JPH02257884A - 細菌性細胞外性リグニンペルオキシダーゼ - Google Patents
細菌性細胞外性リグニンペルオキシダーゼInfo
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- JPH02257884A JPH02257884A JP1307828A JP30782889A JPH02257884A JP H02257884 A JPH02257884 A JP H02257884A JP 1307828 A JP1307828 A JP 1307828A JP 30782889 A JP30782889 A JP 30782889A JP H02257884 A JPH02257884 A JP H02257884A
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- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔関連出願に対するクロス・リファレンス３本出願は、
１９８８年１１月３０日に出願の出願番号筒２７７．８
０２号の一部継続出願である。
１９８８年１１月３０日に出願の出願番号筒２７７．８
０２号の一部継続出願である。
本研究は、米国環境保護局（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ
ｓＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ
Ａｇｅｎｃｙ）により研究協定ＣＰ−８１５３００−
Ｏｆ−０のもとに、および米国エネルギー省（（Ｊｎｉ
ｔｅｄ ５ｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ
Ｅｎｅｒｇｙ）認可［１ｆ！−ＦＧ７８６ＥＲ１３５８
６、および国立科学財団（ＮａｔｉｏｎａｌＳｃｉｅｎ
ｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）認可ＶＣ５−８８０７０
００により一部援助された。米国政府は本研究において
権利を有することができる。
ｓＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ
Ａｇｅｎｃｙ）により研究協定ＣＰ−８１５３００−
Ｏｆ−０のもとに、および米国エネルギー省（（Ｊｎｉ
ｔｅｄ ５ｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ
Ｅｎｅｒｇｙ）認可［１ｆ！−ＦＧ７８６ＥＲ１３５８
６、および国立科学財団（ＮａｔｉｏｎａｌＳｃｉｅｎ
ｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）認可ＶＣ５−８８０７０
００により一部援助された。米国政府は本研究において
権利を有することができる。
本発明は、生来のまたは異種の宿主中でのりグニンペル
オキシダーゼの発現に関する。
オキシダーゼの発現に関する。
リグニンは、紙の製造の副生成物であり、そして経済的
価値の低い非妥協的材料である傾向がある。更に、木材
のバルブ成形におけるリグニンの除去に関連するコスト
が相当かかる。
価値の低い非妥協的材料である傾向がある。更に、木材
のバルブ成形におけるリグニンの除去に関連するコスト
が相当かかる。
生物が植物残渣のセルロースおよびヘミセルロース成分
を分解する時、リグニンを酸化的に解重合することので
きる生物が知られている。この解重合反応は、主なリグ
ニン分解生成物として、改変された水溶性酸沈澱性重合
体リグニンをもたらす、細胞外リグニンペルオキシダー
ゼがリグニンの最初の異化を触媒すると思われる。リグ
ニンを水溶性にするため該生物により使用される酵素は
、商業的なリグニン除去方法において利用することがで
きる。従って、効率的で且つ経済的なリグニンの除去の
ため商業的方法において利用できる酵素組成物の開発に
相当な関心がある。
を分解する時、リグニンを酸化的に解重合することので
きる生物が知られている。この解重合反応は、主なリグ
ニン分解生成物として、改変された水溶性酸沈澱性重合
体リグニンをもたらす、細胞外リグニンペルオキシダー
ゼがリグニンの最初の異化を触媒すると思われる。リグ
ニンを水溶性にするため該生物により使用される酵素は
、商業的なリグニン除去方法において利用することがで
きる。従って、効率的で且つ経済的なリグニンの除去の
ため商業的方法において利用できる酵素組成物の開発に
相当な関心がある。
Ｓ．ビリドスポルス（影旦ム並扛肛■）ＴＴＡ中のリグ
ノセルロース誘導性細胞外性リグニンペルオキシダーゼ
（細菌性リグニンペルオキシダーゼＡＬｉｐ−Ｐ３）は
、Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａら、＾ １．Ｅｎｖｉｒｏｎ
。
ノセルロース誘導性細胞外性リグニンペルオキシダーゼ
（細菌性リグニンペルオキシダーゼＡＬｉｐ−Ｐ３）は
、Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａら、＾ １．Ｅｎｖｉｒｏｎ
。
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１９８８．５４ ： ３０５７−
３０６３により報告されている。Ｒａａ＋ａｃｈａｎｄ
ｒａ ら、Ａ １．Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ。
３０６３により報告されている。Ｒａａ＋ａｃｈａｎｄ
ｒａ ら、Ａ １．Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ。
１９８７、菰： ２７５４−２７６０もまた参照のこ
と。
と。
他のリグニン解重合性放線菌が記載されている。
サーモモノスポラ・メソマイリア（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎ
ｏ−二ｄ）についてはＭｃＣａｒ ｔｈｙら、１９８６
゜Ａ １．Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、＋ ２４ ： ３４７−３５２
； ＭｃＣａｒｔｈｙ＋ １９８’Ｌ ＦＥＭＳ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ、Ｒｅｖ、＋４６： １４５−１６３
；ストレプトマイセス・バジウス（Ｓｔｒｅ ｔｏｗ
ｃｅｓ ｂａｄｉｕｓ）２５２についてはＰｈｅｌａｎ
ら、Ｃａｎｊ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 １９７９．２５
： １２７０−１２７６ ； Ｂｏｒｇｍｅｙｅｒお
よびＣｒａｗｆｏｒｄ、 Ａ １．Ｅｎｖｉｒｏｎ、
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 １９８５＋４９ ： ２７３−
２７８ 、３ ．ビリドスポルス（旦、旦旦並並肛ｕ）
についてはＡｄｈｉら、１９８９、同文献、剥： １１
６５−１１６８を参照のこと、 Ｇｉｒｏｕｘら、１９
８８、同文献、且：３０６４−３０７０およびＢａ１ｌ
ら、同文献、ＥＩＥＬ： １６４２−１６４４もまた参
照のこと。
ｏ−二ｄ）についてはＭｃＣａｒ ｔｈｙら、１９８６
゜Ａ １．Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、＋ ２４ ： ３４７−３５２
； ＭｃＣａｒｔｈｙ＋ １９８’Ｌ ＦＥＭＳ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ、Ｒｅｖ、＋４６： １４５−１６３
；ストレプトマイセス・バジウス（Ｓｔｒｅ ｔｏｗ
ｃｅｓ ｂａｄｉｕｓ）２５２についてはＰｈｅｌａｎ
ら、Ｃａｎｊ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 １９７９．２５
： １２７０−１２７６ ； Ｂｏｒｇｍｅｙｅｒお
よびＣｒａｗｆｏｒｄ、 Ａ １．Ｅｎｖｉｒｏｎ、
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 １９８５＋４９ ： ２７３−
２７８ 、３ ．ビリドスポルス（旦、旦旦並並肛ｕ）
についてはＡｄｈｉら、１９８９、同文献、剥： １１
６５−１１６８を参照のこと、 Ｇｉｒｏｕｘら、１９
８８、同文献、且：３０６４−３０７０およびＢａ１ｌ
ら、同文献、ＥＩＥＬ： １６４２−１６４４もまた参
照のこと。
リグニンペルオキシダーゼをコードするＤＮＡ配列およ
び、リグニンペルオキシダーゼを同定しそして組換えＤ
ＮＡ技術によりリグニンペルオキシダーゼを発現せしめ
るため該ＤＮＡ配列を使用する方法が提供される。該リ
グニンペルオキシダーゼはリグノセルロースを分解する
ことかでき、そして該リグニンペルオキシダーゼ遺伝子
を用いて宿主を形質転換し、リグノセルロース分解活性
を増強することができる。
び、リグニンペルオキシダーゼを同定しそして組換えＤ
ＮＡ技術によりリグニンペルオキシダーゼを発現せしめ
るため該ＤＮＡ配列を使用する方法が提供される。該リ
グニンペルオキシダーゼはリグノセルロースを分解する
ことかでき、そして該リグニンペルオキシダーゼ遺伝子
を用いて宿主を形質転換し、リグノセルロース分解活性
を増強することができる。
リグニンペルオキシダーゼの発現のためのＤＮＡ配列、
ＤＮＡ構成物、ベクターおよび形質転換宿主が提供され
る。ここで該酵素および該酵素を発現できる宿主はリグ
ニンおよびリグノセルロースの分解のために利用可能で
ある。
ＤＮＡ構成物、ベクターおよび形質転換宿主が提供され
る。ここで該酵素および該酵素を発現できる宿主はリグ
ニンおよびリグノセルロースの分解のために利用可能で
ある。
リグニンペルオキシダーゼは、Ｓ．ビリドスポルス（影
杜社並踵虹■）、Ｓ、シアネウス（１江用■）、バジウ
ス（ｂａｄｉｕｓ）を含む多数のストレプトマイセス種
、およびサーモモノスポラ・メソマイリア（乃ｙ１旦１
狙眩■肚且吐旦ｉａ） すどの他の放線菌中に見い出さ
れる。この酵素は、リグニンの最初の異化に関与し、リ
グノセルロース誘導性であり、細胞外性であり、フェノ
ール性。
杜社並踵虹■）、Ｓ、シアネウス（１江用■）、バジウ
ス（ｂａｄｉｕｓ）を含む多数のストレプトマイセス種
、およびサーモモノスポラ・メソマイリア（乃ｙ１旦１
狙眩■肚且吐旦ｉａ） すどの他の放線菌中に見い出さ
れる。この酵素は、リグニンの最初の異化に関与し、リ
グノセルロース誘導性であり、細胞外性であり、フェノ
ール性。
および非フエノール性リグニン構造モデル中の側鎖の炭
素−炭素結合の開裂を触媒し、過酸化水素または過酸化
水素源の存在を必要とし、そして重合体リグニンを酸化
することにより特徴付けられる。当該酵素の生産の誘発
は、リグニン、セルロース、カラマツ材キシランまたは
重合体リグニン分解中間体によっても誘導され得る。該
ペルオキシダーゼは、広い基質特異性を有するヘムタン
パク質である。リグニンおよびリグニン様生成物の他に
、該酵素は他のフェノール類、例えば塩素化された芳香
族化合物を酸化するだろう、該酵素は約３２．０００−
３４．０００ダルトンの分子量を有するが、複数・のサ
ブユニットから構成されるかもしれない。
素−炭素結合の開裂を触媒し、過酸化水素または過酸化
水素源の存在を必要とし、そして重合体リグニンを酸化
することにより特徴付けられる。当該酵素の生産の誘発
は、リグニン、セルロース、カラマツ材キシランまたは
重合体リグニン分解中間体によっても誘導され得る。該
ペルオキシダーゼは、広い基質特異性を有するヘムタン
パク質である。リグニンおよびリグニン様生成物の他に
、該酵素は他のフェノール類、例えば塩素化された芳香
族化合物を酸化するだろう、該酵素は約３２．０００−
３４．０００ダルトンの分子量を有するが、複数・のサ
ブユニットから構成されるかもしれない。
該酵素は０．３０Ｕ／分／ｍｇより大きい活性を有する
。
。
該酵素は約４−８のｐＨ８１域および約２５−５０°Ｃ
の温度にて酸化活性を示す。酸性のｐＨ状態が好ましい
（最適ｐＨ＝５．５−５．６）。
の温度にて酸化活性を示す。酸性のｐＨ状態が好ましい
（最適ｐＨ＝５．５−５．６）。
該酵素は細菌源から得られ、そして過酸化水素の存在下
でリグニンおよびリグノセルロースの炭水化物部分を共
に分解することができる。該酵素は細胞外性であり、酸
化性であり、リグニン、カラマツ材キシランまたは関連
物質により誘導され、そして既知の真菌性リグニンペル
オキシダーゼにより分解できない成る種のリグニン構造
の化学結合を攻撃することができる。該酵素の単離、特
徴付けおよび利用法が提供される。
でリグニンおよびリグノセルロースの炭水化物部分を共
に分解することができる。該酵素は細胞外性であり、酸
化性であり、リグニン、カラマツ材キシランまたは関連
物質により誘導され、そして既知の真菌性リグニンペル
オキシダーゼにより分解できない成る種のリグニン構造
の化学結合を攻撃することができる。該酵素の単離、特
徴付けおよび利用法が提供される。
リグニンペルオキシダーゼ酵素は、細菌の一次増殖と関
係がある。即ち、−次代謝活性の結果であり、そして生
産を誘導するためのストレス等の他の要因に依存しない
と思われる。培地中の高濃度の有機および無機窒素は両
方とも該酵素によるリグニンの分解を阻害しない。
係がある。即ち、−次代謝活性の結果であり、そして生
産を誘導するためのストレス等の他の要因に依存しない
と思われる。培地中の高濃度の有機および無機窒素は両
方とも該酵素によるリグニンの分解を阻害しない。
提供される酵素は、酸化体として過酸化水素を使って天
然の高分子量のリグニンを酸化および解重合することが
できる。別のりゲニンペルオキシダーゼ、例えば真菌フ
ァネロチェート・クリソスおいて報告された最初のもの
である。該細菌性酵素は、真菌性リグニンペルオキシダ
ーゼが攻撃することのできない幾つかのリグニン構造の
化学結合を攻撃することができる。リグニンおよびリグ
ニン構造モデル化合物の０６−酸化もＣ，−Ｃβ開裂も
可能である。
然の高分子量のリグニンを酸化および解重合することが
できる。別のりゲニンペルオキシダーゼ、例えば真菌フ
ァネロチェート・クリソスおいて報告された最初のもの
である。該細菌性酵素は、真菌性リグニンペルオキシダ
ーゼが攻撃することのできない幾つかのリグニン構造の
化学結合を攻撃することができる。リグニンおよびリグ
ニン構造モデル化合物の０６−酸化もＣ，−Ｃβ開裂も
可能である。
本発明の酵素は、Ｃ＆−ヒドロキシルまたはＣヶ−カル
ボニル基を含むβ−０−４およびβ−１タイプのリグニ
ン構造モデル化合物を共に分解することができる。過酸
化水素の存在下で１．２−ジアリールプロパンおよびア
リールグリセロール−β−アリールエーテル型のモデル
化合物のＣ＆Ｃβ結合の酸化的開裂が観察される。該酵
素調製物は、ジアリールエーテルである１−（３，４−
ジメトキシフェニル）−２−（２−メトキシフェニル）
プロパン−１，３−ジオール、１−（４−ヒドロキシ−
３−メトキシフェニル）−２−（２−メトキシフェノキ
シ）プロパン−１−オンおよびジアリールエタンである
１−（４−メトキシフェニル）−２−（フェニル）エタ
ン−１−オンの側鎖中のＣ，−Ｃβ結合の開裂を触媒す
る。
ボニル基を含むβ−０−４およびβ−１タイプのリグニ
ン構造モデル化合物を共に分解することができる。過酸
化水素の存在下で１．２−ジアリールプロパンおよびア
リールグリセロール−β−アリールエーテル型のモデル
化合物のＣ＆Ｃβ結合の酸化的開裂が観察される。該酵
素調製物は、ジアリールエーテルである１−（３，４−
ジメトキシフェニル）−２−（２−メトキシフェニル）
プロパン−１，３−ジオール、１−（４−ヒドロキシ−
３−メトキシフェニル）−２−（２−メトキシフェノキ
シ）プロパン−１−オンおよびジアリールエタンである
１−（４−メトキシフェニル）−２−（フェニル）エタ
ン−１−オンの側鎖中のＣ，−Ｃβ結合の開裂を触媒す
る。
細菌性リグニンペルオキシダーゼ酵素によるＣ＆カルボ
ニル含有化合物のＣ，−Ｃβ開裂は、０６位にヒドロキ
シル基を含むならば同様な化合物を容易に開裂するＰ、
クリソスボリうムのリグニンペルオキシダーゼの作用と
正反対である。ＣｃＭカルボニル基は芳香族核を真菌性
リグニンペルオキシダーゼによる酸化に対して耐性にす
る。従って、該細菌性酵素は真菌性相当物よりもリグニ
ン分解においてより効果的である。細菌介在性リグニン
分解の間のそのようなＣヶーカルボニル含有化合物の分
解は、ストレプトマイセスおよびサーモモノスポラ種に
よる分解の間にリグニンのＣ６−カルボニル含量が増加
するので重要である。
ニル含有化合物のＣ，−Ｃβ開裂は、０６位にヒドロキ
シル基を含むならば同様な化合物を容易に開裂するＰ、
クリソスボリうムのリグニンペルオキシダーゼの作用と
正反対である。ＣｃＭカルボニル基は芳香族核を真菌性
リグニンペルオキシダーゼによる酸化に対して耐性にす
る。従って、該細菌性酵素は真菌性相当物よりもリグニ
ン分解においてより効果的である。細菌介在性リグニン
分解の間のそのようなＣヶーカルボニル含有化合物の分
解は、ストレプトマイセスおよびサーモモノスポラ種に
よる分解の間にリグニンのＣ６−カルボニル含量が増加
するので重要である。
細菌性リグニンペルオキシダーゼで触媒されるリグニン
の分解についての１つの独特な特徴は、遊離される単環
の芳香族フェノールに加えて、リグニンの分解の間に酸
沈澱性ポリフェノール性重合体リグニン（ＡＰＰい中間
体が培地中に蓄積されることであ・る。これらの独特な
分解中間体（ＡＰＰＬ）は、約２０ｋＤよりも小さい分
子量成分の不均質混合物から成る水溶性ポリマーである
。ＡＰＰＬの量はリグノセルロースタイプの生物分解性
と関連がある。
の分解についての１つの独特な特徴は、遊離される単環
の芳香族フェノールに加えて、リグニンの分解の間に酸
沈澱性ポリフェノール性重合体リグニン（ＡＰＰい中間
体が培地中に蓄積されることであ・る。これらの独特な
分解中間体（ＡＰＰＬ）は、約２０ｋＤよりも小さい分
子量成分の不均質混合物から成る水溶性ポリマーである
。ＡＰＰＬの量はリグノセルロースタイプの生物分解性
と関連がある。
ＡＰＰＬの最大回収率はトウモロコシのリグノセルロー
スから得られ、基質中に存在する最初のリグニンの３０
％程度の高さの回収率に達することができる。分解され
たＡＰＰＬは、フェノール性水酸基に冨み、そしてカル
ボキシル基は少ない。分解生成物は非常に酸化性であり
、そしておそらくリグニン中のバラ−ヒドロキシエーテ
ル結合とメトキシ基の実質的開裂に関与するだろう。
スから得られ、基質中に存在する最初のリグニンの３０
％程度の高さの回収率に達することができる。分解され
たＡＰＰＬは、フェノール性水酸基に冨み、そしてカル
ボキシル基は少ない。分解生成物は非常に酸化性であり
、そしておそらくリグニン中のバラ−ヒドロキシエーテ
ル結合とメトキシ基の実質的開裂に関与するだろう。
本酵素はリグニン分解細菌と関連がある。該酵素は細胞
外性である。細菌を培養において増殖させると、該酵素
は培地中に生じる。
外性である。細菌を培養において増殖させると、該酵素
は培地中に生じる。
該リグニンペルオキシダーゼ酵素は、未精製の形、部分
的に純粋な形または精製された形で提供される。該酵素
の粗抽出物は、適当な増殖培地中での適当な細菌の増殖
により調製され得る。培養物は、最大レベルのペルオキ
シダーゼ活性が得られるまで増殖される。最大レベルの
酵素活性を得るための培養物の増殖の実際の時間は様々
である。
的に純粋な形または精製された形で提供される。該酵素
の粗抽出物は、適当な増殖培地中での適当な細菌の増殖
により調製され得る。培養物は、最大レベルのペルオキ
シダーゼ活性が得られるまで増殖される。最大レベルの
酵素活性を得るための培養物の増殖の実際の時間は様々
である。
しかしながら、基質として２．４−ジクロロフェノール
を使ったフラスコ振盪実験に基づくサンプル結果は、最
大レベルが通常約４８時間〜約゛９６時間、普通約７２
時間に得られることを示す。酵素の最大レベルは、リグ
ノセルロースを含まない培地中で通常的０．ＩＵ／ｍｇ
タンパク質〜約０．１８０／ｍｇタンパク質の範囲内で
あろう、より高レベルのペルオキシダーゼ活性のために
、細菌をリグノセルロースの存在下で増殖させることが
できる。約０．０５％（Ｗ／Ｖ）のリグノセルロースが
補足された培地中で細菌を増殖させると、約０．２００
／ｍｇタンパク質質的約０．３２Ｕ／ｍｇタンパク質
範囲内、普通は約０．２４０Ｕ／ｍｇタンパク質のペル
オキシダーゼ活性を得ることができる。
を使ったフラスコ振盪実験に基づくサンプル結果は、最
大レベルが通常約４８時間〜約゛９６時間、普通約７２
時間に得られることを示す。酵素の最大レベルは、リグ
ノセルロースを含まない培地中で通常的０．ＩＵ／ｍｇ
タンパク質〜約０．１８０／ｍｇタンパク質の範囲内で
あろう、より高レベルのペルオキシダーゼ活性のために
、細菌をリグノセルロースの存在下で増殖させることが
できる。約０．０５％（Ｗ／Ｖ）のリグノセルロースが
補足された培地中で細菌を増殖させると、約０．２００
／ｍｇタンパク質質的約０．３２Ｕ／ｍｇタンパク質
範囲内、普通は約０．２４０Ｕ／ｍｇタンパク質のペル
オキシダーゼ活性を得ることができる。
酵母エキス−無機塩培地中の細菌培養物へのカラマツ材
キシランの添加は、細胞外の２．４−ＤＣＰペルオキシ
ダーゼ活性を、キシラン不含有の培地のものと比較して
３倍増加させ、そしてリグノセルロースが補足された培
地と比較すると２倍増加させた。非リグニン誘導物質（
ｉｎｄｕｃｅｒ）を使うことにより、ＡＰＰＬや他の部
分的に分解された水溶性のりゲニンポリマーを含まない
培養上清を得ることが可能である。非リグニン誘導物質
を使うことは、それらの中間体ポリマーが酵素アッセイ
を妨害しそしてペルオキシダーゼ酵素の精製を複雑にす
るので意義深い。
キシランの添加は、細胞外の２．４−ＤＣＰペルオキシ
ダーゼ活性を、キシラン不含有の培地のものと比較して
３倍増加させ、そしてリグノセルロースが補足された培
地と比較すると２倍増加させた。非リグニン誘導物質（
ｉｎｄｕｃｅｒ）を使うことにより、ＡＰＰＬや他の部
分的に分解された水溶性のりゲニンポリマーを含まない
培養上清を得ることが可能である。非リグニン誘導物質
を使うことは、それらの中間体ポリマーが酵素アッセイ
を妨害しそしてペルオキシダーゼ酵素の精製を複雑にす
るので意義深い。
未精製の上清、即ち細菌や他の細胞破片を除去した細菌
培養物のカラマツ材キシランを含有する増殖培地は、約
０，３０Ｕ／分／ｍｇの比活性を示す。
培養物のカラマツ材キシランを含有する増殖培地は、約
０，３０Ｕ／分／ｍｇの比活性を示す。
しかしながら、当業界において知られる従来の精製方法
、例えば硫酸アンモニウム沈澱、セファロースゲル浸透
クロマトグラフィー等を含む方法を使用するプロトコー
ルにより、該リグニナーゼ酵素を精製または部分精製す
ることができる。リグニンペルオキシダーゼの精製また
は部分精製は、該酵素の比活性の増加をもたらす。こう
して、部分精製により０．３０Ｕ／分／ｍｇよりも大き
い比活性を得ることができる。精製された酵素調製物は
、少なくとも約１．２Ｕ／分／ｍｇの比活性を示し、未
精製の上清から精製された形の酵素までに少なくとも３
４倍の比活性の増加をもたらす。
、例えば硫酸アンモニウム沈澱、セファロースゲル浸透
クロマトグラフィー等を含む方法を使用するプロトコー
ルにより、該リグニナーゼ酵素を精製または部分精製す
ることができる。リグニンペルオキシダーゼの精製また
は部分精製は、該酵素の比活性の増加をもたらす。こう
して、部分精製により０．３０Ｕ／分／ｍｇよりも大き
い比活性を得ることができる。精製された酵素調製物は
、少なくとも約１．２Ｕ／分／ｍｇの比活性を示し、未
精製の上清から精製された形の酵素までに少なくとも３
４倍の比活性の増加をもたらす。
２．４−ＤＣＰおよびＬ−ＤＯＰＡを基質として使った
分光光度アッセイにより測定した時の部分精製された酵
素調製物における比活性は、第１表に示される。加えて
、２．４−ＤＣＰおよびＬ−１１０ＰＡ酸化活性は共に
、既知のペルオキシダーゼ阻害剤、例えばシアン化カリ
ウムおよびアジ化ナトリウムにより阻害される（第１表
）。
分光光度アッセイにより測定した時の部分精製された酵
素調製物における比活性は、第１表に示される。加えて
、２．４−ＤＣＰおよびＬ−１１０ＰＡ酸化活性は共に
、既知のペルオキシダーゼ阻害剤、例えばシアン化カリ
ウムおよびアジ化ナトリウムにより阻害される（第１表
）。
この問題の酵素をコードするＤＮＡは、リグニンペルオ
キシダーゼ生産宿主からライブラリーを作成することに
より単離され得る。次いで得られたクローンを用いて、
リグニンペルオキシダーゼについて陰性のバックグラウ
ンドを有する同一のまたは関連する種の菌株を形質転換
する。生じた形質転換体は、色素、例えばリグニナーゼ
の基質である青色の重合体Ｐｏ１ｙ Ｂ−４１１を使っ
てスクリーニングされ得る。透明な輪（ｈａｌｏ）を有
するコロニーが更なる研究のために取り出される。該ク
ローンは、種々のフェノール性色素を含む付加の色素を
用いて、単独でまたは４−アミノアンチピリンと一緒に
使用して、スクリーニング°され得る。
キシダーゼ生産宿主からライブラリーを作成することに
より単離され得る。次いで得られたクローンを用いて、
リグニンペルオキシダーゼについて陰性のバックグラウ
ンドを有する同一のまたは関連する種の菌株を形質転換
する。生じた形質転換体は、色素、例えばリグニナーゼ
の基質である青色の重合体Ｐｏ１ｙ Ｂ−４１１を使っ
てスクリーニングされ得る。透明な輪（ｈａｌｏ）を有
するコロニーが更なる研究のために取り出される。該ク
ローンは、種々のフェノール性色素を含む付加の色素を
用いて、単独でまたは４−アミノアンチピリンと一緒に
使用して、スクリーニング°され得る。
加えて、該クローンを更にスクリーニングしてリグノセ
ルロース分解を提供できることを立証することができる
。形質転換された宿主をリグノセルロース源上で増殖さ
せ、そしてリグノセルロースの分解量を、形質転換され
ていない親のものと比較することにより、リグニンペル
オキシダーゼをコードする遺伝子の存在を立証できる。
ルロース分解を提供できることを立証することができる
。形質転換された宿主をリグノセルロース源上で増殖さ
せ、そしてリグノセルロースの分解量を、形質転換され
ていない親のものと比較することにより、リグニンペル
オキシダーゼをコードする遺伝子の存在を立証できる。
該ライブラリーは、普通は約２〜１０ｋｂ、より普通に
は約３〜８ｋｂの範囲のＤＮＡ断片を含むであろう。１
つまたは複数のクローンがリグニンペルオキシダーゼ遺
伝子を含んで成ると同定されたならば、それらの断片を
該ライブラリーから容易に切り出すことができる。該断
片は、種々のヌクレアーゼ、例えば制限エンドヌクレア
ーゼ、マングマメ（ＩＩＩｕｎｇ ｂｅａｎ）ヌクレア
ーゼ等により更にサイズを小さくすることができる。該
断片の一端または両端のヌクレオチドを除去するために
エキソヌクレアーゼを使うことにより操作することがで
きる。リグニンペルオキシダーゼ情報に富ませるために
、形質転換された宿主からメツセンジャーＲＮＡを得、
そして未形質転換宿主から作製されたｃＤＮＡを使って
削減してもよい。リグニンペルオキシダーゼ情報を明ら
かにするために、リグニンペルオキシダーゼを含有する
ＤＮＡ断片を、富化されたリグニンペルオキシダーゼ情
報を有するｎ＋ＲＮＡ＆ｕ成物とハイブリダイズさせ、
次いでこれを用いてリグニンペルオキシダーゼをコード
する遺伝子のｃＤＮＡを作製することができる。加えて
、このリグニンペルオキシダーゼのｃＤＮＡを使って、
誘導性プロモーターを含む５′−フランキング領域を同
定することができる。
は約３〜８ｋｂの範囲のＤＮＡ断片を含むであろう。１
つまたは複数のクローンがリグニンペルオキシダーゼ遺
伝子を含んで成ると同定されたならば、それらの断片を
該ライブラリーから容易に切り出すことができる。該断
片は、種々のヌクレアーゼ、例えば制限エンドヌクレア
ーゼ、マングマメ（ＩＩＩｕｎｇ ｂｅａｎ）ヌクレア
ーゼ等により更にサイズを小さくすることができる。該
断片の一端または両端のヌクレオチドを除去するために
エキソヌクレアーゼを使うことにより操作することがで
きる。リグニンペルオキシダーゼ情報に富ませるために
、形質転換された宿主からメツセンジャーＲＮＡを得、
そして未形質転換宿主から作製されたｃＤＮＡを使って
削減してもよい。リグニンペルオキシダーゼ情報を明ら
かにするために、リグニンペルオキシダーゼを含有する
ＤＮＡ断片を、富化されたリグニンペルオキシダーゼ情
報を有するｎ＋ＲＮＡ＆ｕ成物とハイブリダイズさせ、
次いでこれを用いてリグニンペルオキシダーゼをコード
する遺伝子のｃＤＮＡを作製することができる。加えて
、このリグニンペルオキシダーゼのｃＤＮＡを使って、
誘導性プロモーターを含む５′−フランキング領域を同
定することができる。
該ＤＮＡは様々な構成物において使用することができる
。ゲノム遺伝子を含む断片を適当なベクター中に挿入す
ることによりコンピテント宿主の形質転換に使ってもよ
い。該ベクターは安定な染色体外維持または宿主のゲノ
ムへの組込みのために用意され得る。ホロ酵素を生産す
るために必要なヘム補欠分子族を提供する宿主を使用す
ることもできるし、またはヘム補欠分子族を提供せずア
ポ酵素を生じるような宿主を用意してもよい。適当な時
、所望であれば、ヘム補欠分子族を外来的に提供するこ
とができる。
。ゲノム遺伝子を含む断片を適当なベクター中に挿入す
ることによりコンピテント宿主の形質転換に使ってもよ
い。該ベクターは安定な染色体外維持または宿主のゲノ
ムへの組込みのために用意され得る。ホロ酵素を生産す
るために必要なヘム補欠分子族を提供する宿主を使用す
ることもできるし、またはヘム補欠分子族を提供せずア
ポ酵素を生じるような宿主を用意してもよい。適当な時
、所望であれば、ヘム補欠分子族を外来的に提供するこ
とができる。
ゲノム断片は、上記のように種々の方法で更に操作する
ことができる。該ゲノムのコード領域から５′−フラン
キング領域を除去しそして形質転換宿主中で機能的なプ
ロモーターで置き換えることができる。該プロモーター
は、形質転換の目的に依存して、構成的であってもよく
誘導的であってもよい。例えば、生物をリグノセルロー
スの分解に使用するつもりであれば、リグノセルロース
の存在に応答する誘導性プロモーターを有するのが望ま
しいだろう。対照的に、酵素を生産しそしてそれを細胞
外的に利用することだけを所望する場合には、構成的な
強力なプロモーターが望ましいだろう。成る場合には、
該遺伝子を増幅遺伝子、例えばＤ）ＩＦＲ，メタロチオ
ネイン等と共に宿主ゲノム中に組込むことにより、該遺
伝子を増幅することが望ましいかもしれない。
ことができる。該ゲノムのコード領域から５′−フラン
キング領域を除去しそして形質転換宿主中で機能的なプ
ロモーターで置き換えることができる。該プロモーター
は、形質転換の目的に依存して、構成的であってもよく
誘導的であってもよい。例えば、生物をリグノセルロー
スの分解に使用するつもりであれば、リグノセルロース
の存在に応答する誘導性プロモーターを有するのが望ま
しいだろう。対照的に、酵素を生産しそしてそれを細胞
外的に利用することだけを所望する場合には、構成的な
強力なプロモーターが望ましいだろう。成る場合には、
該遺伝子を増幅遺伝子、例えばＤ）ＩＦＲ，メタロチオ
ネイン等と共に宿主ゲノム中に組込むことにより、該遺
伝子を増幅することが望ましいかもしれない。
多数の宿主のための非常に様々な発現ベクターが存在し
、又は容易に調製され得る。ベクターは、普通、クロー
ニングベクター中でクローニングするのに機能的である
複製系、例えばＥ、コリ、遺伝子の発現のための形質転
換宿主のための複製系、クローニング宿主中および発現
宿主中での選択のための１もしくは複数のマーカー １
もしくは複数のポリリンカー、特にプロモーター領域の
５′側と終結領域の３′側に隣接する（転写方向は５′
−３′）ポリリンカー、を有することにより特徴付けら
れる。
、又は容易に調製され得る。ベクターは、普通、クロー
ニングベクター中でクローニングするのに機能的である
複製系、例えばＥ、コリ、遺伝子の発現のための形質転
換宿主のための複製系、クローニング宿主中および発現
宿主中での選択のための１もしくは複数のマーカー １
もしくは複数のポリリンカー、特にプロモーター領域の
５′側と終結領域の３′側に隣接する（転写方向は５′
−３′）ポリリンカー、を有することにより特徴付けら
れる。
該マーカーは、ストレス耐性、例えば抗生物質、重金属
または他のパイオシドに対する耐性、栄養素要求性宿主
に対する補完、ウィルス耐性等のために用意され得る。
または他のパイオシドに対する耐性、栄養素要求性宿主
に対する補完、ウィルス耐性等のために用意され得る。
様々な断片を連結により一緒に接続し、そしてブライマ
ー修復、生体外突然変異誘発、エンドヌクレアーゼ制限
消化、切除、テーリング等により操作することができる
。
ー修復、生体外突然変異誘発、エンドヌクレアーゼ制限
消化、切除、テーリング等により操作することができる
。
特に着・目すべきは、原核生物、特定的には放線菌、よ
り特定的にはストレプトマイセス中で安定した維持が可
能である機能的複製系を有するベクターであるが、他の
原核生物、例えばＥ、コリ（Ｂ、 ｃｏｌｉ） 、Ｂ、
サブチリス（Ｂ、３ｇｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ、サーモフィ
ラス（影卦ｅｒｍｃ―迂諌旦）、または真核微生物、例
えば真菌なども着目され得る。
り特定的にはストレプトマイセス中で安定した維持が可
能である機能的複製系を有するベクターであるが、他の
原核生物、例えばＥ、コリ（Ｂ、 ｃｏｌｉ） 、Ｂ、
サブチリス（Ｂ、３ｇｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ、サーモフィ
ラス（影卦ｅｒｍｃ―迂諌旦）、または真核微生物、例
えば真菌なども着目され得る。
使用されるベクターはいずれも、発現宿主中で機能的で
あろう。既に指摘した様に、発現の目的、特定の宿主等
に依存して、生来のプロモーターを使用することもでき
、または別のプロモーターで置き換えることもできる。
あろう。既に指摘した様に、発現の目的、特定の宿主等
に依存して、生来のプロモーターを使用することもでき
、または別のプロモーターで置き換えることもできる。
例となるプロモーターはβ−ガラクトシダーゼプロモー
ターである。
ターである。
宿主の形質転換は常法に従って行われ得る。放線菌では
、プロトプラストを調製し、そして融合物質（ｆｕｓｏ
ｇｅｎ）例えばポリエチレングリコールを使ってプロト
プラストを形質転換させ、次いでストレプトマイセス細
胞を再生しそして該ＤＮＡ構成物の存在についてスクリ
ーニングすることにより形質転換が達成され得る。次に
、該ＤＮＡ構成物の存在について陽性のクローンを、前
述のようにしてリグニンペルオキシダーゼの発現につい
てスクリーニングすることができる。
、プロトプラストを調製し、そして融合物質（ｆｕｓｏ
ｇｅｎ）例えばポリエチレングリコールを使ってプロト
プラストを形質転換させ、次いでストレプトマイセス細
胞を再生しそして該ＤＮＡ構成物の存在についてスクリ
ーニングすることにより形質転換が達成され得る。次に
、該ＤＮＡ構成物の存在について陽性のクローンを、前
述のようにしてリグニンペルオキシダーゼの発現につい
てスクリーニングすることができる。
宿主が一度形質転換されたならば、それを酵素の生産に
利用することができ、酵素を既知の方法に従って単離す
ることができる。酵素が分泌される場合、抽出、沈澱等
により上清から単離でき、そして所望であれば、アフィ
ニティカラムまたは他の技術を使って更に精製すること
ができる。酵素がサイドシルに存在する場合、細胞を溶
解し、溶解物から破片を除去し、そして抽出、タンパク
賞沈澱、クロマトグラフィー等によりリグニンペルオキ
シダーゼを単離できる。
利用することができ、酵素を既知の方法に従って単離す
ることができる。酵素が分泌される場合、抽出、沈澱等
により上清から単離でき、そして所望であれば、アフィ
ニティカラムまたは他の技術を使って更に精製すること
ができる。酵素がサイドシルに存在する場合、細胞を溶
解し、溶解物から破片を除去し、そして抽出、タンパク
賞沈澱、クロマトグラフィー等によりリグニンペルオキ
シダーゼを単離できる。
該形質転換体ま、たは該酵素は、リグニンの分解または
フェノール性もしくは他の感受性化合物の酸化に利用さ
れ得る。該遺伝子は、リグニン分解において既にコンピ
テントな宿主を増強させるため、リグニン分解のための
部分的または完全な能力を宿主に付与するため（この場
合には着目の遺伝子は単独でまたはリグニン分解に関与
する別の酵素と共に利用できる）、あるいは工業的方法
において酸化触媒として使用することのできる酵素の生
産のために利用され得る。該酵素は約０．４−〇、８Ｕ
／ｄの範囲内の濃度において得られ（Ｕは実験の部にお
いて定義されるもの）、そして更に濃縮および精製され
得る。
フェノール性もしくは他の感受性化合物の酸化に利用さ
れ得る。該遺伝子は、リグニン分解において既にコンピ
テントな宿主を増強させるため、リグニン分解のための
部分的または完全な能力を宿主に付与するため（この場
合には着目の遺伝子は単独でまたはリグニン分解に関与
する別の酵素と共に利用できる）、あるいは工業的方法
において酸化触媒として使用することのできる酵素の生
産のために利用され得る。該酵素は約０．４−〇、８Ｕ
／ｄの範囲内の濃度において得られ（Ｕは実験の部にお
いて定義されるもの）、そして更に濃縮および精製され
得る。
次の実施例は例示のために与えられ、限定のためではな
い。
い。
Ｓ．ビリドスポルス（影亘社並且虹用） Ｔ７Ａ（ＡＴ
ＣＣ３９１１５）保存培養液を酵母エキス−肉エキス−
グルコース寒天培地上で４°Ｃにて維持した。保存斜面
からの胞子を、０．５％のカラマツ材キシラン（Ｓｉｇ
ｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、、 Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ
、 Ｍｏ、）（ＹＭＸ）を加えた無機塩溶液中の０．６
％（Ｗ／Ｖ）の酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ＋ Ｄｅｔｒｏｉｔ、 Ｍｉｃｈ、） １
！Ｑの入った２１のフラスコ中に接種し、そして１２
５ｒｐｍで振とうしながら３７℃にて３日間培養した。
ＣＣ３９１１５）保存培養液を酵母エキス−肉エキス−
グルコース寒天培地上で４°Ｃにて維持した。保存斜面
からの胞子を、０．５％のカラマツ材キシラン（Ｓｉｇ
ｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、、 Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ
、 Ｍｏ、）（ＹＭＸ）を加えた無機塩溶液中の０．６
％（Ｗ／Ｖ）の酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ＋ Ｄｅｔｒｏｉｔ、 Ｍｉｃｈ、） １
！Ｑの入った２１のフラスコ中に接種し、そして１２
５ｒｐｍで振とうしながら３７℃にて３日間培養した。
３日間増殖後、グラスウールを通して濾過することによ
り培養上清液を回収した。濾液中のタンパク質を限外濾
過により濃縮し、次いで硫酸アンモニウム（７０％飽和
）で沈澱させた。次に、この沈澱物を２０ｍＭの２−（
Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（
ｐＨ５，５）中に再懸濁した。
り培養上清液を回収した。濾液中のタンパク質を限外濾
過により濃縮し、次いで硫酸アンモニウム（７０％飽和
）で沈澱させた。次に、この沈澱物を２０ｍＭの２−（
Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（
ｐＨ５，５）中に再懸濁した。
溶離液としてＭＥＳ緩衝液を用い、５ｅｐｈａｒｏｓｅ
ＣＬ−６８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ−＋ Ｐｉ
ｓｃａｔａｓｖａｙ＋ Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）を使っ
たゲル濾過により、更に精製を行った。ペルオキシダー
ゼ活性を示す両分を集め、限外濾過により再び濃縮した
。
ＣＬ−６８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ−＋ Ｐｉ
ｓｃａｔａｓｖａｙ＋ Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）を使っ
たゲル濾過により、更に精製を行った。ペルオキシダー
ゼ活性を示す両分を集め、限外濾過により再び濃縮した
。
■案ヱヱ皇不
基質として２．４−ジクロロフェノール（２゜４−ＤＣ
Ｐ） （Ｓｉｇｍａ）を使いペルオキシダーゼ活性をア
ッセイした。最終容量１．０ ｄの反応液は、１００ｍ
Ｍコハク酸ナトリウム（ｐＨ５，５） 、８２ｍＭ
４−アミノアンチピリン（Ｓｉｇｍａ） 、１．０ｍＭ
２ 、４−ジクロロフェノール、４．０ｍＭ 過
酸化水素および１００Ｉの酵素調製物を含んでいた。過
酸化水素の添加により反応を開始し、そしてＡ ５．６
の増加を３７℃にて１分間モニターした。酵素１単位は
、１分間あたり１．０の吸光度単位の増加に必要な酵素
量として表わされる。
Ｐ） （Ｓｉｇｍａ）を使いペルオキシダーゼ活性をア
ッセイした。最終容量１．０ ｄの反応液は、１００ｍ
Ｍコハク酸ナトリウム（ｐＨ５，５） 、８２ｍＭ
４−アミノアンチピリン（Ｓｉｇｍａ） 、１．０ｍＭ
２ 、４−ジクロロフェノール、４．０ｍＭ 過
酸化水素および１００Ｉの酵素調製物を含んでいた。過
酸化水素の添加により反応を開始し、そしてＡ ５．６
の増加を３７℃にて１分間モニターした。酵素１単位は
、１分間あたり１．０の吸光度単位の増加に必要な酵素
量として表わされる。
また、基質としてＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルア
ラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ ； Ｓｉｇｍａ）を使って酵素
活性をアッセイした。
ラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ ； Ｓｉｇｍａ）を使って酵素
活性をアッセイした。
垂直スラブゲル（７，５％ポリアクリルアミド）での未
変性不連続ＰＡＧＥにより、酵素調製物中のタンパク質
を分析した。電気泳動後、クーマシーブルー染色により
タンパク質バンドを可視化した。
変性不連続ＰＡＧＥにより、酵素調製物中のタンパク質
を分析した。電気泳動後、クーマシーブルー染色により
タンパク質バンドを可視化した。
基質としてＬ−ＤＯＰＡ、２，４−ジクロロフェノール
、コーヒー酸、ホモブロトカテチュ酸およびＮ、Ｎ。
、コーヒー酸、ホモブロトカテチュ酸およびＮ、Ｎ。
Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルフェニレンジアミン（ＴＭＰ
Ｄ） （これら全てＳｉｇｍａより）での活性染色によ
り、ペルオキシダーゼバンドを発色させた。
Ｄ） （これら全てＳｉｇｍａより）での活性染色によ
り、ペルオキシダーゼバンドを発色させた。
ンパク の クロマ ブーツ −ＨＰＬＣＰｈａ
ｒｍａｃｉａ ＦＰＬＣＭｏｎｏ Ｑアニオン交換カラ
ムを使い、ＨＰ−１０４ＯＡ二極管配列検出器を備えた
Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ １０９０Ａ高圧液体
クロマトグラフ装置により、部分精製されたものと未精
製の酵素調製物中のタンパク質を分析した。移動相は、
流速１ｄ／分にて４０分間に渡る１０ｍＭ １Ｍ酢酸
ナトリウムグラジェントから成る。 ２８０ｎａ＋と４
０９ｎｍにてピークをモニターし、そして各ピークの吸
光スペクトル（２５０−６００ｎｓ＋）を記録した。
ｒｍａｃｉａ ＦＰＬＣＭｏｎｏ Ｑアニオン交換カラ
ムを使い、ＨＰ−１０４ＯＡ二極管配列検出器を備えた
Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ １０９０Ａ高圧液体
クロマトグラフ装置により、部分精製されたものと未精
製の酵素調製物中のタンパク質を分析した。移動相は、
流速１ｄ／分にて４０分間に渡る１０ｍＭ １Ｍ酢酸
ナトリウムグラジェントから成る。 ２８０ｎａ＋と４
０９ｎｍにてピークをモニターし、そして各ピークの吸
光スペクトル（２５０−６００ｎｓ＋）を記録した。
１００Ｍの３日間ＹＭＸ−増殖させた培養上清液を限外
濾過により１０倍濃縮し、次いで硫酸アンモニウム（７
０％飽和）で沈澱させた。この沈澱を２０１ＩＭのＭＥ
Ｓ緩衝液（ｐＨ６，０）中に再び溶解した。
濾過により１０倍濃縮し、次いで硫酸アンモニウム（７
０％飽和）で沈澱させた。この沈澱を２０１ＩＭのＭＥ
Ｓ緩衝液（ｐＨ６，０）中に再び溶解した。
この濃縮された調製物を５ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６
Ｂゲル濾過カラム（１，５Ｘ １００ｃｍ）に適用した
。２０ｍＭのＭＥＳｉｌ衝液（ｐＨ６，０）によりタン
パク質をカラムから溶出させた。ゲル濾過カラムからの
ペルオキシダーゼの溶出分布は、４つのペルオキシダー
ゼ異性体の存在を示した。主要タンパク質ピークだけが
２．４−ＤＣＰ酸化活性を示した。この主ピークを含む
両分を集め、そして再び限外濾過により濃縮した。
Ｂゲル濾過カラム（１，５Ｘ １００ｃｍ）に適用した
。２０ｍＭのＭＥＳｉｌ衝液（ｐＨ６，０）によりタン
パク質をカラムから溶出させた。ゲル濾過カラムからの
ペルオキシダーゼの溶出分布は、４つのペルオキシダー
ゼ異性体の存在を示した。主要タンパク質ピークだけが
２．４−ＤＣＰ酸化活性を示した。この主ピークを含む
両分を集め、そして再び限外濾過により濃縮した。
ペルオキシダーゼ活性についてＰＡＧＥをＬ−ＤＯＰＡ
で活性染色した時、未精製の濃縮酵素調製物から４つの
ペルオキシダーゼ異性体が観察された。４つの異性体の
中で、Ｐ３と命名した異性体だけが２゜４−ＤＣＰ、ホ
モプロトカテチュ酸、コーヒー酸およびＴＭＰＤに対し
ても活性であった。基質としてＬ−ＤＯＰＡを用いたＰ
ＡＧＥゲルの活性染色でも、もとの粗培養液中では４つ
の異性棒金てを示したのに対して、部分精製された調製
物中ではＰ３だけを示した。Ｐ３バンドは、クーマシー
ブルーでゲルを染色した時の主要タンパク賞バンドでも
あった。
で活性染色した時、未精製の濃縮酵素調製物から４つの
ペルオキシダーゼ異性体が観察された。４つの異性体の
中で、Ｐ３と命名した異性体だけが２゜４−ＤＣＰ、ホ
モプロトカテチュ酸、コーヒー酸およびＴＭＰＤに対し
ても活性であった。基質としてＬ−ＤＯＰＡを用いたＰ
ＡＧＥゲルの活性染色でも、もとの粗培養液中では４つ
の異性棒金てを示したのに対して、部分精製された調製
物中ではＰ３だけを示した。Ｐ３バンドは、クーマシー
ブルーでゲルを染色した時の主要タンパク賞バンドでも
あった。
上記の精製段階は、比活性が３６倍増加した酵素調製物
をもたらした。基質として２．４−ＤＣＰおよびＬ−Ｄ
ＯＰＡを使った分光光度的アッセイにより測定した時の
部分精製された酵素調製物の比活性を第１表に示す、２
．４−ＤＣＰ酸化活性もＬ−ＤＯＰＡ酸化活性も共に既
知のペルオキシダーゼ阻害剤、例えばシアン化カリウム
およびアジ化ナトリウムで阻害された（第１表）、同様
な活性の阻害がＰＡＧＥゲルの活性染色の際中にも認め
られた。
をもたらした。基質として２．４−ＤＣＰおよびＬ−Ｄ
ＯＰＡを使った分光光度的アッセイにより測定した時の
部分精製された酵素調製物の比活性を第１表に示す、２
．４−ＤＣＰ酸化活性もＬ−ＤＯＰＡ酸化活性も共に既
知のペルオキシダーゼ阻害剤、例えばシアン化カリウム
およびアジ化ナトリウムで阻害された（第１表）、同様
な活性の阻害がＰＡＧＥゲルの活性染色の際中にも認め
られた。
１−（３，４−ジメトキシフェニル）−３−ヒドロキシ
−２−（２−メトキシフェノキシ）プロパン−１−オン
の水素化ホウ素ナトリウム還元反応により、１−（３，
４−ジメトキシフェニル）−２−（２−メトキシフェノ
キシ）プロパン−１゜３−ジオール（１）を調製した。
−２−（２−メトキシフェノキシ）プロパン−１−オン
の水素化ホウ素ナトリウム還元反応により、１−（３，
４−ジメトキシフェニル）−２−（２−メトキシフェノ
キシ）プロパン−１゜３−ジオール（１）を調製した。
これは、Ｌａｎｄｕｃｃｉらにより助セ違す咀匝吐（１
９８１）甚： ６７−７０中に記載されたようにして合
成された。モデル化合物１−（４−メトキシフェニル）
−２−（フェニル）エタン−１−オン（ＩＩＩ）および
１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−２−
（２−メトキシフェノキシ）プロパン−１−オン（ＩＩ
）は、Ｄｒ。
９８１）甚： ６７−７０中に記載されたようにして合
成された。モデル化合物１−（４−メトキシフェニル）
−２−（フェニル）エタン−１−オン（ＩＩＩ）および
１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−２−
（２−メトキシフェノキシ）プロパン−１−オン（ＩＩ
）は、Ｄｒ。
Ｒ，Ｌ、Ｃｒａｗｆｏｒｄ（Ｉｄａｈｏ大学、微生物・
生化学部）により入手可能であった。
生化学部）により入手可能であった。
１ゲニンモー°ル 八 の
前記モデル化合物を最終濃度０．０２％（ｗ／ｖ ）に
て反応混合物に添加した。 ０．０２単位／ｄのグルコ
ースオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）および３＋＋＋Ｍのグ
ルコースから成る過酸化物生成系または０．１ｍＭの過
酸化水素、０．１Ｍの酒石酸ナトリウム（ｐＨ５，５）
並びに３００Ｉの酵素調製物を含有する全量３．０ ｔ
ｎｌにおいて反応を行った。対照の反応は、煮沸された
酵素調製物を使って行った。ある反応液は酸素でフラッ
シュし、そして全部を傾斜した試験管中で３７°Ｃにて
１８時間振盪機上でインキュベートした。
て反応混合物に添加した。 ０．０２単位／ｄのグルコ
ースオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）および３＋＋＋Ｍのグ
ルコースから成る過酸化物生成系または０．１ｍＭの過
酸化水素、０．１Ｍの酒石酸ナトリウム（ｐＨ５，５）
並びに３００Ｉの酵素調製物を含有する全量３．０ ｔ
ｎｌにおいて反応を行った。対照の反応は、煮沸された
酵素調製物を使って行った。ある反応液は酸素でフラッ
シュし、そして全部を傾斜した試験管中で３７°Ｃにて
１８時間振盪機上でインキュベートした。
次いで反応液を１２Ｍ Ｈ（Ｊでｐｌ＋ ２−３に酸性
にし、そしてエーテルで１回、酢酸エチルで１回抽出し
た。保持時間を真正な標準物質と比較することによりガ
スクロマトグラフィー／マススペクトロメトリー（ＧＳ
／ＭＳ）により、または真正な標準物が入手できない場
合にはそれらのＭＳフラグメント分布の調査により、ま
たは）ＩＰＬｃにより、特定の生成物を同定した。
にし、そしてエーテルで１回、酢酸エチルで１回抽出し
た。保持時間を真正な標準物質と比較することによりガ
スクロマトグラフィー／マススペクトロメトリー（ＧＳ
／ＭＳ）により、または真正な標準物が入手できない場
合にはそれらのＭＳフラグメント分布の調査により、ま
たは）ＩＰＬｃにより、特定の生成物を同定した。
クロマトブーツ −
ＧＣについては、１００Ｉのｐ−ジオキサン、１０Ｉの
ピリジンおよび５０ｄのＮ、Ｏ−ビス（トリメチルシリ
ル）アセトアミドを使って、抽出試料のトリメチルシリ
ル誘導体を調製した。各試料を３５°Ｃにて２時間置い
た後ＧＣに注入した。ＧＣはフレーム・イオン化検出器
とＨＰ Ｕｌｔｒａ ２キヤピラリーカラム（３０ｍｎ
Ｘ ０．２ ａｍ） （Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａ
ｒｄ Ｃｏ、 。
ピリジンおよび５０ｄのＮ、Ｏ−ビス（トリメチルシリ
ル）アセトアミドを使って、抽出試料のトリメチルシリ
ル誘導体を調製した。各試料を３５°Ｃにて２時間置い
た後ＧＣに注入した。ＧＣはフレーム・イオン化検出器
とＨＰ Ｕｌｔｒａ ２キヤピラリーカラム（３０ｍｎ
Ｘ ０．２ ａｍ） （Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａ
ｒｄ Ｃｏ、 。
５ａｎｔａ Ｃ１ａｒａ＋ Ｃａ１ｆｏｒｎｉａ）を付
けたＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ５８９０ガスクロ
マトグラフ装置において行った。カラム条件は次のよう
であった。オープン温度は１２０°Ｃで２分間の後、毎
分１５°Ｃの勾配で２８０°Ｃにし、この温度を１５分
維持した。インジェクター温度は２４０°Ｃで、検出器
温度は２８０″Ｃであった。質量分析をＶＧ−７−７−
ＨＧ質量分析器（ＶＧ ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａＬＵ
、に、）で行い、これをガスクロマトグラフに連結した
。
けたＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ５８９０ガスクロ
マトグラフ装置において行った。カラム条件は次のよう
であった。オープン温度は１２０°Ｃで２分間の後、毎
分１５°Ｃの勾配で２８０°Ｃにし、この温度を１５分
維持した。インジェクター温度は２４０°Ｃで、検出器
温度は２８０″Ｃであった。質量分析をＶＧ−７−７−
ＨＧ質量分析器（ＶＧ ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａＬＵ
、に、）で行い、これをガスクロマトグラフに連結した
。
ＨＰＬＣは、ＩＰ−１０４ＯＡ二極管配列検出器を備え
たＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ １０９０＾高圧液
体クロマトグラフ装置にて行った。各分析中、２５８．
２８０および３００−についてのクロマトグラムを記録
し、そして各ピークの紫外線（ＵＶ）吸収スペクトル（
２５０−３５０ｎｍ）をピークの前方、頂点および後方
で記録した。
たＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ １０９０＾高圧液
体クロマトグラフ装置にて行った。各分析中、２５８．
２８０および３００−についてのクロマトグラムを記録
し、そして各ピークの紫外線（ＵＶ）吸収スペクトル（
２５０−３５０ｎｍ）をピークの前方、頂点および後方
で記録した。
５＃Ｍの粒径を有するＨｙｐｅｒｓｉｌ ００５の１０
０ｍｍ Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ微口径逆相カ
ラムを、４０℃のカラム温度、５Ｉのサルプリングルー
プおよび０．４ｄ１分の流速で使用した。溶媒供給に使
用するグラジェントは、Ｈ２ＳＯ，でｐＨ３，２に調整
された水とアセトニトリルとから成る移動相であった。
０ｍｍ Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ微口径逆相カ
ラムを、４０℃のカラム温度、５Ｉのサルプリングルー
プおよび０．４ｄ１分の流速で使用した。溶媒供給に使
用するグラジェントは、Ｈ２ＳＯ，でｐＨ３，２に調整
された水とアセトニトリルとから成る移動相であった。
アセトニトリルの比率は２分間１０％であり、次いで１
０分間に渡って５０％に増加させ、そして次の５分間に
渡って１００％に増加させた。最後の１５分間の移動相
は１００％アセトニトリルであった。全分析時間は３０
分間であった。相対保持時間および入手可能な標準化合
物とのＵＶスペクトルの比較により、生成物を同定した
。
０分間に渡って５０％に増加させ、そして次の５分間に
渡って１００％に増加させた。最後の１５分間の移動相
は１００％アセトニトリルであった。全分析時間は３０
分間であった。相対保持時間および入手可能な標準化合
物とのＵＶスペクトルの比較により、生成物を同定した
。
ＭＣＬ （粉末コーンリグニン）、抽出されたトウモロ
コシ藁リグノセルロースまたはセルロース（Ｗｈａｔｍ
ａｎセルロース紙、Ｗ ａｎｄ ＲＢａ１ｓｔｏｎ Ｌ
ｔｄ、＋Ｕ、に、）のいずれか１０■、０．１ Ｍのコ
ハク酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，５）および１ｍＭの
過酸化水素を含有する反応液３． ＯＩＩｉに酵素調製
物を添加した。
コシ藁リグノセルロースまたはセルロース（Ｗｈａｔｍ
ａｎセルロース紙、Ｗ ａｎｄ ＲＢａ１ｓｔｏｎ Ｌ
ｔｄ、＋Ｕ、に、）のいずれか１０■、０．１ Ｍのコ
ハク酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，５）および１ｍＭの
過酸化水素を含有する反応液３． ＯＩＩｉに酵素調製
物を添加した。
次に反応液を３７℃でインキュベートしながら、Ｆｒｅ
ｗら、Ａｎａｌ、Ｃｈｉｍ、＾ｃｔａ、 （１９８３）
１５５ ： １３９−１５０により記載されたように
して、一定の間隔で過酸化水素消費量を測定した。別の
間隔において、既知の容量（１００ｍ ”）の反応液を
４−アミノアンチピリン／フェノール試薬に添加しそし
て生じた溶液のＡ、。、を測定した。標準曲線から過酸
化水素含量を算出した。
ｗら、Ａｎａｌ、Ｃｈｉｍ、＾ｃｔａ、 （１９８３）
１５５ ： １３９−１５０により記載されたように
して、一定の間隔で過酸化水素消費量を測定した。別の
間隔において、既知の容量（１００ｍ ”）の反応液を
４−アミノアンチピリン／フェノール試薬に添加しそし
て生じた溶液のＡ、。、を測定した。標準曲線から過酸
化水素含量を算出した。
モー°ル人のヒ
第１図は、部分精製されたペルオキシダーゼにより酸化
されたリグニン構造モデル化合物、および生成された生
成物を示す。ベラトルアルデヒド、アニスアルデヒドお
よびバニリンのみがＨＰＬＣ、ＧＣおよびＧＣ／ＭＳに
より検出された。微量で生成するグアヤコールはＨＰＬ
Ｃ、ＧＣおよびＧＣ／？ＩＳにより検出された。少量の
生成物（ＩＶ）および（Ｖ）は、ＭＳフラグメント化に
よってのみ検出された。全ての３つのモデル化合物の酸
化により観察される小さなピークは、環Ａから由来する
生成物であると思われた。前記生成物のどれも、もとの
基質中には検出されなかった。Ｂ−アリールエーテルニ
量体（１）はＣ＆−Ｃβ結合のところで開裂されてベラ
トルアルデヒド（ＶＩ）とグアヤコール（■）を生じた
。ジアリールエーテル（ＩＩ）からバニリンとグアヤコ
ールが生じ、このことは同じＣ３Ｃβ開裂を示す。ジア
リールエタン（ＩＩＩ）はＣ＆とＣβ炭素間で開裂され
て少量の生成物としてｐ−アニスアルデヒドを生成した
。モデル化合物の酸化生成物の質量スペクトルを第２表
に示す。
されたリグニン構造モデル化合物、および生成された生
成物を示す。ベラトルアルデヒド、アニスアルデヒドお
よびバニリンのみがＨＰＬＣ、ＧＣおよびＧＣ／ＭＳに
より検出された。微量で生成するグアヤコールはＨＰＬ
Ｃ、ＧＣおよびＧＣ／？ＩＳにより検出された。少量の
生成物（ＩＶ）および（Ｖ）は、ＭＳフラグメント化に
よってのみ検出された。全ての３つのモデル化合物の酸
化により観察される小さなピークは、環Ａから由来する
生成物であると思われた。前記生成物のどれも、もとの
基質中には検出されなかった。Ｂ−アリールエーテルニ
量体（１）はＣ＆−Ｃβ結合のところで開裂されてベラ
トルアルデヒド（ＶＩ）とグアヤコール（■）を生じた
。ジアリールエーテル（ＩＩ）からバニリンとグアヤコ
ールが生じ、このことは同じＣ３Ｃβ開裂を示す。ジア
リールエタン（ＩＩＩ）はＣ＆とＣβ炭素間で開裂され
て少量の生成物としてｐ−アニスアルデヒドを生成した
。モデル化合物の酸化生成物の質量スペクトルを第２表
に示す。
上記リグニン構造モデル化合物の酸化は、反応液に酸素
をフラッシュしてまたはフラッシュなしで起こり、これ
を振盪機上でインキュベートした。
をフラッシュしてまたはフラッシュなしで起こり、これ
を振盪機上でインキュベートした。
この反応には過酸化水素が必要であった。インキュベー
ション時間の間に２回（０時間に１回そして９時間後に
１回）の過酸化水素の添加またはグルコース−グルコー
スオキシダーゼ系による過酸化水素の生成は、同様な結
果をもたらした。酵素活性は、酢酸塩、酒石酸塩および
コハク酸塩緩衝液を用いて、ｐ）１３．５−６．５にて
試験された。これらの緩衝液のうち、酒石酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ５，５）がモデル化合物の酸化にとって優
れていることがわかり、この反応はｐＨ５，５を超える
と起こらなかった。
ション時間の間に２回（０時間に１回そして９時間後に
１回）の過酸化水素の添加またはグルコース−グルコー
スオキシダーゼ系による過酸化水素の生成は、同様な結
果をもたらした。酵素活性は、酢酸塩、酒石酸塩および
コハク酸塩緩衝液を用いて、ｐ）１３．５−６．５にて
試験された。これらの緩衝液のうち、酒石酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ５，５）がモデル化合物の酸化にとって優
れていることがわかり、この反応はｐＨ５，５を超える
と起こらなかった。
ユｌ三１匁盈止
酵素アッセイに使用したのと同じ条件下で、部分精製さ
れた酵素を熱抽出トウモロコシ藁−リグツセルロース、
ＭＣＬまたは純セルロースと共にインキュベートした０
反応中の過酸化水素の消費速度をリグニン構造体の酸化
の間接規準としてモニターした（第３表）、リグニン構
造体（ＭＣＬおよびリグノセルロース）が反応液中に存
在する時には過酸化水素が迅速に利用されるが、セルロ
ース粉末を用いた時や基質の非存在下では利用されなか
った。酵素を欠いているかまたは不活性化された酵素（
１０分間薫沸）を含む対照混合物においては、過酸化水
素は消費されなかった。
れた酵素を熱抽出トウモロコシ藁−リグツセルロース、
ＭＣＬまたは純セルロースと共にインキュベートした０
反応中の過酸化水素の消費速度をリグニン構造体の酸化
の間接規準としてモニターした（第３表）、リグニン構
造体（ＭＣＬおよびリグノセルロース）が反応液中に存
在する時には過酸化水素が迅速に利用されるが、セルロ
ース粉末を用いた時や基質の非存在下では利用されなか
った。酵素を欠いているかまたは不活性化された酵素（
１０分間薫沸）を含む対照混合物においては、過酸化水
素は消費されなかった。
ストレプトマイセス・ビリトスポルス（銹匹１勉シμ担
ｖｉｒｉｄｏｓ ｏｒｕｓ）ＴＥＡを、０．５％（ｗ／
ｖ’）カラマツ材キシランが補足された無機塩−酵母エ
キス（０，６％Ｗ ／ Ｖ ）中で増殖させた。増殖は
、３７℃にて振盪しなから好気的に行った。出発接種材
料として胞子を使い、そしてインキュベーション時間は
４８時間であった。
ｖｉｒｉｄｏｓ ｏｒｕｓ）ＴＥＡを、０．５％（ｗ／
ｖ’）カラマツ材キシランが補足された無機塩−酵母エ
キス（０，６％Ｗ ／ Ｖ ）中で増殖させた。増殖は
、３７℃にて振盪しなから好気的に行った。出発接種材
料として胞子を使い、そしてインキュベーション時間は
４８時間であった。
ゲニンペルオキシ −ゼア セイ
反応混合物には、０．１６ｍＭの４−アミノアンチピリ
ン、３ＩＩＭの２．４−ジクロロフェノール、５．７ｍ
Ｍのｔｈ（ｈおよび２００ Ｉｌｌの酵素溶液カ月、Ｏ
ｄの最終容量中に含まれていた（ｐＨ６，０に緩衝化）
。過酸化水素の添加により反応を開始し、そして５１０
ｎｍでの光学濃度（０，０，）の変化をモニターするこ
とにより活性を追跡した。活性の１単位は、これらのア
ッセイ条件下で１．０の吸光度の０．Ｄ、変化をもたら
す活性として定義された。
ン、３ＩＩＭの２．４−ジクロロフェノール、５．７ｍ
Ｍのｔｈ（ｈおよび２００ Ｉｌｌの酵素溶液カ月、Ｏ
ｄの最終容量中に含まれていた（ｐＨ６，０に緩衝化）
。過酸化水素の添加により反応を開始し、そして５１０
ｎｍでの光学濃度（０，０，）の変化をモニターするこ
とにより活性を追跡した。活性の１単位は、これらのア
ッセイ条件下で１．０の吸光度の０．Ｄ、変化をもたら
す活性として定義された。
ゲニンペルオキシ −ゼの よび
定
増殖の４８時間後、ストレプトマイセス細胞を濾過によ
り培地から除去した。酵素を含有する濾液を、ＰＭＩＯ
Ａｓ１ｃｏｎ濾紙を用いたＡｍ１ｃｏｎ膜限外濾過によ
り濃縮した。１０倍濃縮された濾液中のりゲニンペルオ
キシダーゼを、７０％飽和に硫酸アンモニウムを添加す
ることにより沈澱させた。この沈澱物を少量のｐｔ１６
．Ｏの緩衝液中に再懸濁させた。この酵素調製物６ＩＩ
１１を５ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ ２００ゲル浸
透カラム（カラムベツド体積、１５０Ｃ１１）上に負荷
し、そして溶離液としてｐＨ６，０緩衝液を使って０．
２５ｄ／分の流速においてクロマトグラフィーを行った
。５１ｄ画分を集めた。各両分のリグニンペルオキシダ
ーゼ活性を、次の反応混合物を使ってアッセイした：１
００Ｉｌｌの画分中２．８５ｍＭの２．４−ジクロロフ
ェノール、０．２３ｍＭの４−アミノアンチピリン、５
．７ｍＭのＨｚＯｚ。ミクロタイタープレートウェル中
で３７℃にて５分のインキュベーション時間を使ってア
ッセイを行った。活性画分は褐色に変化した。ミクロタ
イタープレートウェルの外観検査により調べた時最も活
性な画分を保存し、そして活性（上記参照）、タンパク
質含量（Ｌｏｈｒｙら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ｗ、
（１９５１） １９３ ： ２６５−２７６の方法〕お
よび比活性（単位／分／ｍｇタンパク質）について定量
分析を行った。リグニンペルオキシダーゼの分子量を測
定するために、タンパク質分子量標準（Ｂｉｏｒａｄキ
ット）を５ＯＳ−ＰＡＧＥにかけ、そして各標準物質の
既知分子量の対数をゲル上の移動距離に対してプロット
することにより標準曲線を作成した。通常クーマシーブ
ルー染色によりタンパク質を検出した。タンパク賞純度
の測定にはＢｉｏｒａｄの銀染色を使った。
り培地から除去した。酵素を含有する濾液を、ＰＭＩＯ
Ａｓ１ｃｏｎ濾紙を用いたＡｍ１ｃｏｎ膜限外濾過によ
り濃縮した。１０倍濃縮された濾液中のりゲニンペルオ
キシダーゼを、７０％飽和に硫酸アンモニウムを添加す
ることにより沈澱させた。この沈澱物を少量のｐｔ１６
．Ｏの緩衝液中に再懸濁させた。この酵素調製物６ＩＩ
１１を５ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ ２００ゲル浸
透カラム（カラムベツド体積、１５０Ｃ１１）上に負荷
し、そして溶離液としてｐＨ６，０緩衝液を使って０．
２５ｄ／分の流速においてクロマトグラフィーを行った
。５１ｄ画分を集めた。各両分のリグニンペルオキシダ
ーゼ活性を、次の反応混合物を使ってアッセイした：１
００Ｉｌｌの画分中２．８５ｍＭの２．４−ジクロロフ
ェノール、０．２３ｍＭの４−アミノアンチピリン、５
．７ｍＭのＨｚＯｚ。ミクロタイタープレートウェル中
で３７℃にて５分のインキュベーション時間を使ってア
ッセイを行った。活性画分は褐色に変化した。ミクロタ
イタープレートウェルの外観検査により調べた時最も活
性な画分を保存し、そして活性（上記参照）、タンパク
質含量（Ｌｏｈｒｙら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ｗ、
（１９５１） １９３ ： ２６５−２７６の方法〕お
よび比活性（単位／分／ｍｇタンパク質）について定量
分析を行った。リグニンペルオキシダーゼの分子量を測
定するために、タンパク質分子量標準（Ｂｉｏｒａｄキ
ット）を５ＯＳ−ＰＡＧＥにかけ、そして各標準物質の
既知分子量の対数をゲル上の移動距離に対してプロット
することにより標準曲線を作成した。通常クーマシーブ
ルー染色によりタンパク質を検出した。タンパク賞純度
の測定にはＢｉｏｒａｄの銀染色を使った。
本発明者らは、この新規リグニン酸化酵素をアクチノマ
イセート・リグニンペルオキシダーゼＰ３（ＡＬｉＰ−
Ｐ３） と命名した。
イセート・リグニンペルオキシダーゼＰ３（ＡＬｉＰ−
Ｐ３） と命名した。
以下の実施例は遺伝子を得そして発現を証明する上での
遺伝子操作に向けられる。
遺伝子操作に向けられる。
ストレプトマイセス・ビリトスポルス（鉦■Ｂとｕ！狙
ｖｉｒｉｄｏｓ ｏｒｕｓ）Ｔ７Ａ（＾ＴＣＣ３９１１
５）は、Ｉｄａｈ。
ｖｉｒｉｄｏｓ ｏｒｕｓ）Ｔ７Ａ（＾ＴＣＣ３９１１
５）は、Ｉｄａｈ。
土壌から最初に単離された（Ｄ、Ｌ、５ｉｎｄｉｎ、
Ｍ、Ｓ。
Ｍ、Ｓ。
Ｔｈｅｓｉｓ＋ Ｉｄａｈｏ大学、１９７９）リグニン
可溶化酵素である（Ｃｒａｗｆｏｒｄら、１９８３．
Ａ １．Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌ、
４５ ： ８９８−９０４）。ストレプトマイセス・リ
ビダンス（Ｓｔｒｅ ｔｏｅ ｃｅｓ １ｉｖｉｄａｎ
ｓ） ＴＫ６ＣＴＭ０１およびＴＭ０１は、Ｄ、Ａ、Ｈ
ｏｐｗｏｏｄ（Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｉｎ５ｔｉｔｕ
ｔｅ。
可溶化酵素である（Ｃｒａｗｆｏｒｄら、１９８３．
Ａ １．Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌ、
４５ ： ８９８−９０４）。ストレプトマイセス・リ
ビダンス（Ｓｔｒｅ ｔｏｅ ｃｅｓ １ｉｖｉｄａｎ
ｓ） ＴＫ６ＣＴＭ０１およびＴＭ０１は、Ｄ、Ａ、Ｈ
ｏｐｗｏｏｄ（Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｉｎ５ｔｉｔｕ
ｔｅ。
Ｎｏｒｗｉｃｈ＋ ［！ｎｇｒａｎｄ）により提供され
た。ＴＭ６４株はプロリン栄養素要求体でありそしてス
トレプトマイシンに対して耐性（染色体によりコードさ
れる）であり、一方非栄養素要求株ＴＫ２３とＴＭ０１
は、それぞれ染色体によりコードされるスペクチノマイ
シン耐性およびストレプトマイシン耐性を示す（Ｈｏｐ
ｗｏｏｄら、１９８５． Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐ
ｕｌａｔｉｏｎ ｏｆＳｔｒｅ ｔｏＩＩＩｃｅｓ ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ＋ Ｊｏ
ｈｎ ＩｎｎｅｓＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ＋ Ｎｏｒｗｉ
ｃｈ、 ＵＫ）。保存培養液は、酵母エキス−肉エキス
−グルコース寒天（ＹＥＭｔ！Ｄ） （Ｒａｍａ−ｃｈ
ａｎｄｒａ、 １９８７．前掲）上に維持された。保存
斜面からの胞子を全ての実験において接種材料として使
用した。有機培地成分はＤｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、 Ｍｌ）から入手した。
た。ＴＭ６４株はプロリン栄養素要求体でありそしてス
トレプトマイシンに対して耐性（染色体によりコードさ
れる）であり、一方非栄養素要求株ＴＫ２３とＴＭ０１
は、それぞれ染色体によりコードされるスペクチノマイ
シン耐性およびストレプトマイシン耐性を示す（Ｈｏｐ
ｗｏｏｄら、１９８５． Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐ
ｕｌａｔｉｏｎ ｏｆＳｔｒｅ ｔｏＩＩＩｃｅｓ ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ＋ Ｊｏ
ｈｎ ＩｎｎｅｓＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ＋ Ｎｏｒｗｉ
ｃｈ、 ＵＫ）。保存培養液は、酵母エキス−肉エキス
−グルコース寒天（ＹＥＭｔ！Ｄ） （Ｒａｍａ−ｃｈ
ａｎｄｒａ、 １９８７．前掲）上に維持された。保存
斜面からの胞子を全ての実験において接種材料として使
用した。有機培地成分はＤｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、 Ｍｌ）から入手した。
ブースミドベク −
５．８ｋｂプラスミドｐｌＪ７０２ （Ｋａｔｚら、１
９８３． Ｊ。
９８３． Ｊ。
Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 １２９ ： ２７Ｃα
−２７１４）は、Ｄ、Ａ、ｌＩｏｐｗｏｏｄ（Ｊｏｈｎ
Ｉｎｎｅｓ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、 Ｎｏｒｗｉｃｈ
、 Ｅｎｇｌａｎｄ）によりストレプトマイセス・リビ
ダンスＴＫ１５０中において提供された。このプラスミ
ドは選択マーカーとしてチオストレプトン耐性（ｔｓｒ
ゝ）と、クローニング中に挿入により不活性化されるチ
ロシナーゼ（閣ｅド）を有する。ＴＭ１５０のスト・ン
クは、５０．ｗ／ｄのチオストレプトンを含むＹＥ？’
ｌＥＤ寒天斜面上に維持された。
−２７１４）は、Ｄ、Ａ、ｌＩｏｐｗｏｏｄ（Ｊｏｈｎ
Ｉｎｎｅｓ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、 Ｎｏｒｗｉｃｈ
、 Ｅｎｇｌａｎｄ）によりストレプトマイセス・リビ
ダンスＴＫ１５０中において提供された。このプラスミ
ドは選択マーカーとしてチオストレプトン耐性（ｔｓｒ
ゝ）と、クローニング中に挿入により不活性化されるチ
ロシナーゼ（閣ｅド）を有する。ＴＭ１５０のスト・ン
クは、５０．ｗ／ｄのチオストレプトンを含むＹＥ？’
ｌＥＤ寒天斜面上に維持された。
プｊ１」」シ１１証
ｐＪＩ７０２の単離のために、チオストレプトン（５０
ｔａｒ ／ ｄおよび５ ｍＭ ＭｇＣ１ｇを含む酵母
エキス−肉エキス−シラ糖（ＹＥＭＥ）培地中で、培養
物を増殖させた。幾らかの変更（Ｍａｎｉａｔｉｓら、
１９Ｂ２． ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃ３ＨＬ、
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、 ＮＹ）を伴
うＨｏｐｗｏｏｄら、１９８５、前掲により記載された
アルカリ性ドデシル硫酸ナトリウム法により、プラスミ
ドＤＮＡを単離した。
ｔａｒ ／ ｄおよび５ ｍＭ ＭｇＣ１ｇを含む酵母
エキス−肉エキス−シラ糖（ＹＥＭＥ）培地中で、培養
物を増殖させた。幾らかの変更（Ｍａｎｉａｔｉｓら、
１９Ｂ２． ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃ３ＨＬ、
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、 ＮＹ）を伴
うＨｏｐｗｏｏｄら、１９８５、前掲により記載された
アルカリ性ドデシル硫酸ナトリウム法により、プラスミ
ドＤＮＡを単離した。
全体の手順は以前に記載された通りである（Ｒａｆｉｉ
およびＣｒａｗｆｏｒｄ＋ １９８８＋ Ａ １．Ｅ
ｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。
およびＣｒａｗｆｏｒｄ＋ １９８８＋ Ａ １．Ｅ
ｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。
５４ ： １３３４−１３４０）。
旦凡人夏性量付せ
以前に記載された通りに、制限酵素消化、アガロースゲ
ル電気泳動、ビオチンによるＤＮＡのラベル化、サザン
プロットハイプリダイゼーション、およびコロニーハイ
ブリダイゼーションを行った（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１
９８２、前掲； ＲａｆｉｉおよびＣｒａｗｆｏｒｃ
Ｌ１９８８、前掲）。
ル電気泳動、ビオチンによるＤＮＡのラベル化、サザン
プロットハイプリダイゼーション、およびコロニーハイ
ブリダイゼーションを行った（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１
９８２、前掲； ＲａｆｉｉおよびＣｒａｗｆｏｒｃ
Ｌ１９８８、前掲）。
および の
制限酵素はＢｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＢＲＬ ： Ｂｅｔｈｅｓｄａ
、 ＭＤ、）から購入し、そして製造業者により勧めら
れる条件下で消化を行った。チオストレプトンは５ｑｕ
ｉｂｂ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｋａｌａ＋ｍａｚｏｏ、 Ｍｌ）か
ら入手した。他の生化学物質は市販のものから得た。
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＢＲＬ ： Ｂｅｔｈｅｓｄａ
、 ＭＤ、）から購入し、そして製造業者により勧めら
れる条件下で消化を行った。チオストレプトンは５ｑｕ
ｉｂｂ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｋａｌａ＋ｍａｚｏｏ、 Ｍｌ）か
ら入手した。他の生化学物質は市販のものから得た。
のクローニン よ
Ｈｏｐｗｏｏｄら、１９８５．前掲、並びにＫｅｎｄａ
ｌ ＩおよびＫｕｌｌｕｓ、 １９８．４． Ｇｅｎ
ｅ ２９ ： ３１５−３２１により記載されたよう
にしてクローニングを行った。リグニンペルオキシダー
ゼ陰性Ｓ、リビダンスＴＸ６４を受容体として使い、一
方Ｓ．ビリドスポルスＴ７Ａをリグニンペルオキシダー
ゼ遺伝子供与体として使った。 ｐｌＪ７０２のチロシ
ナーゼ遺伝子は、Ｓ．ビリドスポルスＤＮＡライブラリ
ーの作成中にｐｌＪ７０２への供与体ＤＮＡ断片の組み
込みにより挿入的に不活性化された。Ｂｇｌ ［［を使
って染色体の供与体ＤＮＡ（３７℃；１時間）とｐｌＪ
７０２ （３７℃；２時間）の両者を開裂させた。 ｐ
ｌＪ７０２中の単一のＢｇｌ ＩＩ部位はチロシナーゼ
遺伝子内部に存在する。Ｂｇｌ Ｕで消化された供与体
ＤＮＡをショ糖勾配で分画し、そしてＴ４リガーゼを使
って５−１０ｋｂの断片を、脱リン酸化された（アルカ
リホスファターゼで３７°Ｃにて１時間） ｐｌＪ７０
２中に連結せしめた０次いでｐｌＪ７０２中でのＤＮＡ
ライブラリーを使って、ポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）を含有する軟寒天中でＳ、リビダンスＴに６４のプ
ロトプラストを形質転換させた。形質転換されたプロト
プラストをＨｏｐｗｏｏｄら、１９８５、前掲のＲ２Ｙ
Ｅ再生培地上で再生させた。
ｌ ＩおよびＫｕｌｌｕｓ、 １９８．４． Ｇｅｎ
ｅ ２９ ： ３１５−３２１により記載されたよう
にしてクローニングを行った。リグニンペルオキシダー
ゼ陰性Ｓ、リビダンスＴＸ６４を受容体として使い、一
方Ｓ．ビリドスポルスＴ７Ａをリグニンペルオキシダー
ゼ遺伝子供与体として使った。 ｐｌＪ７０２のチロシ
ナーゼ遺伝子は、Ｓ．ビリドスポルスＤＮＡライブラリ
ーの作成中にｐｌＪ７０２への供与体ＤＮＡ断片の組み
込みにより挿入的に不活性化された。Ｂｇｌ ［［を使
って染色体の供与体ＤＮＡ（３７℃；１時間）とｐｌＪ
７０２ （３７℃；２時間）の両者を開裂させた。 ｐ
ｌＪ７０２中の単一のＢｇｌ ＩＩ部位はチロシナーゼ
遺伝子内部に存在する。Ｂｇｌ Ｕで消化された供与体
ＤＮＡをショ糖勾配で分画し、そしてＴ４リガーゼを使
って５−１０ｋｂの断片を、脱リン酸化された（アルカ
リホスファターゼで３７°Ｃにて１時間） ｐｌＪ７０
２中に連結せしめた０次いでｐｌＪ７０２中でのＤＮＡ
ライブラリーを使って、ポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）を含有する軟寒天中でＳ、リビダンスＴに６４のプ
ロトプラストを形質転換させた。形質転換されたプロト
プラストをＨｏｐｗｏｏｄら、１９８５、前掲のＲ２Ｙ
Ｅ再生培地上で再生させた。
３０℃でのＲ２ＹＥ培地の１８−２２時間のインキュベ
ーション後、該寒天培地上にチオストレプトン（５００
ｔｒｙ／ｄ）を含むＬＢ軟寒天（Ｈｏｐｗｏｏｄら、１
９８５、前掲）を重層させた。チロシナーゼを発現しな
い（ａ＋ｅｌ−）チオストレプトン耐性（ｔｓｒ’ ）
コロニーは、供与体ＤＮＡ挿入物を含有するｐｌＪ７０
２を発現していると考えられた。
ーション後、該寒天培地上にチオストレプトン（５００
ｔｒｙ／ｄ）を含むＬＢ軟寒天（Ｈｏｐｗｏｏｄら、１
９８５、前掲）を重層させた。チロシナーゼを発現しな
い（ａ＋ｅｌ−）チオストレプトン耐性（ｔｓｒ’ ）
コロニーは、供与体ＤＮＡ挿入物を含有するｐｌＪ７０
２を発現していると考えられた。
１ゲニンペルオキシ −ゼ クローンのスクーニング
Ｒ２ＹＥ培地からのＴｓｒ’／Ｍｅｌ−コロニーを、窒
素不合無機塩（ＢｏｒｇｍｅｙｅｒおよびＣｒａｗｆｏ
ｒｄ、 １９８５、前掲）、カルボキシメチルセルロー
ス（１０，０ｇ／Ｉｌ） 、酵母エキス（１０，０ｇ／
／！ ） 、カザミノ酸（０，２５ｇ／り、チオストレ
プトン（５０ｘ／ｄ）および青色高分子色素Ｐｏ１ｙ
Ｂ−４１１（０，２ｇ ／ Ｉｌ ） （Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅａｐ。
素不合無機塩（ＢｏｒｇｍｅｙｅｒおよびＣｒａｗｆｏ
ｒｄ、 １９８５、前掲）、カルボキシメチルセルロー
ス（１０，０ｇ／Ｉｌ） 、酵母エキス（１０，０ｇ／
／！ ） 、カザミノ酸（０，２５ｇ／り、チオストレ
プトン（５０ｘ／ｄ）および青色高分子色素Ｐｏ１ｙ
Ｂ−４１１（０，２ｇ ／ Ｉｌ ） （Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅａｐ。
Ｃｏ、）を含有する寒天培地に移した。該色素はリグニ
ナーゼの基質である（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ、＾ｂｓｔ
、Ａｎｎ。
ナーゼの基質である（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ、＾ｂｓｔ
、Ａｎｎ。
Ｍｅｅｔｉｎ Ａｍｅｒ、Ｓｏｃ、 ｆｏｒ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ、＋ １９８５＋ｐ、２６７Ｌリグニンペ
ルオキシダーゼにより酸化されると、該色素は脱色され
る。透明な輪（ｈａｌｏ）を有する形質転換体産生コロ
ニーを仮のリグニンペルオキシダーゼクローンとして採
取した。
ｒｏｂｉｏｌ、＋ １９８５＋ｐ、２６７Ｌリグニンペ
ルオキシダーゼにより酸化されると、該色素は脱色され
る。透明な輪（ｈａｌｏ）を有する形質転換体産生コロ
ニーを仮のリグニンペルオキシダーゼクローンとして採
取した。
ＩＪ７０２ ＴＭ０１．１ いたＳ、リビ ンス
の盪 前記の形質転換−再生法を使って、９．８ｋｂプラスミ
ドｐＩＪ７０２／ＴＫ６４．１を用いてＳ、リビダンス
株ＴＫ６４ 、 ＴＭ０１およびＴＭ０１のプロトプラ
ストを形質転換し、これを本実験の間に単離される組換
えＳ。
の盪 前記の形質転換−再生法を使って、９．８ｋｂプラスミ
ドｐＩＪ７０２／ＴＫ６４．１を用いてＳ、リビダンス
株ＴＫ６４ 、 ＴＭ０１およびＴＭ０１のプロトプラ
ストを形質転換し、これを本実験の間に単離される組換
えＳ。
リビダンスｐｌＪ７０２／ＴＫ６４．１のリグニンペル
オキシダーゼ発現細胞から精製した。再生培地上で増殖
しているコロニーをＰｏ１ｙ Ｂ−４１１色素寒天プレ
ートに移した。この培地上で３０°Ｃにて３−５日間増
殖させた後、リグニンペルオキシダーゼ−触媒酸化とＰ
ｏ１ｙ Ｂ−４１１の脱色を示す透明なゾーンについて
コロニーを調べた。
オキシダーゼ発現細胞から精製した。再生培地上で増殖
しているコロニーをＰｏ１ｙ Ｂ−４１１色素寒天プレ
ートに移した。この培地上で３０°Ｃにて３−５日間増
殖させた後、リグニンペルオキシダーゼ−触媒酸化とＰ
ｏ１ｙ Ｂ−４１１の脱色を示す透明なゾーンについて
コロニーを調べた。
ニンペルオキシ −ゼア セイ
リグニンペルオキシダーゼアッセイは、基質として２，
４−ジクロロフェノール（２，４−ＤＣＰ）（Ｓｉｇｍ
ａ）を使って従来のようにアッセイされた。
４−ジクロロフェノール（２，４−ＤＣＰ）（Ｓｉｇｍ
ａ）を使って従来のようにアッセイされた。
最終審１１．０ ｄの反応混合物は、１００ｄのコハク
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，５）２００Ｉｌｌ、 ８
２ｍＭの４−アミノアンチピリン（Ｓｉｇｍａ）１００
．Ｊ、 １．０ｍＭの２゜４−ＤＣＰ １００！１１．
４．０ｍＭの過酸化水素１００１１１、酵素調製物２０
０ｄおよび水３００Ｉｌｌを含んでいた。過酸化水素の
添加により反応を開始し、そして３７°Ｃで２分間の間
のＡ ５１゜の増加をモニターした。酵素活性１単位は
、１．ＯＵ／分の吸光度の増加に必要な酵素の量として
表わされた。活性は基質としてＬ−３，４−ジヒドロキ
シフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ） （Ｓｉｇｍａ）
を使っても測定することができる（Ｒａｓａｃｈａｎｄ
ｒａ＋ １９８７、前掲）。
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，５）２００Ｉｌｌ、 ８
２ｍＭの４−アミノアンチピリン（Ｓｉｇｍａ）１００
．Ｊ、 １．０ｍＭの２゜４−ＤＣＰ １００！１１．
４．０ｍＭの過酸化水素１００１１１、酵素調製物２０
０ｄおよび水３００Ｉｌｌを含んでいた。過酸化水素の
添加により反応を開始し、そして３７°Ｃで２分間の間
のＡ ５１゜の増加をモニターした。酵素活性１単位は
、１．ＯＵ／分の吸光度の増加に必要な酵素の量として
表わされた。活性は基質としてＬ−３，４−ジヒドロキ
シフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ） （Ｓｉｇｍａ）
を使っても測定することができる（Ｒａｓａｃｈａｎｄ
ｒａ＋ １９８７、前掲）。
ペルオキシ゛ の
培養液濾液中の過酸化水素濃度は、Ｆｒｅ−ら、１９８
３、 Ａｎａｌ ｈｅｍ Ａｃｔ ｌｉ：１３９−
１５０の方法により測定した。異なる時間間隔において
、Ｐｏ１ｙ Ｂ−４１１液体培地中で３−７日間増殖さ
れたＳ．ビリドスポルスＴ７ＡまたはＳ、リビダンスＴ
Ｋ６４の培養液からの既知量の濾液（１００ｍ）を該色
素なしで、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）
を含む４−アミノアンチピリン−フェノール試薬（Ｆｒ
ｅｗら、１９８３、前掲）に添加した。得られた溶液の
Ａ、。。
３、 Ａｎａｌ ｈｅｍ Ａｃｔ ｌｉ：１３９−
１５０の方法により測定した。異なる時間間隔において
、Ｐｏ１ｙ Ｂ−４１１液体培地中で３−７日間増殖さ
れたＳ．ビリドスポルスＴ７ＡまたはＳ、リビダンスＴ
Ｋ６４の培養液からの既知量の濾液（１００ｍ）を該色
素なしで、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）
を含む４−アミノアンチピリン−フェノール試薬（Ｆｒ
ｅｗら、１９８３、前掲）に添加した。得られた溶液の
Ａ、。。
を２５°Ｃにである時間に渡って測定した。過酸化水素
含量は、Ａ５゜、値に関連づけられるか、または標準曲
線から正確に算出することができた。
含量は、Ａ５゜、値に関連づけられるか、または標準曲
線から正確に算出することができた。
ポ アク１ルアミド゛ル仇色ア セイ
垂直スラブゲル（７，５％ポリアクリルアミドゲル）上
での未変性不連続ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｐ
ＡＧＥ） （Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａら、１９８７、前
掲）により、細胞外タンパク質を分析した。電気泳動後
、銀染色によりタンパク質を可視化した（Ｒａｎｇｅｓ
およびＲｉｃｋｗｏｏｄ＋ １９８Ｌ Ｇｅｔ Ｅｌｅ
ｃｔｒｏ ｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓ ：
Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａ ｒｏａｃｈ、 ＩＲ
Ｌ Ｐｒｅｓｓ。
での未変性不連続ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｐ
ＡＧＥ） （Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａら、１９８７、前
掲）により、細胞外タンパク質を分析した。電気泳動後
、銀染色によりタンパク質を可視化した（Ｒａｎｇｅｓ
およびＲｉｃｋｗｏｏｄ＋ １９８Ｌ Ｇｅｔ Ｅｌｅ
ｃｔｒｏ ｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓ ：
Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａ ｒｏａｃｈ、 ＩＲ
Ｌ Ｐｒｅｓｓ。
０ｘｆｏｒｄ ）。未変性ＰＡＧＥゲル上のベルオキシ
ダーゼバンドを、前に記載されたような（Ｒａｍａｃｈ
ａｎｄｒａら、１９８７、前掲ＨＲａｍａｃｈａｎｄｒ
ａら、１９８８、前掲）活性染色により発色させた。
ダーゼバンドを、前に記載されたような（Ｒａｍａｃｈ
ａｎｄｒａら、１９８７、前掲ＨＲａｍａｃｈａｎｄｒ
ａら、１９８８、前掲）活性染色により発色させた。
Ｓ．ビリドスポルスＴ７Ａ、Ｓ、 リビダンスＴＫ６
４およびＳ、リビダンスＴＫ６４．１を以前に記載のよ
うにして（Ｃｒａｗｆｏｒｄら、１９８３．＾ ｌｎ、
Ｅｎｖｉｒｏｎ。
４およびＳ、リビダンスＴＫ６４．１を以前に記載のよ
うにして（Ｃｒａｗｆｏｒｄら、１９８３．＾ ｌｎ、
Ｅｎｖｉｒｏｎ。
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、渇’＞ ： ８９８−９０４）、
５ｇ量の抽出されたトウモロコシ藁リグノセルロース上
で増殖させた。
５ｇ量の抽出されたトウモロコシ藁リグノセルロース上
で増殖させた。
ある実験では、リグノセルロースを欠きそして酵母エキ
スが補足された窒素不含無機塩から成る液体培地（Ｒａ
ｍａｃｈａｎｄｒａら、１９８７、前掲）上でＳ．ビリ
ドスポルスＴ７Ａによりリグニンペルオキシダーゼを生
産させた。
スが補足された窒素不含無機塩から成る液体培地（Ｒａ
ｍａｃｈａｎｄｒａら、１９８７、前掲）上でＳ．ビリ
ドスポルスＴ７Ａによりリグニンペルオキシダーゼを生
産させた。
藍−果
補助基質（ｃｏｓｕｂｓｔｒａｔｅ）としてのｎｚｏｔ
の存在下でＳ．ビリドスポルスＴ７Ａから精製されたり
ゲニンペルオキシダーゼＡＬｉｐ−Ｐ３は、青色素Ｐｏ
１ｙＢ−４１１を脱色するであろう。この反応は可逆的
であり、そしてＰｏ１ｙ Ｂ−４１１寒天プレートの中
心でカットされたウェル中に該酵素と過酸化物を一緒に
置くことにより行うと、該酵素と過酸化物が外側に拡散
するので青色寒天中に透明な輪が現れる。
の存在下でＳ．ビリドスポルスＴ７Ａから精製されたり
ゲニンペルオキシダーゼＡＬｉｐ−Ｐ３は、青色素Ｐｏ
１ｙＢ−４１１を脱色するであろう。この反応は可逆的
であり、そしてＰｏ１ｙ Ｂ−４１１寒天プレートの中
心でカットされたウェル中に該酵素と過酸化物を一緒に
置くことにより行うと、該酵素と過酸化物が外側に拡散
するので青色寒天中に透明な輪が現れる。
Ｓ．ビリドスポルスＴ７Ａも該色素を脱色するが、脱色
はより完全で且つ永久的であり、ＡＬｉＰ−Ｐ３に加え
て幾つかの酵素がＰｏ１ｙ Ｂ−４１１の酸化に関係し
ていることを示す。Ｓ、リビダンスＴＫ６４のコロニー
は色素を幾らか吸着するけれども該色素を脱色しない、
Ｐｏ１ｙ Ｂ−４１１培地上で増殖する間にＴＫ６４
コロニーの周りには透明な輪が全く現われない。これら
の知見に基づき、Ｓ、リビダンスのりゲニンペルオキシ
ダーゼ発現クローンの選択にＰｏ１ｙ Ｂ−４１１脱色
コロニースクリーニングアッセイを使った。
はより完全で且つ永久的であり、ＡＬｉＰ−Ｐ３に加え
て幾つかの酵素がＰｏ１ｙ Ｂ−４１１の酸化に関係し
ていることを示す。Ｓ、リビダンスＴＫ６４のコロニー
は色素を幾らか吸着するけれども該色素を脱色しない、
Ｐｏ１ｙ Ｂ−４１１培地上で増殖する間にＴＫ６４
コロニーの周りには透明な輪が全く現われない。これら
の知見に基づき、Ｓ、リビダンスのりゲニンペルオキシ
ダーゼ発現クローンの選択にＰｏ１ｙ Ｂ−４１１脱色
コロニースクリーニングアッセイを使った。
Ｓ、リビダンス形質転換体によるリグニンペルオキシダ
ーゼの発現は、細胞外のＨｚＯ□補助基質の存在を必要
とする。Ｓ、リビダンスＴＫ６４は、色素または寒天を
欠く液体Ｐｏ１ｙ Ｂ−４１１培地中で増殖させた時に
Ｓ．ビリドスポルスＴ７＾により排出されたのと同じ位
の量でＨ２Ｏ，を細胞外的に生産する。
ーゼの発現は、細胞外のＨｚＯ□補助基質の存在を必要
とする。Ｓ、リビダンスＴＫ６４は、色素または寒天を
欠く液体Ｐｏ１ｙ Ｂ−４１１培地中で増殖させた時に
Ｓ．ビリドスポルスＴ７＾により排出されたのと同じ位
の量でＨ２Ｏ，を細胞外的に生産する。
加えて、Ｓ、リビダンス株は、様々な有機基質から過酸
化物を生成する細胞外性酵素活性を有する。
化物を生成する細胞外性酵素活性を有する。
これらの結果は、細胞外の過酸化物濃度がリグニンペル
オキシダーゼ発現クローンに補助基質を供給するのに十
分であることを示した。
オキシダーゼ発現クローンに補助基質を供給するのに十
分であることを示した。
チオストレプトン修正Ｒ２ＹＥ再生培地上で増殖してい
る約１０００のメラニン陰性Ｓ、リビダンスＴＫ６４コ
ロニー（ｐｌＪ７０２中にＳ．ビリドスポルスＴＥＡの
ＤＮＡ挿入物を含むと推定される）を取り、そしてＰｏ
１ｙ Ｂ−４１１寒天培地プレートに移した。これらの
クローンのうち、２つが３０°Ｃで３−５日間の増殖後
に色素を透明にした。これらのクローンのコロニーは、
純粋酵素を用いて観察されたのと同じような拡大する透
明な輪を生じた。１つのクローン、Ｓ６ リビダンスｐ
ｌＪ７０２／ＴＫ６４．１を更なる特徴付けのために選
択した。というのは、該クローンは他のクローンよりも
寒天培地上で迅速に増殖しそして良く胞子形成したから
である。
る約１０００のメラニン陰性Ｓ、リビダンスＴＫ６４コ
ロニー（ｐｌＪ７０２中にＳ．ビリドスポルスＴＥＡの
ＤＮＡ挿入物を含むと推定される）を取り、そしてＰｏ
１ｙ Ｂ−４１１寒天培地プレートに移した。これらの
クローンのうち、２つが３０°Ｃで３−５日間の増殖後
に色素を透明にした。これらのクローンのコロニーは、
純粋酵素を用いて観察されたのと同じような拡大する透
明な輪を生じた。１つのクローン、Ｓ６ リビダンスｐ
ｌＪ７０２／ＴＫ６４．１を更なる特徴付けのために選
択した。というのは、該クローンは他のクローンよりも
寒天培地上で迅速に増殖しそして良く胞子形成したから
である。
仮定的に同定されたリグニンペルオキシダーゼ発現組換
え体Ｓ、リビダンスＴＫ６４．１を５ｇの抽出された粉
末トウモロコシ藁のリグノセルロース（Ｃｒａｗｆｏｒ
ｄら、１９８３、前掲）上で３０°Ｃにて２週間固相培
養において増殖させ、次いで細胞外リグニンペルオキシ
ダーゼの生産についてテストした。
え体Ｓ、リビダンスＴＫ６４．１を５ｇの抽出された粉
末トウモロコシ藁のリグノセルロース（Ｃｒａｗｆｏｒ
ｄら、１９８３、前掲）上で３０°Ｃにて２週間固相培
養において増殖させ、次いで細胞外リグニンペルオキシ
ダーゼの生産についてテストした。
リグニンペルオキシダーゼ生産の正の対照として、同様
に、ただし３７℃にて増殖させ、−力負の対照として、
プラスミドを含まないＳ、リビダンスＴＫ６４を同様に
増殖させた。２週間後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０） ５０ｄでの抽出およびグラスウールを通した濾
過により培養液をとった。水性の濾液をポリエチレング
リコール（ＭＷ １５．０００−２０，０００）に対す
る透析により３倍濃縮し、次いで未変性ＰＡＧＥゲル活
性染色アッセイおよび２．４−ＤＣＰ酸化アッセイを使
ってリグニンペルオキシダーゼ活性についてアッセイし
た。ゲル中のペルオキシダーゼバンドを検出するのに使
った基質はＬ−ＤＯＰＡ（Ｌ−３，４−ジヒドロキシフ
ェニルアラニン）であった、過酸化水素の存在下で、Ｓ
．ビリドスポルスのリグニンペルオキシダーゼＡＬｉｐ
−Ｐ３はこの基質を迅速に酸化し、一方４−アミノアン
チピリンの存在下でこの反応を行うと濃い赤褐色を生じ
る（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａら、１９８７、前掲）。
に、ただし３７℃にて増殖させ、−力負の対照として、
プラスミドを含まないＳ、リビダンスＴＫ６４を同様に
増殖させた。２週間後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０） ５０ｄでの抽出およびグラスウールを通した濾
過により培養液をとった。水性の濾液をポリエチレング
リコール（ＭＷ １５．０００−２０，０００）に対す
る透析により３倍濃縮し、次いで未変性ＰＡＧＥゲル活
性染色アッセイおよび２．４−ＤＣＰ酸化アッセイを使
ってリグニンペルオキシダーゼ活性についてアッセイし
た。ゲル中のペルオキシダーゼバンドを検出するのに使
った基質はＬ−ＤＯＰＡ（Ｌ−３，４−ジヒドロキシフ
ェニルアラニン）であった、過酸化水素の存在下で、Ｓ
．ビリドスポルスのリグニンペルオキシダーゼＡＬｉｐ
−Ｐ３はこの基質を迅速に酸化し、一方４−アミノアン
チピリンの存在下でこの反応を行うと濃い赤褐色を生じ
る（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａら、１９８７、前掲）。
無機塩−酵母エキスブロス中で増殖された細胞からのＳ
．ビリドスポルスの濾液は、ＡＬｉｐ−Ｐ３リグニンペ
ルオキシダーゼバンドに相当するペルオキシダーゼ活性
バンドを含んでいた（Ｒａｓａｃｈａｎｄｒａら、１９
８８、前掲）、固相リグノセルロース培養からのＳ．ビ
リドスポルスの濾液は、非常に多量のりゲニンペルオキ
シダーゼとご（少量の、以前に観察されているような（
Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａら、１９８７、前掲）別のＬ−
ＤＯＰＡ−酸化ベルオキシダーゼバンドを含んでいた。
．ビリドスポルスの濾液は、ＡＬｉｐ−Ｐ３リグニンペ
ルオキシダーゼバンドに相当するペルオキシダーゼ活性
バンドを含んでいた（Ｒａｓａｃｈａｎｄｒａら、１９
８８、前掲）、固相リグノセルロース培養からのＳ．ビ
リドスポルスの濾液は、非常に多量のりゲニンペルオキ
シダーゼとご（少量の、以前に観察されているような（
Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａら、１９８７、前掲）別のＬ−
ＤＯＰＡ−酸化ベルオキシダーゼバンドを含んでいた。
プラスミド不合のＳ、リビダンスＴＫ６４からの固相培
養濾液は少量の幾つかのペルオキシダーゼ活性タンパク
質を含み、低いバックグラウンドレベルのペルオキシダ
ーゼ活性を示した。この活性は、その存在がデータの解
釈を複雑にするが、リグニンペルオキシダーゼではない
。
養濾液は少量の幾つかのペルオキシダーゼ活性タンパク
質を含み、低いバックグラウンドレベルのペルオキシダ
ーゼ活性を示した。この活性は、その存在がデータの解
釈を複雑にするが、リグニンペルオキシダーゼではない
。
Ｓ、リビダンスＴＫ６４．１からの固相培養濾液は、非
常に高レベルのペルオキシダーゼを含み、そして強力な
活性バンドがＳ．ビリドスポルスの濾液において観察さ
れたＡＬｉｐ−Ｐ３バンドと一致した。
常に高レベルのペルオキシダーゼを含み、そして強力な
活性バンドがＳ．ビリドスポルスの濾液において観察さ
れたＡＬｉｐ−Ｐ３バンドと一致した。
従っ−ｔ：、 ｐＡＧＨゲルアッセイは、クローン化さ
れたＤＮＡがＳ．ビリドスポルスＴ７Ａリグニンペルオ
キシダーゼをコードするという結論を支持している。こ
の結論は２．４−ＤＣＰアッセイの結果によっても支持
される。
れたＤＮＡがＳ．ビリドスポルスＴ７Ａリグニンペルオ
キシダーゼをコードするという結論を支持している。こ
の結論は２．４−ＤＣＰアッセイの結果によっても支持
される。
Ｓ．ビリドスポルスＴ７Ａ、Ｓ、 リビダンスＴＫ６
４およびＳ、リビダンスＴＫ６４．１からの透析濃縮さ
れた濾液は、それぞれ０．１０ 、０．０２および０．
１１Ｕ／Ｊ１１！の２．４−ＤＣＰ酸化活性を示した。
４およびＳ、リビダンスＴＫ６４．１からの透析濃縮さ
れた濾液は、それぞれ０．１０ 、０．０２および０．
１１Ｕ／Ｊ１１！の２．４−ＤＣＰ酸化活性を示した。
この実験では、該濾液は、リグノセルロース（０，０５
％Ｗ／Ｖ）が補足された無機塩−酵母エキス（０，６％
ｗ ／ ｖ ）液体中で３０°Ｃ（Ｔ７７株については
３７°Ｃ）にて４日間増殖されたフラスコ振盪培養物か
らのものである。リグノセルロースの代わりにカルボキ
シメチルセルロース（０，０５％Ｗ ／ Ｖ ）が補足
された培地からの同じ４日間培養物の濾液については、
対応する値はそれぞれ０．０６ 、０．Ｃαおよび０．
０７であった。
％Ｗ／Ｖ）が補足された無機塩−酵母エキス（０，６％
ｗ ／ ｖ ）液体中で３０°Ｃ（Ｔ７７株については
３７°Ｃ）にて４日間増殖されたフラスコ振盪培養物か
らのものである。リグノセルロースの代わりにカルボキ
シメチルセルロース（０，０５％Ｗ ／ Ｖ ）が補足
された培地からの同じ４日間培養物の濾液については、
対応する値はそれぞれ０．０６ 、０．Ｃαおよび０．
０７であった。
ＡＬｉｐ−Ｐ３遺伝子をコードしているプラスミド（ｐ
ｌＪ７０２．ＬＰ）をＳ、リビダンスの細胞から精製し
、そして制限分析により特徴付けた。このプラスミドは
約４ｋｂのＤＮＡ挿入物を含んでおり、この挿入物をＢ
ｇｌ ｎによりｐｌＪ７０２から切り出すことができ
た。該挿入物を精製し、ビオチニル化し、そしてＢｇｌ
ＩＩで制限消化されたＳ．ビリドスポルスのゲノムＤ
ＮＡを探索するのに用いた時、このプローブは約４ｋｂ
ＯサイズのゲノムＤＮＡ断片とハイブリダイズした。こ
れらのデータから、クローン化された前記遺伝子がＳ．
ビリドスポルスのゲノムに由来することが確証される。
ｌＪ７０２．ＬＰ）をＳ、リビダンスの細胞から精製し
、そして制限分析により特徴付けた。このプラスミドは
約４ｋｂのＤＮＡ挿入物を含んでおり、この挿入物をＢ
ｇｌ ｎによりｐｌＪ７０２から切り出すことができ
た。該挿入物を精製し、ビオチニル化し、そしてＢｇｌ
ＩＩで制限消化されたＳ．ビリドスポルスのゲノムＤ
ＮＡを探索するのに用いた時、このプローブは約４ｋｂ
ＯサイズのゲノムＤＮＡ断片とハイブリダイズした。こ
れらのデータから、クローン化された前記遺伝子がＳ．
ビリドスポルスのゲノムに由来することが確証される。
精製されたｐｌＪ７０２．ＬＰを使って、Ｓ、リビダン
スＴＫ６４ 、 ＴＭ０１およびＴＭ０１株を形質転換
せしめた。
スＴＫ６４ 、 ＴＭ０１およびＴＭ０１株を形質転換
せしめた。
これらの形質転換では形質転換の頻度は異なるけれども
、Ｐｏ１ｙ Ｂ−４１１含有培地上で増殖させた時、ど
の形質転換体も該色素を脱色するｐｒＪ７０２．ＬＰを
発現していた。これらの結果は、クローン化されたペル
オキシダーゼ遺伝子が、観察された色素脱色の原因であ
ることを更に確証する。１つのＴＭ０１の形質転換体で
あるＴＭ０１．１ ／ ｐ ＩＪ７０２． ＬＰを更な
る研究に使った。
、Ｐｏ１ｙ Ｂ−４１１含有培地上で増殖させた時、ど
の形質転換体も該色素を脱色するｐｒＪ７０２．ＬＰを
発現していた。これらの結果は、クローン化されたペル
オキシダーゼ遺伝子が、観察された色素脱色の原因であ
ることを更に確証する。１つのＴＭ０１の形質転換体で
あるＴＭ０１．１ ／ ｐ ＩＪ７０２． ＬＰを更な
る研究に使った。
Ｓ、リビダンスＴＫ６４は、固相培養においてトウモロ
コシ藁のリグノセルロース上で増殖させた時はとんどリ
グノセルロースの重量減少を引き起こさない（Ｓ、Ｅａ
ｔｏｎ、 Ｍ、Ｓ、Ｔｈｅｓｉｓ、 Ｉｄａｈｏ大学、
１９８７）。
コシ藁のリグノセルロース上で増殖させた時はとんどリ
グノセルロースの重量減少を引き起こさない（Ｓ、Ｅａ
ｔｏｎ、 Ｍ、Ｓ、Ｔｈｅｓｉｓ、 Ｉｄａｈｏ大学、
１９８７）。
対照的に、Ｓ．ビリドスポルスＴ７Ａは活発に増殖しそ
して該基質のリグニンと炭水化物成分の両方の減少およ
び重量減少を引きおこす（Ｃｒａｗｆｏｒｄら、前掲）
。予備実験において、トウモロコシ藁リグノセルロース
を利用するＴＭ０１株および組換え体ＴＫ２３．１株の
能力を比較した。固相培養としてインキュベーションを
行った。３０″Ｃにて２週間増殖後、ストレプトマイセ
スの増殖に起因するリグノセルロース重量の減少を定量
的に測定した（Ｃｒａｗｆｏｒｄら、前掲）。ＴＭ０１
株とＴＭ０１．１株は、それぞれ３．３％と６．２％の
重量減少を引き起こした。これらのデータは、Ｓ．ビリ
ドスポルスのりゲニンペルオキシダーゼ遺伝子に加えて
、該組換え体が少なくとも部分的にリグノセルロースを
分解する能力を獲得したことを示している。
して該基質のリグニンと炭水化物成分の両方の減少およ
び重量減少を引きおこす（Ｃｒａｗｆｏｒｄら、前掲）
。予備実験において、トウモロコシ藁リグノセルロース
を利用するＴＭ０１株および組換え体ＴＫ２３．１株の
能力を比較した。固相培養としてインキュベーションを
行った。３０″Ｃにて２週間増殖後、ストレプトマイセ
スの増殖に起因するリグノセルロース重量の減少を定量
的に測定した（Ｃｒａｗｆｏｒｄら、前掲）。ＴＭ０１
株とＴＭ０１．１株は、それぞれ３．３％と６．２％の
重量減少を引き起こした。これらのデータは、Ｓ．ビリ
ドスポルスのりゲニンペルオキシダーゼ遺伝子に加えて
、該組換え体が少なくとも部分的にリグノセルロースを
分解する能力を獲得したことを示している。
上記の結果から、リグニンペルオキシダーゼを生産する
能力を伝達できる可能性が現われたことは明らかである
。かくして、該構成物を使うことにより、同種もしくは
異種宿主のりゲニンペルオキシダーゼ能力および生産量
を増強することができ、リグニンの処理のために該酵素
を細胞外的に生産させることができ、または該酵素を触
媒的オキシダーゼとして利用することができる。
能力を伝達できる可能性が現われたことは明らかである
。かくして、該構成物を使うことにより、同種もしくは
異種宿主のりゲニンペルオキシダーゼ能力および生産量
を増強することができ、リグニンの処理のために該酵素
を細胞外的に生産させることができ、または該酵素を触
媒的オキシダーゼとして利用することができる。
今まで本発明を理解の明確化のために説明と実施例によ
り幾らか詳細に記載してきたが、特許請求の範囲の精神
または範囲から逸脱することなく幾らかの変更および改
良を行い得ることは当業者にとって容易に明らかであろ
う。
り幾らか詳細に記載してきたが、特許請求の範囲の精神
または範囲から逸脱することなく幾らかの変更および改
良を行い得ることは当業者にとって容易に明らかであろ
う。
】−」−一表
シアン化物およびアジ化物によるペルオキシダーゼＰ３
活性の阻害１ シアン化カリウム ０．４５（５８％） ０．１５（５０％） タンパク質含量は Ｌｏｗｒｙ法により測定。
活性の阻害１ シアン化カリウム ０．４５（５８％） ０．１５（５０％） タンパク質含量は Ｌｏｗｒｙ法により測定。
第一」し−表
ペルオキシダーゼによるリグニンモデル化合物の酸化か
ら得られる主な生成物の質量スペクトルｔＪ−−表 リグノセルロース系基質を用いたペルオキシダーゼＰ３
反応中の過酸化水素の消費速度ＣＬ セルロース ０．７５ ０．７６ ０．０９ ０．０９
ら得られる主な生成物の質量スペクトルｔＪ−−表 リグノセルロース系基質を用いたペルオキシダーゼＰ３
反応中の過酸化水素の消費速度ＣＬ セルロース ０．７５ ０．７６ ０．０９ ０．０９
第１図は、部分精製されたペルオキシダーゼにより酸化
されるリグニン構造モデル化合物、および生成される生
成物を示す。
されるリグニン構造モデル化合物、および生成される生
成物を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、放線菌リグニンペルオキシダーゼをコードしており
、生来のフランキング配列以外のものに連結されたＤＮ
Ａ配列。 ２、前記ＤＮＡ配列がストレプトマイセス （Ｓｔｒｅｔｏｍｙｃｅｓ）の配列である、請求項１に
記載のＤＮＡ配列。 ３、前記ストレプトマイセスがＳ．ビリドスポルス（￥
Ｓ￥．￥ｖｉｒｉｄｏｓｐｏｒｕｓ￥）である、請求項
２に記載のＤＮＡ配列。 ４、前記ＤＮＡ配列が前記リグニンペルオキシダーゼの
生来のプロモーター領域を含んで成る、請求項１に記載
のＤＮＡ配列。 ５、放線菌宿主中で機能的な複製系および生来のフラン
キング配列以外のものに連結された放線菌リグニンペル
オキシダーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成るベク
ター。 ６、前記ＤＮＡ配列がストレプトマイセスの配列である
、請求項５に記載のベクター。 ７、前記ストレプトマイセスがＳ．ビリドスポルスであ
る、請求項６に記載のベクター。 ８、前記ＤＮＡ配列が前記リグニンペルオキシダーゼの
生来のプロモーター領域を含んで成る、請求項５に記載
のベクター。 ９、形質転換の結果として、放線菌宿主中で機能的なプ
ロモーターおよびターミネーター領域の転写および翻訳
の支配下に放線菌リグニンペルオキシダーゼをコードし
ている配列を含んで成る放線菌リグニンペルオキシダー
ゼ遺伝子をコードしており生来のフランキング配列以外
のものに連結されたＤＮＡ配列を含んで成る、形質転換
された放線菌宿主。 １０、前記ＤＮＡ配列が安定な染色体外要素の一部分を
含んで成る、請求項９に記載の形質転換された放線菌宿
主。 １１、前記ＤＮＡ配列がストレプトマイセスの配列であ
る、請求項９に記載の形質転換された放線菌宿主。 １２、前記ストレプトマイセスがＳ．ビリドスポルスで
ある、請求項１１に記載の形質転換された放線菌宿主。 １３、前記ＤＮＡ配列が前記リグニンペルオキシダーゼ
の生来のプロモーター領域を含んで成る、請求項９に記
載の形質転換された放線菌宿主。 １４、形質転換の結果として、原核生物宿主中で機能的
なプロモーターおよびターミネーター領域の転写および
翻訳の支配下に放線菌リグニンペルオキシダーゼをコー
ドしている配列を含んで成る放線菌リグニンペルオキシ
ダーゼ遺伝子をコードしており生来のフランキング配列
以外のものに連結されたＤＮＡ配列を含んで成る、形質
転換された原核生物宿主。 １５、リグニンペルオキシダーゼの生産方法であって、 適当な栄養培地中で請求項１４に記載の形質転換された
原核生物宿主を増殖せしめ、 それにより前記リグニンペルオキシダーゼが生産される
； ことを含んで成る方法。 １６、約１８ｋＤの分子量を有し、リグニンおよびリグ
ニン分解生成物のＣ＿α−酸化およびＣ＿α−Ｃ＿β開
裂を行うことができそして約０．３０Ｕ／分／ｍｇより
大きい比活性を示すリグニンペルオキシダーゼ酵素の生
産方法であって、 放線菌目（￥Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ￥）宿主
を適当な栄養培地中で増殖せしめ、それにより前記リグ
ニンペルオキシダーゼが前記宿主により分泌され；そし
て 前記リグニンペルオキシダーゼを実質的に純粋な形で単
離する； ことを含んで成る方法。 １７、酸化を受けやすいフェノール性化合物を過酸化水
素の存在下でリグニンペルオキシダーゼにより酸化する
方法であって、 前記フェノール性化合物を過酸化水素源の存在下で請求
項１４に記載の形質転換された原核生物宿主と接触せし
め； それにより前記フェノール性化合物が酸化される、 ことを含んで成る方法。 １８、前記フェノール性化合物がリグノセルロースであ
る、請求項１７に記載の方法。 １９、酸化を受けやすいフェノール性化合物をリグニン
ペルオキシダーゼにより酸化する方法であって、 前記フェノール性化合物を過酸化水素源の存在下で請求
項１５の方法に従って生産されたリグニンペルオキシダ
ーゼと接触せしめ； それにより前記フェノール化合物が酸化される、ことを
含んで成る方法。 ２０、約１８ｋＤの分子量を有し、リグニンおよびリグ
ニン分解生成物のＣ＿α−酸化およびＣ＿α−Ｃ＿β開
裂を行うことができそして約０．３０Ｕ／分／ｍｇより
大きい比活性を示すリグニンペルオキシダーゼ酵素。 ２１、前記酵素が放線菌目（￥Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔ
ａｌｅｓ￥）のメンバーから単離される、請求項２０に
記載の酵素。 ２２、前記メンバーがストレプトマイセス（￥Ｓｔｒｅ
ｐ−ｔｏｍｙｃｅｓ￥）由来である、請求項２１に記載
の酵素。 ２３、前記メンバーがストレプトマイセス・ビリドスポ
ルス（￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥￥ｖｉｒｉｄｏｓ
ｐｏｒｕｓ￥）由来である、請求項２２に記載の酵素。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US277802 | 1988-11-30 | ||
| US07/277,802 US5200338A (en) | 1988-11-30 | 1988-11-30 | Bacterial extracellular lignin peroxidase |
| US422023 | 1989-10-16 | ||
| US07/422,023 US5232845A (en) | 1988-11-30 | 1989-10-16 | Bacterial extracellular lignin peroxidase |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02257884A true JPH02257884A (ja) | 1990-10-18 |
Family
ID=26958724
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1307828A Pending JPH02257884A (ja) | 1988-11-30 | 1989-11-29 | 細菌性細胞外性リグニンペルオキシダーゼ |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5232845A (ja) |
| EP (1) | EP0371712A3 (ja) |
| JP (1) | JPH02257884A (ja) |
| CA (1) | CA2004343C (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015524673A (ja) * | 2012-08-16 | 2015-08-27 | バングラデシュ ジュート リサーチ インスティテュートＢａｎｇｌａｄｅｓｈ Ｊｕｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｓｔｉｔｕｔｅ | Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａｐｈａｓｅｏｌｉｎａ由来のリグニン分解酵素およびその使用 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5149648A (en) * | 1989-03-16 | 1992-09-22 | Kabushiki Kaisha Kobe Seiko Sho | Enzymes employed for producing pulps |
| FR2672066B1 (fr) * | 1991-01-25 | 1997-01-31 | Du Pin Cellulose | Traitement enzymatique d'une pate ligno-cellulosique chimique. |
| US6294047B1 (en) | 1999-07-30 | 2001-09-25 | Institute Of Paper | Methods for reducing fluorescence in paper-containing samples |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4713336A (en) * | 1984-09-27 | 1987-12-15 | Research Corporation Technologies, Inc. | Gene for lignin degradation and uses thereof |
| KR880701776A (ko) * | 1986-09-12 | 1988-11-05 | 예안 클라메르 한스 두돌프 하우스 | 유기 화합물에 있어서의 또는 그와 관련된 개량방법 |
-
1989
- 1989-10-16 US US07/422,023 patent/US5232845A/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-11-24 EP EP19890312240 patent/EP0371712A3/en not_active Withdrawn
- 1989-11-29 JP JP1307828A patent/JPH02257884A/ja active Pending
- 1989-11-30 CA CA002004343A patent/CA2004343C/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015524673A (ja) * | 2012-08-16 | 2015-08-27 | バングラデシュ ジュート リサーチ インスティテュートＢａｎｇｌａｄｅｓｈ Ｊｕｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｓｔｉｔｕｔｅ | Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａｐｈａｓｅｏｌｉｎａ由来のリグニン分解酵素およびその使用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2004343A1 (en) | 1990-05-31 |
| CA2004343C (en) | 1999-08-03 |
| US5232845A (en) | 1993-08-03 |
| EP0371712A3 (en) | 1991-07-24 |
| EP0371712A2 (en) | 1990-06-06 |
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