JPH0225751A - 腫瘍診断法 - Google Patents
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- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
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- G—PHYSICS
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
１豆立直１
本発明は医学診断方法に関し、さらに詳しくは、神経成
長因子受容体担荷ｇｆ４ （ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ
ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅａｒｉｎｇ
ｔｕｍｏｒ）の存在を確定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ
診断方法に関する。
長因子受容体担荷ｇｆ４ （ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ
ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅａｒｉｎｇ
ｔｕｍｏｒ）の存在を確定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ
診断方法に関する。
ヒト血清または尿中の特異的可溶性蛋白の存在は、様々
な腫瘍および疾病状態の検知および診断、ならびにこれ
らの状態の内科的外科的管理の効果の判定に用いられて
きた。これらの可溶性因子としては、多発性骨１ｆｉｌ
ｌｉ患者の“ベンスージョーンズ蛋白、胎児性癌抗原（
ＣＥＡ） 、ならびに肺の小細胞癌および類表皮癌、髄
質性甲状腺癌、胃および食道癌の患者における上皮成長
因子がある。最近、別の蛋白のインターロイキン２受容
体（ＩＬ−２Ｒ）が各種自己免疫疾患、たとえば全身性
エリテマトーデス（ＳＬＥ）、慢性関節リウマチ、痛風
、細菌性心内膜炎、■型インシュリン依存性糖尿病およ
び活性型慢性自己免疫性肝炎に対するマーカーとして、
またＴ−およびＢ−細胞性白血病のマーカとして、その
可能性がかなり注目されるようになってきた。
な腫瘍および疾病状態の検知および診断、ならびにこれ
らの状態の内科的外科的管理の効果の判定に用いられて
きた。これらの可溶性因子としては、多発性骨１ｆｉｌ
ｌｉ患者の“ベンスージョーンズ蛋白、胎児性癌抗原（
ＣＥＡ） 、ならびに肺の小細胞癌および類表皮癌、髄
質性甲状腺癌、胃および食道癌の患者における上皮成長
因子がある。最近、別の蛋白のインターロイキン２受容
体（ＩＬ−２Ｒ）が各種自己免疫疾患、たとえば全身性
エリテマトーデス（ＳＬＥ）、慢性関節リウマチ、痛風
、細菌性心内膜炎、■型インシュリン依存性糖尿病およ
び活性型慢性自己免疫性肝炎に対するマーカーとして、
またＴ−およびＢ−細胞性白血病のマーカとして、その
可能性がかなり注目されるようになってきた。
中枢および末梢神経系の腫瘍の新生における神経成長因
子（ＮＧＦ）またはその受容体（ＮＧＦＲ）の意義につ
いても何年も前から考えられてきた。ＮＧＦの研究の歴
史の総説としては、たとえばＲ，Ｌｅｖｉ−Ｈｏｎｔａ
ｌｃｉｎｉ ： ５ｃｉｅｎｃｅ 、 ２３７ ：
１１５４〜１１６６（１９８７）がある。その結果、ヒ
ト細胞および組織中におけるＮＧＦＲの存在の確認が、
ある種の腫瘍の診断手段としで提案されてきた。Ｆａｂ
ｒｉｃａｎｔらは、たとえば、培養ヒト黒色ｆｌｌＩｌ
砲（Ａ８７５）上にＮＧＦＨの存在を報告している（Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃ＋、 ＵＳＡ
、 ７４−仁ｐ ： ５６５〜５６９．１９７７＞。精
製マウスＮＧＦ （２，５８，β−サブユニットブレバ
レ一ジョン）を ■で放射標識すると、Ａ３７５黒色
腫細胞と容易に結合することが明らかにされた。
子（ＮＧＦ）またはその受容体（ＮＧＦＲ）の意義につ
いても何年も前から考えられてきた。ＮＧＦの研究の歴
史の総説としては、たとえばＲ，Ｌｅｖｉ−Ｈｏｎｔａ
ｌｃｉｎｉ ： ５ｃｉｅｎｃｅ 、 ２３７ ：
１１５４〜１１６６（１９８７）がある。その結果、ヒ
ト細胞および組織中におけるＮＧＦＲの存在の確認が、
ある種の腫瘍の診断手段としで提案されてきた。Ｆａｂ
ｒｉｃａｎｔらは、たとえば、培養ヒト黒色ｆｌｌＩｌ
砲（Ａ８７５）上にＮＧＦＨの存在を報告している（Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃ＋、 ＵＳＡ
、 ７４−仁ｐ ： ５６５〜５６９．１９７７＞。精
製マウスＮＧＦ （２，５８，β−サブユニットブレバ
レ一ジョン）を ■で放射標識すると、Ａ３７５黒色
腫細胞と容易に結合することが明らかにされた。
さらに最近になって、Ｒｏｓｓらは、モノクローナル抗
体を用いて神経冠腫瘍中のＮＧＦＲの性質を明らかにし
た（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、
ＵＳＡ、８１：６６８１〜６６８５．１９８４）。モ
ノクローナル抗体はたとえば、免疫原としてヒト黒色腫
細胞系ＷＭ ２４５細砲を用いてマウスでパイブリドー
マ細胞を得ることによって製造され、モノクローナル抗
体２０．４ （ＩａＧ）が得られた。ＮＧＦＲは、黒色
！ｌＩ胞上で、正常メラニン形成細胞上よりもはるかに
大量に発現されることが明らかにされている。
体を用いて神経冠腫瘍中のＮＧＦＲの性質を明らかにし
た（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、
ＵＳＡ、８１：６６８１〜６６８５．１９８４）。モ
ノクローナル抗体はたとえば、免疫原としてヒト黒色腫
細胞系ＷＭ ２４５細砲を用いてマウスでパイブリドー
マ細胞を得ることによって製造され、モノクローナル抗
体２０．４ （ＩａＧ）が得られた。ＮＧＦＲは、黒色
！ｌＩ胞上で、正常メラニン形成細胞上よりもはるかに
大量に発現されることが明らかにされている。
ヨーロッパ特許出願用２０２，００５号（１９８６年１
１月２０日公告）には、平均分子量的７５．０００ダル
トンのＮＧＦＲに特異的な抗体とヒトＩ［砲を接触させ
ることによって神経冠腫瘍を検出する診断方法が開示さ
れている。
１月２０日公告）には、平均分子量的７５．０００ダル
トンのＮＧＦＲに特異的な抗体とヒトＩ［砲を接触させ
ることによって神経冠腫瘍を検出する診断方法が開示さ
れている。
上述のＮＧＦＲレベルの測定方法には、試験組織のバイ
オプシーといった望ましくない侵襲的操作が必須の組織
学的同定が包含される。
オプシーといった望ましくない侵襲的操作が必須の組織
学的同定が包含される。
１に星皇皇且」
本発明は、神経成長因子受容体担荷腫瘍に罹患している
患者におけるその腫瘍の存在を確定するｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ診断方法を提供するものである。この方法は、上記患
者からの体液サンプルについて、神経成長因子受容体断
片（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈｆ
ａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｒｏ、 Ｎ Ｇ Ｆ Ｒｔ
＞レベルの上昇を確認するものである。本診断方法は
、以下に、架１／免疫沈降アッセイによる尿中のＮＧＦ
Ｒｔの検出および半定盪法の例によって詳細に説明する
。
患者におけるその腫瘍の存在を確定するｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ診断方法を提供するものである。この方法は、上記患
者からの体液サンプルについて、神経成長因子受容体断
片（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈｆ
ａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｒｏ、 Ｎ Ｇ Ｆ Ｒｔ
＞レベルの上昇を確認するものである。本診断方法は
、以下に、架１／免疫沈降アッセイによる尿中のＮＧＦ
Ｒｔの検出および半定盪法の例によって詳細に説明する
。
しかしながら、このイムノアッセイは、他の体液たとえ
ば血液、脳を髄液についても同様に実施できるものであ
る。
ば血液、脳を髄液についても同様に実施できるものであ
る。
この診断方法の主な利点は上述のような腫瘍の初期の、
非侵襲的検出にある。また、既に確診され治療が行われ
ている患者における腫瘍の低減のモニタリングへの利用
が臨床的に重要であろうと考えられる。この生化学的ア
ッセイは、緩解患者の再発を簡便かつ非侵襲的に検出す
る方法を提供する。
非侵襲的検出にある。また、既に確診され治療が行われ
ている患者における腫瘍の低減のモニタリングへの利用
が臨床的に重要であろうと考えられる。この生化学的ア
ッセイは、緩解患者の再発を簡便かつ非侵襲的に検出す
る方法を提供する。
最近、本発明者らは、ラットの羊水、新生１尿および新
生仔血漿中に、切断された型の神経成長因子受容体（Ｎ
ＧＦＲｔ）を同定した。この結果は、ＤｉＳｔｅｐｈａ
ｎｏおよびＪＯｈｎＳＯｎによって、ｐｒｏｃ。
生仔血漿中に、切断された型の神経成長因子受容体（Ｎ
ＧＦＲｔ）を同定した。この結果は、ＤｉＳｔｅｐｈａ
ｎｏおよびＪＯｈｎＳＯｎによって、ｐｒｏｃ。
Ｈｏ口、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、 ８５ ：
２７０〜２７４（１９８８）に発表されている。この
５０キロダルトンの蛋白は、モノクローナル抗体との免
疫沈降によって検出され、ドデシル硫酸ナトリウム−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動 （ＮａＤｏｄＳＯ４−ＰＡＧＥ）ついでオートラジオグ
ラフィーによって分析された。
２７０〜２７４（１９８８）に発表されている。この
５０キロダルトンの蛋白は、モノクローナル抗体との免
疫沈降によって検出され、ドデシル硫酸ナトリウム−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動 （ＮａＤｏｄＳＯ４−ＰＡＧＥ）ついでオートラジオグ
ラフィーによって分析された。
本発明は、ヒト体液中のＮＧＦＲｔレベルの上昇の確認
が、担ＮＧＦＲＩ！！瘍、たとえば神経芽腫、黒色腫、
軟骨肉腫、神経硝腫およびユーイング肉腫の存在のイン
デイケータ−として使用できることを発見し、完成され
たものである。
が、担ＮＧＦＲＩ！！瘍、たとえば神経芽腫、黒色腫、
軟骨肉腫、神経硝腫およびユーイング肉腫の存在のイン
デイケータ−として使用できることを発見し、完成され
たものである。
発明の詳細な説明
する要旨が特定的に指摘され、明確に請求されているが
、図面を参照しながら好ましい態様について以下に詳細
に説明する。これは本発明のよりよう理解に役立つもの
と考える。
、図面を参照しながら好ましい態様について以下に詳細
に説明する。これは本発明のよりよう理解に役立つもの
と考える。
第１図は、 Ｉ−ＮＧＦに架橋され、抗一ＮＧＦＲ
モノクローナル抗体（ＭＡｂ２Ｑ，４）で免疫沈降した
ＮＧＦＲまたはＮＧＦＲｔのオートラジオグラムである
。レーン１〜３はへ８７５黒色腫１ｌ胞の条件メジウム
（ＣＭ）のサンプルで、約７５ＫＤａに受容体種を示し
ている。レーン４〜６はＡ８７５［１１］Ｎから可溶化
した受容体で、９０ＫＤａに種を示している。レーン３
および６は、４００倍過剰の非標識ＮＧＦの存在下にお
ける免疫沈降である。ＳＰは特異的結合レーン、ＮＳＰ
は非特異的結合レーンである。分子量標準はキロダルト
ン（ＫＤａ）で、第１図〜第３図の右側に示してある。
モノクローナル抗体（ＭＡｂ２Ｑ，４）で免疫沈降した
ＮＧＦＲまたはＮＧＦＲｔのオートラジオグラムである
。レーン１〜３はへ８７５黒色腫１ｌ胞の条件メジウム
（ＣＭ）のサンプルで、約７５ＫＤａに受容体種を示し
ている。レーン４〜６はＡ８７５［１１］Ｎから可溶化
した受容体で、９０ＫＤａに種を示している。レーン３
および６は、４００倍過剰の非標識ＮＧＦの存在下にお
ける免疫沈降である。ＳＰは特異的結合レーン、ＮＳＰ
は非特異的結合レーンである。分子量標準はキロダルト
ン（ＫＤａ）で、第１図〜第３図の右側に示してある。
第２図は、５例の新生児の尿からＮＧＦＲｔの免疫沈降
のオートラジオグラムである（レーン１。
のオートラジオグラムである（レーン１。
３、５，７．９）。レーン２．４．６．８．１０は４０
０倍過剰の非標識ＮＧＦの存在下における免疫沈降であ
る。新生児の年齢は、レーン１，２については４月、レ
ーン３．４については出生直後、レーン５，６は７月、
レーン７．８は１日、レーン９．１０は１週である。
０倍過剰の非標識ＮＧＦの存在下における免疫沈降であ
る。新生児の年齢は、レーン１，２については４月、レ
ーン３．４については出生直後、レーン５，６は７月、
レーン７．８は１日、レーン９．１０は１週である。
第３図は、神軽芽ＩＩ（レーン１）、ユーイング肉腫（
レーン２）、神経鞘腫（レーン３）、軟骨肉ｆｉ！（レ
ーン４）および黒色腫（レーン５．６）患者の尿から免
疫沈降されたＮＧＦＲ ｔのオートラジオグラムである
。レーン５はＮ Ｇ Ｆ Ｒ ｉ ｍ性だが、レーン６
は陰性である。
レーン２）、神経鞘腫（レーン３）、軟骨肉ｆｉ！（レ
ーン４）および黒色腫（レーン５．６）患者の尿から免
疫沈降されたＮＧＦＲ ｔのオートラジオグラムである
。レーン５はＮ Ｇ Ｆ Ｒ ｉ ｍ性だが、レーン６
は陰性である。
神経成長因子受容体断片（ＮＧＦＲｆ）の存在の確認は
、以下に、２−サイト架橋免疫沈降アッセイによって例
示する。ＮＧＦＲが膜会合蛋白であり、 Ｉ−ＮＧ
Ｆがそれに化学的に架橋されると適当な抗体によって特
異的に免疫沈降を受け、ドデシル硫酸ナトリウム−ボリ
アクリルアミドゲル電気泳動後にオートラジオグラフィ
ーで可視化できることは公知である。この操作では通常
、９０〜１００ＫＤａおよび約２２０ＫＤａ （多分９
０ＫＤａ種のダイマー）に標識バンドを生じる（ Ｇｒ
ａｂら： Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８ ０ ：６８１９〜６８
２３．１９８３参照）、免疫沈降アッセイにはここでは
、 Ｉ−ＮＧＦに架橋され、ヒト特異的抗ーＮＧＦ
Ｒモノクローナル抗体で免疫沈降させたＮＧＦＲおよび
ＮＧＦＲ ｔのオートラジオグラムを使用寸る。ＮＧＦ
ＲｔはＮ ａ Ｄ ｏ ｄ Ｓ Ｏ ４ − Ｐ Ａ
Ｇ Ｅゲル中約５０〜７０キロダル１−ンの範囲に、標
識バンドによって可視化ざれる。
、以下に、２−サイト架橋免疫沈降アッセイによって例
示する。ＮＧＦＲが膜会合蛋白であり、 Ｉ−ＮＧ
Ｆがそれに化学的に架橋されると適当な抗体によって特
異的に免疫沈降を受け、ドデシル硫酸ナトリウム−ボリ
アクリルアミドゲル電気泳動後にオートラジオグラフィ
ーで可視化できることは公知である。この操作では通常
、９０〜１００ＫＤａおよび約２２０ＫＤａ （多分９
０ＫＤａ種のダイマー）に標識バンドを生じる（ Ｇｒ
ａｂら： Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８ ０ ：６８１９〜６８
２３．１９８３参照）、免疫沈降アッセイにはここでは
、 Ｉ−ＮＧＦに架橋され、ヒト特異的抗ーＮＧＦ
Ｒモノクローナル抗体で免疫沈降させたＮＧＦＲおよび
ＮＧＦＲ ｔのオートラジオグラムを使用寸る。ＮＧＦ
ＲｔはＮ ａ Ｄ ｏ ｄ Ｓ Ｏ ４ − Ｐ Ａ
Ｇ Ｅゲル中約５０〜７０キロダル１−ンの範囲に、標
識バンドによって可視化ざれる。
この架橋一免疫沈降アツセイはＴａｎｉｕｃｈｉら（Ｐ
ｒｏｃ． Ｎａｔｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＬＩＳ
Ａ． ８ ３ ： ４ ０９ ４〜４０９８．１９８６
）によって報告ざれている完全神経成長因子受容体（Ｎ
ＧＦＲ）の免疫沈降７ツセイの場合とほぼ同様にして実
施できる。使用できるアッセイの一例を示せば次のとお
りである。
ｒｏｃ． Ｎａｔｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＬＩＳ
Ａ． ８ ３ ： ４ ０９ ４〜４０９８．１９８６
）によって報告ざれている完全神経成長因子受容体（Ｎ
ＧＦＲ）の免疫沈降７ツセイの場合とほぼ同様にして実
施できる。使用できるアッセイの一例を示せば次のとお
りである。
《１》 放射性ヨード化マウスＮＧＦもしくは１２５
１−ＮＧＦの調製をする ｆ２１ＮＧＦＲｔを含有する尿または他の体液サンブル
を Ｉ−ＮＧＦとインキュベートして結合させる ＋３１ １ − Ｎ Ｇ Ｆ結合受容体を１−エ
チル−３−（ジメチノレアミノブロビノレ）カノレボジ
イミド（ＥＤＣ）で架橋する （４）架橋された受容体を択一Ｎ Ｇ Ｆ Ｒ ｔ−ノ
クローナル抗体で免疫沈降する ｛５｝ 免疫沈降を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動、ついでオートラジオグラ
フィーによって分析する 本発明の診断方法には、他のイムノアッセイ操作、たと
えば１−サイトおよび２−サイ１・ラジオイムノアッセ
イ、ならびにエンザイムイムノアッセイ、たとえばＥｎ
ｇｖａ Ｉ ＩおよびＰｅｒｌｍａｎｎ （ Ｊ。
１−ＮＧＦの調製をする ｆ２１ＮＧＦＲｔを含有する尿または他の体液サンブル
を Ｉ−ＮＧＦとインキュベートして結合させる ＋３１ １ − Ｎ Ｇ Ｆ結合受容体を１−エ
チル−３−（ジメチノレアミノブロビノレ）カノレボジ
イミド（ＥＤＣ）で架橋する （４）架橋された受容体を択一Ｎ Ｇ Ｆ Ｒ ｔ−ノ
クローナル抗体で免疫沈降する ｛５｝ 免疫沈降を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動、ついでオートラジオグラ
フィーによって分析する 本発明の診断方法には、他のイムノアッセイ操作、たと
えば１−サイトおよび２−サイ１・ラジオイムノアッセ
イ、ならびにエンザイムイムノアッセイ、たとえばＥｎ
ｇｖａ Ｉ ＩおよびＰｅｒｌｍａｎｎ （ Ｊ。
Ｉｍｍｕｎｏｌ 、、１０９ ： １ ２９ 〜１３５
． １９７２）によって報告されたエンザイムーリンク
ト・イムノアブソーベント・アッセイ（ＥＬＩＳＡ）も
同様に使用できる。
． １９７２）によって報告されたエンザイムーリンク
ト・イムノアブソーベント・アッセイ（ＥＬＩＳＡ）も
同様に使用できる。
モノクローナル抗体の製造は、たとえばにｏｈｌｅｒお
よびＨｉｌｓｔｅｉｎ （Ｎａｔｕｒｅ、 ２５６ ：
４９５〜４９７ 、１９７５ ： Ｅｕｒ、 Ｊ、
Ｉｍｍｕｎｏｌ、、旦：５１１〜５１９．１９７６）に
よって報告されているような慣用のハイブリドーマ操作
によって実施できる。
よびＨｉｌｓｔｅｉｎ （Ｎａｔｕｒｅ、 ２５６ ：
４９５〜４９７ 、１９７５ ： Ｅｕｒ、 Ｊ、
Ｉｍｍｕｎｏｌ、、旦：５１１〜５１９．１９７６）に
よって報告されているような慣用のハイブリドーマ操作
によって実施できる。
この方法によれば、組織培養に適合させたマウス骨髄腫
ｌｌＡｒ１１を、免疫感作マウスからの牌臓細胞に融合
し、大量の単一抗体分子を産生ずるハイブリッド細胞を
得る。本発明においては所望の抗−ＮＧＦＲ活性を生じ
させるための免疫原として、ＮＧＦＲまたはＮＧＦＲｔ
源を使用する。適当なマウス骨髄腫細胞系は、５ｃｈｕ
Ｉｍａｎら（Ｎａｔｕｒｅ、 ２７６ ： ２６９〜
２７０．１９７８＞によって定義されたＢＡＬＢ／Ｃ起
源の、よく知られたＳＰ２１０−Ａｇ１４細胞系である
。このｂ１示は参考として本川ＩＩＩに導入する。これ
らの細胞のサンプルは、アメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクシ：ｌ ン（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、 Ｈｄ、
）から登録番号ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８１として一般
に利用できる。骨髄腫細胞と免疫感作牌臓細胞の融合を
行うのに適当な方法は、Ｇａ Ｉ ｒ ｒｅら（Ｎａｔ
ｕｒｅ、 ２６６ ： ５５０〜５５２．１９７７＞に
よって報告された慣用方法であり、ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）が単層として生育している細胞に対する
融合剤として用いられる。細胞はＬｉｔｔｌｅ４ｉｅｌ
ｄ （Ｓｃｉｅｎｃｅ 、ユ±５ニア０９．１９６４
）によって記載されたＨＡＴ （ヒボキサンチン、アミ
ノプテリンおよびデミジン）培地中で培養できる。
ｌｌＡｒ１１を、免疫感作マウスからの牌臓細胞に融合
し、大量の単一抗体分子を産生ずるハイブリッド細胞を
得る。本発明においては所望の抗−ＮＧＦＲ活性を生じ
させるための免疫原として、ＮＧＦＲまたはＮＧＦＲｔ
源を使用する。適当なマウス骨髄腫細胞系は、５ｃｈｕ
Ｉｍａｎら（Ｎａｔｕｒｅ、 ２７６ ： ２６９〜
２７０．１９７８＞によって定義されたＢＡＬＢ／Ｃ起
源の、よく知られたＳＰ２１０−Ａｇ１４細胞系である
。このｂ１示は参考として本川ＩＩＩに導入する。これ
らの細胞のサンプルは、アメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクシ：ｌ ン（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、 Ｈｄ、
）から登録番号ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８１として一般
に利用できる。骨髄腫細胞と免疫感作牌臓細胞の融合を
行うのに適当な方法は、Ｇａ Ｉ ｒ ｒｅら（Ｎａｔ
ｕｒｅ、 ２６６ ： ５５０〜５５２．１９７７＞に
よって報告された慣用方法であり、ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）が単層として生育している細胞に対する
融合剤として用いられる。細胞はＬｉｔｔｌｅ４ｉｅｌ
ｄ （Ｓｃｉｅｎｃｅ 、ユ±５ニア０９．１９６４
）によって記載されたＨＡＴ （ヒボキサンチン、アミ
ノプテリンおよびデミジン）培地中で培養できる。
以下に使用される例示的な抗−ＮＧＦＲモノクローナル
抗体２０．４ （ＩＱＧ）は、Ｃｈａｎｄｌｅｒら（Ｊ
、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｗ、、 ２５９ （１１） ：
６８８２〜６８８９．１９８４）による抗−ＮＧＦＲ
ｔ源２（Ｉ ｇＧ）の製造方法と同様の操作により、ラ
ット褐色ｍｔｓｍｍの代わりにヒト黒色腫細胞を免疫原
として用いて製造された（ ＲＯＳＳら二ｆｔｉ出参照
）。
抗体２０．４ （ＩＱＧ）は、Ｃｈａｎｄｌｅｒら（Ｊ
、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｗ、、 ２５９ （１１） ：
６８８２〜６８８９．１９８４）による抗−ＮＧＦＲ
ｔ源２（Ｉ ｇＧ）の製造方法と同様の操作により、ラ
ット褐色ｍｔｓｍｍの代わりにヒト黒色腫細胞を免疫原
として用いて製造された（ ＲＯＳＳら二ｆｔｉ出参照
）。
２０．４ハイブリドーマも、アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション（Ｒｏｃｋｙ ｉ ｌ Ｉｅ、
Ｈｄ ）から登録番号ＡＴＣＣＨＢ８７３７として入手
できる。
チャー・コレクション（Ｒｏｃｋｙ ｉ ｌ Ｉｅ、
Ｈｄ ）から登録番号ＡＴＣＣＨＢ８７３７として入手
できる。
モノクローナル抗体の製造および使用に関するその他の
背景情報については、−膜内な参考書、たとえばＧｏｄ
ｉ ｎＱ著、Ｈｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ＋Ｐｒ１ｎｃｉｐｌａｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉ
ｃｅ、 Ａｃａｄｅｍｉｃ ＰｒｅｓｓＩｎｃ、、 Ｎ
ｅｗ Ｗｏｒｋ、 １９８３刊を参考することができ
る。
背景情報については、−膜内な参考書、たとえばＧｏｄ
ｉ ｎＱ著、Ｈｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ＋Ｐｒ１ｎｃｉｐｌａｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉ
ｃｅ、 Ａｃａｄｅｍｉｃ ＰｒｅｓｓＩｎｃ、、 Ｎ
ｅｗ Ｗｏｒｋ、 １９８３刊を参考することができ
る。
以下の例は、本発明をさらに詳細に例示するものである
。本発明はこれらの特定の例によって限定されるもので
はないことを銘記すべきである。
。本発明はこれらの特定の例によって限定されるもので
はないことを銘記すべきである。
例
材料および方法
細胞培養、へ８７５黒色腫細胞はＧｅｏｒｇｅ Ｊ。
Ｔｏｄａｒｏの実験室から入手しく Ｆａｂｒｉｃａｎ
ｔら二萌出参照）、１０％ウシ胎仔面清（Ｆｅ２）含有
ＨｃＣｏｙの５ａ培地中で生育させた。２種のユーイン
グ細胞系、Ｅｓａ−１およびＲＤ−ＥＳはＡＴＣＣから
それぞれ登録番号ＡＴＣＣＨＴＢ８３およびＡＴＣＣＨ
ＴＢ１６６として購入し、前者にライては２５％ ＦＣ
８含有Ｈｃｃｏｙの５ａ培地中で、後者についてピルビ
ン酸ナトリウムおよび１５％ ＦＣ８含有ＲＰＭ１１６
４０中で生育させた。神経芽腫Ｉ砲系ＮＬＢ−１２７は
ＨｉｌｔＯｎＧＯ１ｄＳｔｅｉｎ博±ｌａｓｈｉｎｇｔ
ｏｎ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｃｈｏｏｌｏｒ Ｍｅ
ｄｉｃｉｎｅ）から恵与され、１％非必須アミノ酸およ
び２０％ＦＣ８含有最小必須培地上に維持した。
ｔら二萌出参照）、１０％ウシ胎仔面清（Ｆｅ２）含有
ＨｃＣｏｙの５ａ培地中で生育させた。２種のユーイン
グ細胞系、Ｅｓａ−１およびＲＤ−ＥＳはＡＴＣＣから
それぞれ登録番号ＡＴＣＣＨＴＢ８３およびＡＴＣＣＨ
ＴＢ１６６として購入し、前者にライては２５％ ＦＣ
８含有Ｈｃｃｏｙの５ａ培地中で、後者についてピルビ
ン酸ナトリウムおよび１５％ ＦＣ８含有ＲＰＭ１１６
４０中で生育させた。神経芽腫Ｉ砲系ＮＬＢ−１２７は
ＨｉｌｔＯｎＧＯ１ｄＳｔｅｉｎ博±ｌａｓｈｉｎｇｔ
ｏｎ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｃｈｏｏｌｏｒ Ｍｅ
ｄｉｃｉｎｅ）から恵与され、１％非必須アミノ酸およ
び２０％ＦＣ８含有最小必須培地上に維持した。
羊水および尿サンプル、羊水はＳｔ、 ＬｏｕｉｓのＪ
ｅｗｉｓｈ病院卵膜穿刺センターから入手した。正常小
児尿サンプルはＳｔ、 Ｌｏｕｉｓ小児病院の臨床化学
実験室から、神経芽腫またはユーイング肉腫患者の尿は
ｓｔ、 ＬＯｕｉＳ小児病院の血液学／腫瘍学部門から
供与された。黒色腫患者の尿はＳｔ、 ＬｏｕｉｓのＢ
ａｒｎｅｓ病院のＰｈ１ｌｌｉｐ Ｈｕｓｔｏｎｅから
、神軽鞘脛または軟肉腫患者の尿はＢａｒｎｅｓ病院の
Ｋｅｉｔｈ Ｒｉｃｈを通じて入手した。
ｅｗｉｓｈ病院卵膜穿刺センターから入手した。正常小
児尿サンプルはＳｔ、 Ｌｏｕｉｓ小児病院の臨床化学
実験室から、神経芽腫またはユーイング肉腫患者の尿は
ｓｔ、 ＬＯｕｉＳ小児病院の血液学／腫瘍学部門から
供与された。黒色腫患者の尿はＳｔ、 ＬｏｕｉｓのＢ
ａｒｎｅｓ病院のＰｈ１ｌｌｉｐ Ｈｕｓｔｏｎｅから
、神軽鞘脛または軟肉腫患者の尿はＢａｒｎｅｓ病院の
Ｋｅｉｔｈ Ｒｉｃｈを通じて入手した。
免疫沈降アッセイ、雄性マークス上顎下腺から精製した
Ｎ Ｇ Ｆ （Ｂｏｃｃｈｉｎｉ ＆ Ａｎｇｅｌｅｔ
ｔｉ ： Ｐｒｏｃ。
Ｎ Ｇ Ｆ （Ｂｏｃｃｈｉｎｉ ＆ Ａｎｇｅｌｅｔ
ｔｉ ： Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、６４ ：
７８９〜７９４゜１９６９）は非活性２０００〜３５
００ＣＥ１１／ｆｍｏｌにヨード化した（Ｈａｒｃｈａ
ｌｏｎｉｓ ： Ｂｉｏｃｈｅｍ。
７８９〜７９４゜１９６９）は非活性２０００〜３５
００ＣＥ１１／ｆｍｏｌにヨード化した（Ｈａｒｃｈａ
ｌｏｎｉｓ ： Ｂｉｏｃｈｅｍ。
Ｊ、、上エユ：２９９〜３０５．１９６９＞。細胞表面
上のＮＧＦＲは生理食塩水中で洗浄した細胞を、リン酸
緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）中２ｎＨ１２５■−ＮＧＦと１
時間インキュベートして検定した。
上のＮＧＦＲは生理食塩水中で洗浄した細胞を、リン酸
緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）中２ｎＨ１２５■−ＮＧＦと１
時間インキュベートして検定した。
非特異的部位は３００〜４００倍過剰の冷ＮＧＦの存在
下に定量した。ＮＧＦはＥＤＣと２０分間インキュベー
トして受容体種に架橋しく Ｔａｎ１ｕｃｈｉら： Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ
、 ８３ ： １９５０〜１９５４．１９８６）、未反
応部位は５０ｍＨトリス塩ｌ！塩、ＤＨ７，４を添加し
て消滅させた。
下に定量した。ＮＧＦはＥＤＣと２０分間インキュベー
トして受容体種に架橋しく Ｔａｎ１ｕｃｈｉら： Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ
、 ８３ ： １９５０〜１９５４．１９８６）、未反
応部位は５０ｍＨトリス塩ｌ！塩、ＤＨ７，４を添加し
て消滅させた。
細胞を洗浄後、１．３％ｎ−オクチルグルコシドの存在
下に１時間可溶化した。ついでサンプルをＢｅｃｌｖａ
ｎミクロフユージ上、１２，０ＯＯｘりで５分間遠心分
離し、上滑に５μグの抗ＮＧＦＲモノクローナル抗体２
０．４−ＩＱＧを添加した。１時間インキュベートした
のち、予め抗−マウスＩｇＧ抗体で飽和した１０％Ｐａ
ｎ５Ｏｒｂｉｎ Ｏ懸濁液（ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）
２０ ｔｌ １を加えた（ Ｐａｎ５ｏｒｂｉｎ細胞は
、５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、 Ｃ
ｏｗａｎＩ株の死滅、硬化細胞のｍ脳表面を免疫グロブ
リン結合プロティンＡで被覆しである）。１時間インキ
ュベートしたのち、混合物を遠心分離し、ＰＢＳ、０．
１％ウシ血清７ルゾミン０．１％丁ｒｉｔｏｎＯＸ −
１００および０．５Ｍスクロースで３回洗浄した。最後
１．：ＰＢｓ−０，１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ −１００
で洗浄した。切断型の可溶性ＮＧＦ受容体種は、オクチ
ルグルコシド可溶化工程とその侵の遠心分離を省略した
以外は同様にして検定した。
下に１時間可溶化した。ついでサンプルをＢｅｃｌｖａ
ｎミクロフユージ上、１２，０ＯＯｘりで５分間遠心分
離し、上滑に５μグの抗ＮＧＦＲモノクローナル抗体２
０．４−ＩＱＧを添加した。１時間インキュベートした
のち、予め抗−マウスＩｇＧ抗体で飽和した１０％Ｐａ
ｎ５Ｏｒｂｉｎ Ｏ懸濁液（ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）
２０ ｔｌ １を加えた（ Ｐａｎ５ｏｒｂｉｎ細胞は
、５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、 Ｃ
ｏｗａｎＩ株の死滅、硬化細胞のｍ脳表面を免疫グロブ
リン結合プロティンＡで被覆しである）。１時間インキ
ュベートしたのち、混合物を遠心分離し、ＰＢＳ、０．
１％ウシ血清７ルゾミン０．１％丁ｒｉｔｏｎＯＸ −
１００および０．５Ｍスクロースで３回洗浄した。最後
１．：ＰＢｓ−０，１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ −１００
で洗浄した。切断型の可溶性ＮＧＦ受容体種は、オクチ
ルグルコシド可溶化工程とその侵の遠心分離を省略した
以外は同様にして検定した。
抗−ＮＧＦＲモノクローナル抗体は、梁構ＮＧＦを含む
サンプルに直接添加した。免疫沈降体を還元５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥサンプル緩衝液に再懸濁し、５分間煮沸し、再び
遠心分離した。上清を７％ポリアクリルアミドゲルクロ
マトグラフィーに付し、乾燥し、にｏｄａｋ Ｘ−Ｏｍ
ａｔ ＡＲ−５フイルム（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａ
ｋ、 Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ ）を用いてオートラ
ジオグラフィーを行い可視化した。
サンプルに直接添加した。免疫沈降体を還元５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥサンプル緩衝液に再懸濁し、５分間煮沸し、再び
遠心分離した。上清を７％ポリアクリルアミドゲルクロ
マトグラフィーに付し、乾燥し、にｏｄａｋ Ｘ−Ｏｍ
ａｔ ＡＲ−５フイルム（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａ
ｋ、 Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ ）を用いてオートラ
ジオグラフィーを行い可視化した。
ＮａＩ はＡｍｅｒｓｈａ＊（Ｃｈｉｅａｇｏ、
ＩＬ ）から入手した。
ＩＬ ）から入手した。
級！
ヒト細胞源からのＮＧＦＲの切断型の存在はＡ３７５黒
色腫綱胞によって条件づけした培地中、七ツクローナル
抗体２０．４を用いて Ｉ−ＮＧＦ架槽／免疫沈降ア
ッセイによって検出した。
色腫綱胞によって条件づけした培地中、七ツクローナル
抗体２０．４を用いて Ｉ−ＮＧＦ架槽／免疫沈降ア
ッセイによって検出した。
細胞受容体複合体は９０ＫＤａの平均分子槍を有する。
培地からの可溶性（ＮＧＦＲ）成分の分子量は７５ＫＤ
ａである。ＮＧＦ七ツマ−が１３ＫＤａであると、これ
は、これらのＮＧＦ結合種の見掛けの分子量として、膜
発現受容体については７７ＫＤａ、可溶性受容体につい
ては６２ＫＤａを生成する。
ａである。ＮＧＦ七ツマ−が１３ＫＤａであると、これ
は、これらのＮＧＦ結合種の見掛けの分子量として、膜
発現受容体については７７ＫＤａ、可溶性受容体につい
ては６２ＫＤａを生成する。
へ８７５綱胞系のほかに、ユーイング系ＥＳａ−１およ
びＲＤ−ＥＳ、ならびに神経芽腫ＮＬ８−１２７のよう
なｍ胞系でも、それらの条件付生育培地中で、７５ＫＤ
ａ ＮＧＦ−結合（分子量にはＮＧＦも包含する）２
ＣＬ４沈降性種の発現が認められた。
びＲＤ−ＥＳ、ならびに神経芽腫ＮＬ８−１２７のよう
なｍ胞系でも、それらの条件付生育培地中で、７５ＫＤ
ａ ＮＧＦ−結合（分子量にはＮＧＦも包含する）２
ＣＬ４沈降性種の発現が認められた。
ラットの結果（ＤｉＳｔｅｐｈａｎｏ ＆ Ｊｏｈｎｓ
ｏｎの報告、前出）と比較して、妊娠齢１４〜３５週の
範囲のヒト胎仔の羊水は３種のＮＧＦ結合タンパク質を
含有した。これらは特異的に標識され、免疫沈降を受け
た（データは示していない）。５例の新生児から得られ
た尿は羊水中に認められたと同一の有意なレベルの、見
掛けの分子盟約６０．４５および３５ＫＤａのタンパク
質に相当するバンド（第２図、レーン１，３．５．７お
よび９）を示した。出生後の年齢が増加すると、これら
のタンパク質のレベルは、正常成人のバックグランドか
ら識別できない点まで低下した。
ｏｎの報告、前出）と比較して、妊娠齢１４〜３５週の
範囲のヒト胎仔の羊水は３種のＮＧＦ結合タンパク質を
含有した。これらは特異的に標識され、免疫沈降を受け
た（データは示していない）。５例の新生児から得られ
た尿は羊水中に認められたと同一の有意なレベルの、見
掛けの分子盟約６０．４５および３５ＫＤａのタンパク
質に相当するバンド（第２図、レーン１，３．５．７お
よび９）を示した。出生後の年齢が増加すると、これら
のタンパク質のレベルは、正常成人のバックグランドか
ら識別できない点まで低下した。
ＮＧＦＲｔレベルの上Ｗは、すべてではないが一部の神
経冠起源の腫瘍を有する患者の尿中でも免疫沈降によっ
て検出されたく第３図）。陽性の！１％瘍には、神経芽
腫、ユーイング肉腫、神経鞘腫、軟骨肉腫および黒色腫
が包含される。これらのすべての場合で、羊水および小
児法サンプルの場合と異なり、約７０ＫＤａのバンドが
常に、３種の免疫沈降種中最強であった。
経冠起源の腫瘍を有する患者の尿中でも免疫沈降によっ
て検出されたく第３図）。陽性の！１％瘍には、神経芽
腫、ユーイング肉腫、神経鞘腫、軟骨肉腫および黒色腫
が包含される。これらのすべての場合で、羊水および小
児法サンプルの場合と異なり、約７０ＫＤａのバンドが
常に、３種の免疫沈降種中最強であった。
以上の開示から、本技術分野における熟練者には、本発
明の精神、範囲から逸脱することなく、多様な実際例が
明白であろう。たとえば、Ｉｉ、１様のイムノアッセイ
が、担Ｎ Ｇ Ｆ Ｒｌ１ｆｉ瘍を有する患者の血液ま
たは脳を髄液ナンブルについても実施できる。また、２
−サイトラジオイムノアッセイの代わりにＥＬＩＳＡ払
を用いて、前述の例の場合とほぼ等しい結果を得ること
ができる。詮所アッセイにはモノクローナル抗体の使用
が好ましいが、モノクローナル抗体の代わりにポリクロ
−犬ル抗体を用いることもできる。このような他のすべ
ての例も、本願特許請求の範囲の範囲内に包含されるも
のであることを理解すべきである。
明の精神、範囲から逸脱することなく、多様な実際例が
明白であろう。たとえば、Ｉｉ、１様のイムノアッセイ
が、担Ｎ Ｇ Ｆ Ｒｌ１ｆｉ瘍を有する患者の血液ま
たは脳を髄液ナンブルについても実施できる。また、２
−サイトラジオイムノアッセイの代わりにＥＬＩＳＡ払
を用いて、前述の例の場合とほぼ等しい結果を得ること
ができる。詮所アッセイにはモノクローナル抗体の使用
が好ましいが、モノクローナル抗体の代わりにポリクロ
−犬ル抗体を用いることもできる。このような他のすべ
ての例も、本願特許請求の範囲の範囲内に包含されるも
のであることを理解すべきである。
第１図は、 Ｉ−ＮＧＦに架橋され、抗−ＮＧＦＲモ
ノクローナル抗体（ＭＡｂ２０．４）によって免疫沈降
されたＮＧＦＲまたはＮＧＦＲｔのオートラジオグラム
を示す写真である。 第２図は、５例の新生児の尿からのＮＧＦＲｔの免疫沈
降のオートラジオグラムを示す写真である。 第３図は、神経芽腫、ユーイング肉腫、神経鞘腫、軟骨
肉腫および黒色腫患者の尿から免疫沈降されたＮＧＦＲ
ｔのオートラジオグラムを示す写真である。
ノクローナル抗体（ＭＡｂ２０．４）によって免疫沈降
されたＮＧＦＲまたはＮＧＦＲｔのオートラジオグラム
を示す写真である。 第２図は、５例の新生児の尿からのＮＧＦＲｔの免疫沈
降のオートラジオグラムを示す写真である。 第３図は、神経芽腫、ユーイング肉腫、神経鞘腫、軟骨
肉腫および黒色腫患者の尿から免疫沈降されたＮＧＦＲ
ｔのオートラジオグラムを示す写真である。
Claims (7)
- （１）神経成長因子受容体担荷腫瘍に罹患している患者
におけるその腫瘍の存在を確定するにあたり、体液サン
プル中の神経成長因子受容体断片レベルの上昇を確認す
ることを特徴とする￥ｉｎ ｖｉｔｒｏ￥診断方法。 - （２）神経成長因子受容体断片の存在はヒト尿中におい
て、抗−神経成長因子受容体抗体を用いる架橋／免疫沈
降アツセイにより確認する特許請求の範囲第１項に記載
の方法。 - （３）抗体はモノクローナル抗体である特許請求の範囲
第２項に記載の方法。 - （４）神経成長因子受容体断片の免疫沈降はＮａＤｏｄ
ＳＯ＿４−ＰＡＧＥゲル中約５０〜７０キロダルトンの
範囲に放射標識バンドのオートラジオグラフィーによつ
て可視化される特許請求の範囲第３項に記載の方法。 - （５）尿サンプルを＾１＾２＾５Ｉ−ＮＧＦとインキユ
ベートして結合させ、生成した結合受容体−＾１＾２＾
５Ｉ−ＮＧＦをＥＤＣで架橋する特許請求の範囲第４項
に記載の方法。 - （６）腫瘍は神経冠腫瘍である特許請求の範囲第１項に
記載の方法。 - （７）神経冠腫瘍は、神経芽腫、ユーイング肉腫、神経
鞘腫、軟骨肉腫および黒色腫からなる群より選ばれる特
許請求の範囲第６項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/198,948 US4855241A (en) | 1988-05-26 | 1988-05-26 | Tumor diagnostic method |
| US198948 | 1988-05-26 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0225751A true JPH0225751A (ja) | 1990-01-29 |
| JP2837872B2 JP2837872B2 (ja) | 1998-12-16 |
Family
ID=22735562
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1132528A Expired - Lifetime JP2837872B2 (ja) | 1988-05-26 | 1989-05-25 | 腫瘍診断法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4855241A (ja) |
| EP (1) | EP0344139B1 (ja) |
| JP (1) | JP2837872B2 (ja) |
| AT (1) | ATE117090T1 (ja) |
| CA (1) | CA1340068C (ja) |
| DE (1) | DE68920477T2 (ja) |
| ES (1) | ES2066012T3 (ja) |
| GR (1) | GR3015058T3 (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5401638A (en) * | 1986-06-04 | 1995-03-28 | Oncogene Science, Inc. | Detection and quantification of neu related proteins in the biological fluids of humans |
| US6861511B1 (en) | 1986-06-04 | 2005-03-01 | Bayer Corporation | Detection and quantification of neu related proteins in the biological fluids of humans |
| US5100774A (en) * | 1988-04-22 | 1992-03-31 | The Wistar Institute Of Anatomy & Biology | Methods for detecting growth factor receptor expression |
| EP0559834A1 (en) * | 1990-11-30 | 1993-09-15 | Abbott Laboratories | Immunoassay and monoclonal antibodies useful for detecting truncated nerve growth factor receptor |
| US6613506B1 (en) | 2000-11-28 | 2003-09-02 | Subsidiary No. 3, Inc. | Compositions and methods for inhibiting human immunodeficiency virus infection by down-regulating human cellular genes |
| GB9902659D0 (en) * | 1999-02-05 | 1999-03-31 | Microbiological Res Authority | Assay with reduced background |
| EP3372614B1 (en) | 2004-04-07 | 2022-06-08 | Rinat Neuroscience Corp. | Methods for treating bone cancer pain by administering a nerve growth factor antagonist |
| AU2009219437B2 (en) * | 2008-02-25 | 2014-10-16 | Nestec S.A. | Drug selection for breast cancer therapy using antibody-based arrays |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0202005A1 (en) * | 1985-04-16 | 1986-11-20 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Diagnostic method for detection of neural crest disease |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4707443A (en) * | 1985-04-19 | 1987-11-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Soluble interleukin-2 receptor as a disease indicator and a method of assaying the same |
-
1988
- 1988-05-26 US US07/198,948 patent/US4855241A/en not_active Expired - Fee Related
-
1989
- 1989-04-21 DE DE68920477T patent/DE68920477T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-04-21 EP EP89870058A patent/EP0344139B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-04-21 AT AT89870058T patent/ATE117090T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-04-21 ES ES89870058T patent/ES2066012T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-25 JP JP1132528A patent/JP2837872B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-25 CA CA000600733A patent/CA1340068C/en not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-02-15 GR GR950400299T patent/GR3015058T3/el unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0202005A1 (en) * | 1985-04-16 | 1986-11-20 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Diagnostic method for detection of neural crest disease |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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