JPH03503596A - 蛋白質若しくはポリペプチドの調製方法、該ポリペプチドをコードするｄｎａ配列、該ｄｎａ配列およびポリペプチドを有する微生物および該ポリペプチドの薬学的製剤としての利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 蛋白質若しくはポリペプチドの調製方法、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ配 列、該ＤＮＡ配列およびポリペプチドを有する微生物および該ポリペプチドの薬 学的製剤としての利用。

発明の詳細な説明 この発明は、蛋白質またはポリペプチドの調製方法に関する。この調製方法は、 所望のポリペプチド鎖に付加されたアミノ末端伸長、（好ましくは、少なくとも ２つのアミノ酸を用いる）を含む。

種々の貴重な蛋白質またはポリペプチド（例えば、酵素またはホルモン）が、宿 主細菌を培養することにより生合成的に製造され得る。宿主細菌は、プラスミド のようなりＮＡ配列を有するベクターを含む。このＤＮＡ配列は所望のポリペプ チドをコードする。得られたポリペプチドは培養液から単離され、例えば、クロ マトグラフにより精製される。この方法において生合成的に製造されるポリペプ チドの例は、ソマトスタチン、インスリンおよびヒト成長ホルモンである。

ヒト成長ホルモンをコードする遺伝子を有する微生物を使用する生合成的方法に よりヒト成長ホルモンを製造することが知られている。ヒト成長ホルモンにおい て、開始コードＡＴＧの翻訳を目的としてアミノ酸メチオニンを用いてＮ末端が 伸長される。所望の蛋白質を純粋な状態で得るために、メチオニン基を取り除く ことが必要である。このことは、微生物自体における酵素的開裂により時々（培 養条件に従って）行われるか、または次の段階においてこの開裂が酵素的に達成 される。ヒト成長ホルモンは分離が困難な多様なポリペプチドの混合物中に生じ るため、両方の場合に、多様な副反応の危険を伴う。さらに、所望のペプチドは 、多（の他のポリペプチドとの混合物中に比較的低濃度で細胞内液中に存在する ため、その単離は困難を伴う。

所望のシグナル配列をＮ末端に結合した蛋白質をコードする遺伝子を有する微生 物を使用することが知られている（ＥＰ０００１９３０参照）。シグナル配列が 存在するため、得られるポリペプチドは、細胞質を閉じ込めている細胞内膜を通 って、単離可能な細胞周辺腔内部に搬送される。これは溶解により行われ、これ により、外膜は退化し、細胞周辺腔からの細胞内液が放出され、単離される。

細胞周辺腔内の液体が一つの分画だけ（例えば、微生物により生産された蛋白質 約１％）を含み、所望の蛋白質が濃縮された形で生じるので、上記の事項は精製 に関してかなりの利点を提供する。

所望の蛋白質を細胞周辺腔内部に搬送することの他の利点は、この間隙内で蛋白 質が実質的に正しく折りたたまれ、活性な蛋白質のための正しく折りたたまれた 本来の蛋白質を与えることである。このことは、試験管内で行うことが非常に困 難である次の折りたたみを実行する必要がないため、産業的規模での蛋白質の生 合成的製造における本格的な利点を含んでいる。

所望の蛋白質が細胞内膜を介して搬送される間またはその後に、シグナル配列は 細菌に含まれている酵素により切断される。しかしながら、培養方法、細菌の菌 種等によっては、シグナル配列の片寄った非特異的切断が行われ、または、続い て酵素的反応を生じ、これにより所望の蛋白質のＮ末端が細胞周辺腔のペプチダ ーゼにより調節されない程度に分解されるため、該切断は完全に特異的ではない 。

上記の理由により、この周知の方法では、単離困難なポリペプチド分子群が一般 的に生ずる結果になる。

最後に、少な（とも２つのアミノ酸からなるアミノ末端伸長を有する所望の蛋白 質をコードする微生物によって、所望の完熟蛋白質を製造することが知られてい る（ＤＫ特許出願３４４８／８４参照）。伸長を有する所望の蛋白質は細胞周辺 腔内に集められ、細胞周辺腔から単離され、精製される。この伸長は、正しいＮ 末端を有する所望の蛋白質を純粋な状態で得るために、例えば、酵素ＤＡＰ　ｌ および／またはＤＡＰ　４を使用して特異的に切断される。さらに、精製を効果 的にする１以上の荷電アミノ酸をこのような予備配列（ｐｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅ ）中に挿入することが可能である。これにより、アミノ末端が伸長された蛋白質 と酵素切断で生じた完熟蛋白質との間の電荷の違いを利用してクロマトグラフ的 に精製することができる。

以下の一般式のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を有する細菌を使用した場 合に、最後にのべた方法の両方の利点は、上記に関連した欠点なしに得ることが できることが現在わかっている。

５−Ｅ−Ｐ （式中、Ｓはシグナル配列、Ｅは少なくとも２つのアミノ酸（少なくとも１つが 荷電されている）を有するアミノ伸長、およびＰは所望の完熟蛋白質である） このような培養において、所望のポリペプチドは関連の伸長を有する状態で合成 される。シグナル配列によって、アミノ末端が伸長された蛋白質は細胞質を閉じ 込める膜を通って搬送されることになる。

以下の一般式のアミノ末端が伸長されたポリペプチドを単離することを可能にす るために、シグナル配列はこの工程の間に切断される。

−Ｐ （式中、ＥおよびＰは、上記の通りである）このアミノ末端が伸長されたポリペ プチドは、正しく折りたたまれた形で生じる。細胞周辺腔を有する微生物が使用 される場合には、所望のアミノ末端が伸長されたポリペプチドは、細胞周辺腔の 中に集められる。完全には理解されないある特定の条件（ｃｉｒｃｕＩＩｌｃｅ ｓ）下で、この蛋白質は、同様に培養液中へと細胞外膜を通過する。

次いで、単離されたアミノ末端が伸長されたポリペプチドを、例えば酵素ＤＡＰ 　ｌの基質として使用し、所望のポリペプチドであるＰを生産することができる 。

この工程の間にシグナル配列が完全に正しくは切断さず、または、切断後にさら に個々のＮ末端アミノ酸の開裂が行われたとしても、最終的な精製において、酵 素的開裂の後にも残存し得るアミノ末端が伸長された蛋白質と完熟蛋白質との間 の電荷の違いを利用することにより、所望の完熟蛋白質を高収率かつ純粋な状態 で製造するためにアミノ末端が伸長されたポリペプチドを使用することが可能で ある。

この発明の方法は、実質的に酵素により取り除き得るアミノ末端伸長を有する任 意の蛋白質を調製するために一般的に使用できる。この発明の方法により製造で きる蛋白質の例は、アミノ末端が伸長されたＩＧＦ　１　、アミノ末端が伸長さ れた２２Ｋ　ｈＧＨ、アミノ末端が伸長された２０Ｋ　ｈＧＨ、アミノ末端が伸 長されたＩＬ　Ｌおよびアミノ末端が伸長されたインスリンである。

アミノ末端の伸長であるＥは、好ましくは、説明したように２つのアミノ酸、特 に好ましくは４〜１６個のアミノ酸を含む。

この発明の好都合な実施例はによれば、アミノ末端の伸長は、少なくとも１つの 荷電アミノ酸を含んでいる。１以上の荷電アミノ酸の存在は、所望の蛋白質の効 果的な精製およびクロマトグラフによる単離を可能にする。

この発明は、一つのＤＮＡ配列、このＤＮＡ配列を含んでいるプラスミドおよび そのようなプラスミドが挿入された微生物にも関する。

プラスミドを挿入し得るどのような微生物も、この発明の方法において使用でき る。Ｅ、ｃｏｌｉは、この目的に良く適しているが、その他の微生物も使用でき る。この例は、Ｂ、サブチルス（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｓ）である。この微生物は、 Ｅ、ｃｏｌｌの場合のように細胞外膜を有しておらず、それゆえ、細胞周辺腔を 有していない。この発明のタイプのＤＮＡ配列を含む挿入されたプラスミドを有 する肌すブチルスを培養すると、得られたポリペプチドは、細胞膜を介して培養 溶液中に搬送され、シグナル配列の切断が同時に起こる。このポリペプチドは、 正しく折りたたまれ、それ自体周知の方法（イオン交換樹脂によるクロマトグラ フ参照）により培養液から単離することができる。

この発明の方法により製造されたアミノ末端伸長を有するポリペプチドは、完熟 蛋白質であるＰを調製する際の開始物質として適当である。アミノ末端伸長を好 適に選択すれば、該伸長の特異な酵素的消化を得ることが可能である。例えば、 酵素ＤＡＰ　１またはＤＡＰ　４のうち一つは、この目的のために使用できる。

この酵素は、好ましくは２つのアミノ酸を同時に除去することにより段階的に開 裂する。続いて、クロマトグラフのような周知の方法により、得られた完熟蛋白 質を未反応な、または部分的に反応した伸長ポリペプチドから単離する。

さらに、この発明は、アミノ末端が伸長されたインターロイキン１　（ＩＬ−１ ）並びにこの生物学的に活性なポリペプチドを含む製剤に関する。

インターロイキンｌ　（ＩＬ−１）は、単核球のような多様な動物細胞内で産生 されるポリペプチドである。ＩＬ−１およびＩＬ−１前駆体の完全なアミノ酸配 列は公知である。

ＩＬ−１は、多様な生物学的効果を有する。すなわち、ＩＬ−１は、ランゲルハ ンス島（すなわち、すい臓のβ−細胞）に対する、細胞毒作用を有し、インスリ ン依存性真正糖尿病（ＩＤＤＭ）を起こす。この作用は、β−細胞の特異的受容 体に対するルー１の結合に関連して起こる。

多様な生物学的影響によって、ＩＬ−１の過剰生産が生じる。

例えば、ＩＤＤＭを治療または予防するために、ＩＬ−１の過剰生産を防ぐこと 、またはＩＬ−１の毒性を妨害することのいづれかが強く望れる。

この発明の実施例は、アミノ末端が伸長された比−１が、すい域中のβ−細胞に 対するようなルー１の細胞毒作用を妨害することを見出だしたことに基づいてい る。

アミノ末端が伸長されたＩＬ−１は、β−細胞上のＩＬ−１受容体に結合し、こ れらの受容体をブロックすると思われる。これにより、ルー１の細胞溶解性効果 が防止される。

すなわち、この発明はアミノ末端が伸長されたＩＬ−１にも関する。さらに、こ の発明はアミノ末端が伸長されたルー１を含む製剤に関する。このアミノ末端が 伸長されたＩＬ−１は、例えば、Ｉ　ＤＤＭの治療または予防的治療のために使 用できる。

さらに、この発明は、アミノ末端が伸長されたＩＬ−１またはアミノ末端が伸長 されたＩＬ−１誘導体をコードするためのＤＮＡ構造に関する。

ＩＬ−１およびＩＬ−１の誘導体の伸長部は、異なる長さを有することができる 。また、例えば天然で生じるＩＬ−１のほとんどの予備配列を包含することがで きる。しかしながら、好ましくは比較的短いアミノ末端伸長（例えば、２〜６個 のアミノ酸含む）が使用される。

この発明のタイプのポリペプチドの典型的な例は、ト１ｅＬ−Ｇｌｕ−Ａｌａ− Ｇｌｕ−ＩＬ−１Ａｌａ−Ｃ：１ｕ−ＩＬ−１およｔｙ”Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｌ ａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−ＩＬ−１であり、すべてのポリペプチドが実質的 に低減された細胞毒作用を有している。特定の場合に、この作用は天然に生じた ＩＬ−１よりも著しく低い。

所望ならば、このポリペプチドを、それ自体公知の方法で修飾することができ、 例えば、１個以上のアミノ酸を他のアミノ酸で置換することにより、または、Ｃ 末端において１個以上のアミノ酸を削除することにより修正することができる。

この発明のポリペプチドは、例えば（ｉ、ａ、）　、糖尿病および自己免疫疾患 と闘うため、またはこれらを防止するために治療的に使用することができる。ま た、エンドトキシン抗体（ｅｎｄｏＬｏｘｉａｎＬｉｂｏｄｉｅｓ）の作用によ る数面ショックに罹っている患者の治療のためにも、このポリペプチドを使用す ることが提案されている。この目的のために、薬剤学的製剤、特に注射可能な製 剤が使用される。この製剤は、薬剤学的に許容し得る担体溶液中にポリペプチド を含む。

この発明のポリペプチドは、該ポリペプチドをコードする遺伝子を含む微生物ま たは細胞株を培養することにより生合成的に製造される。次いで、このポリペプ チドは回収・精製され、所望の製剤が作られる。

宿主細胞に挿入すること、および該宿主細胞を培養することによって、この発明 を実施するために適切なプラスミドの製造は、それ自体公知である組換え技術に より実行し得る。

そのような製造は、この発明の実施に適切な多様なプラスミドの構造および製造 は、第１図〜第４図において説明される。

体であるｐＨＤ１６５と名付けられたプラスミドは、プラスミドｐ＾Ｔ１５３を 基にしている（Ｍａｎｄｅｌ　、Ｍ、Ｈｉｇａ、Ａ、　、　１９７０．　Ｊ、Ｍ ｏｌ　、Ｂｉｏｌ　、　。

５３．１５９−６２参照）。制限部位Ｅ、ｃｏＲＩ／Ｂａｍ旧の間には、プロモ ーター、シャイン・ダルガルノ配列および外膜蛋白質Ａ（Ｃｈｅｎ、Ｒ，ｅｔ　 ａｌ、１９８０．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、７７．４５９２− ９６参照）からのシグナル配列を含むＤＮＡ切片　が挿入され、続いて、制限酵 素ＮａＲ１、Ｂｇｌｌ、　ＰｖｕｌｌおよびＢａｍＨＩの認識配列を含む合成り ＮＡリンカ−が挿入されている。

プラスミドｐＨＤ１６７は、同様にプラスミドｐＡＴ１５３の誘導体である。こ のプラスミドは、プロモーター、シャイン・ダルガルノ配列、ＩＧＦＩをコード する合成遺伝子、および転写ターミネータ−を含む。上記の配列は、ｐＡＴ１５ ３内のＥ、ｃｏＲＩとＢａｍ旧制限部位間に挿入される。プラスミドｐＨＤ１７ Ｂは、Ａｃｃｌ／ＢａｍＨＩＤＮＡ断片として単離された転写ターミネータ−お よびプラスミドｐＨＤ１７６からのＩＧＦＩの遺伝子、およびアミノ末端伸長を コードする短い合成りＮＡリンカ−の他に、プラスミド部位、プロモータ一部位 、およびプラスミドｐＨＤ１６５からのシグナル配列を含む。

すなわち、プラスミドｐＨＤ１７Ｂは、外膜蛋白質Ａシグナル配列をコードする 部位に続いて、アミノ末端伸長Ａ　Ｉ　ａ−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ａ　ｌ　ａ−Ｇｌｕお よびＩＧＰＩをコードする配列を含む。

第２図に示されるプラスミドｐＨＤ１４１は、プラスミドｐＨＤ１８７の誘導体 である。このプラスミドｐＨＤＩＢ７においてＩＧＦＩをコードする配列は、ア ミノ末端が伸長された２０に−ｎＧＨをコードする配列により置換されている。

プラスミドｐＨＤ２２３は、アミノ末端伸長をコードする合成りＮＡリンカ−の 他に、プラスミドｐＨＤ１４１のＣ１ａ　Ｉ／ＥｃｏＲ１間に含まれる配列と、 シグナル配列をコードするｐＨＤ１６５からのＣ１ａｌ／Ｎａｒｌ　Ｄ　Ｎ　Ａ 断片を含む。従って、ｐＨＤ２２３は、外膜蛋白質Ａシグナル配列をコードする 部位と、アミノ末端伸長Ａ　ｌ　ａ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ａ　ｌ　ａ−Ｇ　Ｉ　ｕと、 これに続＜２０に一〇ＧＨをコードする配列と、を有している。

第３図に示されるプラスミドｐＨＤ１０Ｂ−９はベクターｐＵｃ１８の誘導体で ある。このベクターｐＵｃ１８には、Ｅ、ｃｏｌｉフィムブリエ蛋白質に８８　 　（Ｇａａｓｔｒａ、Ｗ、ｅｔ　ａｌ、、１９８２．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ、Ｒｅ ｖ、、　４６．１２９−６１参照）からのシグナル配列をコードする部位が、制 限部位Ｂａｍ旧／Ｐｓｔ１間に挿入されている。

プラスミドｐＨＤ１１７−４５Ｐ１３は、プラスミドｐＨＤ１６７の誘導体であ る。このプラスミドにおいて、ＩＧＰＩをコードする部位は、アミノ末端か伸長 された２２に−ｈＧＩｌをコードする部位で置換されている。

従って、プラスミドｐＨＤ１４８−２２に−ｈＧＨは、フィムブリイ蛋白質に８ ｇからのシグナル配列と、これに続く、アミノ末端伸長Ａ　ｌ　ａ−Ｇ　ｌ　ｕ −Ａ　ｌ　ａ−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ａ　ｌ　ａ−Ｇ　ｌ　ｕと、これに続＜　２２に− ｈＧＨをコードする部位と、を有する。

第４図に示されるプラスミド１）ＨＤ１８３は、プラスミドｐＨＤ１６７の誘導 体である。このプラスミドにおいて、ＩＧＰＩをコードする部位は、アミノ末端 伸長されたＩＬ−１をコードする部位で置換されている。

プラスミドｐ１１Ｄ１８５は、プラスミドｐＡＴ１５３の誘導体である。

このプラスミドには、制限酵素Ｎａ百、Ｂｇｌｌｌ、　Ｐｖｕ［ｌおよびＢａ［ ＩＩＨｌのための認識部位に加え、外膜蛋白質Ａシグナル配列をコードする領域 を含む合成りＮＡ断片が、制限部位Ｅ、　ｃｏＲＩ　／Ｂａａ＋旧間に挿入され ている。

従って、プラスミドｐＨＤ１６３／１８５は、外膜蛋白質Ａからシグナル配列を コードする部位と、これに続くアミノ末端伸長Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ −Ｐｈｃ−Ａｓ＋）およびインターロイキン１をコードする部位と、を含んでい る。

この発明の方法は、以下の幾つかの実施例により、さらに完全に説明されるであ ろう。

実施例１ プロモーターおよび上記シグナル配列を含むプラスミドｐＨＤ１６５を、酵素Ｎ ａ＋Ｉ／Ｂａｍ旧を用いて切断し、次いで、プラスミド断片を精製した。例えば 、ヒトＩＧＦＩをコードする配列、およびこれに続く転写ターミネータ−を有す るプラスミドｐＨＤＬ６７を酵素Ａｃｃｌ／Ｂａｎ＋旧を用いて切断し、次いで 約６００の塩基対を有する断片を精製した。次いで、これらの２つの断片と共に 、酵素Ｎａｒ　Ｉ／Ａｃｃｌのための制限酵素オーバーハングを有するアミノ末 端伸長をコードするＤＮＡリンカ−を　連結し、プラスミドｐＨＤ１７６を形成 した。結合混合物（Ｌｉｇａｎｔｉｏｎ　ｍ１ｘ−ｔｕｒｅ）は、細菌Ｅ、Ｃｏ １１　ＭＣ１０６１内に実質的に形質変換され、アンピシリン含有寒天平板上に 塗沫し、３７℃で一昼夜培養した。

複数の細菌コロニーを選択し、制限酵素分析によりさらに特徴付けるために培養 した。次いで、このクローンｐＨＤ１７６−Ｄ、−Ｆを選択した。クローンｐＨ Ｄ１７Ｂ−Ｆを大規模で培養し、次いで、この細菌を遠心分離で回収した。次い で、この細菌を浸透圧ショックにより部分的に破裂させた。これにより、細胞周 辺腔に存在する蛋白質が細菌から放出された。部分的に破裂した細菌を除去した 後に、アミノ末端を伸長されたＩＧＰＩを精製した。次いで、この物質をＤＡＰ 　１の基質として使用し、これによりＮ末端の伸長を特異的に除去した。

上記細菌ＨＤ１７６−Ｆの培養における発現レベルは、０Ｄ６００が約１である 細菌培養液１リツトルあたりのアミノ末端を伸長されたＩＧＦＩが約５　ｍｇで あった。

イオン交換性のクロマトグラフによる精製ののち、純粋なＩＣＩＣエコ単離され た。

実施例２ ２０にヒト成長ホルモンをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＨＤＩ４１を、 酵素Ｃ１ａｌ／ＥｃｏＲＩを用いて切断し、次いで、このプラスミド断片を精製 した。プラスミドｐＨＤ１６５を酵素Ｃ１ａ　ｌ／Ｎａｒｌを用いて切断し、次 いで、約１２０の塩基対を有する断片・を精製した。プラスミドｐＨＤ２２３を 形成するために、これらの断片は制限酵素Ｎａｒ　ｌ／ＥｃｏＲ１のためのオー バーハングを有する合成りＮＡクリンカの存在下で実質的に共に結合され、プラ スミドｐＨ０２２３が形成された。この結合混合物をＥ、Ｃｏ１１　ＭＣｌｌ０ ６１内に形質転換し、アンピシリン含有成長平板に塗沫した。

培養とこれにより得られたアミノ末端が伸長された２０に成長ホルモンの単離と を実施例１の記載と同様に実施した。

この発現レベルは、実施例１で記載されるものと同じであ上記のシグナル配列が 含まれるプラスミドｐＨＤ１０Ｂ−９を制限酵素Ｂａａ＋旧／Ｈｉｎｄｌを用い て切断した。次いで、１９０の塩基対を有する断片を精製した。この断片を酵素 ＢｓｔＮｌを用いて切断し、鈍端（ｂｌｕｎｔ　ｅｎｄ）を作るために８１ヌク レアーゼを用いて処理し、フェノフルで抽出し、エタノールで結晶化し、次いで 酵素Ｃ１！１を用いて切断した。さらに６０の塩基対を有する断片を精製した。

プラスミドｐｉｆＤ１１７−４５Ｐ１３を酵素Ｃｌ５ｌ／ＥｃｏＲＩを用いて切 断し、次いでプラスミド断片を精製した。プラスミドｐＨＤ１４ｇ−２２に−ｈ ＧＨを形成するために、２つの上記精製された断片をＮａｒｊ／Ｈｉｎｄｌリン カ−の存在下で実質的に共に結合した。この結合混合物を、Ｅ、Ｃｏ１１　ＭＣ １０６１中に形質変換し、アンピシリン含有成長平板上に塗沫した。−昼夜培養 した後、複数のコロニーを、制限酵素分析およびＤＮＡ配列の決定によりさらに 特徴付けるために選択した。

培養とこれにより得られたアミノ末端が伸長された２２Ｋ　ｈＧＨの単離とを実 施例１に記載のような同様の方法で実行した。

実施例４ アミノ末端が伸長されたヒトＩＬ−１をコードする配列を有するプラスミドＩ） ＨＤ１６３を酵素Ｃ１ａｌを用いて切断し、フォスホターゼを用いて処理し、精 製した。

シグナル配列をコードする配列を有するプラスミドｐＨ０１８５を酵素Ｃ１ｘｌ ／Ｎａｒｌを用いて切断し、次いで約９０の塩基対のＤＮＡ断片を精製した。次 いで、プラスミドｐＨＤ１８３／１８５を形成するためにこれらの２つの断片を 共に結合した。

に挿入した。得られたアミノ末端が伸長されたヒトＩＬ−１を精製し、ＤＡＰを 用いた反応によりヒトＩＬ−１に変換した。

次の実施例は、アミノ末端インターロイキン１の製造およびその薬剤学的製剤の ための使用を説明する。

造した。細菌中の高レベル発現および低レベル発現遺伝子のメツセンジャーＲＮ Ａ配列を比較研究することにより、それぞれコドンの使用と発現効率との間に強 い相関関係があることが分かった。すなわち、高レベル発現Ｅ、Ｃｏ１１遺伝子 において最も頻繁に使用されるコドンを使用することが決定された。

有用なりローニング部位が、遺伝子の両端およびその内部に挿入された。この遺 伝子は、アミノ末端伸長Ｍｅｔ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｇｌｕ　（ＭＥＡＥ ）をコードするＤＮＡ配列を用いて伸長された。この遺伝子は、８０ないし１０ ０ヌクレオシドの平均長さを有するオリゴヌクレオチドの制限部位間を段階的に クーロニングすることにより製造された。ＭＥＡＥ−ＩＬ−１のための遺伝子配 列は、第５図に示されている。

Ｅ、Ｃｏ１１は、ＩＬ−１のグリコシレージョンまたはその他の修飾が報告され ていないため、宿主微生物として選択された。この発現は、合成プロモーター（ ｓｐ１３）および最適なシャイン・ダルガルノ配列により調節された。この使用 されたプロモーターは、例えば、Ｅ、Ｃｏ１１におけるｂｈＧＨの発現のために 効果的である（全細菌蛋白質の２０％以上）ことが知られているため、選択され た（バイオテクノロジー、Ｖｏｌ、５．Ｆｅｂ、１９８７．ｐ、１６０）。この クローンをｐＨＤ２３０と呼ぶ。

ｐＨＤ２３０／ＭＣ１０６１からの全細胞抽出液をＳＤＳゲルテ分析し、クマシ ーブルーを用いて着色することにより、期待したサイズの強固なバンドが得られ ることかわった。ＩＬ−Ｌ−特異的Ｅｌ。

Ｉｓ＾で細菌抽出物を分析することによって、その試料は細菌密度（ＯＤ　６０ ０）が１である細菌培養液１１当り約１０■のＩＬ−１に相当する免疫反応性物 質を含んでいることが示された。

ＩＬ−１の抽出を、バイオテクノロジー、Ｖｏｌ、４．Ｄｅｃ、１９８Ｂ、ｐ。

１０７８に説明されているように実行した。Ｎ末端が伸長されたＩＬ−１−β誘 導体の精製を、ＦＰ−Ｓセファロース、ＰＦ−Ｑセファロースおよびゲルろ過コ ロニー上でそれぞれ実行した。問題の誘導体は、アミノ酸分析、Ｎ末端配列分析 、フィルム原子衝撃方法（ｔｈｅ　ｒｉｒｍ　ａｔｏｍｉｃ　ｂｏｍｂａｒｄｍ ｅｎｔｍｅｔｈｏｄ）　（パーパーＭ等の（１９８Ｌ）　Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ 、、Ｃｈｅｍ、Ｃｏｍｍ、Ｖｏｌ、１９８１．ｐ、３２５〜３２７）、ＳＤＳお よび通常の電気泳動による分子量決定　によって特徴付けられる。

実施例８ Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−ト１をコードするクローン の調製 試験管内変異誘導により、フェニルアラニン−アスパラキン酸をコードする領域 を有するＤＮＡ切片をクローンｐＨＤ２３０内部に挿入した。これは、ＩＬ−１ 配列をＭｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−で伸長されるような 方法で挿入された。アミノ末端が延長されたＩＬ−１のための遺伝子は、Ｅ、Ｃ ｏ１１中で発現され、上記のように精製された。

このクローンは、試験管内におけるプラスミドｐＨＤ２３０上での変異誘発によ り調製された。アミノ末端が伸長されたＩＬ−１は上記のようにして発現され、 精製された。Ｎ末端メチオニン基は生体内においてＥ、Ｃｏ１１酵素により切断 された。

実施例１０ １　Ｌ−１のアミノ酸７２−２６９をコードするクローンの調製試験管内での変 異誘導により、アミノ酸番号４−５の配列（ＤＡＮ配列ＡＡＧＣＡＣＣＣＴＧＴ ）の回りに、同様のアミノ酸をコードするための配列が導入されたが、独特のＮ ａｒｌ制限部位（ＤＮＡ配列ＡＧＧＣＧＣＣＧＧＴ）が誘導された。

次いて、得られたクローンｐＨＤ２２８を酵素Ｎａｒｌ／Ｃ１ａｌを用いて切断 し、さらに、以下のアミノ酸配列をコードする断片を挿入した。遺伝子は上記の ようにしてＥ、Ｃｏ１１内で発現され、精製された。

挿入されたアミノ酸配列は、以下の構成を有する。：ＭｅＬ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ− Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ− Ｔｈｒ−Ｐｈｒ−Ｇｌｎ−Ｃ：１ｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−丁ｈｒ −Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇ　ｌ　ｕ−に １ｕ−Ｐ　ｒｏ−Ｉ　ｌ　ｅ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｈ　ｒ−Ｔ　ｒｐ− Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｌ　ａ−Ｔ　ｙ秩| υａｌ−Ｈｉｓ−八ｓｐ。

アミノへ端伸長Ｍｅｔ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｇ　ｌ　ｕの代わりに、アミ ノ酸Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｖａｔ−Ｈｉｓ−Ａｓｐをコードする領域を有す るＤＮＡ断片を、試験管内での変異誘発により、クーロンｐＨＤ２３０上に挿入 した。このアミノ末端が伸長されたＩＬ−１は、上記のようにしてＥ、Ｃｏ１１ 内で発現され、精製された。

特異的生物活性（単位／ｎｇｌＬ−１−β）は、共分裂誘発（ｃｏｍｉｔｏｇｅ ｎｉｃ）マウス胸腺細胞増殖アッセイ（ＬＡＦ）における生物学的応答性の同時 測定によって、また応答したＩＬ−１−β蛋白質のＩＬ−１−βエリザ（Ｅｌｉ ｓａ）による定量により決定される。

１、ＬＡＦアッセイは上記のように実行される（Ｓｃａｎｄ、Ｊ、　１ｍｍｕｎ ｏ１．２８：６１１，１９８７，５ｃａｎｄ、Ｊ、１ｍｍｕｎｏ１．：文献にお いて、インターロイキン１、腫瘍壊死因子アルファおよびプロスタグランジンＥ 、のエンドトキシンに刺激された単核細胞分泌は、安定した個体間での相違を示 す）。

胸腺細胞は、ＣＨ３／ｈｅマウス種（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ、Ｆｅｄｅｒ ａｌ　Ｒｅｐｕｂｌｉｃ　ｏｆ’　Ｇｅｒｍａｎｙ）の５ないし７週齢の雄マウ スから取り出された。この細胞を洗浄した後、それらを９０％のＲｐＭｌ−１８ ４および熱により不活性化された１０％の貯蔵ヒト血清の混合液からなる培養中 にいれて、シャローマイクロタイタープレート（ｓｈａｌｌｏｗ　ｒａｆｃｒｏ ｔｉｔｅｒ　ｐｌａｔｅｓ）　（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ＞内に移した。

この培養液は、稀釈系列に従って試料に加えられており、この稀釈系列は２０容 量％から始まり、ｌ：２で８段階まで稀釈されている。この試験系列は３回繰り 返された。５μｇ　／　ｍｌのＰＩＩＡ（ディフコ（Ｄｉｆ’ｃｏ））をそれぞ れのウェルに加えた。４８時間、３７℃で培養した後、ウェル毎に１μＣｉのト リチウム標識チミジンを加えた。さらに、半自動細胞培養機により１８時間培養 した後に、この培養液はガラス繊維フィルター（スケルトン（５ｋｅｒｔｏｎ） 　、ノルウェー）上に収容された。次いで、フィルターはベータカウンター内で 計数される。

この結果は次のように計算される。二３回の平均を計算する。バックグラウンド の３倍以上の計数を含むそれぞれの稀釈系列について、線形回帰（Ｌｉｎｅａｒ 　ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｒｉ）を行なう。

次の稀釈段階における計数よりも１０％高い場合にだけ、稀釈系列の中の一番高 い計数が導入されている。線形回帰は、半対数的または両対数的のいずれかで行 われる。この線形回帰は、組み換えＩＬ−１−β１１００ｎ／ｍｌ　（ＷＨＯ標 準）からなる標準に対する生物学的応答性の定量化に直接に可能とする平行な曲 線群を与える。さらに、この結果は単位／　ｍｌで表すことができる。ＷＨＯ標 準は１００　Ｕ／ｎｇを含む。

イキット（Ｂｉｏ　Ｒａｄ、Ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ）により行わ れる。

結　　　果 結果を下記の表に示す。ＭＥＡＥ−ＩＬ−１−βの特異的な活性は全範囲が、組 み換えられた完全なＩＬ−１−βよりも５０ないし１００倍弱いことが見出され たことが注目される。この結果は、３つの独立した実験から得られる。

実施例１３ Ｄｉａｂｅｔｅ　ｖｏｌＪ６．ｐ、Ｂ４１−８４７；１９８７：インターロイキ ン−１のランゲルハンス島細胞毒作用、培養条件およびランゲルハンス島供与体 の特性による影響（Ｉｓｌｅｔ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｏｆ’　Ｉｎｔｅ ｒ−１ｅｕｋｉｎ−１１ｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｃ１ｔｕｒｅＣｏｎｄｉｔｉ ｏｎｓ　ａｎｄ　ｌ５ｌｅｔ　ＤｏｎｏｒＣｈａｒａｃｃｅｒｉｓｉｔｉｃｓ、 ）に開示されるように行われる。

すい臓は、ウィスター（ν１ｓｔａｒ）種の５ないし７日齢のラットから取り出 され、ランゲルハンス島（ｉｓｌｅｔ）がコラゲナーゼ崩壊により単離される。

このランゲルハンス島は、ＲＰＭＩ−１６４０＋ｌｏ％ＮＣ３中で３７℃、湿潤 雰囲気で培養される。１週間インキュベートした後、該ランゲルハンス島は　Ｒ ＰＭＩ−１６４０＋０．５％Ｈ３で洗浄され、さらにＩＬ−１有りおよびＩＬ− １なしで″　　６日間インキュベートされる。このランゲルハンス島からのイン スリン分泌は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で決定される。ＩＬ−１をイン キュベートしたランゲルハンス島からのインスリン分泌は、コントロールのＩＬ −１のないランゲルハンス島からのインスリン分泌の百分率（％）として示され る。

びｒ　Ｉ　Ｌ−１と共にランゲルハンス島を培養することによって、ＭＥＡＥ− ＩＬ−１はＡＥ−ＩＬ−１の１０分の１の活性であり、λＥ−ＩＬ−１はｒｌＬ −１の１０分の１の活性であることが示された（第６図参照）第３図は、ＩＬ− １の標準曲線を示している。インスリン分は、ｒｌＬ−１の極低濃度（０，００ １ｎｇ／ｍｌ）において促進される（約１３０％）。一方、インスリン分泌はｒ ｌＬ−１の高濃度（０，Ｉｎｇ／ｍｌ）で約５０％阻害される。

浄書（内容に変更なし） Ｂａ′ｒｌ（Ｉ Ｕ） コシトドｖ９インスリンｈ＄ｒ、ｘｑｂ％′コントＤ−ｐの！ンスリン今ツムρ ｓ’ｑｉ　％２、発明の名称 の薬学的製剤としての利用。

３、特許出願人 住所　デンマーク国、ディ・ケイ−２８８０５、補正書の提出年月日 １９８９年６月１日 ６、添付書類の目録 （１）補正書の翻訳文　　　　　　　　　　　　１通請求の範囲 （式中、Ｐは所望のポリペプチドであり、Ｅは２〜１６個の、好ましくは２〜６ 個のアミノ酸を有し、少なくとも一つが荷電アミノ酸であるアミノ末端伸長であ る）蛋白質またはポリペプチドの調製方法であって、（式中、Ｓはシグナル配列 、ＥおよびＰは上記の通りである）のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含 む真核細菌を、またはシグナル配列の開裂を同時に伴って、一般式５−Ｅ−Ｐの ポリペプチドが微生物の細胞質を閉じ込めている膜を通って細胞周辺腔または培 養溶液内に搬送される条件下に、培養基質中で培養することを特徴とする調製方 法。

（２）　細菌がＥ、Ｃｏ１１またはＢ、サブチルスであることを特徴とする請求 項１記載の方法。

（３）　ＰがポリペプチドＩＣＦ＋、２２Ｋ　ｈＧＨ，Ｉｔ、１またはヒトイン スリンのうち一つであることを特徴とする請求項１または請求項２いづうれか記 載の方法。

（４）　Ｅが一般式、 Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｒ：は Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−のうち一つを有するペプチ ド配列であることを特徴とする請求項１ないし請求項３のいづれか一つに記載の 方法。

（５）　請求項１ないし請求項４のいづれか一つに記載の方法による生産される ポリペプチド。

（６）　請求項５記載のポリペプチドおよび追加の薬剤学的に許容し得る担体を 含むことを特徴とする薬剤学的製剤。

（７）　注射用製剤として調製されることを特徴とする請求項６記載の薬剤学的 製剤。

３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 名称ノボ−ノルディスク　ニー／ニス 平成２年１０月９日（発送日） 図面の翻訳文（Ｆｉｇｌ、　Ｆｉｇ２〜４．　Ｐｉｇ６〜７）７、補正の内容 国際調査報告 １ｍ＊ｎｍ＋ｅＭＩ　Ａｅｅｋｅｌｍ、Ｎ−、ＰＣＴ１０Ｋ８８１０［ＩＩＯ１

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式： Ｅ−Ｐ （式中、Ｐは所望のポリペプチドであり、Ｅはアミノ末端伸長である） の蛋白質またはポリペプチドの調製方法であって、一般式： Ｓ−Ｅ−Ｐ （式中、Ｓはシグナル配列、ＥおよびＰは上記のようである）のポリペプチドを コードするＤＮＡ配列を有する細菌を、一般式Ｓ−Ｅ−Ｐのポリペプチドが、完 全または部分的なシグナル配列の開裂を同時に伴って、細胞質を閉じ込めている 膜を通って搬送される条件下で基質中で培養することを特徴とする調製方法。
2. （２）アミノ末端伸長が少なくとも２つのアミノ酸を含むことを特徴とする請求 項１記載の方法。
3. （３）アミノ末端伸長が４ないし１６個のアミノ酸を含むことを特徴とする請求 項１記載の方法。
4. （４）アミノ末端伸長が、少なくとも１つの荷電アミノ酸を含むことを特徴とす る請求項２または請求項３いづれかに記載の方法。
5. （５）一般式： Ｓ−Ｅ−Ｐ （式中、Ｓ、ＥおよびＰは、請求項１記載の通りである）のポリペプチドをコー ドするコドンを有することを特徴とするプラスミド内に挿入するためのＤＮＡ配 列。
6. （６）請求項５に記載されているＤＮＡ配列を有することを特徴とするプラスミ ド。
7. （７）請求項６に記載のプラスミドを有することを特徴とする微生物。
8. （８）Ｅ．ＣｏｌｉまたはＢ．サブチルスであることを特徴とする請求項７記載 の微生物。
9. （９）請求項５記載の一般式において、ＰがポリペプチドＩＧＦ１、２２Ｋ　ｈ ＧＨ，ＩＬ１またはヒトインスリンのうち一つであることを特徴とするＤＮＡ配 列。
10. （１０）１ないし４５個のアミノ酸からなるアミノ末端伸長を有するインターロ イキン１（ＩＬ−１）またはＩＬ−１誘導体からなるポリペプチド。
11. （１１）伸長が１ないし３０個の、好ましくは１ないし１０個のアミノ酸からな ることを特徴とする請求項１０記載のポリペプチド。
12. （１２）伸長が２ないし６個のアミノ酸からなることを特徴とする請求項１０記 載のポリペプチド。
13. （１３）伸長が１つのアミノ酸からなることを特徴とする請求項１０記載のポリ ペプチド。
14. （１４）下記一般式 【配列があります】， 【配列があります】または 【配列があります】． のうち一つであることを特徴とする請求項１２記載のポリペプチド。
15. （１５）請求項１０ないし請求項１３のいづれか一つに記載されたポリペプチド をコードすることを特徴とするアミノ末端が伸長されたポリペプチドの発現のた めのＤＮＡ配列。
16. （１６）第５図に示すような構造を有することを特徴とする請求項１５記載のＤ ＮＡ配列。
17. （１７）遺伝子器官（ｇｅｎｅ　ａｐｐａｒａｔｕｓ）が、請求項１４または請 求項１５のいづれか一つに記載されたＤＮＡ配列からなることを特徴とする微生 物または細胞。
18. （１８）請求項１０ないし請求項１４のいづれか一つに記載されたポリペプチド および追加の薬剤学的に許容し得る担体からなることを特徴とする薬剤学的製剤 。
19. （１９）注射用製剤として調製されることを特徴とする治療用製剤。
20. （２０）請求項１８または請求項１９のいづれか記載の薬剤学的製剤の投与から なる治療方法。