JPH02255698A - 血液凝固第８因子の製造法 - Google Patents
血液凝固第８因子の製造法Info
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- JPH02255698A JPH02255698A JP1079243A JP7924389A JPH02255698A JP H02255698 A JPH02255698 A JP H02255698A JP 1079243 A JP1079243 A JP 1079243A JP 7924389 A JP7924389 A JP 7924389A JP H02255698 A JPH02255698 A JP H02255698A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は血液凝面第ＶＩＩＩ因子の製造法に関する。
さらに詳しくは、本発明は血液凝面第ＶＩＩＩ因子に含
まれる夾雑蛋白をゲル濾過法により除去し、溶解性が良
好で、高純度の血液凝面第ＶＩＩＩ因子を製造するため
の方法に関する。
まれる夾雑蛋白をゲル濾過法により除去し、溶解性が良
好で、高純度の血液凝面第ＶＩＩＩ因子を製造するため
の方法に関する。
〔従来技術・発明が解決しようとする課題〕血液凝面第
ＶＩＩＩ因子は、７オンウイルブランド因子との複合体
として分子量ｌＯＯ万〜２０００万のマルチマーとして
体内で構成され、他の血漿蛋白質では頬を見ない高分子
として存在している。
ＶＩＩＩ因子は、７オンウイルブランド因子との複合体
として分子量ｌＯＯ万〜２０００万のマルチマーとして
体内で構成され、他の血漿蛋白質では頬を見ない高分子
として存在している。
血液凝面第ＶＩＩＩ因子は、従来より血友病Ａ患者の出
血の治療に使用されている。現在のところ血友病Ａ患者
への血液凝面第ＶＩＩＩ因子の補充にはクリオプレシピ
テート、あるいはこれを原料にＰＥＧ分画、エタノール
分画、グリシン分画などで作られる血液凝面第ＶＩＩＩ
因子濃縮製剤が用いられている。
血の治療に使用されている。現在のところ血友病Ａ患者
への血液凝面第ＶＩＩＩ因子の補充にはクリオプレシピ
テート、あるいはこれを原料にＰＥＧ分画、エタノール
分画、グリシン分画などで作られる血液凝面第ＶＩＩＩ
因子濃縮製剤が用いられている。
しかしながら、これらの製剤はフィブリノーゲンなどの
凝固性蛋白に富み、患者への負担が大きい、また、一般
にこれらの製剤は凍結乾燥した形で製剤化されており、
含有する凝固性蛋白によりその溶解が必ずしも容易では
ないという問題点がある。
凝固性蛋白に富み、患者への負担が大きい、また、一般
にこれらの製剤は凍結乾燥した形で製剤化されており、
含有する凝固性蛋白によりその溶解が必ずしも容易では
ないという問題点がある。
また、近年モノクローナル抗体を用いた製法も開発され
ているがこうした製剤においてはモノクローナル抗体の
混入が危惧されている。
ているがこうした製剤においてはモノクローナル抗体の
混入が危惧されている。
従って、本発明の目的は高純度の血液凝面第ＶＩＩＩ因
子製剤を提供することである。
子製剤を提供することである。
本発明の他の目的は溶解性に優れた血液凝面第ＶＩＩＩ
因子製剤を提供することである。
因子製剤を提供することである。
かかる実情に鑑みて本発明者らは鋭意研究を重ねた結果
、血液凝面第ＶＩＩＩ因子含有水溶液を、排除限界分子
量が８０万〜１億の水不溶性多孔質ゲルを用いるゲル濾
過に付すことによって、複雑な操作を用いることな（効
率的にフィブリノーゲンなどの凝固性蛋白が除去され、
溶解性の良好な血液凝固筒■因子が得られることを見出
し、さらに研究を重ねて本発明を完成した。
、血液凝面第ＶＩＩＩ因子含有水溶液を、排除限界分子
量が８０万〜１億の水不溶性多孔質ゲルを用いるゲル濾
過に付すことによって、複雑な操作を用いることな（効
率的にフィブリノーゲンなどの凝固性蛋白が除去され、
溶解性の良好な血液凝固筒■因子が得られることを見出
し、さらに研究を重ねて本発明を完成した。
すなわち、本発明は血液凝固筒■因子を製造するに当た
り、排除限界分子量が８０万〜１億の水不溶性多孔質ゲ
ルによるゲル濾過で血液凝固筒■因子を分離することを
特徴とし、従来の第■因子濃縮製剤の品質を向上するこ
とを目的としたものである。
り、排除限界分子量が８０万〜１億の水不溶性多孔質ゲ
ルによるゲル濾過で血液凝固筒■因子を分離することを
特徴とし、従来の第■因子濃縮製剤の品質を向上するこ
とを目的としたものである。
本発明に関して、血液凝固筒■因子はヒト由来である限
り特に限定されない。
り特に限定されない。
本発明の出発物質である血液凝面第ＶＩＩＩ因子含有水
溶液は、夾雑物を含有する血液凝面第ＶＩＩＩ因子含有
水溶液であれば特に限定されず、それは部分精製−され
たものであってもよい、血液凝固筒■因子は主として血
漿中に含まれていることから血漿を出発原料とすること
が好ましく、またクリオプレシピテート（寒冷型沈澱物
） （Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｈａ
ｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｚ、１１ ２１ （１９７０
） ＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓＤｉａｔｈｅｓｉｓ Ｈ
ａｅｓ＋ｏｕｒｈａｇｉｃａ ［＋ ６４ （１９６４
） ）などであってもよい、さらに、血液凝固筒■因子
を部分精製したものも使用される。その部分精製方法は
公知の手段により行われ、たとえば水酸化アルミニウム
ゲル処理、ポリエチレングリコール分画処理、エタノー
ル分画処理、グリシン分画処理、陰イオン交換体処理、
疎水性クロマト処理、アフィニティクロマトなどが挙げ
られる（米国特許第３６３０１０１８号明細書、同第３
６５２５３０号明細書、特公昭５５−１２８９０号公報
、特開昭６０−５１１１５号公報、同６３−１０８００
０号公報）、さらに、第■因子は加熱処理したものも利
用できる。（特開昭５８−７４６１７号公報、同５９−
１３４７３０号公報、同６１−２２０２２号公報、同６
０−５１１１６号公報）本発明においては、血液凝固筒
■因子をゲル濾過により精製することによって実施され
る。
溶液は、夾雑物を含有する血液凝面第ＶＩＩＩ因子含有
水溶液であれば特に限定されず、それは部分精製−され
たものであってもよい、血液凝固筒■因子は主として血
漿中に含まれていることから血漿を出発原料とすること
が好ましく、またクリオプレシピテート（寒冷型沈澱物
） （Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｈａ
ｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｚ、１１ ２１ （１９７０
） ＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓＤｉａｔｈｅｓｉｓ Ｈ
ａｅｓ＋ｏｕｒｈａｇｉｃａ ［＋ ６４ （１９６４
） ）などであってもよい、さらに、血液凝固筒■因子
を部分精製したものも使用される。その部分精製方法は
公知の手段により行われ、たとえば水酸化アルミニウム
ゲル処理、ポリエチレングリコール分画処理、エタノー
ル分画処理、グリシン分画処理、陰イオン交換体処理、
疎水性クロマト処理、アフィニティクロマトなどが挙げ
られる（米国特許第３６３０１０１８号明細書、同第３
６５２５３０号明細書、特公昭５５−１２８９０号公報
、特開昭６０−５１１１５号公報、同６３−１０８００
０号公報）、さらに、第■因子は加熱処理したものも利
用できる。（特開昭５８−７４６１７号公報、同５９−
１３４７３０号公報、同６１−２２０２２号公報、同６
０−５１１１６号公報）本発明においては、血液凝固筒
■因子をゲル濾過により精製することによって実施され
る。
ゲル濾適用担体は排除限界分子量が８０万〜１億の水不
溶性多孔質ゲルであれば、特に限定されない、たとえば
、架橋デキストラン系ではセフアク１ｊルー４００．５
００．１０００ （ファルマシア社製）、アガロース系
ではセファロース−２Ｂ。
溶性多孔質ゲルであれば、特に限定されない、たとえば
、架橋デキストラン系ではセフアク１ｊルー４００．５
００．１０００ （ファルマシア社製）、アガロース系
ではセファロース−２Ｂ。
＝４Ｂ（ファルマシア社製）、バイオゲルＡ−５０ｍ、
−１５ｍ（バイオ・ラット社製）などが挙げられる。
−１５ｍ（バイオ・ラット社製）などが挙げられる。
担体の前処理及び展開の溶媒としてはｐＨ６〜８、イオ
ン強度１〜２０００ｍＭ程度の緩衝液が挙げられる。具
体的には、５〜５０ｍＭ）リス緩衝液（ｐＨ７〜９）、
１０〜１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６〜８）などが用
いられる。
ン強度１〜２０００ｍＭ程度の緩衝液が挙げられる。具
体的には、５〜５０ｍＭ）リス緩衝液（ｐＨ７〜９）、
１０〜１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６〜８）などが用
いられる。
試料としてはカラム容量の５〜１０％が望ましい、こう
して血液凝固第１画分を含有する両分を回収することに
より精製・製造することが出来る。
して血液凝固第１画分を含有する両分を回収することに
より精製・製造することが出来る。
なお、好ましくは分子量１００万以上の両分を回収する
。
。
得られた血液凝固筒■因子は公知の精製方法を用いてさ
らに精製することができる（グリシンと食塩を用いる第
■因子の塩析（Ｔｈｏｒｅｌｌ ら、Ｔｈｒｏｓｂ、
Ｒｅｓ、、 ３５．４３１−４５０．１９８４ ）及び
アミンヘキシル−セファロースを用いた方法〔＾ｕｓｔ
ｅｎ＋Ｂｒ、 Ｊ、 Ｈａｅｍａｔｏｌ、 ４３
． ６６９−６７４． １９７９） ） 。
らに精製することができる（グリシンと食塩を用いる第
■因子の塩析（Ｔｈｏｒｅｌｌ ら、Ｔｈｒｏｓｂ、
Ｒｅｓ、、 ３５．４３１−４５０．１９８４ ）及び
アミンヘキシル−セファロースを用いた方法〔＾ｕｓｔ
ｅｎ＋Ｂｒ、 Ｊ、 Ｈａｅｍａｔｏｌ、 ４３
． ６６９−６７４． １９７９） ） 。
製剤化にあたっては、たとえば安定化剤の添加、配合剤
の添加、除菌濾過、分注小分け、凍結乾燥などを施すこ
とができる。
の添加、除菌濾過、分注小分け、凍結乾燥などを施すこ
とができる。
かくして得られた凍結乾燥製剤は、用時注射用蒸留水な
どに溶解して注射などによって投与される。
どに溶解して注射などによって投与される。
本発明の製造方法によって得られた血液凝固筒■因子の
投与量は従来の製剤に準ずればよい。
投与量は従来の製剤に準ずればよい。
実施例１
正常ヒト・血漿を凍結融解して得られたクリオプレシピ
テートを出発材料に、これを２０ｍＭトリス−１０ｍＭ
クエン酸緩衝液（ｐＨ７゜０）で５倍抽出溶解し、水酸
化アルミニウムゲルをクリオプレシピテート投入重量の
１／１０容量を添加して３０分間撹拌した。その後ベン
トナイトを６ｇ／ｌの割合で添加して１時間撹拌後４０
００ｒｐｍ３０分間遠心分離し上清を得、続いてウィル
ス不活化のための界面活性剤処理（０，３％Ｔｒｉ−ｎ
−ｂｕｔｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ 、 １％Ｔｉ１ｅ
ｅｎ ８０の濃度になるように添加後、３０℃、６時間
撹拌）を行い、これをグリシン分画に供した。グリシン
分画の条件は、この溶液にグリシンを１５０ ｇ／ｌの
割合で添加して３０°Ｃ５１時間撹拌後遠心分＃（４０
００ｒｐｍ、３０分間、３０℃）して上清を得、この上
清に塩化ナトリウムを添加（８７ｇ／ｌ）後１時間撹拌
して第■囚子画分を塩析させ遠心沈澱（４０００ｒｐｍ
、３０分間、３０°Ｃ）を得た。
テートを出発材料に、これを２０ｍＭトリス−１０ｍＭ
クエン酸緩衝液（ｐＨ７゜０）で５倍抽出溶解し、水酸
化アルミニウムゲルをクリオプレシピテート投入重量の
１／１０容量を添加して３０分間撹拌した。その後ベン
トナイトを６ｇ／ｌの割合で添加して１時間撹拌後４０
００ｒｐｍ３０分間遠心分離し上清を得、続いてウィル
ス不活化のための界面活性剤処理（０，３％Ｔｒｉ−ｎ
−ｂｕｔｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ 、 １％Ｔｉ１ｅ
ｅｎ ８０の濃度になるように添加後、３０℃、６時間
撹拌）を行い、これをグリシン分画に供した。グリシン
分画の条件は、この溶液にグリシンを１５０ ｇ／ｌの
割合で添加して３０°Ｃ５１時間撹拌後遠心分＃（４０
００ｒｐｍ、３０分間、３０℃）して上清を得、この上
清に塩化ナトリウムを添加（８７ｇ／ｌ）後１時間撹拌
して第■囚子画分を塩析させ遠心沈澱（４０００ｒｐｍ
、３０分間、３０°Ｃ）を得た。
その後、塩析沈澱を２０ｍＭ）リス緩衝液（ｐＨ７，０
）に溶解し２８０ ｎｍ吸光度を２５〜３０に調整した
後ゲル濾過カラムの注入検体とした。カラムの充填剤は
ファルマシア製の５ｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−４００ＨＲ
を使用し、検体はカラムベツド容量の５〜７％の注入量
でカラムより排出された第■囚子活性画分を分取した。
）に溶解し２８０ ｎｍ吸光度を２５〜３０に調整した
後ゲル濾過カラムの注入検体とした。カラムの充填剤は
ファルマシア製の５ｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−４００ＨＲ
を使用し、検体はカラムベツド容量の５〜７％の注入量
でカラムより排出された第■囚子活性画分を分取した。
その条件は、次の通りである：注入サンプル；塩析沈′
ｔｉ溶解液 カラム： ５ｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−４００ＨＲ＜１．
５ｃｒａ １．０． Ｘ ９０ｃｍ ｂｅｄ ｖｏｌ、
ｃａ１６０ｍｌ）流速： ０．３ ｍｌ／ｓｉｎ。
ｔｉ溶解液 カラム： ５ｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−４００ＨＲ＜１．
５ｃｒａ １．０． Ｘ ９０ｃｍ ｂｅｄ ｖｏｌ、
ｃａ１６０ｍｌ）流速： ０．３ ｍｌ／ｓｉｎ。
ｌ８媒： ２０５Ｍ Ｔｒｉｓ （ＨＣＩ）＋
１０ｍＭ ＣａＣ１，。
１０ｍＭ ＣａＣ１，。
ＩＭ ＮａＣｌ ｂｕｆｆｅｒ、 ｐＨ７，０その結果
、第１図に示す様に血液凝面第ＶＩＩＩ因子はカラムボ
イド画分に観察され、夾雑蛋白が高度に分離されていた
。
、第１図に示す様に血液凝面第ＶＩＩＩ因子はカラムボ
イド画分に観察され、夾雑蛋白が高度に分離されていた
。
実施例２〜６
実施例１と同様にして、ゲル濾過法による血液凝面第Ｖ
ＩＩＩ因子の精製の度合を、活性および夾雑する蛋白量
の回収率で調べた。その条件は次の通りである。
ＩＩＩ因子の精製の度合を、活性および夾雑する蛋白量
の回収率で調べた。その条件は次の通りである。
注入サンプル：塩析沈澱溶解液
カラム： ５ｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−４００ＨＲ（１，
５ｃｍ １．Ｄ、 Ｘ ９０ｃｓ ｂｅｄ ｖｏｌ、
ｃａ１６０ｍｌ）溶媒としては実施例１と同一のものを
使用した。
５ｃｍ １．Ｄ、 Ｘ ９０ｃｓ ｂｅｄ ｖｏｌ、
ｃａ１６０ｍｌ）溶媒としては実施例１と同一のものを
使用した。
なお、実施例５および６においては５ｅｐｈａｃｒｙｌ
Ｓ−４００ＨＲｃｏｌｕｍｎ ｓｉｚｅ（５ｃｍ ＣＤ
、 Ｘ ９０ｃｍ ｂｅｄ ｃａ１７００ｍ ｌ ）を
用いた。
Ｓ−４００ＨＲｃｏｌｕｍｎ ｓｉｚｅ（５ｃｍ ＣＤ
、 Ｘ ９０ｃｍ ｂｅｄ ｃａ１７００ｍ ｌ ）を
用いた。
ゲル濾過にかける前（ａρρ１ｉｅｄ）とゲル濾過後の
排除限界分子量以上の分画（ｖｏｉｄ）で血液凝面第Ｖ
ＩＩＩ因子活性および蛋白量を測定した。結果を第１表
に示す。
排除限界分子量以上の分画（ｖｏｉｄ）で血液凝面第Ｖ
ＩＩＩ因子活性および蛋白量を測定した。結果を第１表
に示す。
〔発明の効果］
実施例からも明らかなように、本発明の処理によって血
液凝面第ＶＩＩＩ囚子が効率的に精製され、事実上夾雑
蛋白の極めて低い熔解性の良好な製剤が提供されるとい
う効果がもたらされる。
液凝面第ＶＩＩＩ囚子が効率的に精製され、事実上夾雑
蛋白の極めて低い熔解性の良好な製剤が提供されるとい
う効果がもたらされる。
従って、本発明の方法は血液凝面第ＶＩＩＩ因子の医療
用製剤を調製するために極めて有用と考えられる。
用製剤を調製するために極めて有用と考えられる。
〔以下余白）
４、
第１図は本発明のゲル濾過による血液凝固筒■因子の展
開パターンを示す。 に
開パターンを示す。 に
Claims (1)
- 血液凝固第VIII因子含有水溶液を、排除限界分子量が
８０万〜１億の水不溶性多孔質ゲルを用い、ゲル濾過に
より血液凝面第VIII因子を分離することを特徴とする血
液凝固第VIII因子の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1079243A JP2931319B2 (ja) | 1989-03-29 | 1989-03-29 | 血液凝固第▲ｖｉｉｉ▼因子の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1079243A JP2931319B2 (ja) | 1989-03-29 | 1989-03-29 | 血液凝固第▲ｖｉｉｉ▼因子の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02255698A true JPH02255698A (ja) | 1990-10-16 |
| JP2931319B2 JP2931319B2 (ja) | 1999-08-09 |
Family
ID=13684419
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1079243A Expired - Lifetime JP2931319B2 (ja) | 1989-03-29 | 1989-03-29 | 血液凝固第▲ｖｉｉｉ▼因子の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2931319B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2928382B2 (ja) * | 1990-11-28 | 1999-08-03 | 川崎製鉄株式会社 | 極低炭素アルミキルド鋼の連続鋳造方法 |
| WO2000061633A1 (fr) * | 1999-04-12 | 2000-10-19 | Fujimori Kogyo Co., Ltd. | Procede de purification du facteur viii de coagulation sanguine et du complexe de facteur viii de coagulation sanguine et de facteur von willebrand |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5257310A (en) * | 1975-11-07 | 1977-05-11 | Behringwerke Ag | Antiihemophilia agent and preparation thereof |
-
1989
- 1989-03-29 JP JP1079243A patent/JP2931319B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5257310A (en) * | 1975-11-07 | 1977-05-11 | Behringwerke Ag | Antiihemophilia agent and preparation thereof |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2928382B2 (ja) * | 1990-11-28 | 1999-08-03 | 川崎製鉄株式会社 | 極低炭素アルミキルド鋼の連続鋳造方法 |
| WO2000061633A1 (fr) * | 1999-04-12 | 2000-10-19 | Fujimori Kogyo Co., Ltd. | Procede de purification du facteur viii de coagulation sanguine et du complexe de facteur viii de coagulation sanguine et de facteur von willebrand |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2931319B2 (ja) | 1999-08-09 |
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