JPH02257883A - シグナルペプチド、ｄｎａ配列、ベクター、細菌、およびポリペプチド周辺質生産法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、シグナルペプチド、そのＤＮＡ暗号化配列、
これらの配列を有する発現ベクター、これらのベクター
を導入されたグラム陰性細菌およびポリペプチドの周辺
質生産に関する。

（従来の技術） グラム陰性菌は細胞質中で前駆物質の形で合成されたポ
リペプチドを産生じ、細胞質膜と細菌壁の間の空間−周
辺質（ペリプラスム）−に放出、そこで成熟ポリペプチ
ド、すなわち、特異的生化学的作用を保証し得るポリペ
プチドとして蓄積されることが知られている。これらの
ポリペプチドは特にアルカリホスファターゼのような酵
素を含む。

グラム陰性菌は、天然に周辺質中に異種のポリペプチド
を産生じ得ることが知られている。この周辺質生産は、
細胞質中の蓄積を伴う生産の場合に要求されるように、
細胞質中の他の成分からポリペプチドを分離するよりも
、周辺質の他の構成成分から上記ポリペプチドを分離す
る方がより容易であるため、この種の周辺質生産は非常
に有利である。ポリペプチドは、いずれ除去されなけれ
ばならないＮ−末端メチオニンの付加なしに、および好
ましくない第２次構造を採ることなく、成熟体で構築さ
れることも有利である。

産生が周辺質で行なわれる場合、一般に１５−３０個の
アミノ酸からなるシグナルペプチドと呼ばれるペプチド
によりＮ−末端が延長される成熟ポリペプチドに対応す
る前駆物質の形で、ポリペプチド合成されなければなら
ないことが知られている。このシグナルペプチドは蛋白
の分泌において決定的な役目を果たし、その過程中に開
裂し、その際周辺質中に成熟ポリペプチドを放出する。

異質のポリペプチド、特に、真核細胞由来のポリペプチ
ドの生産における細菌の採用に関する最初の研究は、上
記ポリペプチドの天然の前駆体を暗号化するＤＮＡ配列
を有する発現ベクターによって細菌を形質転換すること
であった。この方法は量に関して産業的生産には適して
いないことが繰り返し証明された。

ポリペプチドの天然のシグナルペプチドを前駆体の形で
合成した細菌性ポリペプチドのシグナルペプチドに置換
する試みは満足すべき解決法を与える。ヨーロッパ特許
公開第０１７７３４３号はこのようなシグナルペプチド
を用いる方法を開示している。

（発明が解決しようとする課題） 本発明者は、細菌のシグナルペプチドの選択が、異種の
ポリペプチド（特に真核由来の）前駆体による不適当な
第２次構造形成を、上記前駆体が細菌中で合成される際
に決定し得るとの知見に基づいて、生化学的に活性な異
種ポリペプチドの好収率な周辺質生産を与える新規なシ
グナルペプチドをデザインした。

本発明は、従って一般式、 ＭＸＫＳＴＬＬＬＬＦＬＬＬＣＬＰＳＷＮＡＧＡ［式中
、 Ａ＝アラニン　　　　　　Ｍ＝メチオニンＣ＝システィ
ン　　　　　Ｎ＝アスパラギンＦ＝フェニルアラニン　
　Ｐ＝プロリンＧ＝グリシン　　　　　　Ｓ；セリン に＝リジン　　　　　　　Ｔ＝スレオニンＬ＝ロイシン
　　　　　　Ｗ２トリプトファンおよびＸはＭとＫとの
間の直接結合、遺伝子コードの２０個のアミノ酸を含む
群から選ばれるアミノ酸、または各々他から独立して、
遺伝子コードの２０個のアミノ酸を含む群から選ばれる
２、３または４個のアミノ酸を含むペプチドを表す。

特に、好ましいシグナルペプチドは式中、ＸがＭとＫの
直接結合を表すか、配列がＡＰＳＧのペプチドの全部ま
たは部分を表す場合である。

本発明の他の目的は、本発明のシグナルペプチドを暗号
化したＤＮＡ配列に関する。遺伝子コードの変質によっ
て許容されるどんな配列も使用することができる。つぎ
のような２個の配列が特に有利である。

５°〜ＡＴＧ−ＧＣＴ−ＣＣＡ−ＴＣＴ−ＧＧＣ−ＡＡ
Ａ−ＴＣｅ−ＡＣＧ− ＣＴＧ−ＣＴＴ−ＣＴＣ−ＴＴへ− ＴＴＴ−ＣＴＧ−ＣＴＣ−ＣＴＧ− ＴＧＣ−ＣＴＧ−ＣＣＣ−ＴＣＴ− ＴＧＧ−ＡＡＣ−ＧＣＣ−ＧＧＣ− ＯＣＴ−３゜ これは、式（１）、 ＭＡＰＳＧＫＳＴＬＬＬＬＦＬＬＬＣＬＰＳＷＮＡＧＡ
のシグナルペプチドを暗号化したものである：および ５°−ＡＴＧ−ＡＡＡ−ＴＣＣ−ＡＣＧ−ＣＴＧ−ＣＴ
Ｔ−ＣＴＣ−ＴＴＡ− ＴＴＴ−ＣＴＧ−ＣＴＣ−ＣＴＧ− ＴＧＣ−ＣＴＧ−ＣＣＣ−ＴＣＴ− ＴＧＧ−ＡＡＣ−ＧＣＣ−ＧＧＣ− ＧＣＴ−３′ これは式（２）、 ＭＫＳＴＬＬＬＬＦＬＬＬＣＬＰＳＷＮＡＧＡのシグナ
ルペプチドを暗号化したものである。

さらに本発明は、ポリペプチドの面部物質を暗号化した
ＤＮＡ配列を有する発現ベクターに関し、シグナルペプ
チドを暗号化したこの配列のその部分は本発明の配列で
ある。

本発明のシグナルペプチド、これを暗号化したＤＮＡ配
列およびこれらの配列を有する発現ベクターはこれらの
ベクターを形質転換されたグラム染色試験に陰性反応す
る細菌（いわゆるグラム陰性細菌）によるポリペプチド
の周辺質生産に適用することができる。

従って、本反応はさらに上記で定義されたベクターによ
って形質転換されたグラム陰性に関する。

これらの細菌のうち、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）が有効である。後者は１個ま
たはそれ以上の変異（もしできるなら安定である）、例
えば、ｃｙａ遺伝子および／またはａｒｐ遺伝子に影響
を及ぼす欠失による変異を伴っているのが好ましい。

本発明の他の目的は、ボリペチドの周辺質生産方法に関
する。上記で定義したグラム陰性細菌の細胞を培養し、
浸透圧ショックを与え、浸透圧ショックの上清から組換
えボリベチドを分離するものである。

本発明の方法は、前駆物質を暗号化したＤＮＡ配列の発
現が誘導プロモーターの制御のもとに行なわれる誘導モ
ード（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｌｌ１ｏｄｅ）による生産
に適合しており、また形質転換された菌の培養が始まる
やいなやボリペチドの生産が連続的に行なわれる構成モ
ードによる生産に適合している。

本発明による方法は、用いられる菌種によって異種性で
あるあらゆる種類のボリペチドの生産に適している。す
なわち、真核起源のボリペチドの生産に適している。こ
れらは、厳密な意味でひと成長ホルモン（ｈａＨ）、ま
たは特にヒルジンの天然体または変異体、例えば、変形
（Ｌｙｓ′７）ＨＶ　２のような小型のペプチドの生産
にしている。

本発明を添付の５Ｍ類の図面に関連する３つの実施例に
よってさらに詳細に説明する。

第１図は、プラスミドｐ１６３．１の制限地図である。

種々の制限セグメントを任意につぎの記号表によって表
示する： ４二二　＝複製開始点の位置（０，Ｒ１）−−一−１−
−−−−０．−−−＝プラスミドｐＩ３Ｒ３２２から誘
導されたＤＮＡセグメント ＝ｈｍＨの天然前駆体を暗号化 した配列を含むＤＮＡセグメ ント ＝転写終了暗号を含むファージ ｆｄのＤＮＡセグメント ２刀万　＝ＵＶ５）リプトファンーラクトースハイブリ
ッドプロモー ター作動因子を含むＤＮＡ セグメント ■■■■Ｉ■Ｉ　＝β−ラクタマーゼを暗号化したＤＮ
Ａセグメント （ＡｐＲ：アンピシリン耐性） 第２図は、プラスミドｐ１６０．１の制限地図であり、
そのＰｖｕｌ　−Ｘｈｏｌ　−ＢａｍＨＩおよびＰｖｕ
Ｉ　−ＯＲＩ　−ＢａｍＨＩ　（２）フラグメントは各
プラスミドｐ１６３、ｌおよびｐＢＲ３２７に由来し、
その小さいＢａ５ＨＩ　（２，）−Ｂａａ＋ＨＩ　（１
）フラグメントは下記の実施例１に記載のフラグメント
３である。

第３図は、プラスミドｐ３Ｂ０．１および９３７３．２
に共通の制限地図である。種々の制限セグメントを任意
につぎの記号表によって表示する：＝ＩｕａＨの天然前
駆体を暗号化し た配列を含むＤＮＡセグメント のＰ　ａｔ　Ｉ　−Ｈ１ｎｄＩＩＩ 第４図は、プラスミドｐ４００．＋８の制限地図である
。種々の制限セグメントを任意にっぎの記号表によって
表示する： 列 一−−−−−−−−−−＝プラスミドｐ１６３．１から
誘導したＰｖｕｌ−Ｘｈｏｌ配列 Ｗ＝ニブラスミドル１６．１から誘 導したＸｈｏｌ　−Ｈｌｎｃｌｌ 斡番＋瞳−―県−― ＝−一一一二シー− ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ ＝下記の実施例１中に記載のフラ グメント３ ＝転写終了暗号を含むファージｆｄ のＤＮＡセグメント −４−４−４−４−４−”プラスミドｐＢＲ３２７から
誘導したＰｖｕｌ　−Ｂａ＋ｓＨＩ（２）＝プラスミド
ル１６３．１から誘 導したＰｖｕｌ−Ｘｈｏｌ配列 ：イ、エユユ、＝プラスミドｐ１６３．１から誘導した
Ｘ　ｈｏ　［−Ｈ１ｎｃｌｌ配列ｎ万力刀テバ　＝下記
の実施例１中に記載のフラグメント３ 左；：五工＝転写終了暗号を含むファージｆｄのＤＮＡ
セグメント 雪特にヒルジンの前駆体のブロモ ーターを含むＤＮＡセグメント （フラグメント４のＨｉｎａｌｌ−Ｎ ニ［Ｉコ［ ｄｅ１部分） を暗号化した配列を含み、記 号中黒色で示されている（フラ グメント５と７の組み合わせ）。

第５図は、プラスミドｐ４６０の制限地図である。種々
の制限セグメントを任意にっぎの記号表によって表示す
る： 導したＰｖｕｌ　−ＢａｍＨＩ　（２）ｍ　＋　＋　＋
　＋　＋　＋　＋　＋　＋＋　　＝プラスミドル１６３
．ｌから誘導したＰｖｕｌ−Ｘｈｏｌ配列 ユココエσｍ＝プラスミドｐ１６３．１から誘導したＸ
　ｈｏ　Ｉ　−Ｈ１ｎａｌｌ配列１、□１ｘ代　”下記
の実施例１中に記載のフラグメント３ 萱、ア□ブ　　＝転写終了暗号を含むファージｆｄ伽着
・ｅ――ｔ＋ のＤＮＡセグメント 一ターを含むＤＮＡセグメント （フラグメント４のＨｉｎｃｌｌ−Ｎ ｄｅ１部分） を暗号化した配列を含み、記 号中黒色で示されている。

実施例！＝式、 ＭＡＰＳＧＫＳＴＬＬＬＬＦＬＬＬＣＬＰＳＷＮＡＧＡ
（１）のシグナルペプチドを有するひと成長ホルモンの
周辺質生産 使用する菌種はヨーロッパ特許出願公開第０２４５１３
８号に記載の菌種と直接関連する菌エシェリキア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）であり、１９８
６年２月１７日にコレクシオン・ナシオナル・ド・キュ
ルチュル・ド・ミクロオルガニスムス（ＣＮＣＭ　　パ
リ、フランス）に寄託番号１−５２９で寄託されている
。この菌は欠失によるｃｙａ変異および欠失によるｃｒ
ｐ変異を伴っている〇シグナルペプチドが本発明の式（
１）−ＭＡＰＳＧＫＳＴＬＬＬＬＦＬＬＬＣＬＰＳＷＮ
ＡＧＡである、ｈｍＨの前駆体を暗号化したＤＮＡ配列
を有するプラスミドを製造した。このプラスミドはｐ３
９８という。

■、プラスミドｐ３９８の構築 ｌａ）プラスミドｐ３７３．２の構築 採用した方法は一般に利用し得る既存のプラスミドから
得たフラグメントおよび現在周知の技術による合成によ
り製造したフラグメントを用いた。

採用したクローニング技術はティー・マニアチス、イー
・エフ・フリッチュおよびジェイ・サムプルツク、モル
キュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュア
ル（Ｍｏｌｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ、　ａ　１ａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ）、（コールド・スプリ
ング・ハーバ−・ラボラトリ−１１９８４年）に記載の
ものである。オリゴヌクレオチドはバイオサーチ４６０
０ＤＮＡシンセサイザーを使用して合成した。

プラスミドｐ１６３．１（第１図）は、ヨーロッパ特許
出願公開第０２４５１３８号に記載されており（上記出
願公開の第２図に示されており、ここに添付の第１図に
示されているＢａｍＨＩ（１）部位をマーク指定してい
ない）、１９８６年２月１７日に１−５３０の寄託番号
でＣＮＣＭに寄託された菌の中に存在し、酵素ＰｖｕＩ
およびＢａｍＨＩで切断された。このプラスミドはｈｍ
Ｈの遺伝子コードを含んでいる。Ｐｖｕｌ　−ＢａｍＨ
Ｉ　（１）フラグメント−以下、フラグメント１という
−は、第１図に示すように、制限酵素Ｘ　ｈｏ　Ｉの作
用部位を含んでおり、これを精製した。

同じく、プラスミドｐＢＲ３２７は、当業者にとって周
知であり（ソベロン・エクス、ら、ジェネ（Ｇｅｎｅ）
第９巻第２８７−３０５頁（１９８０年）参照）、酵素
、Ｐｖｕｌおよび−ＢａｍＨＩによって切断された。Ｐ
ｖｕｌ−ＢａｍＨＩ（２）フラグメント−以下、フラグ
メント２という−は、複製開始点を含んでおり、これを
精製した。

ついで、フラグメント３を製造した；これは、１ａｃｉ
遺伝子およびそのプロモーターを含−む合成りａ５ＨＩ
（１）およびＢａｍＨＩ（２）フラグメントであり、っ
ぎのようなりＮＡ配列を含み、その上に、鎖の二つの端
を第２および３図に記載のプラスミド中のフラグメント
の方向性を特定するために１および２の数字によって識
別する。

Ｂａｒｎ）１１（１） フラグメント３ ＧＣＣＣＧＣＴＡＡＣ ＡＧＣＧＣＧＡＴＴＴ ＧＣＴＧＧＴＧＡＣＣ ＣＡＡＴＧＣＧＡＣＣ ＡＧＡＴＧＣＴＣＣＡ ＣＡＣＴＧＡＣＧＣＧ ＴＴＧＣＧＣＧＡＧ＾ ＾ＧＡＴτＧＴＧＣＡ ＣＣＧＣＣＧＣＴＴＴ ＡＣＡＧＧＣＴＴＣＧ ＧＡＣＴＧＧＡＧＧＴ ＴＧ丁ＧＣＣＡＣＧＣ ＴＴＴＴ丁ＣＣＣＧＣ ＾ＡＡＣＧＧＴＣＴＧ ＡＣＴＧＧＴＴＴＣ＾ ＴＧＣＣＡＴ＾ＣＣＧ ＧＧＣＡＡＣＧＣＣＡ ＧＧＴＴＧＧＧＭＴ ＧＴＴＴＴＣＧＣＡＧ ＡＴＡＡＣＡＧＡＣ＾ ＣＡ丁ＴＣＡＣＣＡＣ ＣＧＡＡＡＧＧＴＴＴ ＾ＴＣＡＧＣＡＡＣＧ ＧＴＭＴＴＣＡＧＣ ＡＡＡＣＧＴＧＧＣＴ （ＣＧＧＣ＾７ＡＣＴ ＣＣＴＧＡＡＴＴＧＡ ＴＧＣＧＣＣＡＴＴＣ ＡＣＴＧＴＴＴＧＣＣ ＴＣＣＧＣＣＡＴＣＧ ＧＧＣＣＴＧＧＴＴＣ ＣＴＧＣＧＡＣＡＪＣ ＣＴＣＴＣＴＴＣＣＧ ＧＡｒＧＧＴＧＴＣＣ ＣＧＣＣＡＧＴＴＧＴ ＣＣＧＣＴＴＣＣＡＣ ＡＣＣＡＣＧＣＧＧＧ ＧＴＡＴＡＡＣＧＴｒ ＧＧＣＧＣＴＡＴＣＡ Ｇ　　　　　３’ ＢａｍＨＩ（２） ついで、第２図に示すように、フラグメント１１２およ
び３を結合し、プラスミドｐＢＲ３２７を得る。このプ
ラスミドは制限酵素ＨｉｎｃｌｌおよびＰｓｔｌで部分
的に切断処理した。この大きいＨｉｎａｌｌ−Ｐｓｔｌ
フラグメントは複製開始点を含んでおり、ついで、第２
図に示すように、下記に示すフラグメント４に結合した
。これは、ｈｍＨの天然前駆体の最初の４４個のアミノ
酸およびこの配列の上流に調節シグナルを暗号化した配
列を有する合成りＮＡフラグメントである。

このフラグメントにおいて、アミノ酸をつぎのような略
号による文字で示す。

Ａ＝アラニン　　　　　Ｍ＝メチオニンＣ＝システィン
　　　　Ｎ＝アスパラギンＤ＝アスパラギン酸　　Ｐ＝
プロリン Ｅ＝グルタミン酸　　　Ｑ＝グルタミンＦ＝フェニルア
ラニン　Ｒ＝アルギニンＧ＝グリシン　　　　　Ｓ＝セ
リン Ｈ＝ヒスチジン　　　　Ｔ：スレオニン１＝イソロイシ
ン　　　Ｖ＝バリン に＝リジン　　　　　　Ｗ＝ニトリブトファン＝ロイシ
ン　　　　　Ｙ＝チロシン プロモーターの配列の配列−３５（ＴＴＧＣＴＴ）およ
び−１０（ＴＡＴＡＡＴ）、および当業者に周知のシャ
インーダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｒｇａｒｎｏ）配
列は、このフラグメント中でその順番に下線で示す。

プラスミド９３８０．１はこの方法で得る。

ついで、プラスミドｐ３８０．１（第３回）は、制限酵
素Ｃ１ａｌおよびＮｄｅｌで切断し、上記のフラグメン
ト４の小さいＣ１ａｌ−ＮｄｅＩフラグメントを除去し
、これを下記のＣ１ａｌ−ＮｄｅＩフラグメントで置換
した： １ａ１ ５°　ＣＧＡＴＡＧＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＩＧＧＡＡ
ＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＴ＾ＴＣＧＣＡＴ人
ＴＴＡＣＡＣＡＣＣＴＴ人ＡＣＡＣＴＣＧＣＣＴＡＴＴ
ＧＴム 得られたプラスミドはプラスミドｐ３７３．２である（
第３図）。

Ｉｂ）プラスミドｐ３９８の構築 最終的に、プラスミド９３７３．２を制限酵素ＮｄｅＩ
およびＸｂａＩで切断し、上記のフラグメント４のＮｄ
ｅＩ−Ｘｂａｌフラグメントを除去し、これを下記に示
す合成Ｎｄｅｌ−Ｘｂａｌフラグメントで置換した。

５′ Ｎｄｅｌ Ｔ’ｆｉＧ　　ＧＣＴ　　ＣＣＡ　　ＴＣＴ　　ＧＧＣ
ＡＡＡ、ＴＣＣＡＣＧ　　ＣＴＧＡＣＣＧＡ　　ＧＧＴ
　　ＡＧＡ　　ＣＣＧ　　ＴＴＴ　　ＡＧＧ　　ＴＧＣ
ＧＡＣＣＴＴ　ＣＴＣＴＴＡ　ＴＴＴ　ＣＴＧ　ＣＴＣ
ＣＴＧ　ＴＧＣＣＴＧＧＡＡ　ＧＡＧ　ＡＡＴ　ＡＡＡ
　ＧＡＣＧＡＧ　ＧＡＣＡＣＧ　ＧＡＣＣＣＣＴＣＴ　
ＴＧ’Ｇ　ＡＡＣＧＣＣＧＧＣｃｃｉｔｒｙｃ　ＣＣＡ
ＧＧＧ　　ＡＧＡ　　ＡＣＣＴＴＧ　　ＣＧＧ　　ＣＣ
Ｇ　　ＣＧＡ　　ＡＡＧ　　ＧＧ丁ｂａｌ ＡＣＣＡ丁Ｔ　　ＣＣＣＴ丁ＡＴ ＴＧＧ　ＴＡＡ　ＧＧＧ　ＡＡＴ　ＡＧＡＴＣ５’この
ようにして得られたプラスミドｐ３９８は、式（１）の
シグナルペプチドを暗号化した特に有利なりＮＡ配列を
含む。この配列は上記の二つの矢印で画する。

２、一般的方法 実験はプラスミドｐ３９８の６個のクローン（クローン
２．３．５．６．７および８）で行なわれ、結果をプラ
スミド９３７３．２に対して評価した。

プラスミドＰ３７３．２はｈｍＨの天然の前駆体を暗号
化したＤＮＡ配列を含む。実験は前もって製造した当該
宿主ベクターを、十分なバイオマス（２，２参照）で得
、導入処理した細胞がｈｍＨを産生（２，４参照）する
ような条件で培養し、浸透圧ショック（２，４参照）で
周辺質空間に含まれる蛋白質を集め、細菌を全融解処理
し、２．４で集めた周辺質ｈｎＨを測定し、２．４およ
び２．５で得られた上清をウェスタン・プロット・テク
ニク（２，７参照）によって分析することにより行った
。

２．１　宿主ベクター系の製造 宿主ベクター系は当業者に周知の細菌形質転換により製
造した。これは具体的に、つぎのような文献に記載され
ている。

一モルキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　
ｃｌ。

ｎｉｎｇ）〜ア・ラボラトリ−・マニュアル（Ａ　１ａ
ｂｏｌａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）−テ（−マニアティ
ス、イー・エフ・フリッチュおよびジェイ・サムプルツ
ク−コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリー−
１９８２年 一イクスペリメンツ・イン・モルキュラー・ジエネテイ
ックス（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ　ＧｅｎｅｔｉａＳ）−ジェイ・エイチ・ミラー
−コールドデスプリング・ハーバ−・ラボラトリー−１
９７２年２．２　培養 ａ）接種 固体培地（ＬＢ培地＋寒天）で得られた分離コロニーを
培地（ＬＢ培地）５ｆｆｉ１中に懸濁さけた。

使用したＬＢ培地はつぎのような特徴を有する。高圧滅
菌前に導入された成分は、 バクトドリプトン　　　　　　　　１０ｇ酵母抽出液　
　　　　　　　　　　　５ｇ塩化ナトリウム　　　　　
　　　　　５ｇ蒸留水　　　　　　　　　　全量　１１
２高圧滅菌前に、ｐｈｉを７．２に調整する。

高圧滅菌後に、アンピシリン１００μ９／ａＱの割合で
添加する。

ｂ）インキュベーション ａ）で調製した懸濁液を３７℃にて１８時間インキュベ
ージロンし、安定生長期に達するまで培養した。得られ
た濃厚懸濁液をＬＢ培地で希釈し、光学密度を６００ｎ
ｓにて一６００ｎｍにおける０Ｄ−０，０３に近付け、
ついで、この細菌懸濁液を３７℃にて撹拌しつつ、６０
０ｎｍにおけるＯＤを０．３のオーダーになるまでイン
キニベートした。

２．３　導入 ２．２ｂで得られた細菌懸濁液にイソプロピル−β−Ｄ
−チオガラクトース（またはＩＰＴＧ）を最終濃度が１
ｂＭに等しくなるような量で添加する。ＩＰＴＧはここ
で通常ラクトース・オペレーターに結合するリプレッサ
ーの作用を中和することによってｈｍＨの前駆体の合成
を始動および維持するために使用した。

この懸濁液は添加したＩＰＴＧとともに３７℃にて２時
間３０分撹拌した。

２．４　浸透圧ショック エヌ・ジー・ノッサールおよびエル・ニー・ヘラペル、
ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ）第２４１巻第３０５５−３０６３頁
（１９６６年）に記載のプロトコルを明細書の記載とし
て挿入する。

ａ）ＴｒｉｓおよびＥＤＴＡでの洗浄 導入後に２．３で得られた懸濁液のサンプルを採り、６
０００ｇで５分間遠心分離した。

残渣を、得られた懸濁液が６００ｎｍのＯＤを１０のオ
ーダーになるような容量のｐＨ７の緩衝液に添加した（
Ａ液）（上記参照）。使用した緩衝液は蒸留水につぎの
ちのを添加して製造した。

・トリ（ヒドロキシメチル）アミノメタン−ＨＣｌ。

またはＴｒｉｓ−ＭＣＩを最終濃度が３０ｇ＋Ｍになる
ように添加した。

・エチレンジアミンテトラ酢酸、またはＥＤＴＡを最終
濃度が１ｍＭになるように添加する。

ｂ）スクロースの作用 ２．４８で得られた懸濁液をａ　ｏ　ｏ　Ｏｇで５分間
遠心分離した。残渣を注意深く等量の、Ａ液に対してス
クロースを１００ｍ１当たり１５ｇ添加し、用時調製の
Ｂ液中に加えた。

懸濁液を１０分間２０℃にて放置した。ついで、６００
０ｇにて５分間遠心分離した。遠心分離管を氷水中に入
れた。

上清を注意深く除去し、氷水温度に前以て冷却した脱塩
水（同量で）で置換した。

このように調製した上清（６００ｎｍにおけるオーダー
がｌＯを有する）を０℃にて５分間放置した。

Ｃ）周辺質中に存在する蛋白質の収集 ２．４ｂで得られた懸濁液を１８０００ｇにて１０分間
遠心分離した。

上清は、周辺質中の蛋白質を含んでおり、これを収集し
た。

２．５　全融解 導入後２．３で得られた懸濁液のサンプルを採り、エッ
ペンドルフ管中６０００ｇにて５分間遠心分離した。

残渣を、懸濁液の１ｍｌ＃＜６００ｎｍのＯＤが０゜２
となるような量の緩衝液に懸濁した。

緩衝液は蒸留水中つぎのものを含む溶液を２回遠心分離
した緩衝液から調製した。

−Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　Ｏ，１２５Ｍ１ｐＨ６，８７−
ドデシル硫酸ナトリウム（４％（Ｗ／Ｖ））；−グリセ
リン（２０％（Ｗ／Ｖ））； −β−メルカプトエタノール（１０％（Ｗ／Ｖ））−ブ
ロモフェノール・ブルー（０，０２％（Ｖ／Ｖ））。

管を１００℃の湯浴中に１０分間入れ、ついで、懸濁液
を６０００ｇにて５分間遠心分離し、上清を集めた。

２．６　周辺質ｈＧＨの同定 ２．４０で得られた上清を、検量注入器および２２０ｎ
ｓの検知器を備えた装置を高圧液体クロマトグラフィー
にかけた。

つぎのちのを使用した： ・長さ１０ｃｍおよび直径４．６ｍｍのスティール製の
ＣＢ−３００オングストローム逆相カラム（ジンクロム
、製品番号Ｃ３−Ｒｌ０３−１０）、・２０分間にＳｔ
液７０容とＳ２液３０容からＳｉ液４０容とＳ２液６０
容に直線こう配で通過する移動相。

Ｓｌ液およびＳ２液はっぎのような特徴を有する： ・５１＝０．１％（Ｖ／Ｖ）のトリフルオロ酢酸を含む
精製水、 ・５２＝０．８％ＣＶ／Ｖ）のトリフルオロ酢酸を含む
ＨＰＬＣのためのアセトニトリル 流速は１分当たり１ｍｌである。

分画液の光学密度を測定し、周辺質ｈＧＨの量を上清１
ｍｌ当たり、マイクログラムであられし、先に確定した
検量曲線と比較して測定する。

２．７　ウェスタン・プロット・テクニクによる分析 継続して次のような操作を行ったニ ーゲル電気泳動による２、４ｃおよび２，５により得ら
れた各上清に含まれる種々の蛋白質の分離（レミリ、ニ
ー、ケー１、ネイチュア（Ｎａｔｕｒｅ）第２２７巻第
６８０−６８５頁（１９７０年）記載のプロトコルによ
る）；使用したゲルは０．５％のドデシル硫酸ナトリウ
ムを含むポリアクリルアミドゲル（１５％１／Ｖ）であ
る； 一ゲル中に含まれる上部蛋白質のニトロセルロース膜の
透過（エイチ、タウビンら、プロシーディング・オブ・
ナショナルアカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）第７
６巻第４３５０−４３５４頁（１９７９年）；−バーネ
ットの操作による免疫検出（ダブリュ。

ダブリュ、バーネット、アナリティカル・バイオケミス
トリー（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏａｈｅｍ、　）第１１２巻
第１９５−２０３頁（１９８１年））：これは次の連続
操作を含むニ ー緩衝液Ａ（ＴｒｉＩＩ−ＨＣＩ　　１０＋ＭＳＮａＣ
１１７０ａＭ、に夏　］膿Ｍ）でニトロセルロース・フ
ィルターを１０分間洗浄する。； 一緩衝液Ｂ（ウシ血清アルブミンを１００ｓ当たり３９
の割合で添加した緩衝液Ａ）をニトロセルロース・フィ
ルターに接触させるニ ー２０℃にて１８時間、ニトロセルローズ・フィルター
を免疫血清（成熟ｈＧ）（およびその前駆体を検出する
ポリクａ−ナル抗体）に接触させる；−緩衝液Ｂでニト
ロセルローズ・フィルターを洗浄； 一１ｘＱ当たり０．１マイクロキユリーの割合のヨード
１２５でラベルした蛋白質Ａ液とニトロセルローズ・フ
ィルターと２０℃にて６時間接触させる； 一フィルターを緩衝液Ａで洗浄； ＝２枚の吸収シート間でフィルターを乾燥ニーフィルタ
ーをＸ線フィルムと接触させるニーフィルムを現像。

３、結果 ３．１周辺質ｈＧＨの固定 結果を下記の表に示すニ プラスミド３９８はプラスミド３７３．２が産生ずるの
に比べておよそ２倍の周辺質産生を行うことが明らかで
ある。

３．２　ウェスタン・プロット・テクニックによる分析 オートジオグラフフィルム分析は、前駆体がプラスミド
ｐ３９８で形質転換した細菌の全顯解後得られた抽出物
中に検出されないが、クローンｐ３７３．２で形質転換
した細菌の全融解後得られた抽出物中には検出されるこ
とを示している。これは本発明のシグナルペプチドが、
前駆体を高い効率で細胞質膜を通過させ、同時成熟を可
能にすることを示している。

これらの結果は本発明の式（１）のシグナルペプチドを
ひと成長ホルモンなどの蛋白の周辺質生産に用いる大き
な利点を強調している。

実施例２：式 ％式％ シグナルペプチドを用いたヒルジン変異体の周辺質生産 １、菌種およびプラスミド 実施例１記載の菌種を使用する。

ｐ４００と称されるプラスミドをｐ３７３．２から構築
する。ヨーロッパ特許出願公開第０２７３８００号に記
載の変異体（Ｌｙｓ”）ＨＶ２を暗号化したＤＮＡ配列
を用いた。この式を次に示す：Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ
　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ上記ＤＮＡ配列が、式（りの本発明の
シグナルペプチドを暗号化した配列に続いている。

プラスミド４００の構築 この変異体（最初の３個のアミノ酸を除外）を暗号化し
た配列を含む合成ＡｃｃＩ　−Ｈｌｎｄｌｌ［フラグメ
ント（フラグメント５）を調製した。下記に示すが、最
後のアミノ酸に対応するコドンは矢印で示しである： フラグメント５ 八ｃｃ１ ５’　　　　ＡＴ　ＡＣＡ　ＧＡＣＴＧＣＡＣＡ　ＧＡ
Ａ　ＴＣＧ　ＧＧＴ。

ＴＧ丁ＣＴＧ　ＡＣＧ　ＴＧＴ　ＣＴＴ　ＡＧＣＣＣＡ
ＣＡＡ　ＡＴＴ　　ＴＴＧ　　ＴＧＣＣＴＣＴＧＣＧＡ
Ｇ　　ＧＧＡ　　ＡＧＣＡＡ丁Ｇ丁Ｔ　　ＴＴＡ　　Ａ
ＡＣＡＣＧ　　ＧＡＧ　　ＡＣＧ　　ＣＴｃ　ＣＣＴ　
　ＴＣＧ　　ＴＴＡＧＴＴ　ＴＧＣＧＧＴ　ＡＡＡ　Ｇ
ＧＣＡＡＴ　ＡＡＧ　ＴＧＣＡＴＡ　ＴＴＧＣＭ　　Ａ
ＣＧ　　ＣＣＡ　　ＴＴＴ　　ＣＣＧ　　ＴＴＡ　　Ｔ
ＴＣＡＣＧ　　丁Ａτ　ＭＣＧＧＴ　ＴＣＴ　ＡＡＡＧ
ＧＡ　ＡＡＧ　ＧＧＣＡＡＣＣＡＡＴＧＴ　ＧＴＣＣＣ
Ａ　　ＡＧＡ　　ＴＴＡ　　ＣＣＴ　ＴＴＣＣＣＧ　　
ＴＴＧ　　ＧＴＴ　　ＡＣＡ　　ＣＡＧＡＣＴ　ＧＧＣ
ＧＭ　ＧＧＴ　ＡＣＡ　ＣＣＧ　ＡＡＡ　ＣＣＴ　ＧＡ
Ａ　ＡＧＣｔｃＡ　ＣＣＧ　　ＣＴＴ　ＣＣＡ　　ＴＧ
Ｔ　　ＧＧＣ７丁丁　ＧＧＡ　　ＣＴＴ　　ｒｃｒｓＣ
ＡＴ　ＡＡＴ　ＭＣＧＧＣＧＡＴ　ＴＴＣＧＭ　ＧＭ　
ＡＴＴ　ＣＣＡＧＴＡ　　ＴＴＡ　　ＴＴＧ　ＣＣＧ　
　ＣＴＡ　ＭＧ　　ＣＴＴ　　ＣＩＴ　Ｔ／Ａ　　ＧＧ
丁ＧＡＡ　ＧＭ　ＴＡＴ　ＴＴＡ　ＣＭ’ＴＧＡＭＡ　
ＡＴＧＭＡ　ＧＡＡＡＴＡ　ＧＴＴ　ＡＧＴ　ＡＴＣＴ
ＣＴ　ＴＡＡ　ＡＡＣＴＡＡ　ＡＣＣＣＴＴＴＴＣＧＡ
Ａ　　ＡＡＧ　　ＴＴＣＧＣＴ　　ＧＧＴ　　ＡＣＴ　
　ＡＡＧ　　ＧＣＴ　　ＴＴＧＡＡＧ　ＣＩＴ　ＴＴＣ
ＡＡＧ　ＣＧＡ　ＣＣＡ　ＴＧＡ　ＴＴＣＣＧＡ　ＡＣ
Ａ ＴＴＡ　　ＧＡＣＧＡＡ　ＧＴＴ　　ＧＴＣＭＧ　　Ａ
ＧＣＴＣＴ　　ＣＣＴ　ＧＣＴＡＡＴ　ＣＴＧ　ＣＴＴ
　ＣＡＡ　ＣＡＧ　ＴＴＣＴＣＧ　ＡＧＡ　ＣＧＡ　Ｃ
ＧＡＧＧＴ　ＭＣＡＣＣＧＴＣＡＴＣＡＴＴ　ＧＣＴＧ
ＧＴ　ＧＧＴ　ＧＡＣＣＣ＾　７ＴＧ　　ＴＧＧ　　Ｃ
ＡＧ　　ＴＡＧ　　丁ＡＡ　　ＣＣＡ　　ＣＣＡ　　Ｃ
ＣＡ　　Ｃ丁ＧＡＣτＧＣＣＡＣＴ　ＧＩＣＧＣＴ　Ａ
ＡＧ　ＡＡＧ　ＴＡＣＧＧＴ　ＧτＣＴＧＡ　ＣＧＧ　
ＴＧＡ　ＣＡＧ　ＣＧＡ　ＴＴＣＴｉｃ　ＡＴＧ　ＣＣ
Ａ　ＣＡＧｌ（（ｎｄｌ■■ ＡＣＴ　ＧＡＣＡＡＧ　ＡＴＣＣＣＡ ＴＧＡ　ＣＴＧ　ＴＴＣＴＡＧ　ＧＧＴ　ＴＣＧ　Ａ　
−５’プラスミドｐ３７３．２を制限酵素Ｎｄｅｌおよ
びＨｉｎｄｌｌ＋で切断し、第３図に示すように複製開
始点を含むＮｄｅＯ−Ｈｉｎｄｌｌ＋７ラグメント（フ
ラグメント６）を精製した。

合成Ｎｄｅ　Ｉ　−Ａｅｃ　Ｉフラグメント（フラグメ
ント７）を調製する；そのフラグメントを次に示す：フ
ラグメント７ ｄｅ１ ５°岳ＧＧＣＴＣＣＡＴＣＴＧＧＣＡＡＡＴＣＣＡＣＧ
ＣＴＧＣＴＴＣＴＣＴＴＡＴＴＴＣＴＧＣＴＣＣＴＧＴ
ＧＣＣＴＧＣＣＣＴＣＴ　−ＡＣＣＧ　ＡＧ（ｉＴＡＧ
　ＡＣＣＧＴＴＴＡＧＧＴＧＣＧＡＣＧ＾＾ＧＡＧＡＡ
ＴＡＡＡＧＡＣ（ｌｉＡＧＧＡｃＡｃＧＧＡｃＧＧＧＡ
Ｇ＾−ｃｃｌ ＴＧＧＡＡＣＧＣＣＧＧＣＧ己ＴＴＡＣＧＴＡＣＣＴＴ
ＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＴＡＡＴＧＣＡＴ＾５゜このフラ
グメントは、式（１）のシグナルペプチドを暗号化した
特に有利なりＮＡ配列を含んでおり、この配列は２つの
矢印で画しており、ヒルジン変異体（Ｌｙｓ”）ＨＶ２
の最初の３個のコドンに対応するヌクレオチド５．６お
よび７を結合する；得られたプラスミドがプラスミドｐ
４００でありこれを第４図に示す。

２、一般的方法 プラスミド４００は、実施例１記載の細菌への形質転換
により導入した。

実験は実施例１の２．１および２．２の項に記載の方法
により２種の異なるクローン（クローンｐ４００．１８
およびｐ４００．２４）に平行して行った。培養は実施
例１の２．３項に示した方法により誘導し、２種類の修
正を行った：誘導は、培養物が６００ｎｍにてＯＤがお
よそ０．５に達したときＩＰＴＧを添加して始め、第■
の実験では３時間３０分間維持し、第２の実験では１７
時間維持した。

誘導後、細胞を浸透圧ショック処理しく実施例１．２．
４参照）、集められた上清中のヒルジンの抗トロンビン
活性を測定した。

この活性は、マークラオード、エフ、ら、（トロムボシ
ス・アンド・ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｉ−Ｉａ
ｅｍｏｓｔａｓ）第５２巻（１９）第１６０−１６３頁
）記載およびハーベイ、アール・ピーら、（プロシーデ
ィング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエ
ンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｓｃｉ、
　ＵＳＡ）第８３巻第１０８４−１０８８頁（１９８６
年）において研究されている技術により測定した。

クローンの１つから得られたヒルジン変異体を高圧液体
クロマログラフイーにより精製し、そのＮＨ！〜末端配
列を決定した。

３、結果 結果を下記の表に示す。浸透圧レジツク後に収集した上
清を、濁度を６００ｎｓにおける０Ｄ＝１０にもってい
き、ｎ＋１当たりの抗トロンビンで表現した。

プラスミドｐ４００ クローン　　　　クローン ヒルジンの特異的抗トロンビン値は既知であり、ヒルジ
ン１＋ｇ当たりｉ　ａｏｏｏと１７７０００抗トロンビ
ン単位の間にあるから（ロイソン、ジーら、バイオテク
ノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）第６巻第７
２−７７頁（１９８８年））、誘導１７時間後、６００
ｎｍ当たりの０Ｄ＝１の上清ｌリットル当たり、ヒルジ
ンが５−１０ｍｇ抽出されることが判明した。

この量はトッド、ジェイ、ら、エフ・イー・ビー・ニス
（ＦＥＢＳ）第２０２巻第３７３−３７７頁記載の量よ
りも非常に多い。これは、ヒルジンのハイブリッド前駆
体を暗号化した配列を有するプラスミドで形質転換した
エシェリキア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）菌中の周辺質中
に産生ずるヒルジンＨＶＩ変異体を伴っており、このシ
グナルペプチドはアルカリホスファターゼのものである
。

さらに、クローン９４００．１８により産生じたヒルジ
ンは変異体（Ｌｙｓ”）ＨＶ２（７）ＮＨ，−末端特徴
を有している。

これらの結果は、式（１）の本発明のシグナルペプチド
がヒルジン変異体（Ｌｙｓ”）ＨＶ２のようなペプチド
の効果的な周辺室生産に適していることを示している。

実施例３：式、 ＭＫＳＴＬＬＬＬＦＬＬＬＣＬＰＳＷＮＡＧＡのシグナ
ルペプチドを有するヒルジン 変異体の周辺質生産 １、菌種およびプラスミド 実施例１に記載の菌を使用した。

プラスミド９４６０の構築のために採用した方法は、ヨ
ーロッパ特許出願公開第０２７３８００号に記載のヒル
ジン（Ｌｙｓ”）ＨＶ２を暗号化した配列を含んでおり
、この配列は本発明の式（２）＝ＭＫＳＴＬＬＬＬＦＬ
ＬＬＣＬＰＳＷＮＡＧＡによるシグナルペプチドを暗号
化した配列に続くものであるが、実施例２に記載したプ
ラスミドｐ４００．１Ｂおよびアメルシャム（Ａｍｅｒ
ｓｈａｓ）でマークしたファージ゛Ｍ１３ｓｐｌＱ中に
変異誘発して得られたフラグメントを使用した。

プラスミドｐ４６０の構築 ｌａ）　　プラスミドｐ４００．１８から得られたフラ
グメント α）プラスミド９４００．１８を酵素ＰｓｔおよびＥｃ
ｏＲＩで切断した。複製の開始点を含む３８６ｇｂｐの
Ｐｓｔ−ＥｃｏＲＩフラグメント、以下、フラグメント
８という（第５図中Ｆ８として表す）を精製した。

β）プラスミドｐ４００．１８を酵素ＮｒｕｌおよびＰ
ｓｔＩで切断した。プロモーターを含む１０６２ｂｐの
小さいＮｒｕｌ−Ｐｓｔｌフラグメントは、以下、フラ
グメント９という（第５図中、Ｆ９として示す）を精製
した。

ｌｂ）ファージＭ１３から得られたＮｒｕｌ−ＥｃｏＲ
フラグメント α）酵素ＸｈｏｌおよびＥｃｏＲＩで切断および精製に
よりプラスミドｐ４００．１８から誘導された６５０ｂ
ｐのＸｈｏｌ−ＥｃｏＲＩフラグメントは、式（１）の
シグナルペプチドを暗号化した配列を含み、これを制限
部位、５ａｌｌ／ＥｃｏＲ１にあるファージＭ　ｌ　３
　ｍｐ　１９　（Ａｍｅｒｓｈａｓ）のポリリンカー（
クローニング・ポリサイド）中に導入した。Ｘｈｏｌお
よびＳｃｉ１部位の連結はこれら二つの部位を消滅させ
た。

β）つぎの配列を有する６３ヌクレオチドのオリゴヌク
レオチド ５°　−ＡＴＧ−ＡＡＡ−ＴＣＣ−ＡＣＧ−ＣＴＧＣＴ
Ｔ−ＣＴＣ−ＴＴＡ−ＴＴＴ−ＣＴＧ−ＣＴＣ−ＣＴＧ
−ＴＧＣ−ＣＴＧ−ＣＣＣ−ＴＣＴ−ＴＧＧ−ＡＡＣ−
ＧＣＣ−ＧＧＣ−ＧＣＴ　−３’ を合成した。この配列は式（２）のシグナルペプチドを
暗号化したものである。

インビトロで変異誘発を目的とする技術を、アメルシャ
ム１５２３キットを用いて、α）にて得られたフラグメ
ントに関連し、シグナルペプチドを暗号化した配列に関
して、変異を有するフラグメントを構築した。

この技術は、このキットに添付のパンフレットに、詳細
に記載されており、ファージＭ１３の二重鎖に６５０　
ｂｐ（上記α）の項参照）のＸｈｏｌ　−ＥｃｏＲＩの
導入、この組換えファージの一重鎖の精製、６３ヌクレ
オチドの上述のオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成
、ＤＮＡポリメラーゼのフレナラフラグメント、および
組換えファージの二重鎖円形を形成するためのＴ４リガ
ーゼの作用からなる。

γ）変異ＤＮＡフラグメントを含むファージは酵素Ｎｒ
ｕｌおよびＥｃｏＲＩで切断した。式（２）のシグナル
ペプチドを暗号化した配列およびヒルジン変異体（Ｌｙ
ｓ”）ＨＶ２を暗号化した配列を含むＮｒｌｌ　−Ｂｃ
ｏＲＩフラグメント、以下、フラグメント１０という（
第５図にＦＩＯとして示す）を精製した。

フラグメント８．９およびｌＯを連結する；得られたプ
ラスミドはプラスミドｐ４６０であり、これを第５図に
示す。

２、−船釣方法 プラスミドｐ４６０を実施例１に記載の細菌に形質導入
した。実験は平行して２種類のクローン（クローンｐ４
６０．２およびｐ４６０．４）で行い、これらには、６
３ヌクレオチドの上述の配列の存在が認められている。

クローンｐ４００．１８の制御は実施例１の２．１およ
び２．２の項に記載の方法のとおりに行った。培養は実
施例１の２゜３の項に示された方法で２つの修正をして
誘導した：培養物が６００ｒａ＋ＪこてＯＤがおよそ０
．５に達したとき、ＩＰＴＧを添加して誘導を行い、２
時間維持した。

誘導後、細胞を浸透圧ショックにかけ（実施例１０の２
．４の項）、上清中に遊離したヒルジン変異体（Ｌｙｓ
”）ＨＶ２をＨＰＬＣにて測定した。

ヒルジン変異体（Ｌｙｓ”）ＨＶ２の測定浸透圧ショッ
ク後、得られた上清を、検量注入器および２２０ｎｒａ
の検知器を備えた装置を高圧液体クロマトグラフィーＨ
ＰＬＣ，にかげた。

つぎのちのを使用した： ・長さ１０ｃｃｍおよび直径４．６ｔＩｍのスティール
製のＣＢ−３００人逆相カラム（ジンクロム、製品番号
ＣＢ−Ｒ１０３−１０）、 ・１０分間にＳｔ液８５容とＳ２液１５容からＳｌ液５
０容とＳ２液５０容に直線こう配で通過する移動相。

Ｓｉ液およびＳ２液は継ぎのような特徴を有する： ・５１＝０．１％（Ｖ／Ｖ）のトリフルオロ酢酸を含む
精製水、 一５２＝０．８％（Ｖ／Ｖ）のトリ３ルオロ酢酸を含む
ＨＰＬＣのためのアセトニトリル 流速は１分当たり２ｍｌである。

分画液の光学密度を測定し、周辺質変異体（Ｌｙｓ４７
）ＨＶ２の量を上清１ｍｌ当たり、ミリグラムで表し、
変異体（Ｌｙｓ”）ＨＶ２の標準溶液と比較して測定し
た。

３、結果 結果を次の表に示す。

結果を浸透圧ショック後、６００ｎｍにおける光学密度
を１とし、集めた上滑のｍｇ／Ｉで示す。

第１実験 被験プラスミド 対照 密度を１とした上清の ヒルジン変異体 （Ｌｙｓ４７）ＨＶ　２のｓｇ／ｌ 対照 密度を１とした上清の ヒルジン変異体 （Ｌ　ｙｓ”）ＨＶ　２　（Ｄｍｇ／　１プラスミド４
６０．２および４６０．４により産生じたヒルジン変異
体（Ｌ　ｙｓ”）ＨＶ　２の周辺質生産はかなりプラス
ミド４００．１８により産生じたものより多いことが上
記の表から明らかである。

これらの結果は、式（２）の本発明のシグナルペＦＩＧ
、１ プチドがヒルジン変異体（Ｌｙｓ”）ＨＶ２のようなヘ
プチドの効果的な周辺質生産にかなり適していることを
示している。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラスミドｐ１６３．１の制限地図である。 第２図は、プラスミドｐｔｓｏ、１の制限地図である。 第３図は、ｐ３８０．１および９３７３．２に共通の制
限地図である。 第４図は、プラスミドｐ４００．１８の制限地図である
。 第５図は、プラスミドｐ４６０の制限地図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式、 【遺伝子配列があります】 ［式中、 Ａ＝アラニンＭ＝メチオニン Ｃ＝システインＮ＝アスパラギン Ｆ＝フェニルアラニンＰ＝プロリン Ｇ＝グリシンＳ＝セリン Ｋ＝リジンＴ＝スレオニン Ｌ＝ロイシンＷ＝トリプトファン およびＸは、ＭとＫ間の直接結合、遺伝子コードの２０
   個のアミノ酸を含む群から選ばれるアミノ酸、または各
   々他から独立して、遺伝子コードの２０個のアミノ酸を
   含む群から選ばれる２、３または４個のアミノ酸を含む
   ペプチドを表す］。 ２、Ｘが、ＭとＫ間の直接結合を表すか、 またはＡＰＳＧの配列のペプチドのすべて、または部分
   を表す、請求項１記載のシグナルペプチド。 ３、Ｘが、直接結合を表す、請求項２記載 のシグナルペプチド。 ４、Ｘが、ＡＰＳＧの配列のペプチドを表 す、請求項２記載のシグナルペプチド。 ５、請求項１−４のいずれか１項記載のシ グナルペプチドを暗号化したＤＮＡ配列。 ６、式、 【遺伝子配列があります】 を有する請求項５記載の配列。 ７、式、 【遺伝子配列があります】 を有する請求項５記載の配列。 ８、ポリペプチドの前駆体を暗号化したＤ ＮＡ配列を有する発現ベクターにおいて、シグナルペプ
   チドを暗号化した配列の部分が請求項５−７のいずれか
   １項の配列である、発現ベクター。 ９、請求項８によるベクターによって形質 転換されたグラム陰性細菌。 １０、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａｃｏ
   ｌｉ）菌種に属する、請求項９記載の細菌。 １１、欠失によるｃｙａ変異および欠失によるｃｒｐ変
   異を有する、請求項１０記載の細菌。 １２、ポリペプチドがヒルジンの天然体ま たは変異体である、請求項９または１０記載の細菌。 １３、ヒルジン変異体が（Ｌｙｓ＾４＾７）ＨＶ２であ
   る、請求項１２記載の細菌。 １４、ポリペプチドがひと生長ホルモンで ある、請求項９または１０記載の細菌。 １５、ポリペプチドの前駆体の発現ベクタ ーにより形質転換してグラム陰性細菌細胞を培養し、細
   胞を浸透圧ショック処理し、浸透圧ショック上清から組
   換えポリペプチドを分離する、ポリペプチドの周辺質生
   産の方法において、グラム陰性細菌が請求項９−１４の
   いずれか１項記載の細菌であることを特徴とする方法。