
使用する場合には、培地として例えばイーグル（Ｅａｇ
ｌｅ）のＭ　Ｅ　Ｍ　［Ｈ、Ｅ　ａｇｕｅ、サイエンス
（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）土３０．４３２（１９５９）］、
タルベッコ（Ｄ　ｕｌｂｅｃｃｏ）の改良イーグル培地
（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）
［Ｏｒｇａｄ　ＬａｕｂおよびＷｉｌｌｉａｍＪ　、　
Ｒｕｔｔｅｒ、　／ヤーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２５８．６
０４３（１９８３）］などが挙げられる。培養は通常３
０〜４２°Ｃ１好ましくは３５°Ｃ〜３７°Ｃて約１〜
１０日間行う。

培養終了後、当業者既知の方法で細胞と上清とを分離す
る。変異型ヒトリゾチームは上清から得られるが、細胞
内に残存する場合には、当分野における通常の方法、例
えば超音波破砕法、フレンチプレスなどを利用した破砕
法、摩砕などの機械的破砕法、細胞溶解酵素による破砕
法などにより細胞を破砕した後抽出する。さらに必要な
らば、トリトン−Ｘ１００、デオキシコーμ−１・など
の界面活性剤を加え、産生された変異型ヒトリゾチーム
を抽出する。得られた変異型ヒトリゾチームは、通常の
タンパク質精製法、例えば塩析、等電点沈澱、ゲル濾過
、イオン交換クロマトグラフィ、高速液体クロマトグラ
フィー（トＴＰＬＣＳＦＰＬＣ等）などに従って精製す
ることができる。

本発明の変異ヒトリゾチーム遺伝子を含んだ発現ベクタ
ーを適当な宿主に導入し、得られた形質転換体を適当な
条件下で培養し、培養」１清のヒトリゾチーム活性を有
するタンパク質を単離し、所望により常法にしたかって
精製することにより、容易かつ簡便に一定した高いヒト
リゾチーム活性を有し、かつ熱安定性および酵素消化に
対する安定性の向上した変異型ヒトリゾチームを得るこ
とができる。また、この方法はあるタンパク質に金属イ
オンの結合部位を人工的に構築することにより熱安定性
で酵素消化に対する安定性の向」ニしたタンパク質を得
る一般的方法となりうる。

以下、実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明する。

尚、以下の実施例は単なる例示にすぎず、如何なる意味
においても、本発明を制限するものではない。

実施例１　プラスミドｐＥＲＩ　　８６０２の構築）　
　１．６ｋｂ、　　８．３ｋｂ断片の調製ＢａｍＨＩ用
緩衝液［６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ２（ｐＨ７゜９）、
ｌ　５０ｍＭ　ＮａＣＬ　６ｍＭ　ＭｇＣ（！２］１０
０μσ中で化学合成したヒトリゾチーム遺伝子を含有し
ているプラスミドｐＧＥＬ１２５［ヨシムラ（Ｋ　、　
Ｙ　ｏｓｈｉｍｕｒａ）前掲］４８．５μｇに６０Ｕの
ＢａｍＨＩ（ヘーリンガーマンハイム山之内製）を加え
て３７°Ｃで２時間反応させたのち、常法通り、冷エタ
ノールを加えてＤＮＡを集めた。このＤＮＡを、上記Ｂ
ａｍＨＩ用緩衝液（１００１１ｆｆ）中で４０ＵのＸｈ
ｏｌ（ベーリンガーマンハイム山之内）を加えて３７°
Ｃで１５分間部分消化したのち、６０°Ｃで１５分間加
熱して反応を停止させた。この反応液を０７％アカロー
ス電気泳動にかけ、１　、６　ｋｂ断片を含むゲルを切
り取り、電気泳動溶出によってゲルから抽出した。

同様の方法で４８．５μｇのｐＧＥＬ１２５を６０Ｕの
ＢａｍＨＩで消化し、常法に従ってエタノールでＤＮＡ
を沈澱させた。このＤＮＡにＢａｍＨＩ用緩衝液中で８
００のＸｈｏｌを３７°Ｃで２時間作用させたのち、前
記１．６ｋｂ断片と全く同様の方法で、プラスミドｐＧ
ＥＬ１２５からプロモータ、シグナル配列、およびヒト
リゾチームコード領域が除去された８、３ｋｂのＢａｍ
ＨＴ−Ｘｈｏｌ制限断片を調製した。

）Ｓｍａｌ認識配列を含む合成オリゴマーの調製ｐＧＥ
Ｌ１２５のヒトリゾチーム遺伝子の３′末端側のＸ、ｈ
ｏｌ切断部位をＳ　ｍａ　Ｉ切断部位に変換するために
、常法に従い、“ＴＣＧＡＣＣＣＧＧ６３′を合成した
。

１ｉｉ）　　１．６ｋｂ断片と合成オリゴマーの連結ｉ
）で得た合成オリゴマー（１００ｎｇ）と１　、６　ｋ
ｂ断片（２μｇ）を２０μＱのライゲーション用緩衝液
［５０ｍＭ　Ｔ　ｒｉｓ　−ＨＣρ（ｐｌ−Ｔ７．８）
、１０　ｍＭ　ＭｇＣρ２．２０ｍＭ　ジチオスレイト
ール（ＤＴＴ）、１ｍＭＡＴＰ］に溶かし、Ｔ４ＤＮＡ
リガーセ（ＮＥＢ製）８００Ｕを加えて１４°Ｃで一夜
反応させ、ＤＮＡを結合させた。常法に従い、エタノー
ルを加えてＤＮＡを集めたのち、１００μρのＢａｍＨ
Ｉ用緩衝液に溶かし、３６ＵのＢａｍＨＩを加えて３７
°Ｃで１時間反応させ、同様にエタノールを加えてＤＮ
Ａを集めた。次にこのＤＮＡを５０μりのＳｍａｌ用緩
衝波緩衝液ｍＭＫＣｌ！、］ＱｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ２
（ＩｌｌＨ８，０）、ｌ　ＯｍＭ　ＭｇＣＬ、１ｍＭＤ
ＴＴ］に溶かし、２１ＵのＳｍａｌ（宝酒造製）を加え
て３０°Ｃで１時間反応させた。これを０７％アカロー
ス電気泳動にかけ、常法通り所望の部分を切り出し、電
気泳動溶出によって１．６ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｓｍａｌ
断片を得た。

ｉＶ）　８．３ｋｂ断片と合成オリゴマーの連結ｉｉｉ
　）と全く同様にして、１μｇの８．３ｋｂ断片と１１
００ｎの合成オリゴマーとを連結したのち、同様にＢａ
ｍＨＩ、およびＳｍａｌで処理して電気泳動にかけ８．
３ｋｂのＢａｍＨＩ　−３ｍａｌ制限断片を得た。

ｖ）　１．６ｋｂＢａｍＨＩ−Ｓｍａｌ断片と８．３ｋ
ｂＢａｍＨ１−３ｍａ丁断片との連結 ｉｖ）で得た８、３ｋｂ断片（１２０ｎｇ）と１．６ｋ
ｂ断片（３６０ｎｇ）を１００μＱのライゲーション用
緩衝液（（ｉｉｉ）に同じ）中で８００ＵのＴ４ＤＮＡ
リガーゼ（ＮＥＢ製）を加えて１４°ｃ−１反応させた
。

その１１５量を用いてＥ、ｃｏｌｉ　ＤＨ］を形質転換
し、プラスミドｐＥＲＩ　　８６０２を得た。

プラスミドｐＧＦ、Ｌ１２５およびプラスミドｐＥＲ１
８６０２の制限酵素切断地図およびプラスミドｐＥＲＩ
　　８６０２の構築模式図を第１図に示す。

実施例２　　Ｍｌ　３ｍｐｌ　９ＸｈＬＺＭの構築）ヒ
トリゾチーム遺伝子を含むＸｈｏｒ　−Ｓｍａｌ断片の
調製 実施例１で調製したプラスミドｐＥＲＩ　８６゜２　　
］００ｎｇを実施例１記載の方法に従ってＸｈ。

■、Ｓ　ｍａ　Ｉで切断し、シグナル配列コード領域お
よびヒトリゾチーム遺伝子を含むｘｈｏｌ　−８ｍａｌ
制限断片を調製した。

）　Ｍｌ　３ｍｐｌ　９へのＸｈｏｌ制限部位の導入Ｍ
　ｌ　３ｍｐ１．９の複製型（ＲＦＸ宝酒造製）２．４
μｇを３０μρのＨｉｎｄｌＩｌ用緩衝液［５０ｍＭ　
ＮａＣＬｌ　０　ｍＭ　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣ（！（ｐＨ７
、５＞、１０　ｍＭ　ＭｇＣＱ２．１ｍＭＤＴＴ］中で
２７Ｕの）−（ｉｎｄｌＴＩ（ベーリンカーマンハイム
山之内製）と３７°Ｃで２時間反応させたのち、常法通
り冷エタノールを加えてＤＮＡを沈澱させた。

一方、常法に従って合成した２本のオリゴマー”ＴＣＧ
ＡＧＧＣＣＡ３°（１００ｎｇ）および’ＡＧＣＴ　Ｔ
　Ｇ　Ｇ　ＣＣ（１００ｎｇ）をＡＴＰを含まないライ
ゲーション用緩衝液（前出）２０μａ中で８０°Ｃ１５
分処理したのち、室温まで徐々に冷却して二本鎖とした
。この反応液に上で得たＨｉｎｄＩＩＩ処理したＭｌ　
３ｍｐｌ　９ＲＦ５００ｎｇとＡＴＰを１ｍＭとなるよ
うに加え、１４°Ｃて一夜反応させた。次にこの１／１
０量をＥ、ｃｏｌｉＴＧ　］に感染させ、常法に従いＸ
ｈｏｌ切断部位をもったＭ１３ｍｐ１９ＲＦを得た。こ
の５μｇを実施例１、ｉｉｉ　）記載の方法でＸｈｏｌ
およびＳｍａＩで処理し、エタノールで沈澱させた。

ｉｉｉ＞　Ｍ　１３ｍｐｌ　９　ＸｈＬ　ＺＭの構築）
で調製したＸｈｏｌ−ＳｍａＩ断片３００ｎｇと）で調
製したＭ１３ｍｐ１９を含む大きいＸｈｏｒＳｍａｌ制
限断片１１００ｎとを５０．ｃｌのライゲーンヨン用緩
衝液（前出）中４００ＵのＴ４ＤＮＡリガーセ（Ｎ　Ｅ
　Ｂ製）と１４°Ｃで一夜反応させ、その１１５量をＥ
、ｃｏｌｉＴＧ　１に感染させ、Ｍ１３ｍｐｉ９ＸｈＬ
ＺＭＲＦを得た。

Ｍｌ　３ｍｐｌ　９ＸｈＬＺＭの構築模式図を第２図に
示す。

実施例３　変異ヒトリゾチーム遺伝子の調製変異ヒトリ
ゾチーム遺伝子の調製には、オリゴヌクレオチド−ブイ
レフテッド・インビトロ、ムタケネシスシステム（アマ
ーンヤム社製キッ１−）ｔ−用いた。また、操作方法は
アーマジャム社製キット用マニュアルに従った。

）ＧｌｎｌｌｌｌおよびＡｌａ１１２をＡｓｐに変換す
るためのオリゴマーの合成 常法に従って次のオリコマ−を合成した。

（Ｉ）Ｇｌｎｅｏ→Δｓｐ、　　Ａｌａ９２＞Ａｓｐ５
ＧＣＴＴＴＧＣＴＴＣＡＧＧＡＣＡＡＣＡＴＴＧＣＴＧ
ＡＴＧＣＴＧＴＴＧＣＣ↓ ×は変更後の塩基を示す。

）アニーリングおよびライゲーション 実施例２で得たＭ１３ｍｐｌ　９ＸｈＬＺＭの単鎖ＤＮ
Ａ１０μ９を含む溶液（１３μｇ）、５′をリン酸化し
たオリゴマー（１）と（ＩＴ　Ｘ〜１　、６　ｐｍｏｌ
／　μＱ）（５μの、緩衝液１（７μのおよび水（４μ
のを混合し、８００Ｃで３分間処理したのち、室温で３
０分間放置した。この反応液にＩＶｉｇＣＱｔ液（１０
μの、ヌクレオチド混を夜１（３８μｆｆ）、水（１２
，ｃｌ）、クレノーフラグメント（１２ＴＪ）、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（１２Ｕ）を加え、１４°Ｃで一夜反応さ
せた。

反応液をニトロセルロースフィルターで癌過し、未反応
の単鎖ＤＮＡを除去したのち、常法に従いエタノールで
ＤＮＡを沈澱させ、５０μＱの緩衝液２に溶解した。

１１１）変異ＤＮＡを含むプラスミドによる大腸菌の形
質転換 ）で得たＤＮＡ溶液５０μＱの内１０μＱに、６５μＱ
の緩衝液３と５ＵのＮｃｉｌを加え３７°Ｃで９０分間
反応させて変異していないＤＮＡにニックを入れた。反
応後さらに５００ｍＭ　ＮａＣｌ２（１２μＣ）、１ｉ
ｉｆｆｌ　４　（１０μσ）、エキソヌクレアーゼＩＩ
Ｉ（５０Ｕ）（２μのを加えて、３７°Ｃて３０分間反
応させ、ニックを入れたＤＮＡを消化した。

次に７０°Ｃて１５分間加熱して酵素を失活させた。冷
却後、ヌクレオチド混液２（１３μの、ＭｇＣρ、液（
５μの、ＤＮＡポリメラーゼＩ　（３Ｕ）、Ｔ４．ＤＮ
Ａリガーゼ（２Ｕ）を加えて１４°Ｃて３時間反応させ
た。この反応液１０〜２０μＱを用い、Ｅ、ｃｏｌｉＴ
Ｇ　ｌを形質転換した。

ｉｖ）変異ＤＮＡの調製と変異の確認 １１１）で得た形質転換体をＹＴ寒天培地（バタトトリ
プトン８ｇ１ハクト酵母エキス５ｇ、、ＮａＣ（！５ｇ
。

＝２４ 寒天１５ｇ、水１のにまき、プラークを生じさせた。プ
ラークを採取し、Ｅ、ｃｏｌｉＴＧｌに感染させ、これ
をＹＴ培地で３７°Ｃにおいて一夜、液体培養し、培養
上清を集めた。この上清１ｍＱにＰＥＧ　／　Ｎ　ａＣ
ｆ２（２０％ポリエチレングリコール６０００．２．５
ＭＮａＣ（り２００μσを加え、よ（混合して１５分間
放置したのぢ、遠心分離して上清を除去した。沈澱にＴ
Ｅ緩衝液（１０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣＱ、ＩｍＭ　ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８，０Ｘ１００μのおよび、ＴＥ緩衝液飽和フ
ェノール（５０μのを加えてよく撹拌したのち、遠心分
離し、水層を採取した。この水層に冷エタノールを加え
て、単鎖ＤＮＡを沈澱さゼた。この単離ＤＮＡを鋳型と
してジデオキ／ヌクレオチ１−合成鎖停止法によって塩
基配列を決定し、目的通り変異したＤＮＡを得た。

実施例４　プラスミドｐＥＲ＋８８１１の構築実施例３
、ｉｖ）で得た変異ＤＮＡをＥ、ｃｏｌｉ　ＴＧｌから
常法によって調製したのち、実施例１．１１１）、記載
の方法に従ってＸｈｏｒおよびＳ　ｍａ　Ｉて処理して
、シグナル配列のコード領域と変異ヒトリソチーム遺伝
子とを含むＸｈｏｌ−３ｍａｌ制限断片（ａ）を得た。

一方プラスミドｐＥＲＩ　　８６０２を同様にＸｈｏｌ
およびＳｍａｌて処理したのら、常法通り電気泳動によ
って９．５ｋｂのＸｈｏ　Ｉ　＝Ｓ　ｍａＩ制限断片（
ｂ）を単離した。

次イテ、これらのＤＮＡ断片（ａ）　（ｂ）各１．０ｎ
ｇと３０％ｇを２０／ｉρのライゲーション用緩衝液中
で実施例１、ｉｉｉ　）と同様に反応させて連結し、こ
のライゲーション反応混合物てＥ、ｃｏｌｉ　Ｄｒ−１
１を形質転換した。形質転換体から、変異ヒトリゾチー
ム遺伝子を含有しているプラスミド数種を得、その一つ
をｐＥＲＩ８８１１と命名した。プラスミドｐＥＲ，１
８８１１の構築模式図を第３図に示す。

実施例５　酵母形質転換体の調製 実施例４て得た発現プラスミドｐＥＲ＋８８１１を用い
、ヒネンらの方法（前出）に従い、Ｓ、セレビシェＡ　
ｌ−１２２Ｒ−を形質転換し、形質転換体Ｓセレビシェ
ＡＨ２２Ｒ−／ｐＥＲＴ　　８８１１を得た。この菌株
は、工業技術院微生物工業技術研究所に受託番号ＦＥＲ
Ｍ　Ｐ１０５７７て寄託されている（寄託口：平成１年
２月２７日）。

実施例６　　Ｓ、セレビシェＡＨ２２Ｒ−／ｐＥＲ１８
８１１の培養 実施例５で得た形質転換体Ｓ　セレビシェＡ　１（２２
Ｒ−／ｐＥＲＩ　　８８１１を、試験管中のパークホル
ダー（Ｂｕｒｋ　ｈｏｌｄｅｒ）［アメリカン・ジャー
ナル・オブ・ボタニー（Ａｍｅｒ、　Ｊ、　Ｂｏｔ、）
３０．２０６（１９４，３）］の改変培地ｌ１１（］ρ
当たりＫ　Ｉ−１２ＰＯ＊０．４ｇ、グルコースｌＯｇ
、アスパラギン５ｇ、シュークロース８０ｇを含有）５
ｍρに接種し、３０°Ｃて７２時間振盪培養した。得ら
れた槁養液１ｍ夕をそれぞれ」１記培地ＩＵ４ｍρを含
む試験管へ移し、３０°Ｃで１日振盪培養した。この培
養液２ｍＣを」−記培地１］Ｔ］８ｍ夕を含む２００ｍ
１２容三角フラスコに移し、３０’Ｃて振盪培養し、７
２時間後に培養液を採取した。

尤旌剋Ｊ　分泌された変異型ヒトリソチームの精製 実施例５で得た形質転換体Ｓ、セレビシェＡＨ２２Ｒ−
／ｐＥＲｌ　　８８１１を実施例６に示した培地５ｍＱ
を含む試験管３本に接種し、３０’Ｃで３０間振盪培養
した。上記培地１８ｍ夕を含有する２００ｍｆ２容三角
フラスコを５本用意し、その各々に、」二の培養液２ｍ
θを移し、３０’Ｃて１０振盪培養した。次に上記培地
２００ｍ０．を含有するＩＱ、容三角フラスコを５本用
意し、その各々にこの培養液２０ｍＱを移し、３０’Ｃ
で４０間培養した。この培養液を遠心分離機にかけ、上
清と菌体を分離した。

この」二清く約１のを５０ｍＭリン酸すトリウム緩衝液
（ｐｌ（６、５）で平衡化した陽イオン交換樹脂（Ｉｎ
ｄｉｏｎ）カラム（０、７ＣｍＸ　］−５ｃｍ）に吸着
させ、同緩衝液３０ｍρで洗浄後、０．５ＭＮａＣｆ２
を含む同緩衝液で溶出した。溶出液を１ｍＣずつ分取し
、各フラクションについて実施例８に従ってリゾチーム
活性を測定した。リゾチーム活性が最大となるフラクシ
ョンを取り、これを高速液体クロマトグラフ　イー（Ａ
ｓａｈｉｐａｋ５０２　Ｃ）により、さらに精製した。

５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を含むＯ６Ｍ硫酸すｌ
　ＩＪウム０−３０％の直線濃度勾配により３０分間溶
出を行い、保持時間２０．８３１分に現れる２８０％ｍ
の吸収ピークを分取し、これをＤ　８６／９２とした。

この溶出パターンを第４図に示した。

実施例８　精製変異型ヒトリゾチームの分析実施例７で
精製した変異型ヒトリゾチーム精製標品について比活性
を測定した。測定はｐ＋−１５，５の０．１Ｍ酢酸緩衝
液中、グリコールキチンを基質として行った。タンパク
質の定量は、ヒドリンチームの２８０％ｍにおける吸光
度を測定して行った。その結果、天然型ヒＩ・リゾチー
ムの比活性を１００としたとき、変異型ヒトリゾチーム
の比活性は、１５０％であった。

次に、この精製した変異型ヒトリゾチームについて全ア
ミノ酸組成の決定を行った。全アミノ酸組成の決定は、
精製標品０．１ｍｇを用い、６規定塩酸中、＋１０°Ｃ
１２２時間加水分解を行い、アミノ酸自動分析計（日立
７３３型）により自動的に行った。

結果を以下の表１に示す。

また、この精製した変異型ヒトリソチームにつイテカル
シウム含有量を決定した。カルシウム含有量の決定は、
原子吸光分析法により行った。

結果を以下の表２に示す。

（以下余白） 表１ 天然型および変異型ヒｊ・リゾチームのアミノ酸組成 注）各個はＬｅｕに対する値を８として標準化したもの
である。

表−λ　天然型および変異型ヒトリゾチームのカルシウ
ム含有量 実施例９　精製変異型ヒトリゾチームの安定性の測定 実施例７て精製した変異型ヒトｌ）ゾチーム精製標品の
熱に’ｔ、−ｆする安定性の測定は、温度に対する酵素
活性の依存性を測定することにより行った。

ｐＨ５，５の０．１．Ｍ酢酸緩衝液中、グリコールキチ
ンに対する活性を、３０ｉ００°Ｃの範囲で測定した結
果、天然型リゾチームは、温度の上昇とともに、活性か
約７０°Ｃまで増加し、約８０°Ｃで失活したか、変異
型ヒトリゾチームは約８０°Ｃまで活性か」−昇しつづ
け、約９０°Ｃで失活した。したかって、熱に対する抵
抗性か、約１０’Ｃ増したことかわかった。このとき、
変異型リゾチームは、天然型リソチームの４０°Ｃの活
性を１００とすると、８０°Ｃで５４０という高い活性
を示した。結果を第５図に示した。

また、タンパク質分解酵素（プロナーゼ）によるノソチ
ームの消化実験を行い変異型リソチームの消化安定性を
測定した。ｐＨ７，１の条件で、リゾチーム　１０μｇ
をプロナーゼ　１０μｇで消化した結果、残存酵素活性
の半減期（１１／２）は、天然型リゾチームでは５６分
、変異型リゾチームては７０分であった。したかって、
変異型リソチームは、酵素消化に対する安定性も増加し
たことかわかった。結果を、第６図に示した。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＥＲＩ　　８６０２の構築模式図
並びにプラスミドｐＧＥＬ１．２５およびプラスミドｐ
ＥＲＩ　　８６０２の制限酵素切断地図、第２図はＭ　
１３ｍｐｌ　８　ＸｈＬ　ＺＭの構築模式図、第３図は
プラスミドｐＥＲＩ８８］］の構築模式図、並びに制限
酵素切断地図、第４図は高速液体クロマドグラフィーに
よる変異タンパク質の溶出状態を示すグラフ、第５図は
天然型および精製変異型ヒトリゾチームの活性の温度依
存性を示すグラフ、第６図はタンパク質分解酵素（プロ
ナーゼ）によるリゾチームの消化実験から得られた、天
然型および変異型リゾチームの残存酵素活性の時間変化
を示したグラフ、第７図は天然型ヒトリゾチームのアミ
ノ酸配列およびそれをコードしているＤＮＡのヌクレオ
チド配列を示す模式図である。 特許出願人　株式会社　蛋白工学研究所式　理　人　弁
理士　青　山　　葆　（外１名）シバ５１Ｊ Ｃｊ　）−（ ＯＬ　）−＜ ωｃ１（ｊ　Ｌ） Ｌ／’ｌ　）−（ いくＨ り＜ト ψＣ４）ＣＪ 菖くト 」＜ト いくト ＜＜ト η訃に Σくト ＜ト＜ くド （ｊ　（）− ０トく くＣＯ ψくト くくド つトく 〉ＣＯ ′；口だ 一ト＜ （（０（Ｊ ニドく ψくト く■Ｕ （）−（Ｊ　Ｃワ 一づトく −〉ＣＯ トドく ＯＱ （Ｃｊ　ＣＪ ＞　）−＜ 一■０ Φ（ＯＣＪ ５５！ニ ート＜ づトく 菖トく 、！！ｌ！ｉ：訃 ）−１＜）− ωドく トドく Ｈ＜＋ 、！５５ト Ｃ！ＩＩ　（Ｊ　（ワ ０　Ｌ　＋−＜ １−−　Ｊ：　（Ｊ■ トクト ψくＨ （（り　Ｏ −＜ト ■０Ｕ ｄＩ−＜ αトく ψくト くＣＯ Φトく 」ト＜ いトく （（Ｊ　（ｊ トドく ψくト ＜＜ト

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列の第８６位の
   グルタミンおよび第９２位のアラニンがアスパラギン酸
   で置き換えられたポリペプチドをコードしている変異ヒ
   トリゾチーム遺伝子。 ２、天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列の第８６位の
   グルタミンおよび第９２位のアラニンがアスパラギン酸
   で置き換えられたポリペプチドをコードしている変異ヒ
   トリゾチーム遺伝子と、シグナルペプチドをコードして
   いるヌクレオチド配列とを含有し、真核生物内で自律的
   に複製可能な変異型ヒトリゾチーム発現ベクター。 ３、プラスミドｐＥＲＩ８８１１である第２項記載の発
   現ベクター。 ４、第２項に記載の発現ベクターを用いて宿主を形質転
   換し、得られた形質転換体を培養し、培養液中に分泌さ
   れたヒトリゾチーム活性を有するタンパク質を分離し、
   所望により精製することからなる、天然型ヒトリゾチー
   ムの第８６位のグルタミンおよび第９２位のアラニンが
   アスパラギン酸で置き換えられた変異型ヒトリゾチーム
   の製造方法。 ５、宿主がサッカロマイセス・セレピシエＡＨ２２Ｒで
   ある第４項記載の方法。 ６、天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列の第８６位の
   グルタミンおよび第９２位のアラニンがアスパラギン酸
   で置き換えられている変異型ヒトリゾチーム。 ７、リゾチームに金属結合部位を構築することにより熱
   安定性および酵素消化に対する安定性を向上させる方法
   。